DE2708018C2

DE2708018C2 -

Info

Publication number: DE2708018C2
Application number: DE2708018A
Authority: DE
Inventors: Juergen Dr.Rer.Nat. Horn; Winfried Dr.Phil. Albert; Hans-Georg Dr.Rer.Nat. Batz; Michael Dr.Phil. 8132 Tutzing De Nelboeck-Hochstetter
Original assignee: Boehringer Mannheim GmbH
Current assignee: Roche Diagnostics GmbH
Priority date: 1977-02-24
Filing date: 1977-02-24
Publication date: 1989-07-20
Also published as: ATA855477A; JPS53105585A; SE7800843L; FR2381782B1; AT362508B; CA1092977A; IT7819499A0; DK84678A; US4182695A; BE863861A; NL7800027A; IL53584A; YU43878A; GB1572973A; DD134536A5; CH654016A5; DE2708018A1; AU517568B2; HU177561B; IT1092974B

Description

Die Erfindung betrifft ein an synthetisches Polyamid als Träger fixiertes immobilisiertes, biologisch aktives Protein, welches sich durch einen neutralen ungeladenen Träger auszeichnet, sowie ein Verfahren zu seiner Herstellung.

Die Fixierung bzw. Immobilisierung von biologisch aktiven Proteinen wie Enzymen, Hormonen, zur Teilnahme an Antigen-Antikörperreaktionen und Hapten-Antikörperreaktionen befähigten Substanzen, Gerinnungsfaktoren und dergleichen, insbesondere im Rahmen der präparativen und der analytischen Chemie, hat in den vergangenen Jahren große Bedeutung erlangt. Es wurden bereits zahlreiche Fixierungsverfahren entwickelt. Trotzdem zeigt es sich, daß ständig neue Fixierungsprobleme auftauchen, die mit den bisher bekannten Methoden nicht befriedigend gelöst werden können. Hierauf ist es auch zurückzuführen, daß bisher trotz der ohne weiteres einsehbaren Vorteile der Fixierung von biologisch aktiven Proteinen an Trägermaterialien auf vielen Gebieten die Einführung der fixierten Proteine in die Praxis nur zögernd erfolgte und sich der erwartete breite Durchbruch noch nicht realisierte.

Von besonderem Interesse als Trägermaterialien für immobilisierte aktive Proteine sind Polyamide aufgrund ihrer interessanten physikalischen und chemischen Eigenschaften. Polyamide weisen aufgrund ihres Gehalts an sekundären Aminogruppen eine gewisse chemische Ähnlichkeit mit der Proteinstruktur auf, insbesondere hinsichtlich ihrer Ladungsverteilung, so daß hier negative Auswirkungen auf die biologische Aktivität der daran immobilisierten Enzyme im Vergleich zu anderen Trägermaterialien gering sind, soweit keine sonstigen Gruppen vorliegen, welche die Aktivität der Proteine nachteilig beeinflussen.

An Polyamid als Trägermaterial fixierte, biologisch aktive Proteine sind bereits bekannt, bei denen das Protein mit dem Polyamid über Amidinostrukturen gebunden ist (vgl. z. B. Kollowik-Kaplan "Methods in Enzymology", Bd. 25, S. 646-648). In analoger Weise hat man auch bereits Polyamide in die Polyiminoester überführt und mit biologisch aktiven Proteinen gekuppelt.

In diesen, an Polyamid immobilisierten, biologisch aktiven Proteinen kommen jedoch die grundsätzlichen günstigen Eigenschaften der Polyamide als Träger für Enzyme nicht voll zur Geltung, da hierbei positiv geladene Gruppen gebildet werden, welche in vielen Fällen in bezug auf die Enzymbindung nachteilig ist. Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, an synthetisches Polyamid gebundene immobilisierte Enzyme zu schaffen, bei denen die Bindung an die Amidgruppen der Polyamide derart erfolgt, daß der Träger neutral und ungeladen bleibt.

Gelöst wird diese Aufgabe erfindungsgemäß durch ein an synthetisches Polyamid kovalent gebundenes, biologisch aktives Protein oder Proteinsubstrat gemäß Patentanspruch 1.

Aus der US-PS 40 02 532 sind Enzymkonjugate mit Proteinmakromolekülen bekannt, die durch Kupplung der beiden Proteine mit einem polyfunktionalen Kupplungsmittel hergestellt werden. Das Problem einer Bindung an synthetische Polyamide wird hier nicht angesprochen.

