DE2913553B1

DE2913553B1 - Verfahren und Reagenz zur enzymatischen Bestimmung von Enzymsubstraten

Info

Publication number: DE2913553B1
Application number: DE2913553A
Authority: DE
Inventors: Erich Bernt; Sigmar Dr Phil Klose; Peter Dr Rer Nat Scheibe
Original assignee: Boehringer Mannheim GmbH
Current assignee: Roche Diagnostics GmbH
Priority date: 1979-04-04
Filing date: 1979-04-04
Publication date: 1980-10-09
Also published as: FI70727C; HU181089B; YU44100B; AU515851B2; JPS5646800B2; JPS55135599A; FI70727B; ATE4126T1; CS783481A2; DE3064075D1; FI801025A; CS244665B2; US4517287A; DE2913553C2; CA1152871A; EP0016947A1; YU91780A; AU5677980A; CS228127B2; DD150256A5

Description

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Die Erfindung betrifft ein Verfahren und ein Reagenz zur enzymatischen Bestimmung von Enzymsubstraten.

Enzymatische Bestimmungen von Enzymsubstraten, so wie z. B. Glucose, Harnsäure, Cholesterin, werden häufig dadurch gestört, daß in den Reagenzien enthaltende Substanzen, beispielsweise reduzierende oder oxidierende Substanzen, mit Zwischenprodukten oder Endprodukten des Testsystems reagieren. Diese störende Nebenreaktion kann rein chemisch ablaufen oder die Störung kann durch Hemmung des Enzyms, Eingang in die enzymatische Reaktion als konkurrierendes Substrat und dergleichen erfolgen. In jedem Fall wird die Konzentration des eigentlichen Indikatorpro- so dukts, welches gemessen wird, bei quantitativen, insbesondere photometrischen Bestimmungen, also beispielsweise des gebildeten Farbstoffs, vermindert. Das für die Richtigkeit des Verfahrens essentielle proportionale Verhältnis zwischen nachzuweisender &5 Substratkonzentration und Konzentration des gemessenen Indikatorprodukts wird auf diese Weise beseitigt. Die Wiederfindung des nachzuweisenden Substrates weicht damit von 100% ab. Mit anderen Worten werden falsche Ergebnisse erhalten.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, dieses Problem zu beseitigen und ein Verfahren und ein Reagenz für die enzymatische Bestimmung eines Enzymsubstrats in Gegenwart von Störsubstanzen zu schaffen, welches zu richtigen Ergebnissen führt und die oben aufgeführten Schwierigkeiten beseitigt.

Gelöst wird diese Aufgabe erfindungsgemäß durch ein Verfahren zur enzymatischen Bestimmung eines Enzymsubstrates unter Verwendung eines enzymhaltigen Reagenzes unter Eliminierung von Störsubstanzen in diesem Reagenz, die mit dem Substrat oder einem Zwischen- oder Endprodukt der Indikatorreaktion reagieren können, dadurch gekennzeichnet, daß man vor Zugabe der zu untersuchenden Probe zuerst eine bestimmte Menge des Substrates mit dem Reagenz zur Umsetzung bringt bis es abreagiert hat und erst danach die zu bestimmende Probe zusetzt.

Durch den Zusatz der bestimmten Substratmenge, die stets deutlich unter der Substratbestimmungskapazität des Analysensystems liegt, wird der Ablauf einer Vorreaktion veranlaßt, bis alles zugesetzte Substrat verbraucht ist. Im Rahmen dieser Vorreaktion werden auch die störenden Substanzen vollständig verbraucht. Sobald diese Reaktion zum Stillstand gekommen ist, wird dann die eigentliche zu untersuchende Probe mit einem unbekannten Gehalt an dem zu bestimmenden Substrat zugesetzt. Die Menge des zu bestimmenden Substrats ergibt sich dann aus der Differenz zwischen dem Endwert der Vorreaktion für das zu messende Reaktionsprodukt und dem Endwert, der nach Zusatz der zu untersuchenden Probe erhalten wird. Wahlweise ist es auch möglich, die eigentliche Probenbestimmung kinetisch zu verfolgen, d. h. nicht Endwerte, sondern nur Reaktionsgeschwindigkeiten zu messen.

