DE2921975C2 - Verfahren und Reagenz für die Biolumineszenz - Google Patents

Verfahren und Reagenz für die Biolumineszenz

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Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung von Adenosintriphosphatkonzentrationen durch Inkontaktbringen der zu untersuchenden Probe mit einem Biolumineszenzreagenz auf Basis von D-Luciferin, Luciferase und Magnesiumionen zum Herbeiführen einer Reaktion, in der das Adenosintriphosphat und D-Luciferin unter Lichtemission an die Luciferase gebunden werden, und Messen der ein Maß für die Adenosintriphosphatkonzentraiion darstellenden Intensität des emittierten Lichts. Die Erfindung betrifft auch ein Reagenz für die Biolumineszenz zur Verwendung bei der Bestimmung von Adenosintriphosphatkonzentrationen, auf Basis von D-Luciferin, Luciferase und Magnesiumionen.
Anwendungszweck der Erfindung ist die Bestimmung
ίο von Konzentrationen des Adenosintriphosphats, im nachfolgenden als ATP bezeichnet z. B. bei ATP-Umwandlungsreaktionen oder ATP umwandelnden Systemen.
Von ATP abhängige Biolumineszenzreagenzien sind
is an sich bekannt Diese Reagenzien basieren auf dem Enzym Luciferase und einem Substrat nämlich D-Luciferin und MagnesiuEiionen und bestimmte andere Metallionen, an die das andere Substrat ATP, in komplexer Weise gebunden werden muß, damit eine Reaktion stattfindet Wird das ATP mit dem Reagenz in Kontakt gebracht finden mehrere durch die Luciferase katalysierte Reaktionen statt die in schematisch vereinfachter Form und zum Teil hypothetisch in der F i g 1 dargestellt sind. Die Reaktionen 1 bis 3 sind im einzelnen an Luciferase aus dem gemeinen amerikanischen Glühwürmchen Photinus pyralis untersucht worden. Übersichtsaufsätze hierzu sind: M. DeLuca (1976), »Advance in Enzymology« (A.Meister, Verfasser), Band 44, Seiten 37-68, John Wiiey&Sons, New York, sowie W. D. McElroy, H.H. Seliger und M. DeLuca (1974), »The Physiology of Insecta«, 2. Auflage (M. Rockstein, Verfasser), Band 11, Seiten 411 —460, Academic Press, New York.
Aus Luciferase (E) wird bei der Reaktion 1 ATP und D-Luciferin (LH2), freies Pyrophosphat (PPi) und enzymgebundenes Luciferyladenylat gebildet. Diese Reaktion begrenzt nicht die Geschwindigkeit weiterer Reaktionen. Der entstehende Enzym-Luciferyladenylat-Komplex unterliegt zwei Vorgängen, welche die Emissionsrate des anfangs emittierten Lichts begrenzen, nämlich einer Konformationsänderung und dem Entzug eines Protons aus dem Luciferyladenylat (s. M. DeLuca und W. D. McElroy, (1974), Biochemistry, Band 13, Seiten 921 -925). Bei der Reaktion 2 wird Luciferylade-
<5 nylat durch Sauerstoff oxidiert unter Bildung von Adenosinmonophosphat, das nachfolgend als AMP bezeichnet wird, angeregtem Oxylaciferin (P*), die beide enzymgebunden bleiben, und Kohlendioxid. In der Reaktion 3 geht das Oxyluciferin unter Emission eines
so Photons in den Grundzustand über. Die zur Emission des Photons erforderliche Energie entstammt der Oxidation des Luciferins und nicht dem Aufspalten der Pyrophosphatbindung des ATP.
Der bei der Reaktion 3 entstehende Enzym-Oxyluciferin-AMP-Komplex ist stabil und kann durch Gelfiltration isoliert werden, wenn die Reaktion in Gegenwart von Pyrophosphatase durchgeführt wird (B. J. Gates und M. DeLuca (1975), Arch, Biochem, Biophys., Band 169, Seiten 616—621). In Abwesenheit von Pyrophosphatase wird ein Enzym-Oxyluciferin-Komplex ohne AMP isoliert der die gleiche Aktivität wie ein freies Enzym aufweist (s. den zuletzt genannten Aufsatz von Gates und DeLuca).
