DE2921975A1

DE2921975A1 - Verfahren und reagens fuer die biolumineszenz

Info

Publication number: DE2921975A1
Application number: DE19792921975
Authority: DE
Inventors: Arne Thorwald Dr Lundin; Arne Myhrman
Original assignee: LKB Produkter AB
Current assignee: Pfizer Health AB
Priority date: 1978-05-31
Filing date: 1979-05-30
Publication date: 1979-12-06
Also published as: GB2022247B; US4246340A; BE876662A; GB2022247A; DE2921975C2; JPS5513893A; SE7806296L; FR2427603B1; CA1116060A; SE428379B; FR2427603A1; NL7904308A

Description

Verfahren und Reagens für die Biolumineszenz

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung von Adenosintriphosphatkonzentrationen durch Inkontaktbringen der zu untersuchenden Probe mit einem Biolumineszenzreagenz auf Basis vonD-Luciferin , Luciferase und Magnesiumionen oder bestimmten anderen Metallionen zum Herbeiführen einer Reaktionen der das Adenosintriphosphat und D-Luciferin unter Lichtemision an die Luciferase gebunden werden,und Messen der ein Maß für die Adenosintriphosphatkonzentration darstellenden Intensität des emittierten Lichts. Die Erfindung betrifft auch ein Reagens für die Biolumineszenz zur Verwendung bei der Bestimmung von Adenosintriphosphatkonzentrationen, auf Basis von D-Luciferin, Luciferase und Magnesiumionen oder bestimmten anderen Metallionen.

Anwendungszweck der Erfindung ist die Bestimmung von Konzentrationen des Adenosintriphosphats, im nachfolgenden als ATP bezeichnet, z.B. bei ATP-Umwandlungsreaktionen oder ATP umwandelnden Systemen.

Von ATP abhängige Biolumineszenzreagenzien sind an sich bekannt. Diese Reagenzien basieren auf ein Enzym, die Luciferase, und eines der beiden Substrate, nämlich D-Luciferin und Magnesiumionen und bestimmte andere Metallionen, an die das andere Substrat, ATP, in komplexer Weise gebunden werden muß, damit eine Reaktion stattfindet. Wenn das ATP mit dem Reagens in Kontakt gebracht wird, findet eine Reaktion oder, richtiger gesagt, eine Reihenfolge von Reaktionen statt, die durch die Luciferase katalysiert werden und die in schematisch vereinfachter und zum Teil hypothetischer Form in der Fig. 1 dargestellt sind. Die Reaktionen 1 bis 3 sind im einzelnen an Luciferase aus dem gemeinen amerikanischen Glühwürmchen Photinus pyralis untersucht worden und

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diese Reaktionen stellen den Stand der Technik dar. Im Verlauf der letzten Jahre sind mehrere Übersichtsaufsätze veröffentlicht worden; siehe M. DeLuca, (1976), "Advance in Enzymology", (A. Meister, Verfasser), Band 44, Seiten 37-68, John Wiley & Sons, New York, sowie W.D. McElroy, H.H. Seliger und M. DeLuca, (1974), "The Physiology of Insecta", 2. Auflage, (M. Rockstein, Verfasser), Band 11, Seiten 411-460, Academic Press, New York.

Bei der Reaktion 1 wird aus Luciferase (E), ATP und D-Luciferin (LH,,) freies Pyrophosphat (PPi) und enzymgebundenes Luciferyladenylat gebildet. Diese Reaktion begrenzt nicht die Geschwindigkeit der vollkommenen Reaktion. Der entstehende Enzym-Luciferyladenylat-Komplex unterliegt zwei Vorgängen, welche die Emissionsrate des anfangs enittierten Lichts begrenzen, nämlich einer Konformationsänderung und demEntzug eines Protons aus dem Luciferyladenylat (s. M. DeLuca und W.D. McElroy, (1974), Biochemistry, Band 13, Seiten 921-925). Bei der Reaktion 2 wird Luciferyladenylat mit Sauerstoff oxidiert, unter Bildung von Adenosinmonophosphat, das nachfolgend als AMP bezeichnet wird, und angeregtes Oxyluciferin (P*), welche beide enzymgebunden bleiben, und Kohlendioxid. In der Reaktion 3 geht das Oxyluciferin unter Emission eines Photons in den Grundzustand über. Die zur Emission des Photons erforderliche Energie entstammt der Oxidation des Luciferins und nicht dem Aufspalten der Pyrophosphatbindung im ATP.

Der bei der Reaktion 3 entstehende Enzym-Oxyluciferin-AMP-Komplex ist stabil und kann durch Gelfiltration isoliert werden, wenn die Reaktion in Gegenwart von Pyrophosphatase durchgeführt wird (B.J.Gates und M. DeLuca, (1975), Arch., Biochem, Biophys., Band 169, Seiten 616-621). In Abwesenheit von Pyrophosphatase wird ein Enzym-Oxyluciferin-Komplex ohne AMP isoliert, der die gleiche Aktivität wie ein freies Enzym aufweist (s. den zuletzt genannten Aufsatz von Gates und DeLuca).

