DE2902677C2 - - Google Patents

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DE2902677C2
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    • C07D263/02—Heterocyclic compounds containing 1,3-oxazole or hydrogenated 1,3-oxazole rings not condensed with other rings
    • C07D263/30—Heterocyclic compounds containing 1,3-oxazole or hydrogenated 1,3-oxazole rings not condensed with other rings having two or three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D263/34—Heterocyclic compounds containing 1,3-oxazole or hydrogenated 1,3-oxazole rings not condensed with other rings having two or three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members with hetero atoms or with carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals, directly attached to ring carbon atoms
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    • Y10S436/801—Electron dense compounds, e.g. ferritin

Description

Die Erfindung betrifft ein Reagenz für Immunoassays, das unlöslich gemachte Antikörper oder Proteinantigene enthält, sowie dessen Verwendung und ein Verfahren zu seiner Herstellung.
Bekanntlich werden unlöslich gemachte Antikörper und Antigene als Reagenzien bei verschiedenen Immunoassays verwendet. Diese Reagenzien werden normalerweise hergestellt, indem man entweder das Antigen oder den Antikörper an einen wasserunlöslichen Träger adsorbiert oder Antikörper oder Antigen an einen wasserunlöslichen Träger kovalent bindet, wobei eine bifunktionelle Brückengruppe eingesetzt wird. Unter den am allgemeinsten verwendbaren bifunktionellen Brückengruppen sind die Dialdehyde, wie beispielsweise Glutaraldehyd, zu nennen. Derartige Brückengruppen reagieren leicht mit freien Aminogruppen im Antikörper oder im Proteinantigen.
Bei vielen Immunoassayverfahren, bei denen unlöslich gemachte Antikörper oder Proteinantigene verwendet werden, treten die wohlbekannten immunospezifischen Reaktionen zwischen einem bestimmten Antikörper (oder Antigen) und dessen entsprechendem Antigen (bzw. Antikörper) auf. Bekanntlich gibt es in den Proteinmolekülen bestimmte aktive Stellen, die für derartige Umsetzungen spezifisch sind, und es ist weiter bekannt, daß an diesen aktiven Stellen oder ihnen benachbart freie Aminogruppen sitzen. Wenn ein Antikörper (oder Proteinantigen) durch kovalentes Überbrücken gemäß den üblichen Verfahren unlöslich gemacht wird, werden daher die aktiven Stellen in gewissem Ausmaß blockiert.
Dadurch wird die Aktivität des Proteins bei einer folgenden immunspezifischen Reaktion, wie beispielsweise bei einem Immunoassay, verringert, was von Nachteil ist.
Aus der Literaturstelle "Annual Review of Biochemistry" 35, 873-880 und 896-908 (1966) ist auch schon die Alkylierung von Amino- und Thiolgruppen von Proteinen mit Bromacetylcellulose als Träger bekannt. Dabei wird als Brückenmittel eine Substanz mit einer freien funktionellen Gruppe verwendet, die sich eher an die im Protein vorhandenen Schwefelatome als an die Aminogruppen bindet. An der Bindung eines Proteins an ein ebenfalls im Protein enthaltendes Substrat bestand jedoch noch immer ein Bedarf.
Gegenstand der Erfindung ist ein Reagenz zur Verwendung bei Immunoassays, enthaltend ein Proteinantigen, einen Antikörper oder die F(ab')₂-Untergruppen eines Antikörpers, der bzw. die kovalent an ein wasserunlösliches Substrat über eine Brückengruppe gebunden ist bzw. sind, wobei die Brückengruppe unmittelbar an Schwefelatome in dem Antigen, dem Antikörper bzw. den Untergruppen eines Antikörpers gebunden ist; das Reagenz ist dadurch gekennzeichnet, daß das Substrat ein Protein enthält, an das die Brückengruppe unmittelbar gebunden ist.
Gegenstand der Erfindung ist weiterhin die Verwendung eines Reagenzes gemäß der Erfindung zur Durchführung eines Immunoassays mit einer immunspezifischen Reaktion zwischen einem Antigen und einem Antikörper oder F(ab')₂-Untergruppen.
