DE2725696A1 - Synthetisches liposom und verfahren zur herstellung - Google Patents

Synthetisches liposom und verfahren zur herstellung

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DE2725696A1
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liposome
hemoglobin
dipl
liposome according
cells
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DE19772725696
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Ljubomir Djordjevich
Irving Franklin Miller
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University of Illinois
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University of Illinois
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    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A61K9/127—Liposomes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
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    • Y10T428/2984—Microcapsule with fluid core [includes liposome]

Description

BLUMBACH · WESER · BERGEN · KRAMER ZWIRNER . HIRSCH · BREHM
PATENTANWÄLTE IN MÜNCHEN UND WIESBADEN 2725696
Pstentconsult Radedcestraße 43 TOGO München 60 Telefon (089) 883603/883604 Telex 05 212313 Telegramme Pateniconsult Patentconsuft Sonnenberger SUaBe 43 4200 Wiesbaden Telefon (06121)563943/561998 Telex 04-186237 Telegramme Peteritconsult
Beschreibung:
Diese Erfindung betrifft ein synthetisches Liposom. Insbesondere betrifft die Erfindung synthetische Zellen, welche in der Form von Mikrokapseln vorliegen und Hämoglobin enthalten, das von Lipiden, insbesondere von Phospholipiden, eingehüllt ist; v/eiterhin betrifft die Erfindung die Herstellung solcher synthetischer Zellen bzw. synthetischer Liposome.
Eine wesentliche Eigenschaft der erfindungsgemäßen synthetischen Zellen ist darin zu sehen, daß diese Zellen Sauerstoff (Op) und Kohlendioxid (CO2) in vergleichbarem Ausmaß wie natürliche, rote Blutkörperchen binden und transportieren. V/eiterhin weisen die erfindungsgemäßen synthetischen Zellen eine solch geringe Größe und eine solche Biegsamkeit auf, daß sie leicht die Kapillargefäße von Säugetieren und/oder Menschen, v/o die Aufnahme und Abgebe von Sauerstoff bzw. Kohlendioxid erfolgt, zu passieren vermögen. Eine v/eitere wichtige und höchst angestrebte Eigenschaft der erfindungsgernäßen Zellen besteht darin,
München: R. Kramer Dipl.-Ing. · W. Weser Dipl.-PftylfDr rW.Vrat.'^.MrSBÄi|M-lng. · H. P. Brehm Dipl.-Chem. Dr. phil. nal. Wiesbaden: P. G. Blumbadi Dipl.-Ing. . P. Bergen Dipl.-Ing. Dr. jur. · G. Zwirner Dipl.-Ing. Dipl.-W.-Ing.
daß mit diesen Zellen fremdes Material in den WirtsOrganismus nicht eingeführt wird.
Im Hinblick auf die Fähigkeit zum Transport von Sauerstoff wirken die erfindungsge:;:Mßen synthetischen Zellen sehr ähnlich wie übliche rote Blutkörperchen von Menschen und/oder Säugetieren, so daß eine Suspension.dieser synthetischen Zellen als Transfusionsflüssigkeit brauchbar ist. Derartige erfindungsgemäße Zellen werden von dem V/irtsorganismus wie natürliche Zellen aufgenommen, wirken im wesentlichen in der gleichen V/eise und werden wie entsprechende natürliche Zellen einem Stoffwechsel unterworfen und ausgeschieden. Bereits aus dieser kurzen Aufzählung wichtiger Eigenschaften ergibt sich für den Fachmann die große Bedeutung dieser erfindungsgemäßen synthetischen Zellen bzw. synthetischen Liposomen.
Wie in der Fachwelt bekannt, stellt Hämoglobin ein konjugiertes Protein dar, mit der prosiheti8chen Gruppe "Harn", das an das Protein, nämlich Globin, gebunden ist. Hämoglobin ist für die rote Farbe des Blutes verantwortlich und wird in allen roten Blutkörperchen angetroffen. Die wesentliche Bedeutung des Hämoglobins beruht darauf, daß es den Sauerstoff aus der Atmosphäre in Form einer lockeren Bindung zu binden vermag und dabei Oxyhämoglobin bildet. In den Organismen der Säugetiere bzw. Menschen erfolgt diese Bildung von Oxyhämoglobin in den Kapillargefäßen nahe den Lungen-
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BAD ORIGUNAL
alveolen, wobei sog. rait Sauerstoff belaüenes Blut gebildet wird. Dieses sauerstoffreiche Blut wird über äa3 Arterien-System zu dem Gewebe transportiert, v/o ein Teil dea Sauerstoffs verbraucht v/ird und als Folge venöses Blut gebildet wird; dieses venöse Blut v/eist eine geringeren Sauerstoffgehalt auf und wird zur erneuten Anreicherung mit Sauerstoff wieder in die Lungen zurückgeführt.