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Die Stabilität des Enzym-Oxyluciferin-AMP-Komplexes führt dazu, daß die Mischung aus Luciferase, D-Luciferin und ATP eher einen Lichtblitz als eine konstante Lichtemission ergibt . Die maximale Lichtintensität wird innerhalb einer Sekunde erreicht und nimmt danach auf ein gleichbleibendes Niveau ab, bei dem die Regenerierung von freiem Enzym im wesentlichen bei der gleichen Rate stattfindet wie die Emission des Lichts. Aufgrund der Tatsache, daß die freien Produkte die Reaktionen inhibieren, ist das gleichbleibende Niveau jedoch nicht vollkommen konstant.

Die Bestimmung von ATP wurde üblicherweise so ausgeführt, daß die Probe mit einer unbekannten ATP-Konzentration mit dem Luciferase, D-Luciferin und Magnesiumionen enthaltenden Biolumineszenzreagens vermischt wurde. Zur Erzielung einer maximalen Zuverlässigkeit der Analyse sollte dabei das Vermischen in geeigneter Weise bei einer vorgegebenen Reaktionsgeschwindigkeit und in einer solchen Meßlage erfolgen, daß die anfängliche Charakteristik des Meßlichtes aufgenommen werden kann (siehe A. Lundin und A. Thore, (1975), Anal. Biochem., Band 66, Seiten 47 - 63). Nach Aufnahme der bei der Bestimmung entstehenden Lichtintensität wird die Analyse mit einer Probe , die eine bekannte ATP-Konzentration enthält,und mit einer Leerprobe ohne ATP wiederholt. Die unbekannte ATP-Konzentration wird aus diesen drei Messungen bzw. Bestimmungen berechnet. Falls die Probe Stoffe enthielt, welche bei der Analyse störend wirken konnten, wurde eine interne Standadisie r te chnik angewendet, d.h., die Probe wurde mit und ohne Zugabe einer bekannten ATP-Konzentration analysiert.

Bereits im Jahre 1952 wurden ATP-abhängige Biolumineszenzsysteme als zur Verfügung stehend aufgezeigt, und zwar nicht nur zur Bestimmung des ATP, sondern im Prinzip auch zur Bestimmung jeglicher Substanz, die an ATP-Umwandlungsreaktionen teilnimmt (B. L. Strehier

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undJ.R. Totter, (1952), Arch. Biochem. Biophys., Band 40, Seiten 28-41). Die Möglichkeit, ein Biolumineszenzreagens zu einem ATP-Umwandlungssystem zuzugeben, um die ATP-Konzentration kontinuierlich durch Messung der Lichtintensität zu verfolgen, hat jedoch sehr geringe praktische Bedeutung erlangt. Die Ursache hierfür beruht zum Teil auf der Tatsache, daß die Aktivität der Luciferase während der Reaktion infolge der vorstehend beschriebenen Produktinhibierung abnahm und zum Teil auf der Tatsache, daß die Luciferasereagenzien durch ATP-Umwandlungssysteme verunreinigt wurden. Das Interesse an dem Verfahren vergrößerte sich jedoch, als es möglich wurde, durch Verwendung von gereinigtem Luciferase und bei synthetischer Herstellung des Luciferins während einer Reaktionszeit von mehreren Minuten eine vernachlässigbare Abnahme der Lichtintensität sowie der ATP-Konzentration zu erzielen (A. Lundin und A. Thore (1975), Anal. Biochem. 66, Seiten 47 -63). Geeignete Bedingungen für die Analyse wurden untersucht und das Verfahren erwies sich als brauchbar für ATP-Konzentra-

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tionen bis zu 10 M (A. Lundin, A. Rickardsson und A. Thore, (1977), Anal. Biochem. Band 75, Seiten 611-620). Trotz wiederholter Versuche ließ sich jedoch ein Reagens mit den vorstehend beschriebenen Eigenschaften in nur sehr wenigen Fällen herstellen.

Dennoch ist es möglich gewesen, die analytische Verwendbarkeit eines Reagens mit den vorstehend angegebenen Eigenschaften für kinetische Bestimmungen von Substraten und Enzymen, Endpunktbestimmungen von Substraten, Überwachungen von Photophosphorylation und verfolgende Beobachtung von lytischen Reaktionen aufzuzeigen (A. Lundin, A. Rickardsson und A. Thore, (1976), Anal. Biochem. Band 75, Seiten 611-620; A. Lundin, A. Rickardsson und A. Thore, (1977), "Proceedings of the 2nd Bi-Annual ATP Methodology Symposium, SAI Technology Company, San Diego; A. Lundin, A. Thore und M. BaItscheffsky, (1977), FEBS Lett. Band 79, Seiten 73-76; A. Lundin (1978),

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"Methods in Enzymology"(M. DeLuca, Verfasser), Band 57, Academic Press, New York; A. Lundin und M. Baitscheffsky, (1978), "Methods in Enzymology"(M. DeLuca, Verfasser), Band 57, Academic Press, New York; A. Lundin und I. Styrelius, (1978), Clin.Chem. Acta und A. ThoreundA.C. Eriksson, (1977), FOA-report).

