DE2655084C2

DE2655084C2 -

Info

Publication number: DE2655084C2
Application number: DE2655084A
Authority: DE
Inventors: Stratis Prof. La Celle Saint Cloud Yvelines Fr Avrameas; Therese Paris Fr Ternynck
Original assignee: Institut Pasteur de Lille
Current assignee: Institut Pasteur de Lille
Priority date: 1975-12-05
Filing date: 1976-12-04
Publication date: 1989-12-14
Also published as: FR2334107A1; FR2334107B1; SE440149B; BE848943A; SE7909965L; SE7613498L; US4193982A; DE2655084A1; US4925921A; SE440830B; US4592998A

Description

Die Erfindung betrifft das im Anspruch 1 angegebene Verfahren zum Koppeln zweier biologischer Substanzen aneinander durch kovalente Bindungen. Die Ansprüche 2 und 3 betreffen Ausgestaltungen des Verfahrens und Anspruch 4 betrifft eine Anwendung des Verfahrens. Z. B. können Proteinen, Glycoproteinen, Polysacchariden, Nucleinsäuren, rote Blutkörperchen und andere biologische Substanzen durch kovalente Bindungen gekoppelt werden. Spezieller befaßt sich die Erfindung mit dem Koppeln von Makromolekülen aneinander oder an rote Blutkörperchen.

Die FR-PSen 74 19 100 und 74 34 519 und "Immunochemistry" 11, Seiten 261 bis 269 (1974) beschreiben ein Koppeln von zwei Proteinen, wie z. B. eines Antikörpers und eines Enzyms, aneinander mit einem Kopplungsmittel, wie z. B. Glutardialdehyd, sowie das Koppeln eines Hormons, wie z. B. Progesteron, und eines Enzyms, wie z. B. der β-D-Galactosidase, aneinander unter Verwendung von Carbodiimid.

Die US-PS 33 22 634 beschreibt ein Verfahren zur Bindung eines Antigens an rote Blutkörperchen, indem letztere zunächst mit einem Polyphenol oder Chinon und anschließend einem Aldehyd behandelt und schließlich in so aktiviertem Zustand mit dem Antigen gekoppelt werden. Die Umsetzung erfolgt nicht in homogener Lösung, und es finden sich keine Angaben über das Molverhältnis der Reaktionspartner.

Die ältere deutsche Patentanmeldung P 26 15 349.1 schlägt ein Verfahren zum Immobilisieren von Antigenen, Enzymen und Enzyminhibitoren vor, indem man sie ohne Koppeln und nur mit Chinon oder aber mit einem an eine unlösliche Substanz gebundenen Chinon in heterogener Lösung umsetzt.

In einem Artikel in "Archives of Biochemistry and Biophysics" 134, Seiten 515 bis 523 (1969) ist gezeigt, daß Benzochinon sehr langsam mit Aminosäuren reagiert, und untersucht die Bindung des Benzochinons auf Cytochrom C. Das Molverhältnis von Benzochinon zu Protein ist dabei maximal 10 : 1.

Schließlich beschreibt "Biochimica et Biophysica Acta" 386, Seiten 196 bis 202 (1975) ein Verfahren zur Bindung von Proteinen auf festen Polysacchariden unter Verwendung von Benzochinon. Das Verfahren arbeitet auch in heterogener Lösung und nennt keine Molverhältnisse des Benzochinons.

Die der Erfindung zugrundeliegende Aufgabe bestand nun darin, zwei biologische Substanzen unter Ausbildung kovalenter Bindungen unter hoher Kopplungsausbeute und Beibehaltung eines hohen Anteils der biologischen Aktivität der Makromoleküle aneinander zu koppeln.

Erfindungsgemäß ist das Verfahren zum Koppeln zweier biologischer Substanzen aneinander durch kovalente Bindungen, indem man die erste Substanz mit Benzochinon aktiviert, die aktivierte Substanz vom Benzochinonüberschuß trennt und sodann mit der zweiten Substanz in Berührung bringt, dadurch gekennzeichnet, daß man die erste Substanz in homogener Lösung mit einem Molverhältnis des Benzochinons zu der zu aktivierenden Substanz von mindestens 200 aktiviert.