In chemischer Hinsicht stellt Ham ein Eisen-Porphyrin dar, d.h., eine Verbindung aus Eisen mit vier Pyrrolgruppen; das Eisen liegt hauptsächlich in zweiwertigem Zustand vor. Üblicherweise v/ird Hämoglobin wie folgt beschrieben:
Globin
Hämoglobin stellt somit ein tetrameres Molekül aus vier Untereinheiten dar, v/obei jede Untereinheit aus einer PoIypetidkette, welche den Proteinanteil oder Globinanteil des Hämoglobins darstellt, und aus Häm aufgebaut ist. Das Harn bildet das wirksame bzw. aktive Zentrum, an dem Sauerstoff gebunden werden kann.
Wird Gesamtblut, insbesondere menschliches Blut, für Transfusions zv/ecke entnommen, so weist es eine Aufbewahrungsdauer von 2Ϊ Tagen auf. Entsprechend den derzeitigen Regelungen muß entnommenes Blut, das 21 Tage alt ist, verworfen werden
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und darf nicht weiter für eine Bluttransfusion verwendet werden.Nach Ablauf dieser Zeitspanne sind die roten Blutkörperchen weitgehend zerstört, so daß so altes Blut für den Sauerstofftransport nicht länger brauchbar ist. Derartiges "altes Blut" enthält ,jedoch immer noch brauchbares, wirksames Hämoglobin und kann deshalb als Ausgangsmaterial für die Herstellung der erfindungsgenäßen synthetischen Zellen verwendet werden.
Gegenüber dieser max. Aufbewahrungsdauer von 21 Tagen für natürliches Gesamtblut, weisen die erfindungsgemäßen Zellen bei angepaßter Pufferung eine wesentlich längere Aufbewahrungsdauer, bzw. Lebensdauer auf, wie das nachfolgend ausgeführt wird.
Aus ihrem Herstellungsverfahren folgt, daß die erfindungsgemäßen synthetischen Hämoglobin-Zellen einen v/eiteren Vorteil aufweisen, da sie für Empfänger unabhängig von deren individueller Blutgruppe, eingesetzt werden können. Das für Transfusionen vorgesehene Gesamtblut muß klassifiziert werden; es müssen besondere Vorsichtsmaßnahmen ergriffen werden, um zu gewährleisten, daß das für die Transfusion vorgesehene Blut mit der Blutgruppe des Empfängers verträglich ist. Vergleichbare Vorsichtsmaßnahmen sind bei Verwendung der erfindungsgemäßen synthetischen Zellen nicht erforderlich. Zur Herstellung der erfindungsgemäßen Zellen wird von einem Ausgangsmaterial ausgegangen, das üblicherweise als "stroma-freies" Hämoglobin
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bezeichnet wird. Dieses Material ist von den Zellv/ünden der roten Blutkörperchen befreit; hierbei ist zu beachten, daß die Zellwände diejenigen Proteine enthalten, welche eine Klassifizierung des Blutes in verschiedene Blutgruppen erforderlich machen. Die V/and bzw. Umhüllung der erfindungsgemäßen synthetischen Zellen wird aus weit verbreiteten (d.h. bei Säugetieren) Lipiden und dgl. gebildet, weshalb die erfindungsger;:äßen Zellen Antigen-Reaktionen auf Proteine nicht hervorrufen.
Die vorliegende Erfindung geht davon aus, daß die Abtrennung der roten Blutkörperchen aus dem Gesamtblut ein seit langem bekanntes und geübtes Verfahren darstellt. Auch die Trennung von Hämoglobin aus den roten Blutkörperchen ist mittels einer Vielzahl von gut bekannten Verfahren möglich.