Die Schwierigkeiten bei der reproduzierbaren Herstellung eines Reagens mit den oben angegebenen Eigenschaften lassen jedoch vermuten, daß die vorstehend angegebenen Verwendungen nicht außerhalb derjenigen Laboratorien zum Einsatz gekommen sind, an denen die Verfahrensweisen entwickelt worden sind.

Aufgabe der Erfindung ist es somit, ein entsprechend verbessertes, gattungsgemäßes Verfahren zur Bestimmung von ATP aufzuzeigen, bei dem ein zuverlässig meßbarer, stabiler Verlauf des Lichtintensitätpegels entsteht, sowie ein in reproduzierbarer Weise herstellbares, zuverlässiges Reagens der gattungsgemäßen Art vorzusehen.

Die Aufgabe wird erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß man bei der Bestimmung einen oder mehrere konkurrierende Inhibitoren der Reaktion in Form von Analogverbindungen des D-Luciferins verwendet. Ferner wird die Aufgabe erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß das Reagens zusätzlich einen oder mehrere konkurrierende Inhibitoren in Form von Analogverbindungen des D-Luciferins enthält.

Gemäß der Erfindung führen die einen ATP-abhängigeη Biolumineszenzreagens zugegebenen Zusätze zu einer Lichtemission, die während der gesamten Meßzeit denselben Proportionalitätsfaktor in Bezug auf die ATP-Konzentration aufweist. Da das Biolumineszenzreagens selbst nur geringe Mengen an ATP verbraucht, ergeben Proben mit einer konstanten ATP-Konzentration eine konstante Lichtemission, welche die Ver-

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wendung des Reagens zu ATP-Bestimmungen erleichtert. Ferner läßt sich ein Reagens mit den oben angegebenen Eigenschaften anderen ATP-Umwandlungssystemen zugeben, so daß es in einfacher Weise ermöglicht werden kann, Änderungen der ATP-Konzentration durch kontinuierliche Messung der Lichtintensität zu verfolgen und zu überwachen. Als ATP-Umwandlungssysteme kommen z.B. Kombinationen von Enzymen und möglicherweise ein Substrat, das in einer Reaktion eine Bindung oder ein Aufbrauchen von ATP ergibt, in Frage. Die analytische Verwendung des Reagens umfaßt die Bestimmung von ATP und Substanzen und Enzymen, die an ATP-Umwandlungsreaktionen teilnehmen, innerhalb, der Gebiete der klinischen Chemie und der klinischen Microbiologie und bei der biochemischen und biologischen Forschung, insbesondere auf dem Gebiet der Bioenergetik.

Vor der Anwendung der Erfindung ergab sich in verschiedenen Reagenzien ein Variationsbereich der Stabilität des Lichtpegels, der sich von einer wenige Prozent pro Minute betragenden Abschwächung der Lichtintensität bis zu einer Abnahme auf die Hälfte der ursprünglichen Lichtintensität nach 1 Minute erstreckte. Erfindungsgemäß wird jedoch aufgezeigt, daß es die Zugabe eines D-Luciferinanalogs ermöglicht, in . reproduzierbarer Weise ein Reagens herzustellen, das die gewünschten Eigenschaften, d.h. einen stabilen Lichtemissionspegel aufweist. Die Wirkung des D-Luciferinanalogs auf die Stabilität des Lichtpegels wurde bisher nicht beobachtet und bei analytischen Anwendungen dürfte es nahegelegen haben, die Gegenwart derartiger Analoge zu vermeiden, weil diese bekanntlich, mit dem D-Luciferin konkurrierend, die lichterzeugende Reaktion inhibieren (J. L. Denburg).

Unter einem D-Luciferinanalog werden im Zusammenhang mit der Erfindung Substanzen verstanden, welche die vorstehend beschriebene Luciferasereaktion inhibieren, wobei diese Inhibierung in Bezug auf D-Lu-

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eiferin konkurrierend erfolgt. Die spezifischen D-Luciferinanaloge, welche zum erwünschten Ergebnis führen, werden mit Leichtigkeit ermittelt, indem sie in inhibierender Konzentration dem Reagens zugegeben werden und die Stabilität des Lichtpegels nach Zugabe von ATP bestimmt wird.

Obwohl die Erfindung nicht durch irgendeine spezifische Theorie bezüglich der Reaktionsmechanik bei der Zugabe eines D-Luciferinanalogs eingeschränkt ist, könnte eine derartige Zugabe zur Folge haben, daß ein geringerer Teil der gesamten Luciferasemenge als inaktiver Enzym-Produkt-Komplex vorkommt. Da die freie Enzymkonzentration infolge der Bildung eines Enzym-Produkt-Komplexes abnimmt, wird der Enzym-Luciferinanalog-Komplex wahrscheinlich unter Bildung von freiem Enzym dissoziiert, wie dies durch die Reaktion 5 in der Fig. 1 gezeigt ist, in der E das D-Luciferinanalog darstellt. Durch Verwendung des D-Luciferinanalogs, d.h. des konkurrierenden Inhibitors, läßt sich die Luciferasemenge ohne entsprechende Erhöhung der Reaktionsgeschwindigkeit vergrößern. Dieses trifft zu, unabhängig davon, ob das D-Luciferinanalog mit ATP gemäß Reaktion 1 reagiert oder, gemäß Reaktion 5, einen Enzym inhibierenden Komplex bildet. Die wesentliche Voraussetzung ist lediglich, daß die Reaktionen umkehrbar und schneller als die Reaktionen 2 bis 4 sind (die Reaktion 4 wird nachstehend im einzelnen erörtert).