Die Stabilität des Enzym-Oxyluciferin-AMP-Komplexes führt dazu, daß die Mischung aus Luciferase, D-Luciferin und ATP eher einen Lichtblitz als eine konstante Lichtemission ergibt. Die maximale Lichtintensität wird innerhalb einer Sekunde erreicht und
nimmt danach auf einen gleichbleibenden Pegel ab, bei dem die Regenerierung von freiem Enzym im vvesentlichen bei der gleichen Geschwindigkeit stattfindet wie die Emission des Lichts. Aufgrund der Tatsache, daß die freien Produkte die Reaktionen inhibieren, ist der gleichbleibende Pegel jedoch ni'At vollkommen konstant
Die Bestimmung des ATP wird üblicherweise so ausgeführt, daß die eine unbekannte ATP-K onzentration enthaltende Probe mit einem die Luciferase, das D-Luciferin und Magnesiumionen enthaltenden Biolumineszenzrcagenz vermischt wird. Zur Erzielung einer maximalen Zuverlässigkeit der Analyse muß dab?i das Vermischen in geeigneter Weise bei einer vorgegebenen Reaktionsgeschwindigkeit und in einer solchen Meßlage erfolgen, daß die anfängliche Charakteristik des Meßlichtes aufgenommen werden kann (siehe A. Liindin und A. Thore (1975), AnaL Biochem, Band 66, Seiten 47-63). Nach Aufnahme der entstehenden Lichtintensität wird die Analyse mit einer Probe, die eine bekannte ATP-Konzentration enthält, und mit einer Leerprobe ohne ATP wiederholt Die unbekannte ATP-Konzentration wird aus diesen drei Messungen berechnet. Falls die Probe Stoffe enthält, die bei der Analyse störend wirken können, wird eine interne Standardisiertechnik angewendet, d. h., die Probe wird mit und ohne Zugabe einer bekannten ATP-Konzentration analysiert.
Bereits im Jahre 1952 wurden ATP-abhängige Biolumineszenzsysteme als zur Verfügung stehend aufgezeigt, und zwar nicht nur zur Bestimmung dis ATP, sondern im Prinzip auch zur Bestimmung jeglicher Substanz, die an ATP-Umwandlungsreaktionen teilnimmt (B. L Strehler und J. R. Trotter (1952), Arch. Biochem. Biophys., Band 40, Seiten 28-41). Die Möglichkeit, ein Biolumineszenzreagenz einem ATP-Umwandlungssystem zuzugeben, um die ATP-Konzentration k*ntinuierlich durch Messung der Lichtintensität zu verfolgen, hat jedoch sehr geringe praktische Bedeutung erlangt Die Ursache hierfür beruht zum Teil auf der Tatsache, daß die Aktivität der Luciferase während der Reaktion infolge der vorstehend beschriebenen Produktinhibierung abnimmt und zum Teil auf der Tatsache, daß die Luciferasereagenzien durch ATP-Umwandlungssysteme verunreinigt werden. Das Interesse an dem Verfahren vergrößerte sich jedoch, als es möglich wurde, durch Verwendung von gereinigter Luciferase und bei synthetischer Hersteilung des Luciferins während einer Reaktionszeit von mehreren Minuten eine vernachlässigbare Abnahme der Lichtin-•ensität sowie der ATP-Konzentration zu erzielen (A. Lundin und A. Thore (1975), Anal. Biochem. 66, Seiten 47-63). Geeignete Bedingungen für die Analyse wurden untersucht und das Verfahren erwies sich als brauchbar für ATP-Konzentrationen bis zu 10~6 mol/1 (A. Lundin, A. Rickardsson und A.Thore (1977), Anal. Biochem., Band 75, Seiten 611 - 620). Trotz wiederholter Versuche ließ sich jedoch ein Reagenz mit den vorstehend beschriebenen Eigenschaften in nur sehr wenigen Fällen herstellen.
Dennoch wurde die analytische Verwendbarkeit eines Reagenz mit den vorstehend angegebenen Eigenschaften für kinetische Bestimmungen von Substraten und Enzymen, Endpunktbestimmungen von Substraten, Überwachung von Photophosphorylation und verfolgende Beobachtung von lytischen Reaktionen aufgezeigt (A. Lundin, A. RickardsFon und A. Thore (1976), Anal. Biochem.. Band 75. Seiten 611-620; A. Lundin,
A. Rickardsson und A. Thore (1977), »Proceedings of the 2nd Bi-Annual ATP Methodology Symposium, SAI Technology Company, San Diego; A. Lundin, A. Thore und M. Baltscheffsky (1977), FEBS Lett, Band 79, Seiten 73 - 76; A. Lundin (1978), »Methods in Enzymology« (M. DeLuca, Verfasser), Band 57, Academic Press, New York; A. Lundin und M. Baltscheffsky (1978), »Methods in Enzymology« (M. DeLuca, Verfasser), Band 57, Academic Press, New York; A. Lundin und I. Styrelius
ίο (1978), CIin. Chem. Acta und A. Thore und A. C Eriksson (1977), FOA-Report).