Für die Menge des erfindungsgemäß zuzusetzenden Substrats lassen sich keine allgemeinen Angaben machen. Es hängt diese Menge von der Art des Bestimmungssystems und der Menge der zu erwartenden Störsubstanzen ab. Im allgemeinen wird man einen genügenden Überschuß an Substrat bezüglich der Störsubstanzen anwenden, um mit Sicherheit auszuschließen, daß noch nicht abreagierte Störsubstanzen vorliegen, wenn die eigentliche unbekannte Probe zugesetzt wird. Andererseits wird man auch nicht zu viel Substrat zusetzen, um nicht für die eigentliche Probenreaktion einen zu hohen und die Genauigkeit der Meßreaktion negativ beeinflussenden Nullwert zu erhalten. Letzteres spielt z. B. eine Rolle bei photometrichen Messungen eines als Verfahrensprodukt gebildeten Farbstoffs. Bei solchen, auf der photometrischen Bestimmung eines als Reaktionsprodukt auftretenden Farbstoffs beruhenden Methoden wird man die zugesetzte bestimmte Substratmenge so niedrig halten, daß noch keine störenden Konzentrationen an Farbstoff gebildet werden. Dies läßt sich in der Praxis in jedem Falle leicht erreichen, da ja ein derartiger Farbstoff oder ein sonstiges Indikatorprodukt erst von derjenigen Substratmenge gebildet wird, welche die zur Abreaktion der Störsubstanzen erforderliche Substratmenge übersteigt

Beim Verfahren der Erfindung ist es nicht erforderlich, die Art der störenden Fremdsubstanzen zu kennen. Häufig handelt es sich hierbei zwar um reduzierende Substanzen, aber auch oxidierende oder sonstige störende Substanzen werden nach dem erfindungsgemäßen Verfahren mit Sicherheit ausgeschaltet.

ORlQ)NAi. INSPECTED

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Reagenz zur enzymatischen Bestimmung eines Enzymsubstrats, enthaltend ein System zur Bestimmung des Substrats, welches aus wenigstens einem Enzym, wenigstens einer Puffersubstanz und wenigstens einer Indikatorsubstanz sowie gegebenenfalls Hilfsstoffen besteht und welches gekennzeichnet ist durch einen Gehalt an einer bestimmten Menge des Substrats im Unterschuß bezüglich der Substratbestimmungskapazität des Systems zur Bestimmung dieses Substrats. ι ο

Wenn das in Trockenform vorliegende, erfindungsgemäße Reagenz in Wasser aufgelöst wird, läuft die Reaktion zur Beseitigung der Störsubstanzen während und nach dem Lösungsvorgang bereits ab. Die so erhaltene Lösung kann dann direkt für die eigentliche Bestimmung des Enzymsubstrats eingesetzt oder aber erneut in ein Trockenreagenz überführt werden, welches zur späteren Wiederauflösung vor Durchführung der Bestimmungsreaktion vorgesehen ist. Es ist aber auch möglich, das erfindungsgemäße Reagenz erst unmittelbar vor seiner Verwendung durch den Substratzusatz zu komplettieren oder alternativ eine andere, zum Start der Reaktion erforderliche Substanz erst nachträglich zuzusetzen, beispielsweise das Enzym oder im Falle einer mehrstufigen Reaktion mit mehreren enzymatischen Schritten, eines der für die Reaktion erforderlichen Enzyme.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Reagenz enthält dieses Glucose als Substrat und das System zur Bestimmung des Substrats Glucose besteht aus Glucoseoxidase (GOD), Peroxidase (POD), Puffer und ABTS® (2,2'-Azino-di-[3-äthyl-benzthiazolin-sulfonat(6)]) als Farbreagenz.