Es ist weiterhin bekannt, daß von verschiedenen Arbeitskreisen die Verwendung von zellfreien Hämoglobin-Lösungen als Ersatz für natürliches Blut untersucht worden ist. Diese Lösungen zeigen jedoch den Nachteil, daß sie vom Empfängerkörper ausserordentlich rasch ausgeschieden werden und deshalb ihren vorgesehenen Zweck überhaupt nicht oder lediglich für ausserordentlich kurze Zeitspannen erfüllen können. Im Gegensatz dazu werden die erfindungsgemäßen synthetischen Zellen, die aus Mikrokapseln mit einem Kern aus Hämoglobin und einer Hülle aus Lipidmaterial bestehen, vom Körper des Empfängers
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über eine wesentlich längere Zeitspanne aufgenommen und behalten ihre Wirksamkeit über eine wesentlich längere Zeitspanne.
Es ist weiterhin bekannt, daß von anderen Arbeitskreisen bereits Körperchen hergestellt worden sind, die allgemein als "Liposome" bezeichnet werden.
Im Hinblick auf ältere Patentschriften sei auf die nachfolgenden Druckschriften hingewiesen:
US-Patentschrift 2 527 210 (Bower) beschreibt die Gewinnung einer Hämoglobin-Lösung, wozu die Zellmembranen von roten Blutkörperchen mittels einer Gefrier-Auftau-Methode zerstört worden sind;
US-Patentschrift 3 133 881 (Childs) offenbart ein Zentrifugierverfahren zum Abtrennen der roten Blutkörperchen von den anderen Bestandteilen des Gesamtblutes;
nV.'-.hrift 3 351 432 (Van Dyck et al) beschreibt das Waschen und ei? I'e'<r;r3'Ati:- en:ig von roten Blutkörperchen;
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US-Patentschrift 3 418 209 (Ushakoff) offenbart die Verbesserung der Aufbewahrung von roten Blutkörperchen mittels einer Glyzerinlösung;
US-Re-issue-Patent 27 359 beschreibt das Waschen von roten Blutkörperchen; und
US-Patentschrift 3 864 478 (Bonhard) offenbart ein anderes Verfahren zur Herstellung einer Hämoglobin-Lösung.
Dieser gesamte Stand der Technik vermittelt keinerlei Anregung zur Mikroverkapselung von Hämoglobin mit einem Lipid, oder sonstige Anregungen zur Herstellung der erfindungsgemäßen synthetiochen Zellen{weiterhin vermittelt dieser Stand der Technik keinerlei Anregung zur Nützlichkeit oder Brauchbarkeit der-artiger Zellen. Die Ähnlichkeit der erfindungsgemäßen synthetischen Zellen mit üblichen roten Blutkörperchen hinsichtlich der Fähigkeit zum Sauerstofftransport muß als ein überraschendes, für den Fachmann nicht vorhersehbares Ergebnis gewertet werden.
Dementsprechend besteht eine wesentliche Aufgabe der vorliegenden Erfindung darin, mikroverkapseltes Hämoglobin bereitzustellen, das mit dem Organismus von Menschen und/oder Säugetieren verträglich und über eine längere Zeitspanne wirksam ist.
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Weiterhin soll mit dieser Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von derartigen Hämoglobin-Zellen angegeben v/erden.
Die erfindungGgeraäße Lösung dieser Aufgabe ist gekennzeichnet durch die Merkmale der oben angegebenen Ansprüche. Weitere Besonderheiten und Vorteile dieser Erfindung ergeben sich aus der nachfolgenden Beschreibung bevorzugter Ausführungsformen.
Zur Herstellung der erfindungsgemäesen Hämoglobin-Zellen muß das Hämoglobin zuerst von den Zellmembranen der roten Blutkörperchen abgetrennt werden. Nach dieser Abtrennung wird das wesentliche Ausgangsmaterial, nämlich "stromafreies" Hämoglobin erhalten; dieses Material wird anschliessend mit einem Lipid verkapselt bzw. mikroverkapselt. Zur Gewinnung von diesem stroma-freien Hämoglobin kann man von relativ frisch abgenommenem Blut ausgehen, bei dem der überwiegende Anteil der roten Blutkörperchen aus lebensfähigen, aktiven Zellen besteht; es kann aber auch von Blut ausgegangen werden, das bereits 21 Tage und mehr älter ist, bei dem bereits ein beträchtlicher Anteil der roten Blutkörperchen nicht mehr lebensfähig bzw. aktiv ist. Es ist wichtig, durch sorgfältige Arbeitsweise das Hämoglobin von all seinen natürlichen Zellmembranen und sonstigen Zeilproteinen abzutrennen, um beim Empfänger die oben genannten Proteinreaktionen und andere nachteilige Reaktionen zu vermeiden.