Die Schwierigkeiten bei der reproduzierbaren Herstellung eines Reagenz mit den oben angegebenen Eigenschaften lassen jedoch vermuten, daß die vorstehend angegebenen Verwendungen nicht außerhalb derjenigen Laboratorien zum Einsatz gekommen sind, an denen die Verfahrensweisen entwickelt wurden.
Aufgabe der Erfindung ist es somit, ein entsprechend verbessertes, gattungsgemäßes Verfahren zur Bestimmung von ATP aufzuzeigen, bei dem ein zuverlässig meßbarer, stabiler Verlauf des Lichtintensitätspegels entsteht, sowie ein in reproduzierbarer Weise herstellbares, zuverlässiges Reagenz der gattungsgemäßen Art anzugeben.
Die erfindungsgemäße Lösung der Aufgabe ergibt sich aus den Patentansprüchen.
Die einem ATP-abhängigen Biolumineszenzreagenz zugegebenen Zusätze führen zu einer Lichtemission, die während der gesamten Meßzeit der ATP-Konzentration proportional ist Da das Biolumineszenzreagenz selbst nur geringe Mengen an ATP verbraucht, ergeben Proben mit einer konstanten ATP-Konzentration eine konstante Lichtemission, was die Verwendung des Reagenz zu ATP-Bestimmungen erleichtert. Ferner läßt sich ein Reagenz mit den oben angegebenen Eigenschaften anderen ATP-Umwandlungssystemen zugeben, so daß es in einfacher Weise ermöglicht wird, Änderungen der ATP-Konzentration durch kontinuierliche Messung der Lichtintensität zu verfolgen und zu überwachen. Als ATP-Umwandlungssysteme kommen z. B. Kombinationen von Enzymen und möglicherweise einem Substrat, das in einer Reaktion ATP bindet oder aufbraucht, in Frage. Die analytische Verwendung des Reagenz umfaßt die Bestimmung von ATP und Substanzen und Enzymen, die an ATP-Umwandlungsreaktionen teilnehmen, innerhalb der Gebiete der klinischen Chemie und der klinischen Mikrobiologie und bei der biochemischen und biologischen Forschung, insbesondere auf dem Gebiet der Bioenergetik.
Im Stand der Technik ergab sich in verschiedenen Reagenzien eine Schwankung der Stabilität des Lichtpegels, die sich von einer wenige Prozent pro Minute betragende Abschwächung der Lichtintensität bis zu einer Abnahme auf die Hälfte der ursprünglichen Lichtintensität nach 1 Minute erstreckte. Erfindungsgemäß wird jedoch aufgezeigt, daß es die Zugabe von L-Luciferin ermöglicht, in reproduzierbarer Weise ein Reagenz herzustellen, das die gewünschten Eigenschaften, d.h. einen stabilen Lichtemissionspegel, aufweist.
Die Wirkung des L-Luciferins auf die Stabilität des Lichtpegels wurde bisher nicht beobachtet und bei analytischen Anwendungen dürfte es nahegelegen haben, die Gegenwart derartiger Analoge zu vermeiden, weil diese bekanntlich, mit dem D-Luciferin konkurrierend, die lichterzeugende Luciferasereaktion inhibieren (J. L. Denburg, R. T. Lee und W. D. McElroy, Arch. Biochem. and Biophys. 134(1969), S. 381-394).
Obwohl die Erfindung nicht durch irgendeine
spezifische Theorie bezüglich der Reaktionsmechanik bei der Zugabe des L-Luciferins eingeschränkt ist, könnte eine derartige Zugabe zur Folge haben, daß ein geringer Teil der gesamten Luciferasemenge als inaktiver Enzym-Produkt-Komplex vorliegt. Da die freie Enzymkonzentration infolge der Bildung eines Enzym-Produkt-Komplexes abnimmt, wird der Enzym-Luciferin-Komplex wahrscheinlich unter Bildung von freiem Enzym dissoziiert, wie dies durch die Reaktion 5 in der F i g. 1 gezeigt ist. Durch Verwendung des L-Luciferins, d. h. eines konkurrierenden Inhibitors, läßt sich die Luciferasemenge ohne entsprechende Erhöhung der Reaktionsgeschwindigkeit vergrößern. Dieses trifft zu, unabhängig davon, ob das L-Luciferin mit ATP gemäß Reaktion 1 reagiert oder gemäß Reaktion 5 einen enzyminhibierenden Komplex bildet. Die wesentliche Voraussetzung ist lediglich, daß die Reaktionen umkehrbar und schneller als die Reaktionen 2 bis 4 ablaufen (die Reaktion 4 wird nachstehend im einzelnen erörtert).