Bei einem derartigen Reagenz werden, bezogen auf 100 ml wäßriger Lösung des Substratbestimmungssystems, etwa 750 bis 1500 U, vorzugsweise 900 bis 1200U, GOD einer spezifischen Aktivität von etwa 100 U/mg eingesetzt. Die entsprechenden Mengen für POD einer Aktivität von ebenfalls ca. 100 U/mg betragen 10 bis 150 U, vorzugsweise 80 bis 120 U/100 ml gebrauchsfertiger Reagenzlösung. Die entsprechenden Konzentrationen für ABTS betragen 75 bis 150 mg, vorzugsweise 90 bis 120 mg/100 ml. Als Puffer kommt ein solcher von pH 6,5 bis 7,5, vorzugsweise 6,8 bis 7,2, in Betracht. Die Konzentration liegt zweckmäßig zwisehen 50 und 20OmMoI, vorzugsweise 80 bis 120 mMol/1. Als Puffer wird Natriumphosphatpuffer

(Na₂HPO₄/NaH2/PO₄)

bevorzugt. Beispiele für andere geeignete Puffer sind so Phosphat-Tris-Puffer, Zitronensäure-Tris-Puffer, Weinsäure-Tris-Puffer und Maleinsäure-Tris-Puffer. Für die Konzentration und den pH-Wert gilt das gleiche wie oben ausgeführt.

Bei einem in der vorstehend beschriebenen Weise zusammengesetzten Reagenz beträgt der Glucosegehalt zweckmäßig 0,01 bis 0,05 mg, vorzugsweise 0,02 bis 0,04 mg/100 ml Lösung.

Bei einem weiteren bevorzugten erfindungsgemäßen Reagenz zur Glucosebestimmung enthält das System zur Bestimmung des Substrats neben GOD und POD als Farbbildungskomponenten 4-Aminophenazon (PAP) und Phenol. In diesem Falle werden an GOD pro 100 ml gebrauchsfertige Reagenzlösung 3000 bis 5000U, vorzugsweise 3800 bis 4200 U/100 ml, an POD 50 bis U, vorzugsweise 160 bis 200 LI/100 ml Lösung sowie 10 bis 20 mg, vorzugsweise 13 bis 17 mg/100 ml PAP und 120 bis 240 mg, vorzugsweise 160 bis 200 mg/100 ml Phenol eingesetzt. Als Puffer wird in diesem Falle Kaliumphosphat-Puffer des oben angegebenen pH-Wertbereiches bevorzugt. Die Konzentration sollte zweckmäßig zwischen 150 und 250 mMol, vorzugsweise 180 bis 220 mMol/1 liegen.

Bei diesem Reagenz beträgt der Glucosegehalt zweckmäßig 0,05 bis 0,25 mg, vorzugsweise 0,1 bis 0,2 mg/100 ml Lösung.

Die obigen Angaben beziehen sich auf das gelöste Reagenz. Sie gelten in gleicher Weise auf die zur Herstellung von 100 ml Lösung bestimmte Menge Trockenreagenz.

Ein weiteres bevorzugtes Reagenz enthält als Substrat Harnsäure und das System zur Bestimmung dieses Substrats besteht aus Uricase, POD, Farbbildner und Puffer. Als Farbbildner wird ein Gemisch von 2,4-Dichlorphenolat und 4-Aminoantipyrin bevorzugt.

