DE2926647A1

DE2926647A1 - Industrieller molekuelselektiver sensor sowie verfahren zur herstellung desselben

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Publication number: DE2926647A1
Application number: DE19792926647
Authority: DE
Inventors: Jenoe Dr Havas; Geza Dr Nagy; Emma Porjesz; Ernoe Dr Pungor
Original assignee: RADELKIS ELECTROKEMIAI
Current assignee: RADELKIS ELECTROKEMIAI
Priority date: 1978-09-08
Filing date: 1979-07-02
Publication date: 1980-03-20
Also published as: BR7904582A; HU177369B; DK308379A; GB2034242A; GB2034242B; US4375399A; CS222242B2

Description

HOFFMANN · ΕΓΓΙΖΕ <£ PARTNER 9 Q ? 6 6 A

PATENTANWÄLTE ^ ^

DR. ING. E. HOFFMANN (1930-197(5) . DIPL.-ING. W.EITLE · DR. RER. NAT. K. HOFFMANN · DIPL.-ING. W. LEHN

DIPL.-ING. K. FUCHSIE · DR. RER. NAT. B. HANSEN ARABELLASTRASSEMSTERtslHAUS) · D-8000 MÖNCH EN 81 · TELEFON (089) 911087 · TELEX 05-29619 (PATH E)

32 226 m/fg

"RADELKIS" Elektrokemiai Müszergyärto Szövetkezet, Budapest / Ungarn

Industrieller molekülselektiver Sensor sowie Verfahren zur Herstellung desselben

Die Erfindung betrifft einen industriellen, molekülselektiven elektroanalytischen Sensor, entsprechend dem vorstehenden HaupLaiisjJxuch, welcher für die selektive Konzentrationsbestimmung von in Flüssigkeiten (z.B. in industriellen Abwässern) gelösten Verbindungen oder Ionen (z.B. Dichlorphenol, Cyanid-, Quecksilber(II)-Ionen) geeignet ist, sowie ein Verfahren zur desselben.

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Es sind molekülselektive elektroanalytische Sensoren bekannt, die sogenannten Enzymelektroden, die zur Bestimmung von in Flüssigkeiten gelösten Verbindungen geeignet sind. Die elektrochemischen Eigenschaften und die Anwendungsmöglichkeiten der molekülselektiven Sensoren sind in der Literatur (z.B. in Pj.L. Bailey: Analysis with Ion Selective Electrodes, Heyden and Son Ltd., London, 19 76; Nagy, G., Pungor, E., Hungs, Sei. Instr. jy:, 1-lo/i975) ausführlich behandelt. Bekanntlich haben die molekülselektiven Sensoren, die als elektrochemische Messzellen bezeichnet werden können, einige gemeinsame Eigenschaften, z.B. dass der Tragkörper des Sensors, welcher die ionenselektive oder Metall-Indikatorelektrode und die Bezugselektrode (Elektrode zweiter Art) enthält, von einem rohrförmigen, mit Elektrolytlösung gefüllten Umhüllungskörper, dessen Ende an der Seite der aktiven Oberfläche der Indikatorelektrode mit einem für Gase oder für Gase und gelöste Stoffe durchgänf-·- gigen bzw. durchlässigen Häutchen (z.B. mit einem Dialysehäutchen) abgeschlossen ist, umhüllt wird, wobei das genannte Häutchen mit einer für den zu bestimmenden Stoff selektiven Gelschicht, mit einer sogenannten Reaktionsschicht (z.B. einer Acrylamid-Gelschicht), die den wirkungsspezifischen Katalysator, d.h. das chemisch oder physikalisch gebundene Enzym enthält in Kontakt ist, oder das genannte Häutchen ist aufeinander geschichtet in Kontakt mit einem für Gase oder für Gase und gelöste Stoffe durchlässigen Häutchen (z.B. mit einem Cellophanhäutchen) und mit einer Lösungsschicht, welche das selektive Enzym in suspendierter Form enthält und welche als Reaktionsschicht dient, und mit einem für Gase und gelöste Stoffe durchlässigen Häutchen (z.B. mit einem Cellophanhäutchen) .

Es ist auch eine ungarische Anmeldung bekannt (Nr. 7577, 1978) bei welcher die Reaktionsschicht so ausgebildet ist, dass das

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Enzym an der Oberfläche einer albuminösen Membran chemisch gebunden ist.