Aus der US-PS 39 70 597 ist ein Verfahren zur Herstellung substituierter Polyamide bekannt, bei dem Amidbindungen geöffnet und die so gebildeten Aminogruppen mit einem Aldehyd und einem Diisocyanoalkan in einer 4-Komponentenreaktion umgesetzt werden. Eine Umsetzung mit der Amidfunktion wird hier nicht vorgenommen, auch wird als Aldehyd Formaldehyd nicht in Betracht gezogen. Wenn daher derart substituierte Polyamide mit einem biologisch aktiven Protein umgesetzt werden, kann hierbei kein Protein gemäß der Erfindung gebildet werden.

Als Polyamid kommen im Rahmen der Erfindung sowohl einheitliche Polyamide, also die sogenannten Rein- oder Homopolykondensate, zu denen die Polykondensate von ω-Aminocarbonsäuren und die Polykondensate aus linearen aliphatischen Diaminen und Dicarbonsäuren sowie Polykondensate mit aromatischen oder anderen Komponenten zählen, und die Mischpolyamide in Betracht. Typische Beispiele sind Polycaprolactam, Polykondensate aus Adipinsäure und Hexamethylendiamin (6,6-Polyamid), 6,10-Polyamid, Polyaminoundecansäure (11-Polyamid), Mischpolyamide aus Caprolactam und Dicarbonsäurediaminsalzen, wie adipinsaurem 4,4′-Diaminodicyclohexylmethan, 12-Polyamid, Polycycloamide, wie Poly-(1,4-cyclohexylendimethylensuperamid) und Polydodecanollactam.

Die Reste R und R₁ bestehen entsprechend der obigen Definition aus den an die Amidogruppe gebundenen Resten des Polyamids. Diese Reste können wiederum aliphatische, aromatische oder aliphatisch- aromatische Reste enthalten, die weitere sekundäre oder tertiäre Aminogruppen, Estergruppen, Amidgruppen, Carboxylgruppen, Hydroxylgruppen oder N-substituierte Carbonamidgruppen enthalten können. Vorzugsweise enthalten R und R₁ dabei geradkettige, verzweigte und/oder zyklische Alkylgruppen bzw. Alkylengruppen mit 1 bis 12 C-Atomen, Phenylgruppen bzw. Phenylengruppen oder Alkylphenylengruppen bzw. Alkylenphenylengruppen, die wieder miteinander durch eine oder mehrere der vorstehend erwähnten N-substituierten Carbonamidgruppen, Amidgruppen, Estergruppen etc. verbunden sind.

Der Rest R₂ leitet sich von einer Verbindung ab, die mit Formaldehyd kondensierbar ist. Diese Eigenschaft ist erfüllt bei den mit Formaldehyd Harz-bildenden Substanzen, beispielsweise also negative Substituenten tragende aromatische Verbindungen oder freie Aminogruppen oder Hydroxylgruppen enthaltende Verbindungen. Außer der mit Formaldehyd kondensierbaren Struktur bzw. Funktion muß noch eine weitere funktionelle Gruppe vorhanden sein, die mit einem Proteinreagens zu reagieren vermag.

Typische Beispiele für im Rahmen der Erfindung geeignete, mit Formaldehyd kondensierbare Verbindungen, von denen der Rest R₂ sich herleitet, sind Phenol, Anilin, Harnstoff, Thioharnstoff, Melamin, Diaminotriazin, Gelatine, Amine, insbesondere aliphatische, aromatische oder araliphatische Diamine mit 2 bis 14 C-Atomen, und Alkohole, insbesondere Diole und Aminoalkohole.

R₃ stellt den Rest eines bi- oder polyfunktionellen Proteinreagens bzw. Proteinkupplungsmittels dar. Beispiele für geeignete Proteinreagentien sind Dialdehyde, wie Glutardialdehyd, Dihydroxysuccinimidester, Diacetale, Bis-Maleinimide, bifunktionelle Iminoester, wie Diäthylmalonimidat, Dimethyladipinimidat, Diepoxyde, Dicarbonsäurechloride, insbesondere α-β-ungesättigte Carbonsäuredichloride, Diisocyanate, Diisothiocyanate und dergleichen. Sie enthalten zweckmäßig 2 bis 12 C-Atome, können jedoch auch längerkettig sein. Beispiele für solche längerkettigen Verbindungen sind Copolymere aus Acrylamid/Methacrylamid und Acrylsäuresuccinimidester/Methacrylsäuresuccinimidester. Die in den vorstehenden Beispielen aufgeführten Proteinreagentien enthalten jeweils zwei funktionelle Gruppen, die zur Kupplung mit biologisch aktiven Proteinen in wäßriger Lösung ohne Beeinträchtigung der biologischen Aktivität derselben geeignet sind. Im Rahmen der Erfindung kann sich R₃ jedoch auch von solchen Proteinreagentien ableiten, die nur eine proteinbindende Funktion oder mehr als zwei derartige Funktionen enthalten. Falls nur eine proteinbindende Gruppe vorliegt, muß wenigstens eine weitere funktionelle Gruppe vorliegen, die mit der weiteren funktionellen Gruppe, welche die mit Formaldehyd kondensierbare Verbindung, von der sich R₂ ableitet, enthält unter Ausbildung einer homöopolaren Bindung zu reagieren vermag. Beispiele für geeignete Proteinreagentien finden sich weiter in den DE-OS 19 15 970; 22 37 083, 21 28 743, 22 60 185 und 26 03 319. Andere Proteinbindungsmittel, von denen sich R₃ ableiten kann, sind z. B. Phosgen, Thiophosgen, Halogencyan und Nitrit.