Die erste Stufe des Verfahrens erfolgt unter Behandlung der ersten Substanz, wie z. B. eines Proteins, die in einem geeigneten Milieu gelöst ist, mit dem gelösten Benzochinon.

Als Lösungsmittel kann man irgendein Lösungsmittel oder Gemisch von organischen Lösungsmitteln, die mit Wasser mischbar sind und in denen das Benzochinon löslich ist, benutzen. Man verwendet wasserhaltige Medien, in welchen die erste Substanz, wie z. B. ein Protein, löslich ist, zweckmäßig solche, deren pH-Wert zwischen etwa 5,5 und 9 liegt, wobei der optimale pH-Wert zwischen 6 und 6,2 liegt.

Ein zweckmäßiges Lösungsmittel für das Benzochinon ist ein niederer aliphatischer Alkohol, wie z. B. Ethanol.

Die Umsetzung mit dem Benzochinon erfolgt bei einer Temperatur, die vorzugsweise 22°C nicht übersteigt, bis das Kopplungsmittel an der zu aktivierenden Substanz, wie z. B. dem Protein, fixiert ist, z. B. während einer Dauer von einigen Minuten bis zu 24 h, insbesondere während etwa einer halben Stunde.

Die Größe des Benzochinonüberschusses ist dabei ein entscheidendes Merkmal für die Erfindung. Bei zu geringen Werten erfolgt die Aktivierung nicht oder praktisch nicht. Sie ist dann unzureichend, um die Kopplung zu ermöglichen. Vorzugsweise liegt das Molverhältnis von Benzochinon zu der zu aktivierenden Substanz über 1000, z. B. bei 2500.

Die Trennung der so aktivierten Substanzen von dem Benzochinonüberschuß kann zum Beispiel mit einer Kolonne für Molekularfiltration (Molekularsieb) erfolgen.

Die Betriebsbedingungen der anschließenden Kopplung mit der zweiten Substanz sind relativ wichtig. Die Kopplungszeit liegt gewöhnlich bei 1 bis 48 h. Man arbeitet bei einer Temperatur unterhalb 22°C oder oberhalb 4°C, wobei die ausreichende Zeit 24 h bei 22°C und 48 h bei 4°C beträgt. Die Kopplung erfolgt in vorteilhafter Weise in einem Lösungsmittel für Substanzen, wenn diese löslich sind, wie im Falle der Proteine, und zwar in einem Puffermilieu. Die Kopplung erfordert einen leicht alkalischen pH-Wert zwischen 8 und 9, und die Gegenwart von Carbonationen ist bevorzugt. Man arbeitet im allgemeinen mit einem Überschuß an markierter Substanz mit Rücksicht auf die andere Substanz. Es ist möglich, eine Kopplung mit äquimolaren Mengenverhältnissen der zu koppelnden Substanzen zu erhalten. Gewöhnlich arbeitet man jedoch mit einem molaren Überschuß einer der Substanzen, besonders mit einem molaren Überschuß von 1 bis 8 Mol.

Indessen kann man je nach Wunsch einen Überschuß der mit Benzochinon behandelten Substanz gegenüber der zu koppelnden Substanz oder umgekehrt verwenden. Somit liegen die Molverhältnisse zweckmäßig zwischen 1 und 4.

Das Verfahren nach der Erfindung ist insbesondere in dem Falle geeignet, wenn eines der Proteine ein Antikörper und das andere Protein ein Enzym ist.

Als Benzochinon kann man das ortho- oder para-Isomere oder ein Gemisch von beiden benutzen. Indessen ist bevorzugt, das para-Benzochinon zu verwenden. Mit diesem bekommt man erhöhte Kopplungsausbeuten, die über 30% liegen und 65% oder mehr je nach den verwendeten Proteinen erreichen können.

Das Verfahren gemäß der Erfindung kann verwendet werden, um durch Koppeln von Antikörper mit Enzymen Antikörper und Antigene aufzufinden und zu titrieren.

