DE2824089A1

DE2824089A1 - Schnellverfahren zur bestimmung von kollagen in fleisch und fleischprodukten

Info

Publication number: DE2824089A1
Application number: DE19782824089
Authority: DE
Inventors: Daniel B Samchuck; David L Stern
Original assignee: Baltimore Spice Co
Current assignee: Baltimore Spice Co
Priority date: 1977-06-02
Filing date: 1978-06-01
Publication date: 1978-12-14
Also published as: US4094646A; SE7806143L

Description

DR. E. WIEGAND D:PL.-:Nü. W. NIEMANK DR. M. KÖHLER DIPL.-ING. C GERNHARDT

MÖNCHEN HAMBURG 2824

TELEFON: 55547« ~0k~ 8000 M ON CH EN 2, TELEGRAMME: KARPATENT MATHI LDENSTRASSE 12 TELEX: 529068 KARP D

¥. 43 167/78 7/RS 1. Juni 1978

The Baltimore Spice Company-Garrison, Maryland (V.St.A.)

Schnellverfahren zur Bestimmung von Kollagen in Fleisch und Fleischprodukten

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Die Erfindung "bezieht sich auf ein schnelles, verläßliches und reproduzierbares Verfahren zum Bestimmen oder Untersuchen von Kollagen in Fleisch. Insbesondere bezieht sich die Erfindung auf eine Verbesserung der Verfahren zur Bestimmung von Kollagen, wie sie zur Zeit in den Vereinigten Staaten von Amerika und in Europa praktisch ausgeübt werden.

Bei einem gewöhnlich praktisch ausgeführten Verfahren zum Bestimmen oder Untersuchen von Kollagen in Fleischproben umfaßt die Arbeitsweise eine Entfettung des Fleisches, eine Gefriertrocknung der Probe vor der Hydrolysierung der Aminosäuren in der Probe, darauf eine Hydrolysierung der Aminosäuren mit nachfolgender Abtrennung der genannten Säuren durch Chromatographie, Eluieren des Hydroxyprolin und schließlich erfolgende KoIorimetrische Messung des Hydroxyproline. Das Verfahren ist zeitraubend und dauert zu lange und ist zu kompliziert, um als Produktionsgerät selbst in einem Laboratorium massiger Größe in einer Anlage zur Behandlung von Fleisch und Fleischprodukten brauchbar zu sein.

Laboratoriumsverfahren zur Bestimmung von Hydroxyprolin sind in der Literatur beschrieben (vgl. z.B. Neuman and Logan, J. Biological Chemistry 184, 299 (195o) and Prockop and Udenfriend, Analytical Biochemistry, 1» 228 (i960)), .aber diese Verfahren sind nicht bei technischen Arbeitsweisen praktisch ausgeführt worden.

Es ist bekannt, daß in Europa ein etwas einfacheres Verfahren in Gebrauch ist, bei dem der Kollagengehalt der Fleisch- und Wurstprodukte durch eine Bestimmung des in ihm befindlichen Hydroxyprolins festgestellt wird. Bei diesem Verfahren wird eine abgewogene Menge von fein zerklei-

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-A-

»ertem Fleischprodukt lose in Metallfolie (Stanniol) eingepackt und das sich ergebende Paket wird in einen Glaskolben gegeben, in den eine saure Lösung von Zinnchlorid eingeführt -wird. Die Lösung -wird erhitzt und während 16 bis 36 h auf Temperatur, lange genug, um vollständig die gesamten Aminosäuren zu hydrolysieren, gehalten. Die sich ergebende Lösung wird gewaschen, in einen Meßkolben gegeben, auf das gewünschte Ausmaß verdünnt,und dann wird der HydroxyproTingehalt mittels eines Kolorimeters abgelesen.

Die Erfindung geht von dem vorgenannten Verfahren aus und ist auf eine Ausgestaltung der Bedingungen gerichtet, unter denen die Hydrolysestufe durchgeführt wird, so daß eine -weniger als vollständige Hydrolyse ausgeführt T?ird zusammen mit einer vollständigen Zerstörung des Tryptophans in der Probe, wodurch weniger als etwa 1 1/2 h für eine genaue Bestimmung des Kollagengehalts einer 3?leischprobe oder eines Fleischprodukts erforderlich sind.