Zum Begriff »konkurrierender Inhibitor« wird hingewiesen auf Segel, »Enzyme Kinetics« (1975), Verlag Wiley-Interscience«, New York, wonach ein »konkurrierender Inhibitor« ein nichtmetabolisierbares Analog oder Derivat des echten Substrats oder ein alternatives Substrat des Enzyms oder ein Produkt der Reaktion sein kann.
insofern freies AMP und freies öxyiucit'erin bei der Reaktion gebildet werden, ist es von Interesse zu untersuchen, ob dies auch die Inhibierung des Produkts beeinflußt. Wenn z. B. ATP in einer Konzentration von 10~6 mol/1 zur Erzeugung von AMP in einer Konzentration von 10-6 mol/1 und Oxyluciferin in einer Konzentration von 10-6 mol/1 führen wurden, so würde die inhibierende Wirkung des AMP die Aktivität der Luciferase um weniger als 0,5% beeinflussen, weil die Inhibierungskonstante K, des AMP 2,4 χ ΙΟ"4 mol/1 beträgt (siehe R. T. Lee, J. L Denburg und W. D. McElroy (1970), Arch. Biochem. Biophys., Band 141, Seiten 38 — 52). Dagegen würde die Bildung von Oxyluciferin, für das K, 2,3 χ 10-? mol/I beträgt (T. Goto, I. Kubota, N. Suzuki und Y. Kishi (1973), »Chemiluminiscence and Bioluminiscence«, Verfasser: M. J. Cormier, D.M. Hercules und J.Lee, Seiten 325-335, Plcr.-jm Press, New York), die Luciferaseaktivität beträchtlich herabsetzen. Folglich kann es unter bestimmten Bedingungen von Wichtigkeit sein, der Wirkung des freien Oxyluciferins entgegenzuwirken. Durch Zugabe des L-Luciferins wird die anfängliche Inhibierung der Luciferase so groß, daß eine zusätzliche Inhibierung durch das Oxyluciferin, welches bei der Reaktion kontinuierlich gebildet wird, vernachlässigbar ist Die Zugabe von inhibierenden Konzentrationen des L-Luciferins stabilisiert folglich den Lichtpegel.
Bei der Analyse mußte die Konzentration des D-Luciferins eine sättigende sein, d. h., so hoch, daß eine geringe Konzentrationsänderung die Reaktionsgeschwindigkeit nicht beeinflußte. Dies war wichtig, weil -andernfalls geringe Volumenänderungen die Reaktionsgeschwindigkeit beeinflußt hätten. Ferner können Bestandteile biologischer Proben die zur Luciferasereaktion verfügbare Konzentration des D-Luciferins beeinflussen und auf diese Weise die Reaktion inhibieren. Eine befriedigende Genauigkeit der Analyse konnte folglich nur bei Sättigungskonzentrationen des D-Luciferins erzielt werden.
Durch die Zugabe des L-Luciferins zum D-Luciferin läßt sich eine scheinbare Sättigung bei einer niedrigen Konzentration des D-Luciferins erreichen, ohne daß die Analyse auf irgendeine andere Weise als durch eine Reduzierung der Meßempfindlichkeit beeinflußt wird. Dies stellt einen zusätzlichen Vorteil der Erfindung dar, weil das D-Luciferin eine teure Substanz ist, die nur in Ausnahmefällen in Sättigungskonzentrationen zugegeben werden kann.
Die infolge der Zugabe des L-Luciferins verringerte Luciferaseaktivität ist durch eine Erhöhung der
Ό Luciferasekonzentration kompensierbar. Es kann somit das Verhältnis von Luciferin zu Luciferase optimal eingestellt werden, z. B. in bezug auf die Kosten der Reagenzherstellung, ohne daß dadurch die Empfindlichkeit der Analyse beeinträchtigt wird. Die diesbezügliche Wichtigkeit der Erfindung geht aus der Tatsache hervor, daß auf dem Weltmarkt für nur eine der entwickelten Anwendungen ein Bedarf zur Durchführung von etwa 5 Mill. Analysen pro Jahr besteht Eine geringfügige Verringerung der Kosten des Reagenz pro Analyse führt somit zu erheblichen Kosteneinsparungen. Dies bedeutet, daß die Erfindung auch in dieser Hinsicht einen sehr wesentlichen Beitrag liefert.