Der Wirkungsmechanismus der bekannten molekülselektiven Sensoren ist folgender: Die Moleküle der sogenannten Substrate (z.B. die Glucose-Moleküle) und gegebenenfalls die Moleküle des Reagens (die Sauerstoffmoleküle) diffundieren in die Schicht, welche das selektive Enzym (z.B. Glucoseoxidase) enthält und welche als wirkungsspezifischer Katalysator dient, in die sogenannte Reaktionsschicht, wo sich eine chemische Reaktion abspielt. Das Ausgangssignal der Indikatorelektrode ist eine eindeutige Funktion der Konzentration und der Aktivität der an der Enzymreaktion teilnehmenden Heagentien oder einer der teilnehmenden oder entstehenden Komponenten. Der lokale Wert der Aktivität oder der Konzentration ist, falls alle Faktoren als konstant angenommen werden können, von der Reaktionsgeschwindigkeit abhängig, welche eine eindeutige Funktion der Konzentration des Substrates ist. Deshalb kann in stationärem Zustand durch die Messung der Stromstärke oder des EMK-Wertes die gesuchte Konzentration der Probe direkt bestimmt werden.

Die Herstellung der bekannten molekülselektiven Sensoren ist kompliziert, zeitraubend und erfordert ausserordentliche Sachverständnis, wobei das Ergebnis, trotz der Tatsache, dass zur Lösung der Enzymimmobilisation eine sehr grosse Zahl verschiedener Methoden zur Verfugung steht (O.R. Zaborsky: Immobilized Enzymes, CRC Press, Cleveland, Ohio, 19 74) nur mehr oder weniger gut reproduzierbar ist.

Der grösste Nachteil solcher Sensoren besteht in ihrer kurzen Lebensdauer (z.B. einige Tage, ein bis zwei Wochen), was auf die ungünstigen Eigenschaften der Reaktionsschicht zurückzuführen

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ist. Ein weiterer Nachteil besteht darin, dass die Sensoren bzw. die Gelschichten, welche das gebundene Enzym enthalten, ausser Gebrauch bei niedriger Temperatur (z.B. zwischen -1 und 2°C)gehalten werden müssen, damit sie ihre Enzymaktivität bewahren können.

Die bekannten Sensoren sind leicht verletzbar und haben eine geringe mechanische Festigkeit und eine lange Ansprechzeit (z.B. zwischen 2 bis 8 Minuten). Aufgrund dieser Umstände ist ihre Anwendung in der Laborpraxis und besonders in der Industrie beschränkt. Die aufgezählten Nachteile haben dazu geführt, dass sich die einfache selektive Messtechnik mittels Sensoren in der Praxis nicht durchgesetzt hat.

Aufgabe der Erfindung ist die Herstellung eines industriell verwertbaren, molekülselektiven Sensors, welcher ohne spezielle Sachkenntnis einfach, in kurzer Zeit und auf reproduzierbare Weise herzustellen ist, welcher eine grosse mechanische Festigkeit besitzt, über eine wesentlich längere Lebensdauer (z.B. ein Jahr) verfügt als die bekannten Typen und welcher eine kurze Ansprechzeit (z.B. von 4o bis 6o Sekunden) aufweist.

Die vorstehende Aufgabe wir3 erfindungsgemäss dadurch gelöst, dass ein molekülselektiver, in der Industrie verwertbarer Sensor entsprechend dem vorstehenden Hauptanspruch zur Verfügung gestellt wird.

Es wurde gefunden, dass ein, die vorstehenden Vorteile aufweisender Sensor hergestellt werden kann, indem die Reaktionsschicht des Sensors als Membran auf einem albuminösen Häutchen (z.B. einer Darmwand) oder auf einem Kunststoff-Häutchen (z.B. Polypropylen-Häutchen) oder in einem aus albuminösem Stoff verfertigten Netz (z.B. einem Seidennetz) oder Kunststoffnetz (z.B. Polyesternetz), wie in oder auf einer Trägermatrix, welche mit der Membran

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chemisch oder physikalisch gebunden ist, oder ohne Trägermatrix mit Netz in Netzstruktur, wobei der Katalysator oder die Katalysatoren kovalent gebunden sind, ausgebildet wird. Die Membran mit Netz in Netzstruktur ist im wesentlichen ein vernetzter Kunststoff (z.B. Polyacrylamid oder ein Polyvinylchloridfilm) , wobei sich im Raumgitter .desselben ein von inerten Albumin- und/oder Eritzymmolekülen aufgebautes aktives Raumgitter befindet.