Leitet sich R₂ von einem aromatischen Amin ab, so läßt sich die Proteinbindung durch Umsetzung mit Nitrit, also Diazotierung der aromatischen Aminogruppe, durchführen. In diesem Falle erhält man eine Verbindung der allgemeinenFormel I mit n = 0.

Als biologisch aktive Proteine kommen im Rahmen der Erfindung z. B. Enzyme, immunologisch aktive Proteine, wie Antikörper, Hormone sowie biologisch aktive Peptide und dergleichen, in Betracht. Anstelle der biologisch aktiven Proteine können auch ihre Substrate fixiert sein.

Das erfindungsgemäße Verfahren zur kovalenten Fixierung von biologisch aktiven Proteinen oder von deren Substraten an synthetischen Polyamiden ist dadurch gekennzeichnet, daß das Polyamid in Anwesenheit eines Lösungsmittels für Polyamide mit einander äquimolaren Mengen Formaldehyd und einer mit Formaldehyd kondensierbaren Verbindung, welche wenigstens eine weitere reaktionsfähige Gruppe enthält, umgesetzt wird unter Bildung eines Polyamidderivates der allgemeinen Formel

worin R und R₁ unabhängig voneinander die an der Amidogruppe gebundenen Reste des Polyamids und R₂′ den Rest der mit Formaldehyd kondensierbaren Verbindung, welche noch wenigstens eine weitere reaktionsfähige Gruppe enthält, darstellen, dieses Polyamidderivat gegebenenfalls mit einem bi- oder polyfunktionellen Proteinreagens umgesetzt und danach in wäßriger Lösung mit einem biologisch aktiven Protein oder einem Substrat davon unter Bindung desselben zusammengebracht wird.

Als Lösungsmittel kommen die bekannten Lösungsmittel für Polyamide im Rahmen der Erfindung zur Anwendung. Hierzu gehören die niederen aliphatischen Carbonsäuren, insbesondere Ameisensäure und Essigsäure. Ihre Konzentration soll wenigstens 10%, vorzugsweise wenigstens 50% betragen. Weitere geeignete Lösungsmittel sind 100%ige Schwefelsäure, Phosphorsäure, Lösungen von Metallsalzen der zweiten Hauptgruppe, wie CaCl₂ in Alkoholen, Phenole, Kresole, Chloralhydrat und andere. Menge und Konzentration des Lösungsmittels hängen einerseits vom verwendeten Polyamid, andererseits davon ab, ob nur eine oberflächliche Anlösung gewünscht wird, die Kondensation in Gegenwart des Formaldehyds also in heterogener Phase verläuft, oder eine vollständige Lösung des Polyamids gewünscht wird. Für Mischpolyamide geeignete Lösungsmittel sind auch Mischungen von wäßrigen Alkoholen mit Lösungsvermittlern, wie Benzol oder chlorierten Kohlenwasserstoffen.

Wird nur eine oberflächliche Anlösung eines festen Polyamids vorgenommen, so erfolgt lediglich eine oberflächliche Ankondensation, ohne daß die Form des Polyamids verändert wird. Letzteres kann daher beispielsweise als Schlauch, Granulat, Folie oder dergleichen vorliegen, und erfindungsgemäß mit einem biologisch aktiven Protein oberflächlich verbunden werden. Bei Durchführung in Lösung werden am Polyamid die Carbonamidgruppen durch Ankondensation substituiert und anschließend wird mit einem geeigneten Fällungsmittel, wie Wasser oder Hydrogencarbonatlösung, das gebildete substituierte Polyamid ausgefällt. Diese Arbeitsweise bietet auch die Möglichkeit, beliebige Oberflächen, insbesondere Kunststoffoberflächen, die mit einem entsprechenden Lösungsmittel an der Oberfläche klebrig gemacht werden (z. B. bei Verwendung von Polystyrolröhrchen mit Benzol) mit einer Lösung des substituierten Polyamids zu beschichten und anschließend die beschichteten Oberflächen durch die Umsetzung mit dem bi- bzw. multifunktionellen Proteinreagens zu aktivieren und zur Proteinbindung einzusetzen.

Gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wird bei nur oberflächlicher Anlösung des Polyamids ein fester Träger aus beliebigem Material verwendet, dessen Oberfläche mit feinteiligem Polyamid, beispielsweise in Form von Geweben, Fäden, Flocken, Lints oder dergleichen beschichtet ist. Die Polyamidteilchen können auf der Trägeroberfläche aufgeklebt, durch elektrische Beflockung aufgebracht oder auf andere Weise gebunden sein. Bei dieser Ausführungsform liegen große spezifische Polyamidoberflächen vor, die bei der Proteinfixierung gemäß Erfindung eine hohe spezifische Aktivität des beschichteten Trägers ergibt. Voraussetzung ist dabei natürlich, daß nur eine oberflächliche Anlösung der feinen Polyamidteilchen erfolgt, die ihre Struktur erhält.

Gemäß einer besonderen Ausführungsform des Verfahrens der Erfindung wird in den Fällen, in denen die mit Formaldehyd kondensierbare Verbindung als weitere Funktion eine Aminogruppe enthält, die Kupplung mit dem biologisch aktiven Protein oder dem Proteinsubstrat mit Hilfe von bekannten Aminkupplungsmitteln, wie Phosgen, Thiophosgen, Halogencyan oder Nitrit durchgeführt. Derartige Kupplungsmittel sind für die Fixierung von biologisch aktiven Proteinen an unlöslichen Trägermaterialien, welche Hydroxyl oder Aminogruppen enthalten, bekannt. Beispielsweise wird bei Verwendung von Nitrit die Aminogruppe diazotiert und das Protein dann mit der Diazogruppe umgesetzt. Bei Verwendung von Thiophosgen wird in erster Stufe das entsprechende Isothiocyanat gebildet, welches dann mit einer Aminogruppe des Proteins unter Immobilisierung desselben reagieren kann.

Das Verfahren der Erfindung läßt sich auch dazu verwenden, anstelle der biologisch aktiven Proteine deren Substrate zu fixieren. Beispielsweise kann radioaktiv markierte Gelatine an dem Polyamid immobilisiert werden. Eine derart an Polyamid immobilisierte Gelatine läßt sich als empfindliches Nachweisreagens für hydrolytische Enzyme verwenden. So kann beispielsweise ein Kunststoffreagensgläschen mit der an Polyamid gebundenen markierten Gelatine beschichtet, mit einer Hydrolaselösung gefüllt und danach die in die Lösung übergegangene Markierung z. B. die Radioaktivität bestimmt werden.

Die Umsetzung der erfindungsgemäß erhaltenen Verbindung der allgemeinen Formel II mit dem Proteinreagens bzw. Kupplungsreagens und dem biologisch aktiven Protein oder Proteinsubstrat kann in einer oder in mehreren Stufen erfolgen. Bei einstufiger Umsetzung wird in wäßriger Lösung die Verbindung der allgemeinen Formel II mit dem biologisch aktiven Protein oder Proteinsubstrat und der Kupplungsverbindung zusammengebracht und reagieren gelassen. Diese Verfahrensweise hat den Vorteil der Einfachheit, es werden jedoch häufig schlechtere Ausbeuten erzielt als bei mehrstufiger Arbeitsweise, da hierbei ein Teil der Verbindung II miteinander gekuppelt werden kann, also unerwünschte Nebenreaktionen eingeht. Bei mehrstufiger Arbeitsweise wird das Kupplungsmittel zuerst mit der Verbindung II umgesetzt und das Produkt dann mit dem Protein oder dem Proteinsubstrat umgesetzt. Weiter kann mit dem Proteinkupplungsmittel das Protein vernetzt werden und von nichtvernetzem Protein abgetrennt werden. Dann wird das vernetzte Protein mit dem gleichen oder einem anderen Proteinkupplungsreagens mit der Verbindung II umgesetzt. Die Bindung derartiger vernetzter Proteinderivate ergibt besonders hohe Aktivitäten.

Die erste Stufe des erfindungsgemäßen Verfahrens, also die Umsetzung in Gegenwart der mit Formaldehyd kondensierbaren Verbindung und mit Formaldehyd, kann bei Temperaturen zwischen etwa 0 und 100°C durchgeführt werden. Arbeitet man in ameisensaurer Lösung und in Gegenwart von Aminen, so kann als Konkurrenzreaktion die Leuckart-Wallach-Reaktion ablaufen. Unter diesen Bedingungen wird daher vorzugsweise bei niedrigeren Temperaturen im Rahmen des obigen Bereiches gearbeitet.