Bei einem pH-Wert von 6 bindet sich das Benzochinon auf den Proteinmolekülen unter Bildung von monosubstituierten Derivaten, und man benötigt einen alkalischen pH-Wert, um die zweite Reaktion zu ermöglichen, entweder mit einem anderen Molekül desselben Proteins unter Polymerbildung oder mit einem anderen Molekül eines anderen Proteins unter Bildung von Konjugaten. Dadurch kann das Benzochinon in Kopplungsreaktionen verwendet werden, die in zwei Schritten erfolgen und auf diese Weise vollkommen kontrollierbar sind.

Das Verfahren nach der Erfindung kann auch für die Kopplung von Makromolekülen, wie roten Blutkörperchen, verwendet werden; denn die Verwendung von Benzochinon als Verbrückungsmittel erlaubt Reaktionen, deren Empfindlichkeit erheblich über derjenigen liegt, die zuvor mit anderen Bindungsmitteln, z. B. mit dem Glutaraldehyd, erhalten wurde.

Es wird angenommen, daß die durch das Verfahren gemäß der Erfindung erhaltenen Resultate auf der Tatsache beruhen, daß das Benzochinon mit anderen Gruppierungen reagiert als Aminogruppierungen.

Beispielsweise kann man sich für das Titrieren von Antikörpern oder Antigenen durch Hämolyse den Vorteil der Eigenschaft roter Blutkörperchen zunutze machen, einer Hämolyse zu unterliegen und sich durch eine Färbung des flüssigen Titriermilieus zu zeigen. Diese Titriertechnik ist erfindungsgemäß möglich, da das Verfahren in homogener Lösung arbeitet.

Die Verwendung von Benzochinon als Kopplungsmittel erlaubt sehr viel anpassungsfähigere und weitere Anwendungen als die bekannten Kopplungsmittel, wie z. B. der Glutaraldehyd, mit dem insbesondere die Reaktionsdauer, der pH-Wert, die Konzentration des Glutaraldehyds und die Molverhältnisse von Glutaraldehyd zu Protein sehr sorgfältig gesteuert werden müssen.

Andererseits erlaubt der Glutaraldehyd nicht, biologische Substanzen zu aktivieren, wie z. B. Polysaccharide und Nucleinsäuren. Seine Verwendung ist auf freie Aminosäuren oder auf Trägersubstanzen von Aminosäuregruppen beschränkt. Der Glutaraldehyd ist also in seinen Anwendungen begrenzt.

Im Gegensatz hierzu ist das Benzochinon ein Kopplungsmittel, welches man allgemein anwenden kann. Beispielsweise kann die Aktivierung von Proteinen, Glycoproteinen oder Polysacchariden ohne das Risiko der Bildung eines Polymers 1 h lang bei einem pH-Wert von 6 durchgeführt werden.

Die erfindungsgemäß zu koppelnden biologischen Substanzen sind zweckmäßig Proteine, Glycoproteine, Polysaccharide, Nucleinsäuren oder rote Blutkörperchen.

Die eine biologische Substanz ist zweckmäßig ein Protein, vorzugsweise ein Enzym, z. B. Peroxydase, Alkaliphosphatase, Glucoseoxydase, β-Galactosidase oder Lactoperoxydase, ein Antikörper oder Fab-Antienzym oder Antivirus, und die andere biologische Substanz ein Protein, wie ein Antikörper oder Antigen, Blutkörperchen, eine Nucleinsäure oder ein Polysaccharid.

Auch kann man einen Antikörper oder ein Fragment Fab des Antikörpers mit dem Benzochinon aktivieren und dann durch Kopplung eine andere Substanz daran fixieren, die zum Markieren und als Titrierreagens dient.

Eine andere Anwendung der Erfindung besteht in der Bindung von Antikörpern an nicht chemisch behandelte rote Blutkörperchen, welche die Eigenschaft, lysiert zu werden, beibehalten und so einen Nachweis der entsprechenden Antigene ermöglichen, die z. B. in einer flüssigen zu untersuchenden Probe zugegen sind. Die Erfindung läßt sich auch bei der Titration von Antitetanusantikörpern und Anti-DNA-Antikörpern in menschlichem Serum anwenden.