Die mechanische Festigkeit der Membran des Sensors gemäss der Erfindung ist infolge ihrer Struktur und v/eiterhin der mechanischen Festigkeit und der enzymähnlichen chemischen Eigenschaften der Trägermaterialien, an welche sie durch chemische oder physikalische Kräfte gebunden ist, ausgezeichnet. Die chemische Widerstandsfähigkeit und die Stabilität der in der oben genannten Membran immobilisierten Enzyme ist ebenfalls hervorragend, so dass der Sensor für lange Zeit funktionsfähig ist. Ausser Gebrauch kann der Sensor gegebenenfalls bei Raumtempratur längere Zeit (z.B. bis zu einem Jahr) ohne bemerkenswerte Veränderung der Enzymaktivität aufbewahrt werden. Die physikalisch-chemischen Eigenschaften der Enzyme, die sich in einer Reaktionsschicht mit Netz in Netzstruktur befinden, ändern sich ebenfalls in vorteilhafter Weise, das bedeutet, dass im Vergleich zu den mobilen Enzymen der pH-Bereich, in welchem sie als Katalysator dienen, wesentlich verbreitert werden kann.

Ein weiterer Vorteil der Erfindungsgemässen Sensorkonstruktion besteht darin, dass im Gegensatz zu den bekannten Sensoren die ungünstige Wirkung der Silberionen, welche aus der Bezugselektrode stammen, auf die Enzymaktivität eliminiert wird.

Eine weitere vorteilhafte Eigenschaft der Membran gemäss der Erfindung besteht darin, dass die mechanische Festigkeit und die

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Konzentration der immobilisierten Enzyme in beliebigem Masse verändert werden können.

Die Durchlässigkeit der natürlichen Membranen (z.B. Luftblase von Fischen, Hautpartien von Säugetieren und Reptilen, die Hornhaut oder die Darmwand einiger Tierarten) ist gegenüber Ionen, Wasser und Gasmolekülen in messtechnischer Hinsicht ideal. Eine weitere vorteilhafte Eigenschaften der natürlichen Membranen ist es, dass sie gegenüber Ionen oder Gasmolekülen, die als Reagens oder Reaktionsprodukt vorkommen können, durchlässig sind und gegenüber Verbindungen mit grösserem Molekulargewicht, die das Messergebnis eventuell beeinflussen können (z.B. das Substratum selbst oder andere in der Probe vorkommende Stoffe) undurchlässig sind.

Der Sensor gemäss der Erfindung kann auch so aufgebaut werden, dass zum Aufbau der Reaktionsschicht eine Membran mit zwei Reaktionsschichten oder mehreren aufeinander geschichteten Membranen mit einer oder zwei Reaktionsschichten angewendet werden. Bei dieser Anordnung ist an jeder Membranoberfläche ein anderes Enzym in immobilisierter Form gebunden. Im Falle der ß-Glucosid-Elektrode enthält die Membranoberfläche an der Seite der Probenlösung ß-Glucosidase und an der Seite der Indxkatorelektrode Glucoseoxidase. Das an der ersten Membran gebundene Enzym, die ß-Glucosidase, ermöglicht eine Hydrolysereaktion zwischen dem ß-Glucosid (z.B. Amigdalin oder Salyzin) und dem Wasser, wodurch u.a. Glucose entsteht. Das an der zweiten Membran gebundene Enzym, die Glucoseoxidase, katalysiert die Reaktion zwischen der Glucose und dem Sauerstoff. An der sich hinter der Membran befindlichen Initiatorelektrode kann das der Sauerstoffkonzentration proportionale Signal gemessen werden. Das der Verringerung- der Sauerstoffkonzentration proportionale Signal ist eine eindeutige Funktion der Konzentration der zu bestimmenden Probe. Mit dieser Ausführung kann man einerseits iriesstechnische Vereinfachungen

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durchführen und eine Steigerung der Selektivität erreichen, andererseits können auch solche Verbindungen bestimmt werden, die in einer einstufigen Reaktion keine elektrochemisch messbaren Komponenten produzieren oder die keine Änderung in der Konzentration oder Aktivität der messbaren Komponente zustande bringen.