Unter Formaldehyd werden im Rahmen der Erfindung die üblichen Formen des Formaldehyds verstanden, also wäßrige Formaldehydlösungen, Paraformaldehyd, Trioxan und andere Formaldehydpolymere, die sich unter den Reaktionsbedingungen wie freier Formaldehyd verhalten. Besonders bevorzugt wird Trioxan, da es als feste und chemisch eindeutig definierte Substanz am einfachsten quantitativ zu handhaben ist.

Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht die Immobilisierung bzw. Fixierung biologisch aktiver Proteine oder ihrer Substrate an Trägermaterialien auf Basis von synthetischen Polyamiden in besonders schonender Weise und unter Erhalt der vorteilhaften Eigenschaften. Erfindungsgemäß kann das Protein direkt an die als Zwischenprodukte gebildete Verbindung der Formel II gekuppelt werden, als auch über Zwischenverbindungen beliebig zu wählender Größe gebunden werden. Letzteres erlaubt es, auch den Abstand des Proteins zum eigentlichen Trägermolekül nach Belieben auszuwählen. Ein größerer Abstand, also die Verwendung eines längeren Spacers, ist beispielsweise dann von Interesse, wenn bereits vorvernetzte Proteine fixiert werden sollen, also Aggregate, die aus mehreren Molekülen der biologisch aktiven Proteine bestehen. Aus räumlichen Gründen ist dann häufig ein möglichst langer Spacer erforderlich.

Die erfindungsgemäßen immobilisierten biologisch aktiven Proteine bzw. Proteinsubstrate können in wäßrigen Lösungen löslich oder unlöslich sein. Durch Kupplung mit wasserlöslichen Polyamiden kann beispielsweise das Ausbluten des Proteins durch semipermeable Membranen verringert oder beseitigt werden, die Stabilität erhöht werden oder ihre Einsatzfähigkeit als Arzneimittel ermöglicht werden. Bei der Kupplung an unlösliche Trägermaterialien steht die einfache Wiedergewinnbarkeit des biologisch aktiven Proteins im Vordergrund der Anwendungszwecke. Sie können aber auch zur Gewinnung von Antigenen und Antikörpern als spezifische Adsorptionsmittel und im Rahmen der enzymatischen Analyse verwendet werden.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung weiter.

Beispiel 1

0,3 M Phenylendiamin und 0,1 M Trioxan werden in 50proz. Ameisensäure zusammengegeben und 3 Stunden durch einen 3 m langen Schlauch aus Polyamid-6 hindurchgepumpt. Der Schlauch wird anschließend mit Wasser gespült, mit einer 10proz. Lösung von Glutardialdehyd in 0,2 M Borat-Puffer, pH = 8,5, gefüllt, 15 Minuten stehengelassen, wieder gewaschen und dann mit einer Lösung von 2 mg Glucose-oxidase pro ml 0,1 M Phosphat-Puffer, pH = 7,8, gefüllt und über Nacht bei 4° stehengelassen. Nach Waschen mit 0,1 M Phosphat-Puffer, pH = 7,0, der 1 M an Kochsalz ist, wird eine enzymatische Aktivität von 1,8 U/m Schlauch gemessen.

Beispiel 2

20 g Polyamidflocken von 1 mm Länge werden in 50proz. Ameisensäure suspendiert und mit 0,3 M Phenylendiamin und 0,1 M Trioxan 3 Stunden bei 50° umgesetzt. Nach dem Abfiltrieren wird gewaschen und die modifizierten Polyamidflocken werden in 1 : 10 verdünnter Salzsäure suspendiert, auf 0° gekühlt und unter Rühren bei 0° mit 2,5 M Natriumnitrit-Lösung versetzt. Nach 60 Minuten wird mit eisgekühltem Wasser gewaschen und ein Teil des Derivates sofort mit einer Lösung von Glucoseoxidase mit 10 mg/ml in Phosphat-Puffer, pH = 7,0, versetzt. Die anschließend nach der Fixierung über Nacht bei 4° mit 1 M Kochsalzlösung gewaschenen Polyamidflocken weisen eine Aktivität von 17 U/g auf.

Beispiel 3-5

Es wird wie in Beispiel 2 verfahren, nur wird anstelle von Phenylendiamin Anilin bzw. Dianisidin bzw. Diamino-diphenylmethan eingesetzt.

Beispiel 6

0,03 M Phenylendiamin und 0,01 M Trioxan werden in 50proz. Essigsäure gelöst, auf 60° erwärmt und 3 Stunden durch einen 2 m langen Polyamidschlauch gepumpt. Anschließend wird der Schlauch mit Wasser gewaschen und eine 5proz. Lösung eines Copolymeren aus Methacrylamid und Methacrylsäure-hydroxysuccinimidester in den Schlauch eingefüllt und nach 4 Stunden wieder entleert und mit Wasser gewaschen. Dann wird eine Lösung von 2 mg Glucoseoxidase pro ml 0,1 M Phosphat-Puffer, pH = 7,8, eingefüllt und nach Stehen über Nacht bei 4° entleert und gewaschen. Der fertige Enzymschlauch weist eine Aktivität von 1,5 U/m auf.