Gegenstand der Erfindung ist schließlich ein Verfahren zur Herstellung eines Reagenzes gemäß der Erfindung, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man ein Proteinantigen oder einen Antikörper oder die F(ab')₂-Untergruppen davon mit einem Brückenreagenz unter kovalenter Bindung des Brückenreagenzes unmittelbar an Schwefelatome in dem Antigen, dem Antikörper oder den Untergruppen davon umsetzt, wobei vor oder nach der Umsetzung das Brückenreagenz kovalent an das wasserunlösliche, das Protein enthaltende Substrat gebunden wird.
Antikörper-Immunglobuline enthalten eine Anzahl von Polypeptidketten, die in bestimmten Abständen durch Disulfidbindungen miteinander verknüpft sind. Die Ketten selbst können ebenfalls Disulfidgruppen enthalten. In einer bevorzugten Durchführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens werden die Disulfidbindungen einer milden Reduktion zu Sulfhydrylgruppen -SH unterworfen, wobei diese dann mit der einen funktionellen Gruppe eines bifunktionellen Brückenmittels umgesetzt werden. Die genannte funktionelle Gruppe ist eine, die eher mit -SH-Gruppen als mit freien Aminogruppen reagiert. Eine derartige bevorzugte funktionelle Gruppe ist eine Chloracetylgruppe, wie beispielsweise die Monochloracetylgruppe -CO-CH₂-Cl (I).
Die andere funktionelle Gruppe des bifunktionellen Brückenmittels reagiert mit dem wasserunlöslichen, ein Protein enthaltenden Substrat, an das der Antikörper oder das Proteinantigen gebunden werden soll. Das Substrat kann beispielsweise in Folienform oder in Form eines Rohres vorliegen. Im letztgenannten Fall kann das Antigen oder der Antikörper an der Innen- oder der Außenseite des Rohres oder an beiden Seiten immobilisiert werden. Vornehmlich liegt das Substrat jedoch in Teilchenform vor, und die Reagenzien gemäß der Erfindung können dann beispielsweise aus den Teilchen in Suspension in einer wäßrigen Flüssigkeit bestehen, die zweckmäßigerweise einen Puffer enthalten kann. In einer bevorzugten Durchführungsform ist das teilchenförmige Substrat magnetisch anziehbar, so daß es leicht durch Anwendung eines Magnetfeldes aus einem Gemisch abgetrennt werden kann. Die Verwendung von teilchenförmigem Material in Immunoassays ist bekannt. Ein besonders bevorzugtes teilchenförmiges Substrat besteht aus Latexteilchen.
Die Art des Materials, aus dem das Substrat zusammengesetzt ist, ist nicht von entscheidender Bedeutung. Künstliche polymere Materialien, die wasserunlöslich sind, können zur Ausbildung des Substrats verwendet werden, wobei derartige Substrate mit einem reaktionsfähigen Proteinüberzug versehen werden. Ein typisches Protein, das sich für diesen Zweck eignet, ist Albumin. In derartigen Fällen enthält die Brückengruppe als eine funktionelle Gruppe eine Gruppe, die leicht mit Albumin reagiert. Zwar sind mehrere derartige Gruppen bekannt, jedoch wird gemäß einem bevorzugten Merkmal der Erfindung ein Anhydrid verwendet, das bevorzugt als ein solches der Formel
vorliegt. Eine derartige Gruppe reagiert leicht mit freien Aminogruppen eines Proteins, wie beispielsweise des Albumins.
Zur Herstellung eines erfindungsgemäßen Reagenzes, in dem ein Antikörper oder ein Proteinantigen kovalent an ein Protein, wie beispielsweise Albumin, gebunden ist, wird vorzugsweise eine bifunktionelle Brückensubstanz verwendet, die an dem einen Ende die Chloracetylgruppe I und am anderen Ende die Anhydridgruppe II aufweist. Eine besonders bevorzugte Klasse für derartige Brückenmittel ist diejenige der allgemeinen Formel
worin n eine ganze Zahl von 1 bis 10 und vorzugsweise 4 bedeutet. Diese Verbindungen sind selbst neu und als solche Gegenstand der Erfindung. Die Verbindung gemäß Formel III mit n = 4 wird im folgenden als "NCA" bezeichnet.