Die Elektrode gemäss der Erfindung kann auch so verwirklicht werden, dass an getrennten Oberflächenpartieri der Membran oder eines Häutchens oder Netzes natürlicher Struktur, welche als Reaktionszone dienen,oder an gegebenen Oberflächenpartien in statistisch homogener Verteilung, verschiedene Enzyme gebunden sind und zu einer der Oberflachenpartien eine oder mehrere Indxkatorelektroden gehören. Mit dieser Anordnung können molekülselektive Sensoren mit mehreren Funktionen ohne Dimensionsvergrösserung hergestellt werden, wodurch die parallele Bestimmung mehrerer Komponenten in der selben Probenlösung durchführbar wird, oder mit der parallelen Bestimmung die Konzentration der Störkompononten. manuell oder automatisch in Anschlag gebracht werden kann.

Bei anderen Ausführungen der molekülselektiven Sensoren, die gemäss der Erfindung hergestellt werden, ist die Membran im Hinblick auf den Schutz und die weitere Vergrösserung der mechanischen Festigkeit der Reaktionszone mit einem inerten Polymernetz oder- Gewebe in Kontakt. Bei weiteren Ausführungen ist, im Interesse einer sehr kurzen Ansprechzeit,an der Oberschicht der einen Seite der Membran eine solche Schicht nach dem Imprägnierungsverfahren mit Hilfe eines Vernetzungsprozesses ausgebildet, die für Gase durchlässig ist oder Ionenaustauscher-Eigenschaften hat.

Die molekülselektiven Sensoren werden gemäss der Erfindung so hergestellt, dass eine Lösung des■Monomeren oder Polymeren

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(z.B. eine Lösung mit Acrylamid- oder Polyvinylalkohol), die zur Bildung eines inerten Raumgitters geeignet ist, mit einer gut gepufferten Lösung mit inerten! Protein und/oder Enzym (z.B. eine Lösung mit Serumprotein und einem Gehalt an Glucoseoxidase), die zur Bildung eines aktiven Raumgitters geeignet ist, vermischt wird. Zu dieser Lösungsmischung werden noch bifunktionelle Reagensstoffe (z.B. Ν,Ν'-Methylen-bis-acryl-amid und Glutaraldehyd) und Anreger (z.B. Persulfat) und Beimischungen (z.B. Phenolsulfat und Glyzerin) gegeben. Die Lösungsmischung wird auf eine albuminöse Membran natürlichen Ursprungs (z.B. einen Darm) oder auf ein Kunststoffhäutchen (z.B. ein Polypropylen-Häutchen) oder auf ein Netz eines bestimmten Stoffes (z.B. ein Flussnetz) oder auf ein inertes Kunststoffnetz (z.B.ein Nylonnetz), welche auf einer glatten Oberfläche liegen, aufgetragen. Nach der Querverrietzung und Trocknung der Lösung werden die fertigen Membranen von der glatten Oberfläche abgetrennt und in ein Wasserbad mit destilliertem Wasser gebracht, in welchem die in wasserlöslicher Form gebliebenen Komponenten herausgelöst werden. Nach Beendigung der Spüloperation sind die Membranen im messfertigen Zustand. Die fertige Membran wird mit dem für Gase oder für Gase und gelöste Stoffe durchlässigen Häutchen zusammen auf den Umhüllungskörper des Sensors aufgelegt und danach wird die Indikator- und die Bezugselektrode in die sich in dem Sensor befindende Elektrolytlösung so eingetaucht, dass die Oberfläche der Indikatorelektrode ■■ ■ ■ in unmittelbarer Nähe der Membran zu liegen kommt. Die Elektroden werden befestigt. Damit ist der Sensor im messfähigen Zustand.

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Beispiel 1

Auf der Abbildung 1 ist als Beispiel ein gemäss der Erfindung hergestellter glucoseselektiver Sensor (teilweise in Durchschnitt) dargestellt.

In der Aushöhlung des Sensorkörpers 1 befindet sich eine Pufferlösung 2 mit einem Gehalt an Chloridionen, in welche die in dem Gehäuse 3 fest angebrachte Platin-Indikatorelektrode 4 und die Silber-Silberchlorid-Bezugselektrode 3 eintauchen.

Der Rand des Sensorkörpers 1 ist mit einem gaspermeablen Polypropylen-Häutchen 6, welches die Indikatorelektrode 4 berührt, abgeschlossen. Das gaspermeable Häutchen 6 ist mit einer aus aktivem Netz aufgebauten Membran 7, welche an kommerzielle Schweinedarmmembran chemisch gebundenes, in inertem PoIyvinylalkoholnetz, welches mit Ν,Ν'-Methylen-bis-acrylamid vernetzt ist, untergebrachtes, und mit Glutaraldehyd vernetztes Albumin und Glucoseoxidase (E.C. 1.1.3.4.) enthält, in Berührung. Das gaspermeable Häutchen 6 und die Membran 7 sind mit einem Gummiring an dem Sensorkörper 1 befestigt.