Ein derartiges Reagenz enthält in einer zweckmäßigen Ausführungsform 35 bis 45 U, vorzugsweise 38 bis 42 U/100 ml gebrauchsfertiger Lösung an Uricase mit einer spezifischen Aktivität von etwa 9 U/mg. Die POD-Menge für ein Präparat von ca. 100 U/mg beträgt zweckmäßig 30 bis 40 U, vorzugsweise 33 bis 37 U/ 100 ml Lösung. Das 2,4-Dichlorphenolat, welches als Alkalisalz, Ammoniumsalz oder Aminosalz, vorzugsweise als Äthylammoniumsalz, eingesetzt wird, liegt zweckmäßig in Mengen zwischen 150 und 200 mg, vorzugsweise 165 bis 180 mg/100 ml, bezogen auf das Äthylammoniumsalz, vor. Diese Mengenangaben verändern sich natürlich mit der Natur des Kations. Das 4-Aminoantipyrin wird zweckmäßig in 150 bis 250 mg, vorzugsweise 180 bis 220 mg/100 ml Reagenz, eingesetzt.

Die Puffersubstanz soll im pH-Bereich 8,5 bis 9,5, vorzugsweise 8,7 bis 9,3, puffern. Die Konzentration beträgt zweckmäßig 100 bis 20OmMoI, vorzugsweise 130 bis 180mMol/I. Bevorzugt wird Tris-Citrat-Puffer, andere, gut geeignete Puffersubstanzen sind Tris-Weinsäure und Tris-Maleinsäure.

Bei diesem Reagenz liegt der Harnsäurezusatz zweckmäßig zwischen 0,05 und 0,25 mg, vorzugsweise 0,1 bis 0,2 mg/100 ml, bezogen auf das Lithium- oder Natriumsalz.

Noch ein weiteres bevorzugtes Reagenz gemäß der Erfindung enthält Cholesterin als Substrat und das System zur Bestimmung dieses Substrats besteht aus Cholesterinesterase, Cholesterinoxidase, POD und Farbbildner sowie Puffersubstanz. Als Farbbildner eignet sich besonders eine Mischung von 4-Aminoantipyrin und Phenol.

In einer zweckmäßigen Ausführungsform enthält dieses Reagenz 15 bis 25 U, vorzugsweise 17 bis 23 U/100 ml Reagenzlösung einer Cholesterinesterase mit einer spezifischen Aktivität von ca. 20 U/mg, 20 bis 30 U, vorzugsweise 22 bis 28 U/100 ml einer Cholesterinoxidase einer spezifischen Aktivität von ca. 25 U/mg, 50 bis 200 U, vorzugsweise 130 bis 180 U/100 ml Lösung einer POD von ca. 100 U/mg, 15 bis 25 mg, vorzugsweise 17 bis 23 mg/100 ml Reagenzlösung 4-Aminoantipyrin und 40 bis 60 mg, vorzugsweise 45 bis 55 mg/100 ml Phenol. Als Puffer wird eine geeignete Puffersubstanz, pH 7 bis 8,5, vorzugsweise 7,8 bis 8,2, mit einer Konzentration zwischen 150 und 25OmMoI, vorzugsweise 180 bis 220 mMol/1 eingesetzt. Besonders geeignet ist Kaliumphosphat-Puffer, jedoch eignen sich andere Puffersubstanzen, die im angegebenen Bereich zu puffern vermögen, ebenfalls. Der Cholesteringehalt eines derartigen Reagenz beträgt zweckmäßig 0,20 bis

0,60 mg, vorzugsweise 0,30 bis 0,50 mg/100 ml Reagenzlösung bzw. der zur Herstellung einer solchen Reagenzlösungsmenge vorgesehenen Trockenreagenzmenge.

Es versteht sich, daß die für die oben beschriebenen bevorzugten erfindungsgemäßen Reagenzzusammensetzungen die angegebenen Enzymmengen nur für Enzyme der jeweils aufgeführten spezifichen Aktivität gelten und durch Präparate anderer Aktivität ersetzt werden können.

Es ist ersichtlich, daß erfindungsgemäß Störreaktionen bei der enzymatischen Bestimmung von Enzymsubstraten beseitigt werden können. Dies ermöglicht es, weniger reine Reagenzien einzusetzen, die Lagerfähigkeit von Reagenzien, bei denen Störsubstanzen während der Lagerung erst entstehen, zu verlängern und die Genauigkeit der Bestimmungen zu erhöhen.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung weiter.