Zusammenfassend ist zu folgern, daß der Einsatz des L-Luciferins es ermöglicht, daß Verhältnis Luciferin/Luciferase optimal zu gestalten, z. B. in bezug auf Herstellungskosten des Reagenz, sowie auch in bezug auf eine Erhöhung der Stabilität des Lichtpegels. Eine geeignete Konzentration des D-Luciterins ist diejenige, die zu einer Inhibierung der Luciferasereaktion und somit der Lichtintensität von mindestens 25% führt, weil bei geringerer Inhibierung die Auswirkung auf die Stabilität des Lichtpegels und die zur Sättigung benötigte Konzentration des D-Luciferins zu klein ist, um bei der Analyse von wirtschaftlicher Bedeutung zu
sein. Ein besonders bevorzugter Bereich beträgt 50 bis 90%. Eine Inhibierung der Intensität von mehr als 90% führt u. a. dazu, daß unnötige große Anforderungen an die Meß- und Registriergeräte gestellt werden müssen und erfordert auch eine solche Erhöhung der einzusetzenden Luciferpsemenge, daß die Analyse unwirtschaftlich wird. Ferner entsteht bei großen Luciferasemengen leicht eine Störung der Analyse.
Gemäß einer spezifisch bevorzugten Ausführungs-ίοππ der Erfindung wird der konkurrierende Inhibitor
zusammen mit Pyrophosphat dem Reagenz zugegeben. Es ist an sich bekannt, daß Pyrophosphatkonzentrationen, welche die Luciferasereaktion inhibieren, auch einer Abnahme der Lichtintensität entgegenwirken (W. D. McElroy, J.W. Hastins, J.Coulombre und
V. Sonnenfeld (1953), Arch. Biochem. Biophys, Band 46 (1953), Seiten 399-416). Dies ist bisher jedoch nicht zur Verbesserung der Anaiysebedingungen bei der Bestimmung von ATP verwendet worden.
Es wurde in überraschender Weise festgestellt, daß die kombinierte Verwendung von Pyrophosphat in viel geringerer Konzentration als vorher üblich, vorzugsweise in einer Höchstkonzentration von 10—' mol/1 und insbesondere in einer Konzentration von nicht mehr als 10~5 mol/1 zusammen mit dem konkurrierenden Inhibitor in der vorstehend angegebenen Konzentration zu einem sehr stabilen Lichtpegel führt Durch diese Kombination wird eine Stabilität des Lichtpegels erhalten, wie sie ansonsten nur durch erhebliche größere Inhibierung der Luciferase unter Verwendung
von entweder Pyrophosphat oder L-Luciferin erreichbar ist Bei einer konkurrierenden Inhibierung mit L-Luciferin von etwa 50% und einer Pyrophosphatkonzentration von 10~6 mol/1 beträgt der Abfall der
Lichtintensitätskurve weniger als 3%. Bei einer Inhibierung von etwa 75% und einer Pyrophosphatkonzentration von 10"6mol/l wird ein in der Größenordnung von 1 % liegender Abfall der Lichtintensitätskurve erhalten. Eine derart stabile Lichtintensität erlaubt es natürlich, viel weniger aufwendige Meß- und Registriergeräte einzusetzen, und sie stellt vor allem eine sehr gute Voraussetzung für eine kontinuierliche Analyse bei ATP umwandelnden Reaktionen dar. Bei der Erfindung sind die üblicherweise verwendeten Pyrophosphate einsetzbar.
Es wird an dieser Stelle keine spezifische Theorie der Reaktionsmechanik festgelegt. Es ist jedoch möglich, daß das Pyrophosphat mit dem AMP im Enzym-Oxyluciferin-AMP-Komplex gemäß der Reaktion 4 der F i g. 1 reagiert. Zur Bildung des ATP aus Pyrophosphat und AMP wird Energie benötigt. Diese Energie ergibt sich wahrscheinlich aus der Rückumwandlung des Enzyms in die ursprüngliche, vor der Oxidationsreaktion bestehende Konformation (Reaktion 2 der Fig. 1). Eine Änderung der Konformation würde eine Erklärung dafür bieten, daß die Produktinhibierung nicht konkurrierend ist (J. J. Lemasters und C. R. Hacknebrock (1977). Biochemistry, Band 16, Seiten 445-447), während Oxyluciferin ein konkurrierender Inhibitor ist (siehe Goto und Mitarbeiter (1973), a.a.O.). Die Reaktion mit Pyrophosphat würde somit eine starke, nicht konkurrierende Inhibierung (siehe Goto und Mitarbeiter (1973), a. a. O.) in eine schwächere, konkurrierende Inhibierung umwandeln. Der Wirkung der konkurrierenden Inhibierung auf den Lichtpegel kann durch die erfindungsgemäße Zugabe des L-Luciferins entgegengewirkt werden (siehe oben). Gemäß der Reaktion 4 der F i g. 1 führt die Luciferasereaktion in Gegenwart von Pyrophosphat insgesamt zu keinem Aufbrauchen des ATP. Dies würde zur Stabilisierung des Lichtpegels beitragen.