Das andere Ende des Sensorkörpers 1 ist mit einer Plastikverschlusskappe 9 abgeschlossen. Die Indikatorelektrode 4 und die Bezugselektrode 5 sind mit der polarisierenden Spannungsquelle und mit den Eingängen des Strommessers über das Kabel 1o in Verbindung.

Die Herstellung des glucoseselektiven Sensors wird auf folgende Weise durchgeführt: Ein Teil eines im Handel erhältlichen, gesalzenen Schweinedarmes wird 1o bis 15 Minuten lang in

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destilliertes Wasser eingeweicht. Die gequollene Membran wird mit einem 15,um dicken gaspermeablen Häutchen (z.B. aus Polypropylen) zusammen in ausgespanntem Zustand auf den Rand des Sensorkörpers befestigt (das Polypropylenhäutchen muss sich auf der Seite der Höhle des Sensorkörpers befinden). Die Membran wird 2o Minuten lang getrocknet. In ein Gefäss werden 80 mg Bovinalbumin, 80 mg Glucoseoxidase (SIGMA, Chemical Company, Type II) und I00 mg N,N'-Methylen-bis-acrylamid eingewogen und danach in 4 ml Pufferlösung mit einem pH-Wert von 7,08 durch Rühren aufgelöst. In ein anderes Gefäss werden 2,97 g einer.1o Gew.-Mgen Polyvinylalkohollösung eingemessen. Danach werden zu der Lösung in dem ersten Gefäss o,3 ml Glyzerin und zu der Lösung in dem zweiten Gefäss 1oo,ul einer 25 %-igen Glutaraldehydlösung und 1oo,ul einer 5 %-igen frisch hergestellten Phenolsulfatlösung gegeben. Die zwei Lösungen werden vermischt, dann zusammengegossen und wieder vermischt. Zu der Lösungsmischung werden noch 2-3 mg Kaliumpersulfat gegeben, erneut vermischt und 4o ,ul bzw. 2 ml von dieser Lösungsmischung werden auf eine Schweinedarmmembran

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mit 8 cm Cberflache oder auf einen Polypropylenfilm gegossen.

Nachdem die Membran 12h lang in Raumtemperatur gelassen wurde, werden von der Oberfläche der Membran, die sich an dem Sensorkörper befindet oder die von der Kunststoffplatte abgetrennt ist, durch Waschen mit destilliertem Wasser das nicht immobilisierte Enzym und der Glutaraldehyd-Überschuss entfernt. Die auf diese Weise verfertigte Membran, welche Glucosdoxidase in immobilisierter Form enthält, ist in messfertigem oder in aufbewahrbarem Zustand.

Nach der Herstellung der aktivierten Membran wird die in den Tragekörper in bekannter Weise eingelegte Platin-Indikatorelektrode vorbereitet. Die Oberfläche der Indikatorelektrode wird in einer auf eine Glasplatte aufgetropfte Salpetersäurelösung mit 6 Mol/dm Konzentration eingeweicht. Die Salpetersäure

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wird dann mit destilliertem Wasser abgewaschen. Nach dem Abwaschen ist die Indikatorelektrode in messfertigem Zustand (die Einweichungsoperation in Salpetersäure muss im Laufe des Messens jede zweite bis dritte Woche wiederholt werden).

Nach der Vorbereitungsaktion wird der glucoseselektive Sensor gemäss Abbildung 1 zusammengestellt, und danach wird er an die polarisierende Spannungsquelle und an die Stromstärkemesseinheit angeschlossen.

Die Bestimmung der gesuchten Glucosekonzentration der Probe ist mittels der Elektrode durch die Aufnahme einer Kalibrierungskurve oder mit der Additionstechnik durchführbar. Nachfolgend wird eine vorteilhafte Variation der Additionstechnik, die sogenannte Methode der mehrfachen Probenzugabe, erläutert.

Es wurde festgesbellt, dass zwischen der Abnahme der gemessenen Stromstärke i und der Glucosekonzentration der Lösung c der folgende Zusammenhang besteht""

r- , V

V die maximale Reaktionsgeschwindigkeit K die Michaelis-Konstante der Enzym-Substrat-Reaktion, und k den proportionalen Faktor darstellt.