Insofern freies AMP und freies Oxyluciferin bei der Reaktion gebildet werden, ist es von Interesse zu untersuchen, ob dies auch die Inhibierung des Produkts beeinflußt. Wenn z.B. 1O~ M ATP zur Erzeugung

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von 10 M AMP und 10 M Oxyluciferin führen würden, so würde die Inhibierung des AMP die Aktivität der Luciferase um weniger als 0, 5 %

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beeinflussen, weil K für AMP 2, 4 χ 10 M beträgt (siehe R. T. Lee,

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J. L. Denburg und W.D. McElroy, (1970), Arch. Biochem. Biophys. Band 141, Seiten 38-52). Dagegen würde die Bildung von Oxyluciferin, für das der K.-Wert 2, 3 χ 1O^-7M beträgt (T. Goto, I. Kubota, N. Suzuki und Y. Kishi, (1973), "Chemiluminiscence and Bioluminiscence" (Verfasser: M. J. Cormier, D.M. Hercules und J. Lee), Seiten 325 - 335, Plenum Press, New York), die Luciferaseaktivität beträchtlich herabsetzen. Folglich kann es unter bestimmten Bedingungen von Wichtigkeit sein, der Auswirkung der Erzeugung von freiem oxyluciferin entgegenzuwirken. Durch Zugabe eines D-Luciferinanalogs wird die anfängliche Inhibierung der Luciferase so groß, daß die zusätzliche Inhibierung durch das Oxyluciferin, welches bei der Reaktion kontinuierlich gebildet wird, vernachlässigbar ist. Die Zugabe von inhibierenden Konzentrationen eines D-Luciferinanalogs wird folglich den Lichtpegel stabilisieren.

Bei der Durchführung der Analyse sollte die Konzentration des D-Luciferins sättigend sein, d.h., so hoch, daß eine geringe Konzentrationsänderung die Reaktionsgeschwindigkeit nicht beeinflußt. Dies ist von Wichtigkeit, weil andernfalls geringe Volumenänderungen die Reaktionsgeschwindigkeit beeinflussen würden. Ferner können Bestandteile biologischer Proben die zur Luciferasereaktion verfügbare Konzentration des D-Luciferins beeinflussen und auf diese Weise diese Reaktion inhibieren. Eine befriedigende Genauigkeit der Analyse könnte folglich nur durch Verwendung von Sättigungskonzentrationen des D-Luciferins erzielt werden.

Durch die Zugabe eines D-Luciferinanalogs zum D-Luciferin läßt sich anscheinend eine Sättigung bei einer niedrigen Konzentration des D-Luciferins erreichen, ohne daß die Genauigkeit der Analyse auf irgendeine andere Weise als durch eine Reduzierung der Empfindlichkeit beeinflußt wird. Dies stellt einen zusätzlichen Vorteil der Erfindung dar, weil das D-Luciferin eine teure Substanz ist, die nur in Ausnahmefällen in Sättigungskonzentrationen zugegeben werden kann.

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Die infolge der Zugabe eines Analogs verringerte Luciferaseaktivität ist durch eine Erhöhung der Luciferasekonzentration kompensierbar. Es kann somit das Verhältnis von Luciferin zu Luciferase optimal eingestellt werden, z.B. in Bezug auf die Kosten der Reagensherstellung, ohne daß dadurch die Empfindlichkeit der Analyse beeinträchtig wird. Die diesbezügliche Wichtigkeit der Erfindung geht aus der Tatsache hervor, daß auf dem Weltmarkt für nur eine der entwickelten Anwendungen der Bedarf zur Durchführung von etwa 5 Mill. Analysen pro Jahr besteht. Eine Verringerung der Kosten des Reagens um weniger als 1 Cent pro Analyse würde somit zu erheblichen Kostenverkleinerungen führen. Dies bedeutet, daß die Erfindung auch in dieser Hinsicht einen sehr wesentlichen Beitrag zur Praxis auf diesem Gebiet liefert.