Zusätzlich zur Mitwirkung bei der Abspaltung des Enzyms aus dem Enzym-Oxyluciferin-AM P- Komplex könnte das Pyrophosphat in inhibierenden Konzentrationen dazu beitragen, die Reaktion 1 in F i g. 1 in Rückwärtsrichtung zu treiben. Durch Zugabe von Pyrophosphat könnte somit die gesamte Enzymkonzentration erhöht werden, ohne eine entsprechende Vergrößerung der Lichtintensität. Ein kleinerer Anteil der gesamten Enzymkonzentration wird dadurch in Form eines inaktiven Enzymproduktkomplexes gegenwärtig sein. Inhibierende Pyrophosphatkonzentrationen würden somit zur Stabilisierung des Lichtpegels beitragen.
Gemäß einer anderen bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird dem Biolumineszenzreagenz Coenzym A zugegeben, d. h. entweder in Kombination mit nur dem konkurrierenden Inhibitor oder in Kombination mit dem konkurrierenden Inhibitor und Pyrophosphat Es hat sich auch gezeigt, daß die Zugabe von Coenzym A den Lichtpegel stabilisiert Die Tatsache, daß sich eine Erhöhung der Lichtintensität durch Zugabe von nur Coenzym A erreichen läßt ist an sich bekannt (siehe die Veröffentlichung von R-L. Airth, W. C Rhodes und W. D. McElroy (1958), Biochem. Biophys. Acta, Band 27, ab Seite 519), jedoch ist die Verwendung von Coenzym A zur Verbesserung der analytischen Bedingungen bei der Bestimmung von ATP bisher nicht beschrieben worden.
Die Reaktionsmechanik des Coenzyms A besteht wahrscheinlich darin, daß die Verbindung mit Oxyluciferin im Enzym-Oxyluciferin-AM P-Komplex gemäß der Reaktion 4 in der F i g. 1 reagiert (in der das Coenzym A mit CoA bezeichnet ist). Die Reaktion zwischen dem Coenzym A und dem Oxyluciferin ändert die nicht konkurrierende Produktinhibierung des Enzyms und des Oxyluciferin-AMP-Komplexes in eine schwache konkurrierende Inhibierung durch AMP, die unter normalen analytischen Bedingungen nicht vernachlässigbar ist.
Das Coenzym A übt somit seine Wirkung aus, ohne
ίο die Luciferasereaktion zu hemmen. Hier ergibt sich ein Unterschied zum L-Luciferin und, in bestimmten Fällen, auch zu Pyrophosphat. Die mit L-Luciferin und Pyrophosphat erhaltene Inhibierung ist jedoch bei vielen analytischen Anwendungen ohne Wichtigkeit, weil die Empfindlichkeit des Luciferaseverfahrens im allgemeinen sogar nach der Inhibierung zufriedenstellend ist. Wenn dies nicht der Fall ist kann die Konzentration der Luciferase erhöht werden, vorausgesetzt, daß das Luciferasepräparat keinen hohen Anteil an Verunreinigungen aufweist, die bei der Analyse stören. Bei bestimmten Anwendungen der Erfindung kann es somit von speziellem Interesse sein, ein hochgereinigtes Luciferasepräparat zu verwenden. Verschiedene Verfahren zur Reinigung von Luciferase sind an sich bekannt und alle diese Verfahren lassen sich in den meisten Fällen einsetzen. Wenn die Anforderungen an Reinheit sehr hoch sind, besteht eine bevorzugte Äusführungsform der Erfindung in der Verwendung eines Reagenz, das Luciferase enthält, die mittels der isoelektrischen Fokussierung gereinigt worden ist. Luciferase läßt sich ferner gegen unspezifische Aktivierung dadurch schützen, daß die richtigen Reaktionsbedingungen gewählt und schützende Substanzen, wie z. B. Rinderserumalbumin, Thiolverbindungen und/oder Ethylendiamintetraessigsäure hinzugegeben werden.