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Zur Abtrennung von Hämoglobin aus Blut sind zahlreiche Verfahren bekannt. Zuerst werden die roten Blutkörperchen vom Plasma abgetrennt, was mittels Zentrifugieren oder dgl. erfolgen kann. Der danach erhaltene Rückstand besteht aus heilen wie zerbrochenen roten Blutkörperchen. Durch Maßnahmen zum Einfrieren und Auftauen werden die restlichen Zellmembranen aufgebrochen; naturgemäß können auch andere Maßnahmen zur Öffnung der heilen Zellen angewandt werden; nach der anschließenden Filtrierung oder dgl. wird eine strona-freie Hämoglobin-Lösung erhalten. Die Konzentration an Hämoglobin und an anderen Bestandteilen kann nach Bedarf eingestellt werden.
Anschließend wird die erhaltene Hämoglobin-Lösung mittels natürlich vorkommender Lipide mikroverkapselt, um synthetische Liposom-Zellen zu erhalten. Die größte Abmessung dieser Zellen beträgt typischerweise 1 bis 10 um. Von den Erfindern v/ird angenommen, daß die Lipidmembran angenähert 2 Moleküllagen dick ist.
Im Rahmen dieser Beschreibung und der Ansprüche v/ird unter der Bezeichnung "Liposom" eine Mikrokapsel verstanden, deren Wand oder Membran aus Lipiden, insbesondere aus Phospholipiden gebildet ist, wobei die V/and oder Membran als weiteren Zusatz ein Sterin, insbesondere Cholesterin, enthalten kann.
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Nach einem bevorzugten Verfahren zur Ausbildung dieser Umhüllung wird zuerst eine Dünnschicht aus Lipid an der Innenfläche eines Behälters ausgebildet. Im Laboratoriumsmaßstab wird als Behälter üblichen/eise eine Flasche oder ein Kolben mit rundem Boden verwendet. Gemeinsam nit einem organischen Lösungsmittel wird eine geringe Menge Lipid in den Kolben gegeben, und dieser v/ird sowohl geschüttelt wie gedreht, um eine Dünnschicht aus dem Lipid an der Innenfläche abzuscheiden. Diese Dünnschicht läßt man anschließend trocknen. Anschließend wird eine kleine Menge der gereinigten Hämoglobin-Lösung in den Kolben gegeben. Obwohl auch andere Maßnahmen zur Mikroverkapselung brauchbar sind,wird vorzugsweise das nachfolgende Verfahren angewandt:
Der Kolben wird in ein bei 37 C gehaltenes Wasserbad gegeben und der Einwirkung einer Ultraschallquelle, welche bei einer Frequenz von 50 000 Hz arbeitet, ausgesetzt. In Gegenv/art der Hämoglobin-Lösung und als Folge dieses Mischverfahrens bildet das Lipidrnaterial eine durchgehende Membran um die Hämoglobin-Lösimg, wonach die erfindungsgemäßen Zellen erhalten werden. Die Zellen v/erden anschließend von der extrazellulären Hämoglobin-Lösung abgetrennt und in einer geeigneten Trägerflüssigkeit suspendiert.
Die Materialien für die Umhüllung werden gewöhnlich aus der Gruppe der Phospholipide ausgewählt; repräsentative, brauch-
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bare Phospholipide gehören zu den Lecithinen, den Kephalinen und den Sphingomyelinen. Wie bereits oben ausgeführt, wird die Auswahl der Phospholipide auf Phospholipide beschränkt, die natürlicherweise im Organismus von Säugetieren und/oder Menschen vorkommen, um die Schwierigkeiten zu vermeiden, die aus Abwehrreaktionen des Körpers auf körperfremde Stoffe resultieren kennten. Ohne daß damit eine erschöpfende Aufzählung beabsichtigt ist, gehören zu brauchbaren Phospholipiden die nachfolgenden beispielhaften Verbindungen, nämlich Phosphatidsäure, Phosphatidylserin, Phosphatidylinositol, Phosphatidylcholin und Phosphatidylethanolamin.