Zusammenfassend ist zu folgern, daß die erfindungsgemäße Verwendung des Luciferinanalogs es ermöglicht, das Verhältnis Luciferin/Luciferase optimal zu gestalten, z.B. in Bezug auf Herstellungskosten des Reagens, sowie auch in Bezug auf eine Erhöhung der Stabilität des Lichtpegels. Eine geeignete Konzentration des D-Luciferins ist diejenige, die zu einer Inhibierung der Luciferasereaktion und somit der Lichtintensität von mindestens 25 % führt, weil bei geringerer Inhibierung die Auswirkung auf die Stabilität des Lichtpegels und die zur Sättigung benötigte Konzentration des D-Luciferins zu klein ist, um bei der Analyse von wirtschaftlicher Bedeutung zu sein. Ein besonders bevorzugter Bereich beträgt 50 bis 90 %. Eine Inhibierung der Intensität von mehr als 90 % führt u.a. dazu, daß unnötig große Anforderungen an die Meß- und Registriergeräte gestellt werden müssen und erfordert auch eine solche Erhöhung der einzusetzenden Luciferase menge, daß die Analyse unwirtschaftlich wird. Ferner entsteht bei großen Luciferasemengen leicht eine Störung der Analyse.

Gemäß einer spezifisch bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird der oben erwähnte konkurrierende Inhibitor zusammen mit Pyro-

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phosphat dem Reagens zugegeben. Es ist an sich bekannt, daß Pyrophosphatkonzentrationen, welche die Luciferasereaktion inhibieren, auch der Abnahme der Lichtintensität entgegenwirken (W.D. McElroy, J.W. Hastings, J. Coulombre und V. Sonnenfeld (1953), Arch. Biochem. Biophys. Band 46, Seiten 399-416). Dies ist bisher jedoch nicht zur Verbesserung der Analysebedingungen bei der Bestimmung von ATP verwendet worden.

Es wurde in überraschender Weise festgestellt, daß die kombinierte Verwendung von Pyrophosphat in viel geringerer Konzentration als vorher

-4 üblich war, vorzugsweise in einer Höchstkonzentration von 10 M und insbesondere in einer Konzentration von nicht mehr als 10 M, zusammen mit einem konkurrierenden Inhibitor in der vorstehend angegebenen Konzentration zu einem sehr stabilen Lichtpegel führt. Durch diese Kombination wird eine Stabilität des Lichtpegels erhalten, wie sie ansonsten nur durch erheblich größere Inhibierung der Luciferase unter Verwendung von entweder Pyrophosphat oder einem D-Luciferinanalog erreichbar ist. Bei einer konkurrierenden Inhibierung mit einem D-Luciferinanalog von etwa 50 % und einer Pyrophosphatkonzentration von 10 M ist es auf diese Weise möglich gewesen, einen Abfall der Lichtintensitätskurve herbeizuführen, der weniger als 3 % beträgt. Bei einer Inhi-

—fi bierung von etwa 75 % und einer Pyrophosphatkonzentration von 10 M ist es möglich gewesen, einen in der Größenordnung von 1 % liegenden Abfall der Lichtintensitätskurve zu erhalten. Eine derart stabile Lichtintensität erlaubt es natürlich, viel weniger aufwendige Meß- und Registriergeräte einzusetzen, und sie stellt vor allem eine sehr gute Voraussetzung für die kontinuierliche Analyse bei ATP umwandelnden Reaktionen dar. Bei der Erfindung sind die üblicherweise verwendeten Pyrophosphate einsetzbar.

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Die Art der hier auftretenden Reaktion soll durch keine spezifische Theorie der Reaktionsmechanik festgelegt werden. Es ist jedoch möglich, daß das Pyrophosphat mit AMP imEnzym-Oxyluciferin-AMP-Komplex gemäß der Reaktion 4 der Fig. 1 reagiert. Zur Bildung von ATP aus Pyrophosphat und AMP wird Energie benötigt. Diese Energie ergibt sich wahrscheinlich durch die Rückumwandlung von Enzym zur ursprünglichen Konformation aus der vor der Oxidations reaktion bestehenden Konformation (Reaktion 2 der Fig. 1). Das Auftreten einer Änderung der Konformation würde eine Erklärung dafür bieten, daß die Produktinhibierung nicht konkurrierend ist (J. J. Lemasters und CR. Hacknebrock, (1977), Biochemistry , Band 16, Seiten 445-447), während Oxyluciferin ein konkurrierender Inhibitor ist (siehe Goto und Mitarbeiter, (1973), a.a.O.). Die Reaktion mit Pyrophosphat würde somit eine starke,nicht konkurrierende Inhibierung (siehe Goto und Mitarbeiter, (1973), a.a.O.) in eine schwächere, konkurrierende Inhibierung umwandeln. Der Auswirkung der konkurrierenden Inhibierung auf den Lichtpegel kann erfindungsgemäß durch Zugabe eines D-Luciferinanalogs entgegengewirkt werden (siehe oben). Gemäß der Reaktion 4 der Fig. 1 führt die Luciferasereaktion in Gegenwart von Pyrophosphat insgesamt zulanem Aufbrauchen von ATP. Dies würde zur Stabilisierung des Lichtpegels beitragen.

Zusätzlich zur Mitwirkung bei der Abspaltung des Enzyms aus dem Enzym-Oxyluciferin-AMP-Komplex könnte das Pyrophosphat in inhibierenden Konzentrationen dazu beitragen, die Reaktion 1 in Fig. 1 in Rückwärtsrichtung zu treiben. Durch Zugabe von Pyrophosphat könnte somit die gesamte Enzymkonzentration erhöht werden, ohne eine entsprechende Vergrößerung der Lichtintensität. Ein kleinerer Anteil der gesamten Enzymkonzentration wird dadurch in Form eines inaktiven Enzymproduktkomplexes gegenwärtig sein. Inhibierende Pyrophosphatkonzentrationen würden somit zur Stabilisierung des Lichtpegels beitragen.