Wenn wie bei der Verbindung NCA und den anderen Verbindungen der Formel III das Brückenmittel eine funktionelle Gruppe enthält, die leicht mit den Aminogruppen des Proteins reagiert, ist es wichtig, sicherzustellen, daß diese funktionelle Gruppe nicht mit freien Aminogruppen in dem Antigen, dem Antikörper bzw. den F(ab')₂-Untergruppen davon reagiert. Das kann dadurch geschehen, daß man beispielsweise das Brückenmittel zunächst mit dem wasserunlöslichen Träger umsetzt und lediglich danach mit dem Immunglobulin- Antikörper oder Proteinantigen in Berührung bringt.
Im folgenden wird ein Beispiel für ein Verfahren zur Herstellung eines Reagenzes gemäß der Erfindung beschrieben. Latexteilchen werden mit Albumin (oder einem anderen Protein oder Polypeptid, wie Lactoferrin) überzogen, wobei das Albumin an die Latexteilchen adsorbiert wird. Im Falle eines Sulfidgruppen enthaltenden Überzuges, die mit den Brückengruppen reagieren können, wie beispielsweise im Falle einer Beschichtung mit Albumin, wird das Beschichtungsmaterial (vor oder nach Ausbildung der Beschichtung) alkyliert; um derartige Gruppen zu zerstören oder zu inaktivieren. Die mit Albumin überzogenen Teilchen werden anschließend etwa 24 h bei neutralem pH-Wert (beispielsweise 7,1) mit NCA bebrütet, und die Anhydridgruppen des NCA reagieren mit den Aminogruppen an dem Albumin. (Alternativ kann das NCA zunächst an das alkylierte Albumin gekuppelt werden, und die Teilchen können mit der erhaltenen Verbindung beschichtet werden.)
Der Antikörper wird unter milden Bedingungen reduziert (beispielsweise mit Dithiothreit), um an ihm Sulfhydrylgruppen zu erzeugen. Anschließend wird er mit den Latex-Albumin-NCA-Teilchen vermischt und das Ganze bei Raumtemperatur 36 h bebrütet. Der Antikörper reagiert mit den Chloracetylgruppen am NCA und wird somit kovalent über das NCA an das Albumin gebunden.
Von den verschiedenen Antikörper-Immunglobulinen ist das IgG das gebräuchlichste. Bekanntlich nehmen IgG-Moleküle leicht die Form eines Y an, wobei die beiden oberen Glieder (F(ab')₂-Anteile) an ihren äußeren Enden die Stellen für die Antigenbindung enthalten und das untere Glied (F(c)-Anteil) unter anderem Stellen enthält, an denen beispielsweise Umsetzungen mit dem Rheumatoidfaktor und der Komponente C1q ablaufen. Die Stelle, an der die drei Glieder des Y zusammenstoßen, wird der Verzweigungsbereich (hinge area) genannt. In diesem Bereich treten Disulfidbindungen zwischen benachbarten Polypeptidketten auf, und vermutlich mit diesen Bindungen reagieren die bevorzugten Brückenreagenzien gemäß der Erfindung. Es ergibt sich deshalb, daß die Brückengruppen die Antigenbindungsstellen an den F(ab')₂-Anteilen der Moleküle nicht stören.
