DE2654723A1 - Magnetisches gel fuer immunoenzymatische bestimmungen - Google Patents

Magnetisches gel fuer immunoenzymatische bestimmungen

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DE2654723A1 DE19762654723 DE2654723A DE2654723A1 DE 2654723 A1 DE2654723 A1 DE 2654723A1 DE 19762654723 DE19762654723 DE 19762654723 DE 2654723 A DE2654723 A DE 2654723A DE 2654723 A1 DE2654723 A1 DE 2654723A1
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Description

patentanwAlteNCILCKEN &LAUFER
DR. HUGO WILCKEN · DIPL.-ING. THONiAS WILCKEN · CIPL.-CHEM. DR-WOLFG1 LOBECK LÜBECK
München, den 2. Dezember 1976
INSTITUT PASTEUR
28, nue du Docteur Ro ux
F-7SO15 Paris
Magnetisches Gel für immunoenzymatische Bestimmungen
Die Erfindung betrifft im allgemeinen die quantitative Bestimmung von Proteinen wie beispielsweise Antigene oder Antikörper, die in bestimmten biologischen Medien enthalten sind. Die Erfindung betrifft insbesondere ein magnetisches Gel auf der Basis von Acrylamid, Agarose oder Acryiamid-Agarose sowie ein Verfahren zur Herstellung dieses magnetischen Gels und seiner Verwendung bei immunoenzymatiscnen Analysen und Bestimmungen.
Das magnetische Gel nach der Erfindung besteht beispielsweise aus Polyacrylamid-Agarose und magnetischen Teilchen, die mit einem Antikörper gekoppelt sind, und eine schnelle immunoenzymatiscne Bestimmung der Antigene ermöglicht, die beispielsweise in einer biologischen Flüssigkeit enthalten sind. Die Gegenwart der magnetischen
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IUBCCK 1 ■ B-e!lc Snaßc 52 c 4 · TV-Won (0451) 7 5ΠΡ8 # 8 MÜNCHEN EO · Pnnzregenlenstraße 7< - Telefon (089) 47736«
• _ '«'.e.i H.-amborg 138' 19-204 Banken: G.-i^erjlmili LQbi-rk (Bl? ÄM002: Mo-Nr. 390187 · Deutsche Bank Mündien (BLZ 70070010) Kto.-Nr, 65.05432
Teilchen ermöglicht eine schnelle Abtrennung des Gels aus dem Reaktionsmedium mit Hilfe eines Magnetfeldes und verringert wesentlich die Dauer der Bestimmung bzw. Analyse.
Die Erfassung und Bestimmung von Antikörpern oder Antigenen mit Hilfe von Enzymen ist eine bereits bekannte -Technik, (Bull. Soc. Chim.Biol. 1968, 50, No. 5-6). Es sind bereits Verfahren vorgeschlagen worden zur Darstellung und zur Bestimmung einer Reaktionsverbindung zwischen einem spezifischen fixierenden Protein und der entsprechenden zu fixierenden Substanz mittels Markierung der letzteren mit Hilfe eines Enzyms. Die Bestimmung der enzymatischen Aktivität des Reaktionsmediums nach Fixierung der zu fixierenden Substanz am fixierenden Protein erfolgt bei solchen Verfahren eine mehrstufige Zentrifugierung, die die Dauer der Bestimmung wesentlich verlängert. Solche Verfahren können eine nichtausreichende Empfindlichkeit besitzen, da die Abtrennung der unlöslichen Teilchen aus dem Reaktionsmedium schwer zu realisieren ist und zwar insbesondere aufgrund der Natur und des Molekulargewichtes der fixierenden Substanz.