Bei bestimmten biologischen Proben ist die Verwendbarkeit von Pyrophosphat und Coenzym A durch Enzymsysteme begrenzt, die diese Substanzen abbauen. In diesen Fällen läßt sich die Wirkung derartiger Enzyme dadurch verhindern, daß ein Inhibitor zugegeben wird, der die Luciferasereaktion nicht beeinflußt. Die Pyrophosphataseaktivität läßt sich z. B. durch Mangan- oder Fluoridionen inhibieren. Wird die synthetische Natur des L-Luciferins in Betracht gezogen, erscheint es, daß dieses in den biologischen Proben vermutlich keiner enzymatischen Degradierung unterliegt
Bei der Herstellung eines Biolumineszenzreagenz mit gewünschten Eigenschaften muß die Auswahl an Substanzen aus der Gruppe bestehend aus L-Luciferin, Pyrophosphaten und Coenzym A je nach der Verwendung bestimmt werden, weil die Anforderungen verschiedener Verwendungen in bezug auf Empfindlichkeit Probenzusammensetzung, auftretenden Störreaktionen, Preis des Reagenz, Lagerstabilität usw. variieren. Wird in Betracht gezogen, daß die Erfindung es ermöglicht eine Auswahl aus einer großen Gruppe von Substanzen zu treffen, dürften sich für den Fachmann keine Schwierigkeiten beim Auffinden einer geeigneten Reagenzzusammensetzung für jeden einzelnen Anwendungszweck ergeben.
Zusätzlich zur vorstehenden Beschreibung der Vorteile und Anwendungen der Erfindung ist hinzuzufügen, daß kontinuierliche Messungen und Beobachtun-
gen von ATP umwandelnden Reaktionen mit dem erfindungsgemäßen, verbesserten Biolumineszenzreagenz eine Empfindlichkeit aufweisen, die üblicherweise um mehrere Zehnerpotenzen größer ist, als die
Empfindlichkeit eines entsprechenden spektralphotometrischen Verfahrens. Die analytische Verfahrensweise ist jedoch sehr ähnlich der Verfahrensweise bei gekoppelter spektralphotometrischer Analyse, die z. B. auf der Grundlage der NAD+/NADH-Umwandlung durchgeführt wird. Bei der Bestimmung von ATP in ATP nichtumwandelnden Systemen, d. h. in Proben mit konstanter ATP-Konzentration, weist ein Reagenz mit den oben angegebenen Eigenschaften auch ersichtliche Vorteile auf. Da das Licht konstant ist, werden keine Anforderungen an die Geschwindigkeit des Vermischens von Reagenz und Proben gestellt. Das Vermischen muß nicht an der Meßstelle stattfinden und die Lichtmessung kann im Verlauf einer beliebigen Zeitdauer durchgeführt werden. Hierdurch wird die Empfindlichkeit und auch die Reproduzierbarkcit vergrößert. Bei der Bestimmung von ATP in Zellensystemen weist das erfindungsgemäße Reagenz auch große Vorteile auf, weil es die Messung der Konzentration von extrazellulärem und intrazellulärem ATP in derselben Probe ermöglicht Zuerst wird die Konzentration von extrazellulärem ATP gemessen, wonach ein lytisches Reagenz, welches das Luciferasesystem nicht beeinflußt, hinzugegeben und die der Konzentration von intrazellulärem ATP entsprechende Erhöhung der Lichtintensität gemessen wird.
Es ist möglich, die Bestandteile des erfindungsgemäßen Biolumineszenzreagenz getrennt zuzugeben. Es lassen sich folglich ein oder mehrere der Bestandteile zusammen mit dem zur Erzielung des gewünschten pH-Werts erforderlichen Puffer hinzugeben.
Anhand des nachstehenden Beispiels wird die Erfindung näher erläutert:
Beispiel
Dieses Beispiel erläutert wie L-Luciferin und Pyrophosphat zusammen ein Reagenz mit stabilem Lichtpegel bei bereits annehmbarer Inhibierung ergeben. Die verwendete Luciferase wurde mittels isoelektrischer Fokussierung gereinigt. In der Fig.2 ist die Lichtintensität als Funktion der Zeit nach der Zugabe von ATP in einer endgültigen Konzentration von 10-6mol/l zur jeweiligen Reaktionsmischung gezeigt. In den Reaktionsmischungen (endgültiges Volumen 1 ml) ist in allen Fällen Luciferase, D-Luciferin (100 μg/ml), Magnesiumacetat (10 mmol), Rinderserumalbumin (0,1%), Ethylendiamintetraessigsäure (2 mmol), und 0,1 mol tris (Hydroxymethyl) aminomethanpuffer unter Einstellung eines pH-Wertes von 7,75 mit
Essigsäure, enthalten.