Erfindungsgemäß ist es bevorzugt, eine Brückengruppe zu verwenden, die eine Kette von mindestens 5 Atomen Länge enthält (noch stärker bevorzugt sind Brückenreagenzien gemäß Formel III, in denen n 4 oder größer ist), um den Antikörper (beispielsweise IgG) oder das Antigen in einer gewissen Entfernung von der Substratoberfläche, an die sie gebunden sind, zu halten. Dies führt dazu, daß das Antigen oder der Antikörper für Umsetzungen besser zugänglich sind als bei früheren Verfahren, bei denen beispielsweise als Brückensubstanzen Bromcyan oder Glutaraldehyd verwendet werden. Somit wurde gefunden, daß die Aktivität eines Antikörpers an einem erfindungsgemäßen Reagenz unter Verwendung von NCA sehr viel größer ist als in dem Fall, wenn derselbe Antikörper unmittelbar an das Substrat adsorbiert worden ist. Beispielsweise ist die Empfindlichkeit des Tests bei einem Agglutinierungsassay unter Verwendung von Latex-Rinderserumalbumin-NCA-Antikörper und -Antigen etwa 50mal größer als in dem Fall, in dem der Antikörper lediglich unmittelbar an den Latex adsorbiert war (in diesem Falle war das Antigen Pferdeferritin und der Antikörper Kaninchenantifferritin).
Gegenstand der gleichzeitig eingereichten Patentanmeldung P 29 02 676.4-52 ist ein Verfahren zur Durchführung eines Immunoassays, bei dem anstelle des Gesamtimmunglobulins die F(ab')₂-Untergruppen davon verwendet werden. Die Reagenzien gemäß der Erfindung können anstelle des Antikörpers auch die F(ab′)₂-Untergruppen davon enthalten. Derartige Reagenzien können in äußerst vorteilhafter Weise unter Verwendung der Verbindungen gemäß Formel III, vorzugsweise von NCA, wie folgt hergestellt werden. Nach Herstellung der Latex-Albumin-NCA-Antikörperteilchen, bei denen der Antikörper beispielsweise IgG ist, wie oben ausführlich beschrieben, werden die Teilchen mit Pepsin digeriert. Dies führt zur Bildung von Latex-Albumin-NCA-F(ab')₂, d. h. die F(c)-Untergruppe ist nicht länger anwesend. Am meisten bevorzugt ist es, daß die Reagenzien gemäß der Erfindung, die die F(ab')₂-Untergruppen von IgG enthalten, praktisch frei von dem entsprechenden Gesamt-IgG und den F(c)-Untergruppen sind.
Die erfindungsgemäßen Reagenzien können in einer großen Vielfalt von Immunoassayverfahren verwendet werden, wie dem Fachmann klar ist. Eine Möglichkeit besteht darin, daß man
  • a) ein Gemisch einer Probe der Flüssigkeit mit einem erfindungsgemäßen Reagenz, das einen Antikörper oder eine F(ab')₂-Untergruppe davon, die an das zu bestimmende Antigen gebunden werden, enthält, herstellt,
  • b) das Gemisch zur Ermöglichung der Umsetzung bebrütet und
  • c) das Gemisch zur Bestimmung des Ausmaßes der Umsetzung und dadurch der Menge an Antigen in der Flüssigkeitsprobe untersucht.
Wenn ein Reagenz gemäß der Erfindung verwendet wird, das F(ab')₂-Untergruppen enthält, ist das Umsetzungsgemisch vorzugsweise praktisch frei von dem entsprechenden Immunglobulin und den F(c)-Untergruppen davon.
Ein analoges Verfahren kann zur Bestimmung eines Antikörpers in einer Flüssigkeit angewandt werden, wobei ein entsprechendes Proteinantigen verwendet wird, an das sich der Antikörper bindet.
Ein sehr bevorzugter Assay ist der Latexagglutinierungsassay. Bei diesem Assay wird ein Reagenz in der Form einer Suspension von Latexteilchen verwendet, wobei die Teilchen nach Umsetzung mit dem zu ermittelnden Antigen oder Antikörper agglutinieren. Das Ausmaß der Umsetzung wird durch Beobachten des Ausmaßes der Agglutinierung bestimmt, woraus sich die Menge an dem zu bestimmenden Antigen oder Antikörper in der Flüssigkeitsprobe ermitteln läßt. Am meisten bevorzugt ist es, das Ausmaß der Agglutinierung durch selektives Auszählen der nicht agglutinierten Latexteilchen zu bestimmen, die in dem Umsetzungsgemisch zurückbleiben.