Aus dem Wert der gemessenen Abnahme der Stromstärke in zwei glucosehaltige Lösungen mit bekannter Konzentration können die von den gegebenen Umständen und von dem Sensor abhängigen V- und K-Werte bestimmt werden, aufgrund derer die Konzentration aller Probenlösungen nach der Abnahme der Stromstärke bestimmt werden können, wie nachfolgend angegeben.

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Cc_n-1 + κ)²

= Ik ^{n Ί}

η η Κ + V (2)

Aufgrund der nachfolgenden Gleichung ist die Konzentration der Probe:

η η a_n

wobei _n das , das Volumen der Lösung nach der Standardzugabe ist.

a das Volumen der η-ten Probe

Gemäss dem Beispiel können auch andere molekülselektive Sensoren hergestellt werden. In der Tabelle 1 werden einige weitere Beispiele angegeben. In der ersten Kolonne der Tabelle wird die Molekülart dargestellt, auf welche der Sensor selektiv ist; in der zweiten Kolonne das auf der Membran immobilisierte Enzym, welches mit dem gasdurchlässigen Häutchen in Verbindung steht; in der dritten Kolonne werden die Arten der Indikatorelektroden aufgezählt.

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Tabelle 1

zu bestimmende
Komponente

immobilisiertes Enzym

Indikator-Elektrode

Harnsäure

Cholesterin

L-Aminosäure

D-Aminosäure

D-Galaktose

Sulfit

Oxalat

Xanthin

O-Diphenol

p-Diphenol-wasserstoff -hyperoxid

Laktat

Pyruvat

Uricase

E.C.1.7.3.3.

Cholesterin-oxidase E.C.1.1.3.6.

L-Aminosäure-oxidase E.C.1.4.3.2.

D-Aminosäure-oxidase E.C.1.4.3.3.

Galaktose-oxidase E.C.1.1.3.5.

SuIfit-oxidase E.C.1.8.3.1.

Oxalat-oxidase E.C.1.2.3.4.

Xanthin-oxidase E.C.1.2.3.2.

O-Diphenol-oxidase E.C.1.1o.3.1.

Katalase E.C.1.11.1.6.

Laktase-oxidase E.C.1.1.3.2.

Pyruvat-oxidase E.C.1.2.3.3. Platin

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Fortsetzung der Tabelle

zu bestimmende Komponente

immobilisiertes Enzym Indikatorelektrode

Alkohol

L-Pheny!alanin 2-Oxosäure

Oxalacetat

Acetoacetat

L-Valin

L-Glutamat

L-Ornithin

L-Lysin

Penicillin

Alkoholoxidase E.C.1.1.3.1.3.

L-Phenylalaninase E.C.1.14.3.1.

Pyruvatdecarboxilase E.C.4.1.1.1.

Oxalacetatdecarboxilase E.C.4.1.1.3.

Acetoacetatdecarboxilase E.C.4.1.1.4.

Valindecarboxilase E.C.4.1.1.14.

Glutamatdecarboxilase E.G.4.1.1.15.

Ornithindecarboxilase E.C.4.1.1.17.

Lysindecarboxilase E.C.4.1.1.18.

ß-Laktamase E.C.3.5.2.6. Platin

wasserstoffionenselektive Elektrode

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Beispiel 2

Die Abbildung 2 zeigt ein Ausführungsbeispiel der nach der Erfindung hergestellten harnstoffselektiven Elektrode teilweise im Durchschnitt.In dem Sensorkörper 1 befindet sich eine chloridionenhaltige Elektrolytlösung 2,in welche eine ammoniumionenselektive Indikatorelektrode und eine Silber-Silberchlorid-Bezugselektrode eingetaucht ist. Die Indikatorelektrode 4 ist im Ende des Sensorkörpers 1 mit einer für die Elektrolytlösung 2 nicht permeablen Verschliessung mit einer scheibenförmigen Abdichtung 11 befestigt. Die Indikatorelektrode 4 ist entweder mit einer Membran 7, die die immobilisierte Urease (E.C.3.5.1.5.) und Seide-oder Kunststoffnetz enthält, oder mit einer Membran 7 ohne Befestigung mit Netz in Netzstruktur in Kontakt. Die Membran 7 wird mit einem Gummiring 8 am Umhüllungskörper 1 befestigt. In der Wand 2 des Umhüllungskörpers 1 ist eine für die Elektrolytlösung durchdringbare Filterschicht 12 (z.B. ein Keramikstab) untergebracht. Das andere Ende des Umhüllungskörpers 1 ist durch eine Kunststoffverschlusskappe abgeschlossen. Die Indikatorelektrode- 4 und die Bezugselektrode 5 sind mit den Eingängen der elektronischen Spannungsmesseinheit mit Hilfe eines Kabels Io in Verbindung.