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Gemäß einer anderen bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird dem Biolumineszenzreagens Coenzym A zugegeben, d.h. entweder in Kombination nur mit dem konkurrierenden Inhibitor oder in Kombination mit dem konkurrierenden Inhibitor und Pyrophosphat. Es hat sich auch gezeigt, daß die Zugabe von Coenzym A den Lichtpegel stabilisiert. Die Tatsache, daß sich eine Erhöhung der Lichtintensität durch Zugabe von nur Coenzym A erreichen läßt, ist an sich bekannt (siehe die Veröffentlichung von R. L. Airth, W. C. Rhodes und W.D. McElroy, (1958), Biochem. Biophys. Acta, Band 27, ab Seite 519), jedoch ist die Verwendung von Coenzym A zur Verbesserung der analytischen Bedingungen bei der Bestimmung von ATP bisher nicht vorgeschlagen worden.

Die Reaktionsmechanik des Coenzym A besteht wahrscheinlich darin, daß die Verbindung mit Oxyluciferin im Enzym-Oxyluciferjn-AMP-Komplex gemäß der Reaktion 4 in der Fig. 1 reagiert (in der das Coenzym A mit CoA bezeichnet ist). Die Reaktion zwischen dem Coenzym A und dem Oxyluciferin ändert die nicht konkurrierende Produktinhibierung des Enzyms und des Gxylucifain-AMP-Komplexes zu einer schwachen Konkurrierenden Inhibierung durch AMP, die unter normalen analytischen Bedingungen nicht vernachlässigbar ist.

Das Coenzym A übt somit seine Wirkung aus, ohne die Luciferasereaktion zu hemmen. Hier ergibt sich ein Unterschied zu D-Luciferinanalogen und, in bestimmten Fällen, auch zu Pyrophosphat. Die mit D-Luciferinanalogen und Pyrophosphat erhaltene Inhibierung ist jedoch bei vielen analytischen Anwendungen ohne Wichtigkeit, weil die Empfindlichkeit des Luciferaseverfahrens im allgemeinen sogar nach der Inhibierung zufriedenstellend ist. Wenn dies nicht der Fall ist, kann die Konzentration der Luciferase erhöht werden, vorausgesetzt daß das Luciferasepräparat keinen hohen Anteil an Verunreinigungen aufweist, die bei der Analyse stören. Bei bestimmten Anwendungen der Erfindung kann es so-

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mit von speziellem Interesse sein, ein hochgereinigtes Luciferasepräparat zu verwenden. Verschiedene Verfahren zur Reinigung von Luciferase sind an sich bekannt und alle diese Verfahren lassen sich in den meisten Fällen einsetzen. Wenn die Anforderungen an Reinheit sehr hoch sind, besteht eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung in der Verwendung eines Reagens, das Luciferase enthält, die mittels der isoelektrischen Fokussierung gereinigt worden ist. Luciferase läßt sich ferner gegen unspezifische Aktivierung dadurch schützen, daß die richtigen Reaktionsbedingungen gewählt und schützende Substanzen, wie z.B. Rinderserumalbumin, Thiolverbindungen und/oder Äthylendiamintetraessigsäure hinzugegeben werden.

Bei bestimmten biologischen Proben ist die Verwendbarkeit von Pyrophosphat und Coenzym A durch das Vorkommen von Enzymsystemen begrenzt, welche diese Substanzen degradieren. In diesen Fällen läßt sich die Wirkung derartiger Enzyme dadurch verhindern, daß ein Inhibitor zugegeben wird, der die Luciferasereaktion nicht beeinflußt. Die Pyrophosphataseaktivität läßt sich z.B. durch Mangan- oder Fluoridionen inhibieren. Wird die synthetische Natur der Luciferinanaloge in Betracht gezogen, ergibt sich, daß diese in den biologischen Proben vermutlich keiner enzymatischen Degradierung unterliegen.

Bei der Herstellung eines Biolumineszenzreagens mit gewünschten Eigenschaften muß die Auswahl an Substanzen oder an der Kombination von Substanzen aus der Gruppe bestehend aus D-Luciferinanalogen,Pyrophosphatenund Coenzym A je nach der Verwendung bestimmt werden. Dies beruht auf dem Umstand, daß die Anforderungen verschiedener Verwendungen in Bezug auf Empfindlichkeit, Probenzusammensetzung, auftretenden StörreaKtionen, Preisniveau · des Reagens, Lagerstabilität usw. variieren. Wird in Betracht gezogen, daß die Erfindung es ermöglicht, eine Auswahl aus einer großen Gruppe von Substanzen zu

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treffen, dürften sich für den Fachmann keine Schwierigkeiten beim Auffinden einer geeigneten Reagenzzusammensetzung für jeden einzelnen Anwendungszweck ergeben.