In Fig.2 zeigt A eine mit einem Reagenz ohne weitere Zusätze erhaltene Lichtkurve mit abfallendem Pegel, die zur kontinuierlichen Messung bei ATP umwandelnden Systemen nicht geeignet ist Bei B ist die Wirkung eines Zusatzes von L-Luciferin (10μg/ml) gezeigt, der zu eir.er !nhibienir.g vor. etwa 70% führt. Die Abnahmecharakteristik der Kurve ist annehmbar, jedoch lassen sich aufgrund der anfänglichen Spitzenwerte bei hohen ATP-Konzentrationen keine kontinu- ierlichen Messungen in ATP umwandelnden Systeme durchführen. Werden höhere Konzentrationen des Zusatzes eingesetzt und dabei größere Inhibierungen erhalten, so ergeben sich jedoch geradlinige und brauchbare Lichtkurven. Die Wirkung von Pyrophos phat (10--6mol/l) ist bei C gezeigt Der Abfall der Lichtkurve ist immer noch zu groß und es ergibt sich anfangs in geringem Ausmaß ein Spitzenwert Bei höheren und mehr inhibierenden Konzentrationen des Zusatzes nähert sich die Lichtkurve mehr einer Geraden. Bei D ist die Wirkung von L-Luciferin (10μg/ml) und Pyrophosphat (lO-'mol/l) gezeigt. In diesem Fall sind der Abfall der Kurve sowie auch der anfängliche Spitzenwert fast vollkommen verschwunden. Dieses Reagenz ist somit zu analytischen Zwecken gut geeignet. Folglicherweise ergeben nur die Reagenzien, die L-Luciferin (Fig.2, B und D) enthalten, bei denen anscheinend eine Sättigungskonzentration des Luciferins (D+ L, siehe oben) vorliegt eine maximale Genauigkeit der Analyse.
Hierzu 2 Blatt Zeichnungen

Claims (10)

Patentansprüche:
1. Verfahren zur Bestimmung von Adenosintriphosphatkonzentrationen durch Inkontaktbringen der zu untersuchenden Probe mit einem Biolumineszenzreagenz auf Basis von D-Luciferin, Luciferase und Magnesiumionen zum Herbeiführen einer Reaktion, in der das Adenosintriphosphat und D-Luciferin unter Lichtemission an die Luciferase gebunden werden, und Messen der ein Maß für die Adenosintriphosphatkonzentration darstellenden Intensität des emittierten Lichts, dadurch gekennzeichnet, daß man bei der Bestimmung einen konkurrierenden Inhibitor der Reaktion in Form von L-Luciferin in einer Konzentration einsetzt, die zu einer Inhibbrung von mindestens 25%, vorzugsweise 50 bis 90% der Lichtintensität führt
2. Verfahren nach Anspruch I, dadurch gekennzeichnet, daß man bei der Bestimmung auch Pyrophosphat in einer maximalen Konzentration von 10-4M einsetzt
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man auch Coenzym A bei der Bestimmung einsetzt
4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Luciferase-Präparat einsetzt das durch isoelektrische Fokussierung gereinigt worden ist
5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet daß man ein Luciferase-Präparat mit einem Zusatz an Rinderserumalbumin, Thiolverbindupgen und/oder Äthylendiamintetraessigsäure einsetzt.
6. Reagens für die Biolumineszenz zur Verwendung bei der Bestimmung von Adenosintriphosphatkonzentrationen, auf Basis von D-Luciferin, Luciferase und Magnesiumionen, dadurch gekennzeichnet, daß es zusätzlich einen konkurrierenden Inhibitor in Form von L-Luciferin in einer Konzentration, die zu einer Inhibierung von mindestens 25%, vorzugsweise 50 bis 90% der Lichtintensität führt, enthält.
7. Reagens nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß es auch Pyrophosphat in einer maximalen Konzentration von 10~4M enthält.
8. Reagens nach Anspruch 6 oder 7, dadurch gekennzeichnet, daß es auch Coenzym A enthält.
9. Reagens nach einem der Ansprüche 6 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß es Luciferase enthält, die durch isoelektrische Fokussierung gereinigt worden ist.
10. Reagens nach einem der Ansprüche 6 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß es Luciferase mit einem Zusatz an Rinderserumalbumin, Thiolverbindungen und/oder Äthylendiamintetraessigsäure enthält.
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