Beispiel 7

Je 20 g Polyamid-6-Partikel werden mit 0,3 M Phenylendiamin und 0,1 M Trioxan in 60proz. Essigsäurelösung bei 50° bzw. mit 0,3 M Diaminodiphenylmethan und 0,1 M Trioxan in 60proz. Essigsäurelösung bei 50°C 2 Stunden lang umgesetzt. Nach Waschen mit Wasser wird jeweils die Hälfte des Phenylendiamin-Produktes und des Diaminodiphenylmethan-Produktes in 1 : 10 verdünnter Salzsäure suspendiert, auf 0° gekühlt und unter Rühren bei 0°C mit 2,5 M Natriumnitrit-Lösung diazotiert. Nach 60 Minuten wird mit eisgekühltem Wasser gewaschen. Je 1 g diazotiertes Phenyldiamin- Derivat werden mit einer Lösung von 10 mg Glucoseoxidase pro ml 0,1 M Phosphat-Puffer, pH = 7,0, versetzt und bei 4° über Nacht belassen. Nach dem Waschen mit 0,1 M Phosphat-Puffer, pH = 7,0, der 1 M an Kochsalz ist, ergibt sich eine Aktivität im Fall des Phenylendiamin-Derivates von 17 U/g, im Fall des Diaminodiphenylmethan- Derivates von 71 U/g. Je 1 g des frisch diazotierten Phenylendiamin-Derivates und des Diaminodiphenylmethan-Derivates werden mit einer Lösung von 5 mg Cholesterinoxidase pro ml 0,1 M Phosphat-Puffer, pH = 6,0, versetzt, über Nacht bei 4° belassen und anschließend mit 0,1 M Phosphat-Puffer, pH = 6,0, der 1 M an Kochsalz ist, gewaschen. Es ergibt sich eine Aktivität von 155 U/g bei dem diazotierten Phenylendiamin-Derivat bzw. 160 U/g bei dem diazotierten Diaminodiphenylmethan- Derivat. Anschließend werden die beiden Produkte nochmals mit 0,1 M Phosphat-Puffer, pH = 6,0, der 1 M an Kochsalz und 0,5proz. an Thesit ist (Hydroxypolyäthoxyidodecan), gewaschen. Durch diesen Waschvorgang nimmt die Aktivität des Phenylendiamin-Derivates auf 10 U/g und die des Diaminodiphenylmethan-Derivates auf 15 U/g ab.

Beispiel 8

Jeweils 5 g Polyamidpartikel werden mit jeweils 0,3 M Diaminodiphenylmethan und 0,1 M Trioxan bzw. 0,3 M Harnstoff und 0,1 M Trioxan bzw. 0,3 M Anilin und 0,1 M Trioxan bzw. 0,3 M Triaminotriazin und 0,1 M Trioxan in 50proz. Ameisensäure-Lösung 3 Stunden bei 20° umgesetzt. Nach dem Waschen werden die verschiedenen Derivate mit 10proz. Glutardialdehyd-Lösung in 0,2 M Borat-Puffer, pH = 8,5, für 15 Minuten umgesetzt und abermals gewaschen. Je 1 g der verschiedenen Derivate wird danach mit 3 ml einer Nierenacylase-Lösung von 480 mg in 40,5 ml 0,1 M Triäthanolamin-Puffer, pH = 8,3, für 1 Stunden versetzt, danach abfiltriert und gewaschen. Die gemessene Aktivität beträgt im Fall des Phenylendiamin-Derivates 7,5 U/g, bei Diaminodiphenylmethan 6,7 U/g, bei Harnstoff 6,8 U/g, bei Triaminotriazin 8,9 U/g.

Beispiel 9

10 g Polyamid-6-Partikel werden mit einer Lösung von 2 g Gelatine und 0,1 M Trioxan in 50proz. Ameisensäure-Lösung 3 Stunden bei 50° umgesetzt. Anschließend wird gewaschen und das Polyamid-Derivat mit einer 10proz. Lösung von Glutardialdehyd in 0,2 M Borat- Puffer, pH = 8,5, versetzt. Nach 15 Minuten wird abfiltriert und erneut gewaschen und das Derivat mit einer Lösung von 5 mg Glucoseoxidase pro ml 0,1 M Phosphat-Puffer, pH = 7,8, versetzt. Nach Stehen über Nacht bei 4° wird abfiltriert und gewaschen. Die Aktivität der an das Polyamidgelatine-Derivat gebundenen Glucoseoxidase beträgt 81 U/g.