Bei einem weiteren bevorzugten Assay enthält das Reagenz Teilchen, die anschließend aus dem Reaktionsgemisch abgetrennt werden, wobei entweder die abgetrennten Teilchen oder das zurückbleibende Gemisch oder beides analysiert werden, um die Menge an zu bestimmendem Antigen oder Antikörper festzustellen. Vorzugsweise sind die Teilchen magnetisch anziehbar und werden unter Anwendung eines Magnetfeldes abgetrennt. Die Verwendung von magnetischen Teilchen ist in der BE-PS 8 52 327 beschrieben.
Die Reagenzien gemäß der Erfindung können auf eine Vielzahl von Flüssigkeiten angewandt werden, jedoch werden üblicherweise am meisten menschliche Körperflüssigkeiten, wie Blut, Serum oder Plasma, untersucht.
Die Verfahren können manuell oder automatisch durchgeführt werden, beispielsweise nach dem Prinzip des kontinuierlichen Durchflusses, wobei einzelne Abschnitte des Reaktionsgemisches, getrennt durch Inertstoffsegmente, wie beispielsweise Luft, und gewünschtenfalls durch Abschnitte aus einer Waschflüssigkeit, eine Leitung entlanggeschickt werden.
Im allgemeinen können die teilchenförmigen Reagenzien gemäß der Erfindung eine beliebige zweckmäßige Teilchengröße aufweisen. Für die meisten Zwecke ist eine Teilchengröße von etwa 1 bis 20 µ geeignet. Besonders, jedoch nicht ausschließlich in dem Falle der Verwendung bei der kontinuierlichen Durchflußtechnik muß das spezifische Gewicht der Teilchen vorzugsweise etwa 1,4 bis 3,2 betragen (oder mindestens demjenigen der Flüssigkeit des Reaktionsgemisches benachbart sein), um ein übermäßiges Aufschwimmen oder Absetzen der Teilchen in dem fließenden flüssigen Reaktionsgemisch zu vermeiden.
Die Erfindung wird im folgenden an Hand von Beispielen näher erläutert.
Beispiel 1
Eine Serum- oder Plasmaprobe mit einem zu bestimmenden Gehalt an Antigen wird mit einer Suspension aus Latexteilchen vermischt, an die Antikörper gegenüber diesem Antigen gebunden sind. Das Gemisch wird in eine mit Luftabschnitten versehene Leitung geführt. Es wird in einer Verzögerungsschlange gehalten und dort 15 bis 20 min bei 50 Hz einer Vibrationsbehandlung unterzogen, um die starke Agglutinierung zu beschleunigen. Die Latexteilchen wurden nacheinander im Verhältnis 1 : 80 und noch einmal 1 : 80 verdünnt, so daß eine Endverdünnung von 1 : 6400 erhalten wurde. Anschließend wurden die Teilchen durch eine Zählapparatur geführt, die elektronisch speziell so modifiziert worden war, daß sämtliche nichtmonomeren Teilchen zurückgewiesen wurden.
Die Abnahme in der Monomerenanzahl ist direkt proportional der Konzentration an dem vorhandenen Antigen.
Beispiel 2 Herstellung des Reagenzes Latexteilchen
Dow, 0,794 µ Durchmesser (Standardabweichung (S.D.) 0,044 µ) No. 41943, Serva, Feinbiochemica, D-6900 Heidelberg 1 (10%ige Suspension).
Alkyliertes Rinderserumalbumin
Alkyliertes Rinderserumalbumin wurde wie folgt hergestellt. Eine Lösung von Rinderserumalbumin in 0,1m Phosphatpuffer vom pH 8,5 wurde mit dem fünfmolaren Überschuß von Dithiothreit vermischt und 1 h bei 37°C belassen. Das Dithiothreit reduziert das Rinderserumalbumin. Danach wird Jodessigsäure im zehnfachen Überschuß, bezogen auf Dithiothreit, zugesetzt. Nach 2 h Stehen bei Raumtemperatur wurde das Rinderserumalbumin abgetrennt und der alkalische Anteil an Sephadex G25 in einer Phosphatpufferlösung (0,1m, pH 7,2) ins Gleichgewicht gebracht.