Die Erfindung wird nachstehend anhand eines Beispiels naher erläutert.

Beispiel

5 g Fleischprodukt werden lose in ein Stück von Stanniolfolie von annähernd 25 x 25 mm (2 inch Quadrat) eingewickelt. Das sich ergebende Paket wird in einen 25o al-Kolben eingebracht. 3o ml einer Zinnchlorid-SalzsäurelSsung, die durch Aufschlämmen von 17,5 g SnCl₂ in I4o ml Wasser xtnd 35o ml HCl (37?0 hergestellt worden ist, wird zugegeben.

Die sich ergebende Mischung wird 33 min in einem Kolben gekocht, der mit einem Luftkondensator und einer Destilliersäule ausgestattet ist. Das Ende der Destillier-

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säule ist in 9oo ml Wasser eingetaucht, dem 1 g NaOH zugegeben worden ist. Wenige Tropfen Phenolphthalein sind als Indikator hinzugefügt. Am Ende der 33 min wird der Kolben entfernt, und das Destillat wird von der Innen« seite des Luftkondensators und des Kolbens abgewaschen. Der Inhalt wird einige Minuten abkühlen gelassen und dann in einen volumetrischen Kolben von 5oo ml überführt. Wasser wird bis zu der 5oo ml-Marke zugegeben.

Die Lösung wird dann durch ein 15 cm-Filterpapier filtriert. Es werden zwei saubere Glasrohre erhalten und 7,5 ml Chloraminpuffer wird zu jedem Rohr zugegeben. Der Chloraminpuffer wird wie folgt hergestellt:

Eine erste Pufferlösung (pH-Wert 6,o) wird durch Auflösen der folgenden Substanzen in Wasser hergestellt:

25 g Citronensäure
17 g NaOH

6 ml CHxCOOH (konzentriert)
6o g Natriumacetat . 3^0.

Wasser wird zur Aufhellung auf 5oo ml zugegeben und dann werden 5 Tropfen Toluol als Konservierungsmittel hinzugefügt.

25o ml der obengenannten Pufferlösung (pH-Wert 6,o) werden mit 122 ml n-Propanol und 5o ml Wasser gemischt, um eine zweite Propanol-Pufferlösung zu bilden.

Die endgültige Chloramin-Pufferlösung, die zu den Glasrohren zugesetzt wird, wird dadurch hergestellt, daß man 1,41 g Chloramin T zu 2oo ml Wasser und 9o ml der Propanol-Pufferlösung zugibt.

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In dem ersten Glasrohr wird 1/2 ml ¥asser eingebracht und dazu 7,5 ml Chloramin^-Pufferlösung zugegeben, dies dient als Kontrollmuster. Das Rohr wird mit einem Stopfen versehen, von Hand geschüttelt, um ein gründliches Mischen zu gewährleisten,und Io min stehengelassen.

In das zweite Glasprüfrohr wird 1/2 ml des Filtrats von der Fleischprobe mit 7,5 ml Chloramin-Pufferlosung eingebracht. Das Rohr wird mit einem Stopfen versehen, von Hand geschüttelt, um ein gründliches Mischen zu gewahrleisten, und wird auch Io min neben der Kontrollglaszelle, welche 1/2 ml Wasser enthält, stehengelassen.

Am Ende von Io min werden 2,5 ml eines frisch bereiteten Farbreagens zu beiden Glasrohren zugegeben. Dieses Reagens wird durch Suspendieren von 15 g 4-Dimethylaminobenzaldehyd in 62 ml n-Propanol hergestellt, wonach 26 ml 6o#ige Perchlorsäure (HClO^) langsam hinzugegeben und die sich ergebende Lösung abkühlen gelassen wird.

Das Farbreagens wird zu dem Glasrohr, welches das Filtrat enthält, und zu dem Kontrollrohr, das Wasser enthält, zugegeben. Dann werden die Rohre lose mit einem Stopfen versehen und in einen Heizblock bei 6l°C 15 min eingebracht. Darauf wurden beide Glasrohre mit einem Stopfen dicht verschlossen und unter kaltem Leitungswasser gekühlt. Nach 4 min wurde das Kontrollmuster aus dem Kühlverfahren herausgenommen, in das Kolorimeter eingesetzt und auf loo% standardisiert. Am Ende von 5 min Abkühlung wurde das Glasrohr, welches 1/2 ml des Filtrats der Fleischprobe enthielt, aus dem Kühlverfahren herausgenommen, in das Kolorimeter eingesetzt, und es wurde eine Ablesung vorgenommen.