Ergaenzend zur alleinigen Verwendung von Phospholipiden ist erfindungsgemäß festgestellt worden, daß der Zusatz eines Sterins wie etwa Gholesterins, die-jenigen Eigenschaften der Zellmembran, welche für die vorgesehene Verwendung angestrebt werden, stark verbessern.
Im Rahmen der Erfindung wird es deshalb bevorzugt, als Hüllmaterial Cholesterin gemeinsam mit einem oder mehreren Phospholipiden zu verwenden. Hierbei ist festgestellt worden, daß eine besonders gute und bevorzugte Umhüllung aus 3 Gew.-Teilen Ei -Lecithin und einem Gew.-Teil Cholesterin erhalten wird. In den nachfolgenden Beispielen wird dieses Hüllmaterial als "3ti-Material" bezeichnet.
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Als Hämoglobin-Lösung γ/ird vorzugsweise eine Lösung verwendet, welche diejenigen Ionen enthält, die üblicherweise im Plasma vorhanden sind. Darüberhinaus können jedoch auch andere Ionen vorhanden sein. Der pH-V/ert der Lösung wird vorzugsweise auf 7»4 eingestellt; darüberhinaus soll die Lösung vorzugsweise isoosmotisch gegenüber normalem Plasma sein.
Zur Herstellung der Dünnschicht aus dem Hüllmaterial an der Innenseite des Behälters werden die Ausgangsstoffe, insbesondere Cholesterin und Phospholipid, zuerst in einem inerten, leicht verdampfbaren organischen Lösungsmittel wie etwa Chloroform, gelöst, Dieses Lösungsmittel wird anschließend verdampft, wobei die Dünnschicht an der Behälterwand zurückbleibt.
Die nachfolgenden Beispiele dienen zur Erläuterung der Erfindung, ohne diese einzuschränken.
Beispiel 1:
60 mg 3:1 Material (3 Gew.-Teile Ei-Lecithin, 1 Gew.-Teil Cholesterin) wurden in einem 1 L Rundkolben unter sterilen Bedingungen in 30 ml reinem Chloroform bei 25°C gelöst. An den Kolben wurde Vakuum angelegt und die Lösung angenähert 15 min lang längs der Innenwand des Kolbens bewegt, wobei eine dünne, durchsichtige Schicht in Form eines Überzugs an
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2/3 der Innenwand des Kolbens ausgebildet wurde. In dieeen überzogenen Kolben wurden anschließend 10 ml Hämoglobin-Lösung eingebracht, welche 16 g/% Hämoglobin zusammen mit den anderen löslichen intrazellulären Bestandteilen von roten Blutkörperchen enthielt. Diese Lösung zeigte einai pH-v,rert von 7,4 und war gegenüber normalem Plasma isoosmotisch. Daraufhin wurde der Kolben bis zu seinem Hals in ein bei 37 C gehaltenes Wasserbad eingetaucht. Durch das Bad hindurch wirkte 15 min lang eine Ultraschallquelle mit einer Frequenz von 50 kHz auf den Kolben und seinen Inhalt ein. Danach wurden 10 ml einer Dispersion mit mikroverkapceltem Hämoglobin erhalten; die Teilchengröße der Mikrokapsel lag im Bereich von 1 bis 10 um. Diese Dispersion wurde 3 mal mit normaler Salzlösung gewaschen, und jeweils zentrifugiert und dekantiert, um das Endprodukt zu erhalten.
Anteile an Hämoglobin, die bei diesem Ansatz nicht verkapselt wurden, können in einem nachfolgenden Ansatz erneut verkapselt v/erden.