Beispiel 1

Reagenz zur Glucosebestimmung nach der ABTS-Methode

Natriumphosphat-Puffer, pH 7,0 100 mMol/1

Glucoseoxidase (ca. 100 U/mg) 1000 U/l 00 ml

Peroxidase (ca. 100 U/mg) 80 U/l 00 ml

ABTS*) 100 mg/100 ml

Glucose 0,05 mg/100 ml

*) 2,2'-Azino-di-[3-äthyl-benzthiazolin-suIfonsäure(6)]-diammoniumsalz.

Beispiel 2

Reagenz zur Glucosebestimmung nach der GOD-PAP-Methode

Kaliumphosphat-Puffer, pH 7,1 205 mMol/1

Glucoseoxidase

(GOD; ca. 100 U/mg) 4100 U/100 ml

Peroxidase (POD; ca. 100 U/mg) 190 U/100 ml

PAP (4-Aminophenazon) 17 mg/100 ml

Phenol 200 mg/100 ml

Glucose 0,2 mg/100 ml

Beispiel 3 Reagenz zur Cholesterinbestimmung

Kaliumphosphat-Puffer, pH 7,9 200 mMol/1

Cholesterinesterase

(ca. 20 U/mg) 22 U/100 ml

Cholesterinoxidase

(ca. 25 U/mg) 24 U/100 ml

Peroxidase (ca. 100 U/mg) 150 U/100 ml

4-Aminoantipyrin 21 mg/100 ml

Phenol 47 mg/100 ml

Cholesterin 0,4 mg/100 ml

Beispiel 4 Reagenz zur Harnsäurebestimmung

Tris-Citrat-Puff er, pH 9,1
Uricase (ca. 9 U/mg)
Peroxidase (ca. 100 U/mg)
2,4-Dichlorphenolatäthylammoniumsalz
4-Aminoantipyrin
Harnsäure (Li- oder Na-SaIz)

15OmMoVl 39 U/100 ml 36 U/100 ml

170 mg/100 ml 190 mg/100 ml 0,16 mg/100 ml

Beispiel 5
Vergleichende Glucosebestimmung

Um die erfindungsgemäß verbesserte Genauigkeit der Glucosebestimmung zu zeigen, wurde wie folgt vorgegangen:

Zwei Reagenzienlösungen A und B wurden durch Auflösen von Reagenz gemäß Beispiel 1 in der erforderlichen Menge Wasser hergestellt. Bei Lösung A wurde jedoch der Glucosezusatz weggelassen. Zur Bestimmung wurde eine Glucose-Standardreihe mit von 50 bis 400 mg/100 ml ansteigendem Glucosegehalt sowie Humanserum eingesetzt.

Bestimmungsansatz:

Wellenlänge: Hg 436 nm.

Küvette: 1 cm Schichtdicke.

Inkubationstemperatur: 20 bis 25° C.

Messung erfolgte gegen Leerwert in handelsüblichem Photometer. In die Küvetten wurden folgende Lösungen einpipettiert:

	Leerwert	Standard	Probe
Destl. Wasser	0,1ml	—	—
Verdünnte	—	0,1ml	-
Standardlösung
Enteiweißte	—	-	0,1ml
Probe
Testreagenz	5,0 ml	5,0 ml	5,0 ml
(A/B)

mischen, bei 20 bis 25° C inkubieren. Nach 25 bis 50 Minuten Extinktion der Probe (Ep_robe) und Extinktion des Standards (Estandard) gegen Leerwert messen.

Berechnung der Glucosekonzentration in der Probe:

= 100

E₁

Probe

-^Standard

[mg/100 ml]

Meßergebnisse:

Glucose-Standard-Reihe (50 bis 400 mg/100 ml).