Es sind weiterhin Verfahren zur Bindung von Enzymen auf magnetischen Trägern bekannt (Biotechnology and Bioengineering, Vol. XV (197.3) und Biotechnology and Bioengineering Vol. XVI, p. 385-396 (1974). Bei diesen Verfahren wird das Enzym direkt auf den magnetischen Träger fixiert und man kann auf diese Weise industriemässig hergestellte Enzyme beispielsweise aus Fermentationsvorrichtungen verwenden. Ihre Konservierung, Wiedergewinnung und Wiederverwendung ist nicht schwierig.
Überraschenderweise konnte ein magnetisches Gel entwickelt werden, das sich für immunoenzymatische Bestimmungen und gegebenenfalls für radio— immunologische Bestimmungen eignet.
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Das Gel nach der vorliegenden Erfindung ist ein Acrylamidgel oder ein Agarosegel oder ein gemischtes Gel aus Acrylamid-Agarose, das magnetische Teilchen enthält. Acrylamidgele, Agarosegele und gemischte Gele aus Acrylamid-Agarose sind bekannt und sind bereits verwendet worden als Wände runqst rag er für die elektrophoretische Auftrennung von biologischen Substanzen oder für immunochemüsche Analysemethoden in einem gelierten Medium (französisches Patent FR 1 483 742).
Die magnetischen Gele nach der Erfindung werden in bekannter Weise hergestellt, indem die magnetischen Teilchen im Verlauf der Bildung des Gels eingebaut werden und insbesondere inmitten der Ausgangsmaterialien, die für die Herstellung verwendet werden.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens nach der Erfindung kann man ein magnetisches Mischgel aus Acrylamid-Agarose herstellen unter Verwendung des Verfahrens , das von Uriel et al (C. R. Acad.. Soc. Paris, 273, Seiten 2358-2360, 1971, Serie D) beschrieben wird, bei dem die entsprechend der Erfindung zugesetzten magnetischen Teilchen dem Acrylamid—Monomer zugesetzt werden. Die entsprechend der vorliegenden Erfindung verwendeten magnetischen Gele besitzen vorzugsweise eine sphärische bzw. kugelige Form mit einer Korngröße zwischen 50 und 500 um.
Die in dem Gel nach der Erfindung eingebauten magnetischen Teilchen bestehen beispielsweise aus Magnetit—Teilchen, aus Ferritteilchen oder aus Eisenpulver. Vorzugsweise werden Magnetit-Teile hen verwendet. Die Menge der magnetischen Teilchen, die in die Gele nach der Erfindung eingebaut werden, ist nicht kritisch. Sie muß jedoch ausreichend sein, urn eine gute Abtrennung des Gels aus einem flüssigen Reaktionsmedium mittels eines Magnets zu ermöglichen. Beispielsweise
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QRiGiUMA!, INbPECTED
würde eine Menge in der Größenordnung von 20 g Maqnetit für 10 g Äcrylamid-Monomer und 0,25 q rjisacrylamid ausreicnen, wenn das Gel ein Polyacrylarnid-Agar-jse-Gt L ist, das nach den oben beschriebenen Verfahren hergestellt worden ist.
Das so hergestellte magnetische GeL kann anschließend mit einem Protein gekoppelt werden und zwar mit Hilfe eines auf diesem Gebiet üblichen Kupplungsmittel. Beispielsweise kann als KopplungsmitteT Glutaraldehyd verwendet werden.
Die Kopplung der Proteine mit dem magnetischen Gel nach der Erfindung wird in vorteilhafter Weise erreicht nach dem Verfahren von T. Ternynck und S. Avrameas (F.E. B.S., Briefe 23, 24, 1972).
Das mit einem Protein, wie beispielsweise einem Antikörper oder einem Antigen gekoppelte magnetische Gel nach der Erfindung kann für eine immunoenzymatische Bestimmung des Antikörpers verwendet werden oder für das entsprechende Antigen, Ein weiteres Ziel der Erfindung ist dieser magnetische Gel-Protein—Komplex. Das magnetische Gel nach der Erfindung wird in äer folgenden Beschreibung anhand eines magnetischen Gels dargestellt, das mit einem Antigen gekoppelt ist.