Beispiele I. Kopplung von Proteinen oder Glycoproteinen mit Makromolekülen Beispiel 1

Kopplung von Antikörpern eines Hammels an Ig von Mäusen oder ihres Fragmentes Fab an Enzyme, wie z. B. die Peroxydase, die Glucoseoxidase und die Alkaliphosphatase, die Lactoperoxidase, die β-Galacttosidase.

IA. Aktivierung des Proteins Beispiel IA1

5 mg Peroxidase (oder andere Proteine) werden in 0,8 mg 0,1 M Phosphatpuffer von pH 8 aufgelöst. Das Benzochinon wird in der Form einer Lösung von 6 mg in 0,2 mg Ethanol zugegeben. Die Reaktion wird bei 22°C 20 min lang bei Dunkelheit durchgeführt. Der Chinonüberschuß und die Produkte der Reaktion werden von der aktivierten Peroxidase auf einer Molekularsiebkolonne (0,9 × 5 cm) abgetrennt, die mit 0,1 M Natriumbicarbonat äquilibriert ist.

Beispiel IA2

Man löst 5 mg Peroxidase oder andere Proteine in 0,8 mg 0,1 M Phosphatpuffer von pH 6. Das Benzochinon wird in der Form einer Lösung von 6 mg/0,2 ml Ethanol zugegeben. Die Reaktion erfolgt bei 22°C während 1 h in der Dunkelheit. Der Chinonüberschuß und die Produkte der Reaktion werden von der aktivierten Peroxidase auf einer Molekularsiebkolonne (0,9 × 5 cm) abgetrennt, die mit 0,1 M Natriumbicarbonat äquilibriert ist.

IB. Kopplung von Proteinen untereinander Beispiel IB1

5 mg gemäß Beispiel IA2 aktivierte Peroxidase in 1 ml 0,1 M Natriumbicarbonatlösung werden mit 5 mg Fab (oder 20 mg Antikörper) in einer Lösung von 5 mg/ml in 0,1 M Natriumbicarbonatlösung gekoppelt. Die Kopplung erfolgt während 24 h bei einer Temperatur unterhalb 22°C oder während 48 h bei 4°C.

Die Kopplungsausbeuten zeigen, daß ungefähr 30% Fab mit 30% Peroxidase gekoppelt werden, wenn die Proteine in einem Molverhältnis von 1 : 1 zum Reagieren gebracht werden, daß aber der Prozentsatz bis auf 65% steigt, wenn ein Molekül Fab mit 4 Molekülen "aktivierter" Peroxidase zum Reagieren gebracht wird.

Beispiel IB2

5 mg alkalische Phosphatase, die gemäß Beispiel IA2 aktiviert ist, wird mit 2,5 mg Fab (oder 10 mg Antikörper) unter den gleichen Bedingungen wie bei Beispiel IB1 zur Kopplung gebracht.

Beispiel IB3

5 mg Glucoseoxidase, die gemäß Beispiel IA2 aktiviert ist, wird mit 1,25 mg Fab (oder 5 mg Antikörper) unter den gleichen Bedingungen zur Kopplung gebracht.

Man erhält identische Resultate, wenn man als Variante zunächst die Aktivierung von Antikörpern und dann die Kopplung mit dem Enzym durchführt.

Beispiel IB4

Man koppelt 5 mg Antikörper oder 1,25 mg Fab Antikörper mit 5 mg aktivierter Peroxidase. Die erhaltene Ausbeute, d. h. der Prozentsatz aktiviertes Fab, welches auf dem Enzym fixiert ist, beträgt praktisch 75%, wenn man nach der Technik gemäß Beispiel IB1 arbeitet.

Andere Versuche sind unter den gleichen Bedingungen mit Glucoseoxidase und der Alkaliphosphatase, der β-Galactosidase und der Lactoperoxidase durchgeführt worden. Es wurden ähnliche Resultate wie die mit Peroxidase erhalten, wenn man in jedem Falle ungefähr 4 Moleküle Enzym für 1 Molekül aktiviertes Fab verwendete.