Die Ausbildung der Reaktionsschicht der harnstoffselektiven Elektrode geschieht ebenso wie es im Beispiel 1 beschrieben ist. Der Unterschied besteht darin, dass in diesem Fall in der Membran Urease (E.C.3.5.1.5.) immobilisiert wird und anstatt Schweinedarmmembran Seide- oder Nylonnetz verwendet wird. Die Zusammenstellung des Sensors geschieht auf dieselbe Weise wie es auf der Abbildung 2 gezeigt ist. Die Konzentration der zu bestimmenden

Probe kann auf bekannte Weise mit Hilfe einer EMK-Konzentra-

tions-Kalibrierungskurve oder mit Hilfe der Additionstechnik durchgeführt werden.

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Ändere molekülselektive Elektroden können auch nach dem Beispiel 2 verwirklicht werden. In Tabelle 2 sind einige weitere Beispiele zusammengefasst. In der ersten Kolonne der Tabelle wird die Molekülart dargestellt, auf welche der Sensor selektiv anspricht; in der zweiten Kolonne wird das immobilisierte Enzym und in der dritten Kolonne die zur Bestimmung erforderliche Indikatorelektrode aufgeführt.

Tabelle 2

zu bestimmende Komponente

immobilisiertes Enzym

Indikatorelektrode

L-Dioxyphenylalanin L-Phenylalanin L-Amino s äuren D-Serin

L-Homoserin L-Threonin L-Histidin Nitrit

L-Aminosäureoxidase E.C.1.4.3.2.

D-Serindehydratase E.C.4.2.1.14.

Homoserindehydratase E.C.4.2.1.15.

Threonindehydratase E.C.4.2.1.16.

Histidase E.C.4.3.1.3.

Nitritreduktase E.C.1.6.6.4.

ammoniumionenselektive Elektrode

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Beispiel 3

Der Aufbau einer erfindungsgemäss hergestellten argininselektiven Elektrode entspricht im wesentlichen dem in Beispiel 2 beschriebenen Aufbau der harnstoffselektiven Elektrode. Eine Abweichung besteht darin,dass am Ende des Umhüllungskörpers 1 zwei aufeinander geschichtete Membranen 7 mit Hilfe eines Gummiringes 8 befestigt sind, und auf der Membran, die an der Seite der Indikatorelektrode liegt, Urease, und auf der anderen perforierten Membran Arginase in immobiliserter Form gebunden sind. Die argininselektive Elektrode ist also mit zwei Reaktionsschichten ausgebildet.

Die Herstellung der argininselektiven Elektrode gemäss der Erfindung wird auf folgende Weise durchgeführt. Zuerst wird ein harnstoffselektiver Sensor auf die in Beispiel 2 beschriebene Weise hergestellt. Danach wird auf der Membran, die die Urease enthält, noch eine perforierte Membran, welche Arginase (E.C.3.5.3.1.) enthält, gelegt. Die Herstellung der letzteren geschieht genauso, wie es in dem Beispiel 1 beschrieben ist.

Die argininselektive Elektrode kann auch so hergestellt werden, dass zum Aufbau des Sensors nur eine solche Membran 7 gebraucht wird, in welcher zwei Enzymsorten, Arginase und Urease, in statistisch homogener Verteilung immobilisiert sind. Bei dieser Ausführung entspricht der weitere Aufbau und die Herstellung des Sensors sinngemäss der im vorhergehenden Fall beschriebenen.

Die Funktion des Sensors beruht auf einer zweistufigen Reaktion, entsprechend den Gleichungen:

L-Arginin + H₉O L-Ornitin + Harnstoff

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„ , _cc , „ _Λ Urease ν Kohlendioxid + Ammoniak Harnstoff + H₃O

Die Argininkonzentration der zu bestimmenden Probe kann auf bekannte Weise mit Hilfe einer Kalibrierungskurve oder unter Anwendung der Additionstechnik bestimmt werden.