Nach einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird die Bestimmung des Antikörpers, der in einer biologischen Flüssigkeit enthalten ist, in der folgenden Weise durchgeführt.
Eine bestimmte Menge des mit einem Antigen gekoppelten magnetischen Gels wird mit der biologischen Flüssigkeit in Kontakt gebracht, die den zu bestimmenden Antikörper enthält. Nach einer Inkubierungszeit von etwa 1/2 bis zu 1 Stunde wird das Gel mehrere male mit einem Phosphatpuffer gewaschen, indem man das Gel entlang der Wand des
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ORiGSMAL !NSPEGTSD
λ.
Reagenzglases mittels eines Magnetfeldes festhält. Dies ist möglich aufgrund der Tatsache, daß im Gel magnetische Teilchen enthalten sind. Auf diese Weise werden die bei den herkömmlichen Bestimmungsvei— fahren dieser Art notwendigen Zentrifugierungen nach jeder Auswaschung vermieden. Nachdem diese Waschungen durchgeführt worden sind, wird das Gel etwa 30 Minuten lang in Gegenwart des Antikörpers inkubiert, der mittels eines Enzyms markiert worden ist. Die Markierung des Antikörpers wird in herkömmlicher Weise durchgeführt. Dazu werden Enzyme verwendet, die in bekannter Weise bei immunoenzymatischen Bestimmungen benutzt werden, wie beispielsweise Glucoseoxydase und Peroxy das e.
Nach der Inkubierung des Gels in Gegenwart des mit einem Enzym markierten Antikörpers misst man die enzymatische Aktivität .des Gels, nachdem man den Überstand eliminiert hat. Dies geschieht, indem man das Gel an der Wand des Reagenzglases mittels eines Magnetfeldes festhält. Die enzymatische Aktivität wird bestimmt durch Ablesen der optischen Dichte. Die Bestimmungsdauer liegt bei etwa 2 Stunden. Bei der Verwendung eines Gels nach der Erfindung können die herkömmlichen immunoenzymatischen Bestimmungen etwa auf ein Viertel der sonst üblichen Zeitdauer reduziert werden.
Die magnetischen Gele nach der Erfindung können insbesondere verwendet werden für die Bestimmung der Immunoglobuline (IgE), die antimedikamentös, antiallergisch und antiparasitär sind, sowie für die Be-Stimmung der IgM, die spezifische Antirötel-Mittel sind und es ermöglichen, frische Röteln während der Schwangerschaft nachzuweisen. Die magnetischen Gele nach der Erfindung ermöglichen ebenfalls die schnelle Bestimmung von Antikörpern, Tetanus-Antitoxine (wie beispielsweise bei Unfällen) oder Anti-ADN-Antikörper, (beispielsweise im Falle von LupuserythematoiJus =. )
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Fs ist ebenfalls möglich die Spezifität bzw. Eigentümlichkeit der Anti-Pollenallergie, wie beispielsweise von Gräsern (wie beispielsweise Dactyle, Irraie, Seigle, Fleole) nachzuprüfen und die Intensität der humoralen Reaktion zu messen ( Menge der starken und schwachen spezifischen IgE).
Das magnetische Gel nach der Erfindung kann Teil eines Reaktionssatzes für imm.jnoenzymatische Bestimmungen sein. Ein solcher Reaktionssatz kann aus folgenden Bestandteilen zusammengesetzt sein:
1) Magnetisches Gel, gekoppelt mit einem Antigen oder einem Antikörper
2) ein Puffer
3) ein bezüglich des zu untersuchenden Antigens spezifischer Antikörper oder ein bezüglich des zu untersuchenden Antikörpers spezifisches Antigen, jeweils mit einem Enzym gekoppelt
4) ein Magnet
5) ein Substrat des Enzyms zum Feststellen seiner enzymatischen Aktivität und
6) normales Nachweisserum.