Beispiel IB5

1,25 mg aktiviertes Fab gemäß Beispiel IB2 werden mit 5 mg Fab-Antiperoxidase gekoppelt. In diesem Falle kann die Fab- Antiperoxidase als Markierer dienen, wenn man sie mit der Peroxidase nach der Kopplungsreaktion Fab-Fab Anti-PO mit dem Antigen in Berührung bringt.

Die Enzyme und die mit dem Benzochinon behandelten Antikörper behalten mehr als 65% ihrer Aktivität.

Die verschiedenen bei Beispiel 1 erhaltenen Zusammensetzungen werden mit Erfolg verwendet, um die durch die Lymphzellen immunisierender Tiere abgesonderten Immunoglubuline nachzuweisen. Die verwendete Technik ist folgende:

Die von der Ratte oder von den Lymphdrüsen der Maus stammenden Zellen erhalten einige Tage vorher eine Antigeninjektion und werden dann auf dem Objektträger eines Mikroskops ausgebreitet und dann mit dem Fragment Fab Anti-Ig der Maus, welches mit dem Enzym gekoppelt ist, inkubiert. Nach der Wäsche läßt sich das Enzym durch seine spezifische cytochemische Reaktion ermitteln. Die erhaltene Färbung gestattet die Lokalisierung der Reaktionsstelle des Fab unter dem Mikroskop. Durch ein Verfahren mit sukzessiver Auflösung des Fab, welches mit dem Enzym gekoppelt ist, kann man die Aktivität dieser Kopplungen im Hinblick auf jene vergleichen, die mittels Glutaraldehyd erhalten wird. Die Empfindlichkeit dieser zwei Reagentien auf gleiche Antikörperkonzentrationen ist identisch. Im Hinblick auf den Prozentsatz erhaltener Kopplung sieht man, daß das erfindungsgemäße Verfahren dem bekannten Verfahren mit der Verwendung von Glutaraldehyd überlegen ist.

II. Kopplung von Polysacchariden mit Makromolekülen Beispiele 2 und 3

Kopplung von Polysaccharid T von Salmonella typhi mit Enzymen.

Beispiel 2

Kopplung durch Aktivierung von Polysaccharid.

2A. Aktivierung von Polysaccharid

1 mg Polysaccharid T wird in 0,8 ml 0,1 M Phosphatpuffer von pH 6 gelöst. Das Benzochinon wird in der Form von 6 mg in 0,2 ml Ethanol zugegeben. Die Reaktion erfolgt bei 22°C während 1 h in der Dunkelheit. Der Chinonüberschuß wird durch Filtration auf einer Molekularsiebkolonne wie im Beispiel IA2 vom aktivierten Polysaccharid abgetrennt.

2B. Kopplung von Polysaccharid T mit dem Enzym

1 mg aktiviertes Polysaccharid T in 1 ml 0,1 M-Natriumbicarbonatlösung wird mit 2 mg alkalischer Phosphatase (oder einem anderen Enzym) in 0,2 ml 0,1 M-Natriumbicarbonatlösung gekoppelt. Die Kopplung erfolgt während 24 h bei Labortemperatur.

Beispiel 3

Kopplung durch Aktivierung des Enzyms.

3A. Aktivierung des Enzyms

Man arbeitet auf die gleiche Weise wie bei Beispiel IA2 unter Verwendung eines Enzyms, welches Peroxidase, Alkaliphosphatase oder Glucoseoxidase ist.

3B. Kopplung des Enzyms mit Polysaccharid

1 mg aktiviertes Enzym gemäß Beispiel 3A in 0,2 ml 0,1 M Natriumbicarbonatlösung wird mit 0,1 mg Polysaccharid in 0,1 ml 0,1 M Natriumbicarbonatlösung zur Kopplung gebracht. Die Kopplung erfolgt während 24 h bei Labortemperatur.

III. Kopplung von Nucleinsäuren mit Makromolekülen Beispiele 4 und 5

Kopplung von ADN mit einem Enzym.

Beispiel 4

Kopplung durch Aktivierung von ADN.