Beispiel 2:
14,4 mg Cholesterin, 43,2 ^TSi-Leei thin und 2,4 mg Phosphatidsäure wurden bei 250C in einem 1 L Rundkolben unter sterilen Bedingungen in 25 ml reinem Chloroform gelöst. An den Kolben wurde Vakuum angelegt und die Lösung angenähert 15 min lang
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längs der Innenwand des Kolbens bewegt, v/obei eine dünne, durchsichtige Schicht erhalten wurde, die in Form eines Überzugs 2/3 der Innenwand des Kolbens bedeckte. In diesen überzogenen Kolben wurden anschließend 10 rnl Hämoglobin-Lösung gegeben, welche 15,7 g/% Hämoglobin einschl. anderer üblicher löslicher intrazellulärer Bestandteile in einer isotonischen Salz-Lösung enthielt. Darüberhinaus wurde das Verfahren nach Beispiel 1 wiederholt.
Beispiel 3:
20 mg Cholesterin und 100 mg Ei-Lecithin wurden unter stei'ilen Bedingungen in einem 1 L Rundkolben in 25 ml reinem Chloroform gelöst. Anschließend wurde im v/esentlichen das Verfahren nach Beispiel 1 v/iederholt, lediglich mit der Abweichung, daß eine Hämoglobin-Lösung mit 14,71 g/% Hämoglobin einschl. anderer üblicher, löslicher, intrazellulärer Bestandteile, in isotonischer Salz-Lösung verwendet wurde.
Beispiel 4:
30 mg Cholesterin, 80 mg Ei-Lecithin und 10mg Phosphatidylserin wurden unter sterilen Bedingungen in einem 1 L Rundkolben in 25 ml reinem Chloroform gelöst. Die restlichen Maßnahmen erfolgten analog zu Beispiel 3.
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Beispiel 5:
Im wesentlichen wurde das Verfahren nach Beispiel 1 wiederholt; abweichend davon wurde eine Hämoglobin-Lösung mit 22 g/% Hämoglobin einschl. anderer üblicher löslicher intrazellulärer Bestandteile in isotonischer Salz-Lösung verwendet.
An den nach Beispiel 1 erhaltenen Mikrokapseln mit verkapseltem Hämoglobin wurden Versuche zur Absorption von
Sauerstoff durchgeführt.
Hierzu wurden Gasgemische mit variablen Anteilen von Sauerstoff, Stickstoff und Kohlendioxid unter einem Gesamtdruck von 1 Atmosphäre mit Proben des erfindungsgemäß verkapselten Hämoglobins zusammengebracht, und mittels spektrophotomeirischer Methoden die relative Sättigung des Hämoglobins mit
Sauerstoff bestimmt. Die ermittelten Ergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle aufgeführt:
Sauerstoffpartialdruck Kohlendioxidpartialdruck Sättigung mit (mm Hg) (mm Hg) Sauerstoff (#
— — ——
20 45 20,7
3o 42 46,3
40 42 62,3
50 41 72,0
60 41 85,7
70 40 89,5
80 40 90,7 90
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Die Untersuchungen wurden bei einem pH-Wert von 6,35 und bei einer Temperatur von 220C durchgeführt; die erzielten Sättigungen mit Sauerstoff stimmen recht genau mit den Sättigungswerten überein, die unter den gleichen Bedingungen mit üblichem Gesamtblut erhalten werden.
Zur Durchführung der Mikroverkapselung wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung die Anwendung von Ultraschallenergie bevorzugt. Es können jedoch auch andere Maßnahmen vorgesehen v/erden, welche eine heftige Rührung des Mediums aus Hämoglobin, Lipid und Cholesterin gewährleisten. Auf jeden Fall ist es erforderlich, daß eine innige Vermischung des Hämoglobins mit den vorgesehenen Materialien für die Zellmembran erfolgt.
Die resultierende Zellgröße kann in ziemlich engen Grenzen geregelt werden, um zu gewährleisten, daß die erhaltenen Zellen die engen Kapillaren ungehindert passieren können. Die sich einstellende Zellgröße ist abhängig von solchen Faktoren wie etwa die Temperatur, die Viskosität, die Rührgeschwindigkeit, die Oberflächenspannung zwischen dem Membranmaterial und der wässrigen Phase mit dem zu verkapselnden Hämoglobin, sov/ie von weiteren physikalischen Parametern. Sofern eine Rührung bei niedrigeren Energieniveaus durchgeführt wird, als sie erfindungsgemäß vorgesehen sind, führt das zu einer verminderten Wirksamkeit bei der Zellbildung.