Der Reaktionssatz kann weiterhin Vorrichtungen enthalten, mit denen man eine Serie von Verbindungslösungen des zu untersuchenden Musters herstellen kann.
Bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung werden in den folgenden Beispielen im einzelnen erläutert.
Beispiel 1
a) Herstellung eines ferromagnetischen Polyacrylamid-Agarose-
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-V-
Man verwendete das von Uriel et al (CR. Acad. Sc. Paris, t, 273, 2358-2360, 1971 Serie D) beschriebene Verfahren.
Es wurden 50 g Γ.λ, O^ tür ^x-hn Gramm Acrylamidmonnrner und 0,25 g Bis-Acrylamid und 5 g Agarose verwendet. Das Magnetit wurde zu der Lösunq aus Acrylamid und Bisacrylamid zugesetzt, bevor diese mit der Lösuno vermischt wurden, die die Agarose enthielt.
b) Kopplung der Proteine auf dem so herwe.v. eilten magnetischen Gel.
Das in der oben beschriebenen Weise hergestellte Gel wurde mit den Proteinen gekoppelt mit Hilfe von Glutaraldehyd mit der von T. Ternynck und S. Avrameas beschriebenen Verfahren (FEBS Letters 23_, 24, 1972).
Folgende Proteine wurden fixiert:
1) Ig Schaf
2) Schafantikörper, Anti-Ig von Hasen
3) Tetanus-Aiatoxin
4) Rinderalbumin
Die fixierten Mengen dieser Substanzen werden im folgenden als
O _
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f-unktion der Größe der magnetischen Gelteilchen angegeben.
Durchmesser Menge Menge Menge Menge des
der ferro- des am der des fixierten
magnetischen Schaf Anti- fixier- Rinderalbumins
Polyacrylamid- fixier ' körper ten
Agarose ten Iq vorn Anatoxin
Teilchen Schaf —Tetanus
Anti-Ig
vomSchaf
fixiert
500 250 μιτι 1, 5 mg/ml
250 125 /Lim 3, 1 mg/ml
125 63 ,um 3, 1 mg/ml 2,1 mg/ml 0,75 mg/ml 1,4 mg/ml
Beispiel 2
Bestimmung der Antikörper:.
In jedes Reagenzglas , das 50 "jul des auf dem magnetischen Gel
fixierten Antigen enthielt, wurden 1 ml einer Irmmunoserumiosung oder eines normalen Testserums gegeben.
Nach einer Inkubationszeit nach einer Stunde bei 20 C wird das Gel dreimal mit einem Phosphatpuffer (PBS) gewaschen. Das Gel wird während der Waschungen mittels eines Magnetes an der Wand des Reagenzglases festgehalten.
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Anschließend wird das Gel 30 Minuten lang in Gegenwart, der Antiim'munoglobulin-Antikörper, die mit Glukoseoxydase markiert sind, inkubiert.
Die enzymatische Reaktion wird mit dem Gel nach drei weiteren Waschungen mit PE3S durchgeführt.
Die Ablesung der optischen Dichte wird bei 400 nm durchgeführt und zwar 10 Minuten nach der enzymatischen Reaktion bei Raumtemperatur. Die dabei gemessene enzymatische Aktivität wurde mit der enzymatischen Aktivität von normalem Serum verglichen.
Als Gel wurde magnetisches Gel verwendet, das mit Schafs-Ig gekoppelt worden war und entsprechend Beispiel 1 hergestellt worden war. Dieses Gel wurde nach der oben angegebenen Verfahrensweise mit Kaninchen-Immunoserum Anti Ig vom Schaf inkubiert und es wurde die optische Dichte des Gels für verschiedene Verdünnungen dieses Immunoserums gemessen. Die dabei erhaltenen Ergebnisse sind in der beiliegenden Grafik dargestellt. Auf der Ordinate ist die bei 400 nm gemessene optische Dichte angegeben und auf der Abszisse die Verdünnungen. Die Kurve (A) bezieht sich auf das Immunoserum und die Kurve (B) bezieht sich auf ein normales Serum, das als Vergleichsserum verwendet wurde.