Beispiel 10

0,1 M Polyamid-6 wird in 100proz. Ameisensäure gelöst und mit 0,1 M Phenylendiamin und 0,033 M Trioxan versetzt. Nach 3 Stunden bei 50° wird die Lösung in Wasser ausgefällt und das ausgefällte Polyamid-Derivat nach Waschen mit Alkohol und Wasser mit 10proz. Glutardialdehyd-Lösung in 0,2 M Borat-Puffer, pH = 8,5, für 15 Minuten versetzt und erneut gewaschen. Danach wird das Polyamid- Derivat zu einer Lösung von 2 mg Glucoseoxidase pro ml 0,1 M Phosphat-Puffer, pH = 7,8, gegeben, über Nacht bei 4° stehengelassen und anschließend gewaschen. Das gewaschene Polyamid-Derivat weist anschließend eine Aktivität von 16 U/g auf.

Beispiel 11

Polyamid-Derivat wie in Beispiel 10 wird hergestellt, jedoch nicht in Wasser ausgefällt, sondern mit Tonpartikeln mit einem Durchmesser von 0,315 bis 0,400 mm versetzt, so daß noch diskrete Partikel vorliegen, und anschließend evakuiert. Nach dem Waschen mit Wasser wird mit 10proz. Glutardialdehyd-Lösung in 0,2 M Borat-Puffer, pH = 8,5, versetzt, nach 15 Minuten abfiltriert und gewaschen und der gecoatete Ton mit einer Lösung von 2 mg Glucoseoxidase pro ml 0,1 M Phosphat-Puffer, pH = 7,8, versetzt. Nach Stehen über Nacht bei 4°, Abfiltrieren und Waschen, weist das Polyamid-Ton-Derivat eine Glucoseoxidase-Aktivität von 8 U/g auf.

Beispiel 12

Polyamid-Derivat wie in Beispiel 10 wird hergestellt und in vorher mit Benzol klebrig gemachte Polystyrolgläschen von 3 cm Höhe und 1 cm Durchmesser eingefüllt. Nach einstündigem Stehenlassen wird ausgegossen und gespült, dann mit einer 10proz. Lösung von Glutardialdehyd in 0,2 M Borat-Puffer, pH = 8,5, gefüllt, nach 15 Minuten ausgeleert und gespült und mit einer Lösung von 2 mg Glucoseoxidase pro ml 0,1 M Phosphat-Puffer, pH = 7,8, gefüllt. Nach Stehen über Nacht bei 4° werden die Gläschen gewaschen und weisen anschließend eine Aktivität von 0,5 U/Gläschen auf.

Beispiel 13

In einem Gemisch aus 18,6 g CaCl₂ und 18,6 g H₂O plus 63 g Methanol und 1 bis 1000 Teilen Ameisensäure wird Polyamid-6 bei erhöhter Temperatur von 30 bis 80°C gelöst und heiß in 2 m lange Polyamid-6-Schläuche eingefüllt und danach sofort mit kaltem Wasser gespült. An der inneren Oberfläche des Schlauches bleibt eine Schicht amorphes, reaktionsfähiges Polyamid zurück. Dann wird eine Lösung von 0,03 M Phenylendiamin und 0,01 M Trioxan in 60proz. Essigsäure bei 60° durch die Polyamidschläuche gepumpt. Anschließend wird mit Wasser gewaschen und dann eine Lösung von 50 mg Korksäuredihydroxysuccinimidester in 1 ml Dioxan in den Schlauch eingefüllt. Nach 15 Stunden wird der Schlauch geleert und

a) eine Lösung von 5 mg Glucoseoxidase pro ml 0,1 M Phosphat- Puffer, pH = 7,8, eingefüllt,
b) eine Lösung von 372 mg Glucoseoxidase in 4,5 ml 0,1 M Phosphat- Puffer, pH = 7,8, wird mit 6,4 mg Äthylenglycolbispropionsäure- bishydroxysuccinimidester in 0,5 ml Dioxan versetzt und über Nacht bei 4° stehengelassen. Danach wird die vernetzte Glucoseoxidase über eine Sephadex-G200® (vernetztes Dextran)-Säule chromatographiert und die vernetzten Anteile (ca. 90% im Ausschlußvolumen) werden in 0,1 M Phosphat-Puffer, pH = 7,8, in den oben propagierten Schlauch gefüllt.

Im Fall a) ergibt sich eine Aktivität von 4 U/m, im Fall b) eine Aktivität von 9 U/m.