Zusätzlich zur vorstehenden Beschreibung der Vorteile und Anwendungen der Erfindung ist hinzuzufügen, daß kontinuierliche Messungen und Beobachtungen von ATP umwandelnden Reaktionen mit dem erfindungs ge mäßen, verbesserten Biolumineszenzreagens eine Empfindlichtkeit aufweisen, die üblicherweise um mehrere Zehnerpotenzen größer ist, als die Empfindlichkeit des entsprechenden spektralphotometrischen Verfahrens. Die analytische Verfahrensweise ist jedoch sehr ähnlich der Verfahrensweise bei gedoppelter spektralphotometrischer Analyse, die z.B. auf der Grundlage der NAD⁺/NADH-Umwandlung durchgeführt wird. Bei der Bestimmung von ATP in ATP nichtumwandelnden Systemen, d.h. in Proben mit konstanter ATP-Konzentration, weist ein Reagens mit den oben angegebenen Eigenschaften auch ersichtliche Vorteile auf. Da das Licht konstant ist, werden keine Anforderungen an die Geschwindigkeit der Vermischung von Reagens und Proben gestellt. Das Vermischen muß nicht in der Meßposition stattfinden und die Lichtmessung kann während des Verlaufs einer beliebigen Zeitdauer durchgeführt werden. Hierdurch wird die Empfindlichkeit und auch die Reproduzierbarkeit vergrößert. Bei der Bestimmung von ATP in Zellensystemen weist das erfindungsgemäße Reagens auch große Vorteile auf, weil es die Messung der Konzentration von extrazellulären!und intrazellulärem ATP in derselben Probe ermöglicht. Zuerst wird die Konzentration von extrazellulären ATP gemessen, wonach ein lytisches Reagens, welches das Luciferasesystem nicht beeinflußt, hinzugegeben und die der Konzentration von intrazellulären ATP entsprechende Verstärkung des Lichts gemssen wird.

Obwohl die einzelnen Bestandteile des erfindungs ge mäße η Biolumineszenzreagens der Einfachheit halber als Teile des Reagens beschrieben

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worden sind, ist es selbstverständlich möglich, diese getrennt zuzugeben. Es lassen sich folglich eine oder mehrere der Komponenten zusammen mit den zur Erzielung des gewünschten pH-Werts erforderlichen Puffers hinzugeben.

Anhand der nachstehenden, nicht einschränkenden Beispiele, wird die Erfindung näher erläutert.

Beispiel

Dieses Beispiel, das sich auf die Fig. 2 bezieht, erläutert, wie D-Luciferinanaloge (in diesem Falle L-Luciferin) und Pyrophosphat zusammen verwendet werden können, so daß ein Reagens mit stabilem Lichtpegel bei bereits annehmbarer Inhibierung erhalten werden kann. Die im Beispiel verwendete Luciferase wurde mittels der isoelektrischen Fokussierung gereinigt. In der Fig. 2 ist die Lichtintensität als Funktion der Zeit nach der Zugabe von ATP. in einer endgültigen Konzentration von 10~ M zur Reaktionsmischung gezeigt. In der Reaktionsmischung (endgültiges Volumen ImI) ist in allen Fällen Luciferase, D-Luciferin (100 pg/ml), Magnesiumacetat (10 mM), Rinderserumalbumin (0,1 %), Äthylendiamintetraessigsäure (2 mM), und 0,1 M tris (Hydroxymethyl) aniinomethanpuffer, der unter Verwendung von Essigsäure auf einen pH-Wert von 7, 75 eingestellt worden war, enthalten.

Die Fig. 2a zeigt die ohne weitere Zusätze erhaltene Lichtkurve . Ein Reagens mit abfallendem Pegel gemäß der Fig. 2a ist zur kontinuierlichen Messung bei ATP umwandelnden Systemen nicht verwendbar. Die Fig. 2b zeigt die Wirkung des Zusatzes von L-Luciferin (10 μg/ml), der zu einer Inhibierung von etwa 70 % führt. Die Abnahme bzw. Abnahmecharakteristik der Kurve ist annehmoar, jedoch können aufgrund der anfänglichen Spitzenwerte die Reagenzien bei hohen ATP-Konzentratio-

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nen zu kontinuierlichen Messungen in ATP umwandelnden Systemen nicht verwendet werden. Werden höhere Konzentrationen des Zusatzes eingesetzt und dabei größere Inhibierungen erhalten, so ergeben sich jedoch dabei geradelinige Lichtkurven und brauchbare Reagenzien. In der Fig. 2c ist die Wirkung von Pyrophosphat (10~ M) gezeigt. Der Abfall der Lichtkurve ist immer noch zu groß und es ergibt sich anfangs in geringem Ausmaße ein Spitzenwert. Bei höheren und mehr inhibierenden Konzentrationen des Zusatzes nähert sich die Lichtkurve mehr einer Geraden. Die Fig. 2d zeigt die Wirkung von L-Luciferin (10 pg/ml) und Pyrophosphat (10 M). In diesem Fall sind der Abfall der Kurve sowie auch der anfängliche Spitzenwert fast vollkommen verschwunden. DiesesReagens ist somit zu analytischen Zwecken gut geeignet. Nur die Reagenzien, die L-Luciferin (2b und 2d) enthalten, wobei ans cheinaxi eine Sättigung in Bezug auf Luciferin (D+L, siehe oben) gegeben ist, werden fol^icherweise eine maximale Genauigkeit bei der Analyse ergeben.