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Die folgende. Tabelle gibt die Umwandlungsfaktoren für ein solches Kolorimeter. Für Kollagenprozentsätze, die größer als 5% sind, kann eine Verdünnung ausgeführt werden, indem man 1/4 ml des Filtrats anstatt 1/2 ml zugibt, und die Endergebnisse auf der Umwandlungstabelle können durch den entsprechenden Faktor 2 multipliziert werden.

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Kollagenumwandlungstabelle

Kolorimeter-	% Kollagen
ablesung
0,915 : -	0,188
0,880	■- 0,282
0,847	0,376
0,815	0,471
0,785	. 0,565
0,756	0,659
0,727	0,753
0,700	0,847
0,674. _m '	0,941
0,648	♦ 035
0,624	»129
0,600	'1,226
0,578"	' 1,323
0,556	1,419
0,536	1 ,505
0,515 ·	1,602
0,496	' 1,699
0,478	1,785
0,460	1,882
0,442	:. 1,978
0,426 .	2,075
0,410	2·, 161
0,394	2,258
0,380	2,355
Q,365	• .2,452
0,352 ..	2,538
0,339	2,634
0,326 '	2,731
0,314	2,828
0,302	2,914
0,291	3,011

Kolorimeter-	% Kollagen
ablesung
0,280	3,108
0,269	3_t204
0,259 ' ■	• 3,290
0,249	3,387
0,240	'. 3,484
0,231	- .3,581
0,222	3,667
0,214*	3,763
0,206 '	. 3,860
0,199	3,956
;0,187	.4,043
0,184	4 ,139
0,177 ·	4,237
0,170	. 4,334
0,164	Ά ,419
0,158..	4, 516
0,152 "	• 4,613
0,146 . ·	4,710
0,141	4 ,'796
0,135-	. 4,892
.0,130/	4#989
0,125	5,086
0,121 ·	5,172
0,115	5,269
0,112 . .	5,366
0,108 .. . -	5,462
0,104	• 5,548
0,099	5*645
0,096	5,742
0,092	5,839

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Die beschleunigte Arbeitsweise gemäß der Erfindung ist auf die vollständige Zerstörung des Tryptophans und die unvollständige Hydrolyse des Hydroxyprolin bis zu einem bekannten Ausmaß gegründet. 33 min Kochen ergeben 42% Hydrolyse des Hydroxyproline, weniger als 2o min gewährleistet keine vollständige Zerstörung des Tryptophans, mehr als 1 h Kochen scheint nichts zu der Verläßlichkeit hinzuzufügen. Offensichtlich muß die Kolorimeterablesung mit der prozentualen Hydrolyse übereinstimmen, wobei die vorstehende Tabelle für eine solche Hydrolyse gegeben ist. Bei dem Verfahren gibt keine der anderen Aminosäuren als Hydroxyprolin und Tryptophan eine Reaktion mit dem obenbeschriebenen farberzeugenden Mittel. Das Tryptophan muß daher beseitigt werden, um eine Ablesung des Hydroxyprolins zu gestatten.

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Claims

Patentansprüche

Schnellverfahren zur Bestimmung von Kollagen in einer Probe von Fleisch oder Fleischprodukten, dadurch gekennzeichnet, daß man die Aminosäuren in der Probe unter derartigen Bedingungen hydrolysiert, daß das gesamte Tryptophan in ihr zerstört wird und nur ein Anteil des darin befindlichen Hydroxyprolins hydrolysiert wird und daß dann der Prozentsatz von Kollagen kolorimetrisch bestimmt wird, indem man .den Prozentsatz von Hydroxyprolin, der hydrolysiert und extrahiert worden ist, abliest.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Hydrolyse in einer angesäuerten Lösung von Zinnchlorid (SnCl₂) ausgeführt wird.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Hydrolyse dadurch ausgeführt wird, daß man die Probe zwischen 2o min und 9o min in der angesäuerten Lösung von Zinn(ll)-chlorid kocht.

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