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In diesem Zusammenhang ist die Beobachtung interessant, daß sich bei dem erfindungsgemäßen Verfahren die Zellgröße im wesentlichen selbst regulierend einstellt. Zellen mit einer Teilchengröße über 10 um scheinen etwas unbeständig zu sein und zerfallen in kleinere Einheiten. Darüberhinaus können natürlich Liposome, die für den vorgesehenen Verwendungszweck zu groß sind, leicht durch Filtrieren abgetrennt werden.
Die erfindungsgemäßen Hämoglobin-Liposone v/eisen noch eine weitere bemerkenswerte Eigenschaft auf. Unter üblichen Bedingungen v/eisen rote Blutkörperchen eine geringfügige öberflächige elektronegative Ladung auf, die üblicherweise als "Zeta Potential" bestimmt v/ird. Unter solchen Meßbedingungen, die denen der obigen Versuche zur Sättigung mit Sauerstoff entsprechen, weisen rote Blutkörperchen Zeta-Potentiale im Bereich von -8 bis -17 mV auf. Durch eine ausgewählte Regelung der relativen Anteile der Bestandteile für die Zellmembranen kann bei der Herstellung der erfindungsgemäßen synthetischen Zellen das Zeta-Potential der Zellen ebenfalls in diesem Bereich gehalten v/erden; tatsächlich wurde an den nach Beispiel 3 erhaltenen Zellen ein Zeta-Potential von -22 mV bestimmt. Die im Rahmen dieser Erfindung eingesetzten verschiedenen Phospholipide weisen elektronegative Ladungen auf. Es wird angenommen, daß diese elektronegativen Ladungen sowohl bei den natürlichen roten Blutkörperchen wie
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bei den erfindungsgernäßen Zellen von physiologischer Bedeutung sind, um zusammen mit anderen Eigenschaften zu gewährleisten, daß sowohl die Zellen in dem Blutstrom voneinander getrennt bleiben, wie von den Y.'änden der Blutgefäße entfernt bleiben.
Bei den erfindungsgemäßen Hämoglobin-Liposomen weist die Zellmembran vorzugsweise eine zweischichtige Struktur auf; es können jedoch auch Membranen mit einer mehrschichtigen Struktur verwendet wex'den. Sofern eine ausreichende Mikroverkapselung des Hämoglobins gewährleiseet ist, wird es bevorzugt, daß die Zellwand so dünn wie möglich ist, um den AustauGch von Sauerstoff bzv/. Kohlendioxid zu fördern.
Aus obigen Angaben ist für den Fachmann ersichtlich, daß die erfindungsgemäßen Hämoglobin-Liposome lediglich solche Materialien enthalten, die auch in den Organismen von Säugetieren und/oder Menschen natürlicherv/eise vorkommen. Derartige Zellen können daher für Bluttransfusionen, beispielsweise in einer isotonischen Kochsalzlösung oder einem synthetischen Plasma f verwendet v/erden; hierbei ergibt sich eine vergleichsweise lange Aufenthaltsdauer im Körper des Wirtsorganismus im Vergleich zur Verwendung von freiem Hämoglobin; weiterhin werden die erfindungsgemäßen Zellen im Verlauf des natürlichen Stoffwechsels abgebaut und anschließend ausgeschieden.
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Darüberhinaus zeigen die erfindungsgemäßen Zellen eine größere Beständigkeit als übliche rote Blutkörperchen, so daß die erfindungsgemäßen Zellen auch bei Reaktionen, die außerhalb des lebendigen Körpers ablaufen, beispielsweise in Herz-Lungen-Maschinen oder künstlichen Nieren, mit Erfolg eingesetzt werden können. Darüberhinaus deuten die bisherigen Erfahrungen daraufhin, daß diese Zellen eine recht gute Lebensdauer aufweisen, welche deutlich über die 21 Tage hinausgeht, v/elche für Gesamtblut nach der Abnahme zulässig ist. Bei einem pH-Wert von 6,5 ist festgestellt worden, daß nach einer Aufbewahrung von 2 Wochen noch 50% des Hämoglobins der erfindungsgemäßen Liposomen aktiv war; nach einer Aufbewahrungsdauer von 6 Wochen waren noch 25% des Hämoglobins der erfindungsgemäßen Liposomen aktiv. Bei einer Aufbewahrung bei einem pH-Wert von 7,4 werden noch bessere Ergebnisse erwartet.