Man erhielt analoge Ergebnisse, wenn man ein Gel verwendete, das mit einem nach Beispiel 1 hergestellten Rinderalbumin gekoppelt war und mit einem Kaninchen-Immunoserum - Rinderalbuminantiserum.
Die Empfindlichkeit der nach der Erfindung durchgeführten Bestimmung
- 10 -
709825/0879 original
lieql bei (-!-λa 50 nc; Antikörper je ml.
Patentanspruch e:
- 11 -
7 0 9 8 2 5/0879 OR1GINAL

Claims (9)

  1. Patentansp rüche
    rTT\ Magnetisches Gel für immunoenzymatische Bestimmungen, dadurch gekennzeichnet, daß es aus Polyacrylamid und/oder Agarose besteht, die magnetische Teilchen enthalten.
  2. 2. Magnetisches Gel nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die magnetischen Teilchen aus Magnetitteilchen, Ferritteilchen oder aus einem Eisenpulver bestehen.
  3. 3. Magnetisches Gel nach Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Gel mit Hilfe eines Kupplungsmittels mit einem Protein gekoppelt ist.
  4. 4. Magnetisches Gel nach Ansprüchen 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß das Kupplungsmittel Glutaraldehyd ist.
  5. 5. Magnetisches Gel nach Ansprüchen 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß das Gel ein Polyacrylamid-Agarosegel ist, die magnetischen Teilchen aus Magnetitteilchen bestehen und das Gel mit einem Protein gekoppelt ist wie ein Antigen oder ein Antikörper mittels Glutaraldehyd.
  6. 6. Immunoenzymatisches Bestimmungsverfahren für biologische Flüssigkeiten, die Antikörper oder Antigene enthalten, unter Verwendung des magnetischen Gels nach Ansprüchen 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß das nach Ansprüchen 3 bis 5
    709825/0879 - 12 -
    ORIGINAL
    hergestellte magnetische Gel mit der biologischen Flüssigkeit inkubiert wird, anschließend das Gel nach dem Waschen mit Antikörper oder Antigen inkubiert wird, die mit Hilfe eines Enzyms markiert worden sind, und die enzymatische Aktivität des Gels bestimmt wird, wobei die Abtrennungen des Gels nach jedem Waschen mit Hilfe eines Magnetfeldes realisiert wird.
  7. 7. Immunoenzymatisches Bestimmungsverfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß es für die Bestimmung von Allergenen, Tetanus-Anatoxinen und anderen Antigenen verwendet wird.
  8. 8. Reaktionssatz für die Durchführung von immunoenzymatischen Bestimmungsverfahren nach der Erfindung, gekennzeichnet
    1) ein magnetisches Gel, das mit einem Antigen oder einem Antikörper gekoppelt ist,
    2) einem Puffer
    3) einem bezüglich des zu untersuchenden Antigens spezifischem Antikörper oder einem bezüglich des zu untersuchenden Antikörpers spezifischen Antigen, die jeweils mit einem Enzym gekoppelt sind,
    4) einem Magnet
    5) einem Substrat des En zyms zur Feststellung seiner enzymatischen Aktivität, und
    6) einem normalen Nachweisserum.
  9. 9. Verfahren zur Herstellung eines magnetischen Gels nach Ansprüchen 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß die magnetischen Teilchen in die Ausgangsmaterialien eingebaut werden, die verwendet werden, um das Gel herzustellen.
    709825/0879
DE2654723A 1975-12-02 1976-12-02 Magnetischer Festphasenträger für immunologische Bestimmungen sowie ein Verfahren zu dessen Herstellung Expired DE2654723C2 (de)

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