Beispiel 14

10 g Polyamid-6-Partikel mit 0,100 bis 0,125 mm Durchmesser werden in 100 ml 40proz. Ameisensäure suspendiert und 2,25 g Trioxan (0,075 Mol Formaldehydeinheiten) und 9,4 g Phenol (0,1 Mol) werden zugegeben. Nach 3 Stunden bei 50° wird abgesaugt, mit Methanol nachgewaschen und danach mit trockenem Äther nachgewaschen. Die Partikel werden in 250 ml Toluol suspendiert, in dem 10 ml Hexamethylendiisocyanat gelöst sind. Nach 2 Stunden wird abgesaugt, mit getrocknetem Äther nachgespült und sofort eine Lösung von 5 mg Glucoseoxidase pro ml 0,1 M Phosphat-Puffer, pH = 7,0, zu den Partikeln zugegeben. Nach Stehen über Nacht wird gewaschen und die anschließend gemessene Aktivität beträgt 11,2 U/g.

Claims

1. An synthetisches Polyamid kovalent gebundenes, biologisch aktives Protein oder Proteinsubstrat, dadurch gekennzeichnet, daß es der allgemeinen Formel entspricht, worin R und R₁ die an der Amidogruppe gebundenen Reste des Polyamids darstellen, R₂ den Rest einer mit Formaldehyd kondensierbaren Verbindung darstellt, welche wenigstens eine weitere reaktionsfähige Gruppe enthält, R₃ den Rest eines bi- oder polyfunktionellen Proteinreagenz darstellt, n die Zahl 0 oder 1 und P ein biologisch aktives Protein bedeutet.

2. Protein nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß R und R₁ Reste von Polycaprolactam, 6,6-Polyamid, 6,10-Polyamid, 11-Polyamid oder 12-Polyamid sind.

3. Protein nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß R₂ sich von Phenol, Anilin, Harnstoff, Thioharnstoff, Melamin, Diaminotriacin, aliphatischen, aromatischen oder araliphatischen Diaminen mit 2 bis 14 C-Atomen ableitet.

4. Protein nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß sich R₃ von Glutardialdehyd, Dihydroxysuccinimidester, Diacetal, Bismaleinimid, bifunktionellem Iminoester, Diepoxyd, Dicarbonsäurechlorid, Diisocyanat oder Diisothiocyanat mit 2 bis 12 C-Atomen ableitet.

5. Protein nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß sich R₃ von einem Copolymeren aus Acrylamid/Methacrylamid und Acrylsäuresuccinimidester/Methacrylsäuresuccinimidester ableitet.

6. Verfahren zur Fixierung von biologisch aktivem Protein oder Proteinsubstrat an Polyamide, dadurch gekennzeichnet, daß das Polyamid in Anwesenheit eines Lösungsmittels für Polyamide mit einander äquimolaren Mengen Formaldehyd und einer mit Formaldehyd kondensierbaren Verbindung, welche wenigstens eine weitere reaktionsfähige Gruppe enthält, umgesetzt wird unter Bildung eines Polyamidderivates der allgemeinen Formel worin R und R₁ unabhängig voneinander die an der Amidogruppe gebundenen Reste des Polyamids und R₂′ den Rest der mit Formaldehyd kondensierbaren Verbindung mit wenigstens einer weiteren reaktionsfähigen Gruppe darstellt, gegebenenfalls dieses Polyamidderivat mit einem bi- oder polyfunktionellen Proteinreagenz umgesetzt und danach in wäßriger Lösung mit einem biologisch aktiven Protein oder Proteinsubstrat unter Bindung desselben zusammengebracht wird.

7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Umsetzung mit dem Formaldehyd in wenigstens 50%iger Ameisensäure oder Essigsäure durchgeführt wird.

8. Verfahren nach Anspruch 6 oder 7, dadurch gekennzeichnet, daß das Polyamid als Formkörper eingesetzt wird und nur eine oberflächliche Anlösung vorgenommen wird.

9. Verfahren nach Anspruch 6 oder 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Umsetzung mit gelöstem Polyamid durchgeführt wird und die Verbindung der Formel II dann auf eine feste Trägeroberfläche abgeschieden wird.

10. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß der Formkörper aus einem festen Trägermaterial besteht, dessen Oberfläche mit feinteiligem Polyamid beschichtet ist.

11. Verfahren nach einem der Ansprüche 6 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß die Kupplung mit dem Protein durch Umsetzung mit Nitrit und Diazotierung erfolgt.

12. Verfahren nach Anspruch 6 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß die Kupplung mittels Phosgen, Thiophosgen oder Halogencyan erfolgt.

13. Verfahren nach Anspruch 6 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß ein vernetztes Protein gekuppelt wird.