Glucosekonzentration

Extinktion in Reagenz
A B

50 mg/100 ml
100 mg/100 ml
200 mg/100 ml
300 mg/100 ml
400 mg/100 ml

0,060
0,236
0,400
0,577

0,095
0,170
0,353
0,533
0,700

Die obigen Meßergebnisse sind in der Figur der Zeichnung graphisch dargestellt. Die Kurve für Lösung A zeigt, daß Probeflüssigkeiten mit einem Glucosegehalt unter ca. 70 mg/100 ml nicht gemessen werden, da keine Extinktion, d.h. Farbentwicklung auftritt. Bei Verwendung des allgemein üblichen Ein-Punkt-Standards (z. B. 100 mg Glucose/100 ml) werden Proben mit einer Glucosekonzentration zwischen 70 und 100 mg/ 100 ml zu niedrig, Proben mit Glucosegehalten über 100 mg/100 ml zu hoch gegenüber dem tatsächlichen Gehalt ermittelt. Nur Probekonzentrationen, die exakt der Konzentration des Standards entsprechen, liefern

korrekte Meßwerte. Das erfindungsgemäße Reagenz B hingegen liefert durchweg richtige Werte.

Die Ergebnisse mit Humanserumproben wurden in der oben beschriebenen Weise durchgeführt, wobei zum

Vergleich die nach der Hexokinase-Methode (Standardmethode) erhaltenen Werte bestimmt wurden. Die Ergebnisse zeigt nachstehende Tabelle.

HK/G6P-DH
(Standard-Methode) Reagenz A

Reagenz B

Serum 1	53 mg/100 ml	kein Meßwert	51mg/100ml
Serum 2	84 mg/100 ml	55 mg/100 ml	83,5 mg/100 ml
Serum 3	135 mg/100 ml	213 mg/100 ml	135 mg/100 ml

Hierzu 1 Blatt Zeichnungen

030 141/382

Claims

Patentansprüche:

1. Reagenz zur enzymatischen Bestimmung eines Enzymsubstrats, enthaltend ein System zur Bestimmung des Substrats, welches aus wenigstens einem Enzym, wenigstens einer Puffersubstanz und wenigstens einer Indikatorsubstanz sowie gegebenenfalls Hilfsstoffen besteht, gekennzeichnet durch einen Gehalt an einer bestimmten Menge des Substrats im Unterschuß bezüglich der Substratbestimmungskapazität des Systems zur Bestimmung dieses Substrats.

2. Reagenz nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es Glucose als Substrat enthält und das System zur Bestimmung des Substrats aus Glucoseoxidase, Peroxidase, ABTS und Puffer besteht.

3. Reagenz nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es Harnsäure als Substrat enthält und das System zur Bestimmung eines Substrats aus Uricase, Peroxidase, 2,4-DichIorphenolat, 4-Aminoantipyrin und Puffer besteht.

4. Reagenz nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es Cholesterin als Substrat enthält und das System zur Bestimmung eines Substrats aus Cholesterinesterase, Cholesterinoxidase, Peroxidase, 4-Aminoantipyrin, Phenol und Puffer besteht.

5. Reagenz nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es Glucose als Substrat enthält und das System zur Bestimmung eines Substrats aus Glucoseoxidase, Peroxidase, 4-Aminophenazon, Phenol und Puffer besteht.

6. Verfahren zur enzymatischen Bestimmung eines Enzymsubstrats unter Verwendung eines enzymhaltigen Reagenzes unter Eliminierung von Störsubstanzen in diesem Reagenz, die mit dem Substrat selbst oder einem Zwischen- oder Endprodukt der Indikatorreaktion reagieren können, dadurch gekennzeichnet, daß man vor Zugabe der zu untersuchenden Probe zuerst eine bestimmte Menge des Substrats mit dem Reagenz zur Umsetzung bringt bis es abreagiert hat und erst danach die zu bestimmende Probe zusetzt.