Zur Frage der Terminologie bei dem in dieser Beschreibung verwendeten Begriff "Analogverbindung des D-Luciferins" bzw. "D-Luciferinanalog" wird auf den in der englischsprachigen Literatur verwendeten Ausdruck "luciferin analogue" hingewiesen, wie er z.B. im Auf satz von Denburg, Lee und McElroy in Arch. Biochem. Biophys. (1969), 134, Seiten 381-394 vorkommt.

Zum Begriff "konkurrierender Inhibitor" wird hingewiesen auf Segel, "Enzyme Kinetics", (1975), Verlag Wiley-Interscience", New York, wonach ein "konkurrierender Inhibitor" ein nichtmetabolisierbares Analog oder Derivat des echten Substrats oder ein alternatives Substrat des Enzyms oder ein Produkt der Reaktion sein kann. Eine technologisch äquivalente Wirkung liegt hier vor.

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Claims

LIEDL, NÖTR> ZEIYLE*

Patentanwälte
8000 München 22 · Steinsdorfstraße 21-22 · Telefon 089 / 22 94 41

LKB- PRODUKTER AB 16125 Brommal, SCHWEDEN

und

ARNE THORWALD LUNDIN Gaveliusgatan 6, 11641 Stockholm, SCHWEDEN

Verfahren und Reagens für die Biolumineszenz

Patentansprüche:

IJ Verfahren zur Bestimmung von Adenosintriphosphatkonzentra-

tionen durch Inkontaktbringen der zu untersuchenden Probe mit einem Biolumineszenzreagenz auf Basis von D-Luciferin, Luciferase und Magnesiumionen oder bestimmten anderen Metällionen zum Herbeiführen einer Reaktion, in der das Adenosintriphosphat und D-Luciferin unter Lichtemision an die Luciferase gebunden werden,und Messen der ein Maß für die Adenosintriphosphatkonzentration darstellenden Intensität des emittierten Lichts, dadurch gekennzeichnet, daß man bei der Bestimmung einen oder mehrere konkurrierende Inhibitoren der Reaktion in Form von Analogverbindungen des D-Luciferins verwendet.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,

daß man die D-Luciferinanalo@3· in einer Konzentration einsetzt, die zu einer Inhibierung von mindestens 25 %, vorzugsweise 50 bis 90 % der Lichtintensität führen.

A9255-J/W 909849/0814
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man als D-Luciferinanalog. L-Luciferin einsetzt.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß man bei der Bestimmung auch Pyrophosphat verwendet.
5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daii man das Pyrophosphat in einer maximalen Konzentration von lo" M, vorzugsweise in einer maximalen Konzentration von 10 M einsetzt.
6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man auch Coenzym A bei der Bestimmung einsetzt.
7. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Luciferase enthaltendes Reagens einsetzt, das durch isoelektrische Fokussierung gereinigt worden ist.
8. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Luciferase enthaltendes Reagens mit einem Zusatz an Rinderserumalbumin, Thiolverbindungen und/oder Xthylendiamintetraessigsäure einsetzt.
9. Reagens für die Biolumineszenz zur Verwendung bei der Bestimmung von Adenosintriphosphatkonzentrationen, auf Basis von D-Luciferin, Luciferase und Magnesiumionen oder bestimmten anderen Metallionen, dadurch gekennzeichnet, daß es zusätzlich einen oder mehrere konkurrierende Inhibitoren in Form von Analogverbindungen des D-Luciferins enthält.

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10. Reagens nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß das D-Luciferinanalog in einer Konzentration vorliegt, die zu einer Inhibierung von mindestens 25 %, vorzugsweise 50 bis 90 % der Lichtintensität führt.
11. Reagens nach Anspruch 9 oder 10, dadurch gekennzeichnet, daß das D-Luciferinanalog L-Luciferin ist.
12. Reagens nach einem der Ansprüche 9 bis 11, dadurch ge kennzeichnet, daß es auch Pyrophosphat enthält.
13. Reagens nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet,

-4 daß das Pyrophosphat in einer maximalen Konzentration von 10 M,

-5 vorzugsweise in einer maximalen Konzentration von 10 M vorliegt.
14. Reagens nach einem der Ansprüche 9 bis 14, dadurch ge kennzeichnet, daß es auch Coenzym A enthält.
15. Reagens nach einem der Ansprüche 9 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß es Luciferase enthält, die durch isoelektrische Fokussierung gereinigt worden ist.
16. Reagens nach einem der Ansprüche 9 bis 15, dadurch gekennzeichnet, daß es Luciferase mit einem Zusatz an Rinderserumalbumin, Thiolverbindungen und/oder Äthylendiamintetraessigsäure enthält.

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