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Claims (17)

  1. BLUMBACH · WESER · BERGEN · KRAMER ZWIRNER · HIRSCH · BREHM
    PATENTANWÄLTE IN MÜNCHEN UND WIESBADEN 2725696
    Palenlconsult RadedcestraBe 43 80C0 München 60 Telefon (069) d83o03/883604 Telex 05-212313 Telegramme Palentconsull Patentconsult Sonnenberger Straßo 43 6200 Wiesbaden Telefon (06121) 562943/561998 Telex 04-186237 Telegramme Palenlconsull
    University of Illinois Foundation ?. Juni 1977
    224 Illini Union, AS-01
    Urbana, Illinois 61801,
    U. S. A.
    Synthetisches Liposom und Verfahren zur Herstellung
    Patentansprüche:
    Synthetisches Liposom,
    gekennzeichnet durch
    eine Mikrokapsel mit einem Kern aus Hämoglobin und einer Hülle aus einer Lipidmembran.
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    MUnchen: R. Kramer Dipl.-Ing. . W. Weser Oipl.-Phys. Or. rer. nal. · P. Hirsch Dipl.-Ing. · H. P. Brehm Dipl.-Chem. Dr. phil. nal. Wiesbaden: P.G. Blurtibach Dipl.-Ing. . P.Bergen Dipl.-Ing. Dr. jur. · G. Zwirner Dipl.-Ing. Dipl.-W.-Ing.
    ORIGINAL INSPECTED
  2. 2. Liposom nach Anspruch 1, dadurch .gekennzeichnet, daß die Lipidroeiribran ein Sterin enthält.
  3. 3. Liposom nach den Ansprüchen 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Lipid ein Phospholipid ist.
  4. 4. Liposom nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Lipid ein Phospholipid und das Sterin Cholesterin ist.
  5. 5. Liposom nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Membran eine solche Durchlässigkeit aufweist, daß Sauerstoff und Kohlendioxid leicht durch die Membran hindurchtreten kann.
  6. 6. Liposom nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß das Liposom eine solche Größe und Biegsamkeit aufweist, daß es ungehindert die I.apillargefäße von Säugetieren und Menschen zu passieren vermag.
  7. 7. Verfahren nach einem der Ansprüche 4 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß
    das Phospholipid aus der nachfolgenden Gruppe von Substanzen ausgewählt ist, nämlich der Lecithins, der Kephaline, sowie der Gemische dieser Substanzen. 709851/0960
  8. 8. Liposom nach einem der Ansprüche 4 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß als Phospholipid sowohl Lecithin wie Phosphatid säure vorhanden sind, und
    das Gewichtsverhältnis der Summe aus Lecithin und Phosphatidsäure zu Cholesterin angenähert 3 : 1 beträgt.
  9. 9. Liposom nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß das Hämoglobin stroma-frei ist.
  10. 10. Liposom nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß das Lipid mit dem Organismus von Säugetieren und/oder Menschen verträglich ist.
  11. 11. Liposom nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Sterin ein natürlich vorkommendes Sterin ist.
  12. 12. Liposom nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß die Teilchengröße der Mikrokapsel (größte Ausdehnung) 1 bis 10 ρ beträgt.
  13. 13. Liposom nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß das Liposom unter physiologischen Bedingungen eine elektro-
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    negative Ladung aufweist.
  14. 14. Liposom nach einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß das Liposom in Verbindung mit einem flüssigen Träger mit dem Gewebe von Menschen und/oder Säugetieren verträglich ist.
  15. 15. Liposom nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß als flüssiger Träger eine physiologisch verträgliche Salzlösung verwendet wird.
  16. 16. Verfahren zur Herstellung des synthetischen Liposoms nach einem der Ansprüche 1 bis 15, dadurch gekennzeichnet, daß stroma-freies Hämoglobin mit einer Schicht aus Phospholipid verkapselt wird.
  17. 17. Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß dem Phospholipid Cholesterin zugesetzt wird.
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