4A. Aktivierung von ADN

1 mg ADN wird in 0,7 ml 0,1 M Phosphatpuffer bei pH 6 gelöst. Das Benzochinon wird in Form von 6 mg in 0,2 ml Ethanol zugegeben. Die Reaktion erfolgt bei 22°C während 1 h in der Dunkelheit. Das Gemisch wird auf einer Molekularsiebkolonne filtriert wie in Beispiel 1A.

4B. Kopplung von aktivierter ADN mit der Peroxidase

1 mg aktivierte ADN in 1 ml 0,1 M Phosphatpuffer mit pH 8 wird mit 1 mg Peroxidase in 0,1 ml 0,1 M Phosphatpuffer mit pH 8 zur Kopplung gebracht. Die Kopplung erfolgt während 24 h bei Labortemperatur.

Beispiel 5

Kopplung durch Aktivierung des Enzyms.

5A. Aktivierung des Enzyms

Man arbeitet in der gleichen Weise wie bei Beispiel 1A2 unter Verwendung eines Enzyms, welches Peroxidase, Phosphatase oder Glucoseoxidase ist.

5B. Kopplung von Enzym mit ADN

1 mg aktiviertes Enzym gemäß Beispiel 5A in 0,2 ml 0,1 M Phosphatpuffer wird mit 1 mg ADN in Lösung in 0,1 M Phosphatpuffer mit pH 8 zur Kopplung gebracht.

IV. Kopplung von Makromolekülen mit roten Blutkörperchen Beispiel 6

Das Verfahren gemäß der Erfindung wird bei der Kopplung von Proteinen, Glycoproteinen und aktivierten Polysacchariden mit roten Blutkörperchen mit dem Ziel angewendet, Hämagglutinations- oder Hämolysereaktionen zu bekommen.

6A. Aktivierung von Proteinen oder des Polysaccharids

Diese Aktivierung wie auch die Filtration auf Molekularsieb erfolgen wie zuvor in Beispiel IA1 beschrieben.

6B. Kopplung von Makromolekülen mit roten Blutkörperchen

1 mg Proteine oder Polysaccharide, die gemäß Beispiel 6A aktiviert sind, in 1 ml 0,1 M Natriumbicarbonatlösung wird zu 0,25 ml Bodensatz gewaschener roter Blutkörperchen zugegeben. Nach 2 h Rühren bei Labortemperatur sind die roten Blutkörperchen dreimal in dem Milieu gewaschen, welches der Hämagglutations- oder Hämolysereaktion dienen wird.

Die unterschiedlichen Vorbereitungen werden getroffen, um einerseits die Gegenwart von Antikörpern oder Antigenen in biologischen Flüssigkeiten und andererseits die Sekretion der Zellen durch geeignete Verfahren nachzuweisen.

a) Titrierung von Antikörpern durch Hämagglutination oder Hämolyse Beispiel: Dosierung von Antitetanus-Antikörpern im menschlichen Serum

Zu filtrierendes Antiserum wird nach und nach mit zunehmenden Volumenanteilen (0,05 ml) in einem Puffer gelöst, der Mg⁺⁺ und Ca⁺⁺⁺ notwendig für die Hämolysereaktion enthält. Die mit dem Tetanusgift durch das Benzochinon sensibilisierten roten Blutkörperchen werden (0,01 ml einer Lösung mit 5%) zugegeben, und die Cuvetten werden gerührt, um die roten Blutkörperchen gut freizulegen. Nach 45 min bei 37°C ist die Hämagglutinationsreaktion gut sichtbar. Wenn man dann Ergänzungsstoff zugibt, findet die Hämolyse der roten Blutkörperchen 45 bis 60 min später bei 37°C statt.

b) Titrieren eines Antigens durch Hämagglutation oder Hämolyse Dosierung von IgG in Mäuseserum

Das Mäuseserum wird wie das Antiserum in Beispiel a aufgelöst. Die mit den Antikörpern oder dem Fragment Fab von Antikörpern sensibilisierten roten Blutkörperchen werden wie in Beispiel a zugegeben. Nach 25 min bei 37°C wird die Agglutinationsreaktion sichtbar. Man kann mit der Hämolyse durch Zugabe von Ergänzungsstoff wie in Beispiel a fortfahren.