Kuppeln von NCA an Rinderserumalbumin
Das alkylierte Rinderserumalbumin in 0,1m Phosphatpuffer vom pH 7,2 wurde mit 1/7 seines Gewichtes an NCA bei 4°C über Nacht bebrütet. Das Protein kann nach Dialyse bei pH 7 unmittelbar verwendet oder nach Dialyse in Ammonium­ bicarbonat lyophilisiert werden.
Kuppeln von Rinderserumalbumin/NCA an Latex
0,4 ml Phosphatpuffer vom pH 7,1 wurden in einem Glasrohr mit 250 g Rinderserumalbumin/NCA in Phosphatpuffer sowie 50 ml der 10%igen Latexsuspension vermischt. Kurz vor dem Gebrauch wurde der zu behandelnde Latex zweimal mit 0,1m Pufferlösung vom pH 9,6 gewaschen und dann erneut in demselben Puffer suspendiert.
Alkylierung von IgG
Antiferritinantiserum vom Schaf wurde unter milden Bedingungen in Dithiothreit wie folgt reduziert. Das IgG wurde 1 h in Gegenwart eines zweimolaren Überschusses von Dithiothreit in einer Lösung von 0,1m Bicarbonat vom pH 8,5 bebrütet.
Latex-Rinderserumalbumin/NCA-IgG
50 ml 10%iger Suspension von Latex-Rinderserumalbumin/NCA wurden mit 1 mg reduziertem IgG vermischt. Das Gemisch wurde 30 min mit Stickstoff durchspült und anschließend unter weniger als 5 mm Hg Druck in einem Glasrohr verschlossen und im Dunklen gehalten. Vor seiner Verwendung wurde es zweimal mit 1 ml Puffer aus 0,17m NaCl, 0,1m Glycin (pH 9,2) und 0,05% Tween 20 gewaschen und anschließend in 1%igem Rinderserumalbumin in demselben Puffer (0,27m), jedoch in Abwesenheit von Tween 20 suspendiert.
Assay
Der Agglutinierungsassay auf Ferritin im Serum wurde durchgeführt, wie oben beschrieben. Es wurden Sera mit 27 unterschiedlichen Ferritingehalten untersucht, wobei jedes Serum mehrere Male bestimmt wurde. Die Sera wurden außerdem nach dem Radioimmunoassay-Verfahren RAMCO untersucht. Der Korrelations­ koeffizient zwischen den beiden Assaymethoden betrug 0,92. Die Serumproben wurden bei einer Verdünnung von 20 : 1 dem Assay unterzogen und besaßen einen normalen Gehalt von 20 bis 300 µg Ferritin/l.

Claims (25)

1. Reagenz zur Verwendung bei Immunoassays, enthaltend ein Proteinantigen, einen Antikörper oder die F(ab')₂- Untergruppe eines Antikörpers, kovalent über eine Brückengruppe an ein wasserunlösliches Substrat gebunden, wobei die Brückengruppe unmittelbar mit Schwefelatomen in dem Antigen, dem Antikörper oder den Untergruppen verknüpft ist, dadurch gekennzeichnet, daß das Substrat ein Protein enthält, an das die Brückengruppe unmittelbar gebunden ist.
2. Reagenz gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Anteil der Brückengruppe, der unmittelbar an die Schwefelatome gebunden ist, von einer Monochloracetylgruppe abgeleitet ist.
3. Reagenz gemäß Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Brückengruppe eine Kette mit mindestens 5 Atomen Länge enthält, um das Antigen, den Antikörper oder die Untergruppe von dem Substrat räumlich zu trennen.
4. Reagenz gemäß Anspruch 1, 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß der Antikörper ein Immunglobulin G ist.
5. Reagenz gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Untergruppen die F(ab')₂-Untergruppen eines Immunglobulins G sind.
6. Reagenz gemäß Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß es praktisch frei von dem Immunglobulin G und den F(c)-Untergruppen davon ist.
7. Reagenz gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß derjenige Abschnitt der Brückengruppe, der an das Protein des Substrats gebunden ist, von einer Anhydridgruppe abgeleitet ist.