c) Nachweis der Sekretion von Proteinen durch die Zellen durch örtliche Hämolyse Nachweis der Sekretion von Antikörper durch die Immunocyten

Die örtliche Hämolysereaktion erfolgt gemäß den klassischen Hämolysetechniken entweder in Gel oder in flüssiger Phase, und zwar mit den Zellen, die von den Lymphdrüsen immunisierender Ratten stammen, und mit roten Blutkörperchen, die entweder mit Proteinen, Glycoproteinen oder Polysacchariden sensibilisiert sind.

Um die Bedeutung der Benzochinonkonzentration im Verlaufe der Aktivierungsreaktion klarzustellen, werden Versuche durchgeführt, indem man die Peroxidase durch das Benzochinon unter im übrigen identischen Bedingungen, aber mit jeweils verschiedenen Benzochinonmengen aktiviert. Die aktivierte Peroxidase wird auf den roten Blutkörperchen gebunden und die Hämolyse durchgeführt. Die Hämolyse ist ein bequemes Mittel, um die Reaktionsausbeute zu bestimmen. Die Abwesenheit der Hämolyse zeigt an, daß die Fixierung nicht stattgefunden hat. Der Hämolysegrad gestattet, qualitativ die Ausbeute der Reaktion auszuwerten.

Die Reaktionsbedingungen sind die gleichen wie die in Beispiel Ial. Die in Reaktion gebrachte Menge Peroxidase beträgt 5 mg. Die veränderliche Benzochinonmengen werden jedesmal in 0,2 ml Ethanol gelöst. Die Resultate sind in der folgenden Tabelle zusammengestellt:

Tabelle

Die obigen Ergebnisse zeigen den entscheidenden Einfluß der Benzochinonkonzentration auf die Ausbeute der Reaktion.

V. Markierung von Zellenbestandteilen in situ unter Verwendung von Fab-Paaren mit dem Benzochinon

Das Prinzip ist folgendes: Man läßt das Fab-Paar so mit dem Benzochinon auf einen Träger wirken, der das Antigen unter den Antigen-Antikörper-Bedingungen bei einem pH 6,5 enthält. Nach dem Abnehmen des Fab-Überschusses erhöht sich der pH- Wert auf 8, wodurch die freie Chinongruppierung aktiv wird. Wenn die aminierten Gruppierungen des Trägers blockiert sind, reagiert das Benzochinon mit jenen Gruppierungen der zugegebenen Markierungssubstanz in alkalischem Milieu.

Beispiel 7 7A. Aktivierung des Fab

Die Aktivierung erfolgt ebenso wie die Filtration auf Molekularsieb wie zuvor in Beispiel 1A beschrieben.

7B. Markierung in situ

Die in Formol fixierten Zellen werden während 1 h in eine Fab-Lösung (0,5 bis 1 mg/ml in 0,15 M NaCl) gegeben. Nach dem Waschen in dem 0,15 M NaCl werden die Zellen mit einer Peroxidaselösung (oder einer anderen Markierungssubstanz) während mindestens 6 h in 0,1 M Natriumbicarbonatlösung inkubiert.

Claims

1. Verfahren zum Koppeln zweier biologischer Substanzen aneinander durch kovalente Bindungen, indem man die erste Substanz mit Benzochinon aktiviert, die aktivierte Substanz vom Benzochinonüberschuß trennt und sodann mit der zweiten Substanz in Berührung bringt, dadurch gekennzeichnet, daß man die erste Substanz in homogener Lösung mit einem Molverhältnis des Benzochinons zu der zu aktivierenden Substanz von mindestens 200 aktiviert.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die erste Substanz mit einem Molverhältnis des Benzochinons zu der zu aktivierenden Substanz von mehr als 1000 aktiviert.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man als Benzochinon para-Benzochinon verwendet.

4. Anwendung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 3 zur Auffindung oder zum Titrieren von Antikörpern oder Antigenen.