8. Reagenz gemäß Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Brückengruppe von einer Verbindung der Formel abgeleitet ist, worin n eine ganze Zahl von 1 bis 10 bedeutet.
9. Reagenz gemäß Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß n = 4.
10. Reagenz gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das Substrat in folienartiger Form oder in Röhrenform vorliegt.
11. Reagenz gemäß einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß das Substrat ein teilchenförmiges Material ist.
12. Reagenz gemäß Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß das Substrat ein Latex oder ein teilchenförmiges, magnetisch anziehbares Material ist.
13. Reagenz gemäß Anspruch 11 oder 12, dadurch gekennzeichnet, daß das als Substrat verwendete teilchenförmige Material in Suspension in einer wäßrigen Flüssigkeit vorliegt.
14. Reagenz gemäß Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß Suspension einen Puffer enthält.
15. Verwendung eines Reagenzes gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche zur Durchführung eines Immunoassays mit einer immunspezifischen Umsetzung zwischen einem Antigen und einem Antikörper oder F(ab')₂-Untergruppen.
16. Verwendung gemäß Anspruch 15, wobei bei Anwesenheit von F(ab')₂-Untergruppen das Umsetzungsgemisch frei von dem Proteinantikörper, aus dem die Untergruppen erhalten worden sind, sowie frei von den entsprechenden F(c)-Untergruppen gehalten wird.
17. Verwendung gemäß einem der Ansprüche 15 oder 16 auf der Grundlage des Prinzips des kontinuierlichen Durchflusses.
18. Verwendung gemäß einem der Ansprüche 15 bis 17 zur Bestimmung eines Antigens oder eines Antikörpers in menschlichem Serum.
19. Verfahren zur Herstellung eines Reagenzes gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Proteinantigen oder einen Antikörper oder die F(ab')₂-Untergruppen davon mit einem Brückenreagenz zur kovalenten Bindung des Brückenreagenzes unmittelbar an Schwefelatome in dem Antigen bzw. dem Antikörper oder den Untergruppen davon umsetzt und vor oder nach dieser Umsetzung das Brückenreagenz kovalent an das wasserunlösliche, das Protein enthaltende Substrat bindet.
20. Verfahren gemäß Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß man als Brückenreagenz ein solches mit einer terminalen Chloracetylgruppe verwendet, wobei die Schwefelatome in dem Antigen bzw. dem Antikörper oder den F(ab')₂-Untergruppen davon zu Sulphhydrylgruppen reduziert werden und die Chloracetylgruppe des Brückenreagenzes mit den Sulphhydrylgruppen unter Ausbildung einer kovalenten Bindung zwischen dem Brückenreagenz und dem Antigen bzw. dem Antikörper oder den F(ab')₂-Untergruppen davon umgesetzt wird.
21. Verfahren gemäß Anspruch 19 oder 20, dadurch gekennzeichnet, daß das Brückenreagenz mit einer zweiten terminalen Gruppe mit den freien Aminogruppen des Proteins unter Ausbildung einer kovalenten Bindung zwischen dem Brückenreagenz und dem Substrat reagiert und eine Umsetzung der zweiten terminalen Gruppe mit freien Aminogruppen an dem Antigen bzw. dem Antikörper oder den F(ab')₂-Untergruppen davon nicht eintritt.
22. Verfahren gemäß Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, daß man als zweite terminale Gruppe eine Anhydridgruppe verwendet.
23. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 20 bis 22, dadurch gekennzeichnet, daß man als Brückenreagenz ein solches der Formel verwendet, wobei n eine ganze Zahl von 1 bis 10 ist.
24. Verfahren gemäß Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, daß n 4 ist.
25. Verfahren zur Herstellung eines Reagenzes gemäß Anspruch 1 mit einem Gehalt an F(ab')₂-Untergruppen, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Reagenz gemäß Anspruch 1 herstellt, in dem ein Immunglobulin-G-Antikörper mit dem Brückenreagenz verbunden ist, und dieses Reagenz mit Pepsin zur Abtrennung der F(c)-Untergruppen digeriert.
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