Über die anderen erfindungsgemäss herstellbaren molekülselektiven Sensoren, die entsprechend Beispiel 3 mit zwei Reaktionsschichten oder mit einer Reaktionsschicht mit zwei Enzymen in statistisch homogener Verteilung ausgestaltet sind, gibt Tabelle 3 eine Übersicht. In der ersten Kolonne der Tabelle stehen jene Moleküle, die mit dem molekülselektiven Sensor zu bestimmen sind; in der zweiten Kolonne sind die in der äusseren Membran immobilisierten Enzymkatalysatoren zu finden. In der dritten Kolonne sind die in der inneren Membran, die der Indikatorelektrode zugewandt ist, immobilisierten Enzymkatalysatoren angegeben. In der vierten Kolonne sind die Indikatorelektroden aufgezählt.

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Tabelle

zu bestimmende
Komponente

an der Oberfläche der Membran Indikatorimmobilisierte Enzyme elektrode

Inosin
Adenosin

Guanosin

Kreatinin

ß-D-Glucoside
Disaccharide
Amygdalin
Salicin

^-D-Glucoside
(z.B.Maltose)

D-Glucose-1-phosphat

D-Glucose-6-phosphat

Barbiturate

Guanin

Uridinnukleosidase E.C.3.2.2.2.

Adenosinnukleosidase E.C.3.2.2.a.

Guanosinphosphory-

lase

E.C.2.4.2.15.

Kreatinase

ß-Glucosidase E.C.3.2.1.21.

ίτΟ-Glucosidase E.C.3.2.1.2o.

Glucose-1-phospha-

tase

E.C.3.1.3.1o.

Glucose-6-Phosphatase E.C.3.1.3.9.

Barbiturase Xanthinoxidase Platin .Cj · O · \*£mo*£**

Adenindeaminase ammoniumionen-E.C.3.5.4.2. selektive oder

wasserstoffionenselektxve Elektrode

Guanase "

E.C.3.5.4.3.

Urease
E.O.S % ο.Ί.

ammonxumionen

selektive

Elektrode

Guanase
E.C.3.5.4.3. Glucoseoxidase Platin E.C.1.1.3.4.

Glucoseoxidase E.C.1.1.3.4.

Urease anunoniuraionen-

E.C.3.5.1.5. selective oder

wasserstoffionenselektive Elektrode

Xanthinoxidase Platin E.C.1.2.3.2.

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Beispiel 4

In Beispiel 4 wird ein .Ausführungsbeispiel und die Herstellung eines bifunktionellen molekülselektiven Sensors gemäss der Erfindung beschrieben.

In dem Umhüllungskörper 1 befindet sich eine chloridionenhaltige Pufferlösung 2, in welche zwei Platin-Indikatorelektroden 4, die einzeln in je einem Tragekörper 3 eingebaut sind, eingetaucht sind. Mit den Oberflächen der Indikatorelektroden 4 ist ein auf der Öffnung des Umhüllungskörpers 1 befestigtes, gasdurchlässiges Polypropylen-Häutchen 6 in Kontakt. Die Oberfläche des Häutchens 6 ist mit einer Membran 7 bedeckt. In einem Teil der Membran 7, die mit einer der Indikatorelektroden 4 in Kontakt steht, ist D-Aminosäureoxidase, und in einem anderen Teil der Membran, die mit der anderen Indikatorelektrode in Kontakt steht, ist L-Aminosäureoxidase in immobilisierter Form gebunden. Die übrigen Details des Aufbaus des bifunktionellen molekülselektiven Sensors entsprechen sinngemäss dem Aufbau des in Beispiel 1 beschriebenen Sensors.

Die Herstellung der Reaktionsschichten, die Aminosäureoxidase enthalten, erfolgt im wesentlichen auf die in Beispiel 1 beschriebene Weise; der Unterschied besteht darin, dass anstatt Schweinedarm ein Stück Haut verwendet wird, und in einem Teil der Membran anstatt Glucoseoxidase, bei einem pH-Wert von 8,3 2 bis 3 mg D-Aminosäureoxidase (E.C.1.4.3.3., Sygma kristallisiert) und in einem anderen Teil der Membran bei einem pH-Wert von 6,5 2 bis 3 mg L-Aminosäureoxidase (E.C.1.4.3.2., Sygma IV) immobilisiert sind. Die weiteren Schritte zur Herstellung entsprechen denen von Beispiel 1.

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Mit dem bifunktionellen molekülselektiven Sensor ist die selektive parallele Bestimmung der D- und L-Isomere der Aminosäurenmöglich. Die Messung wird so durchgeführt, dass der selektive Sensor zuerst in Standard-Lösungen,die nur die L-Formen der zu bestimmenden Aminosäure {.zB. Fenilalanine) enthalten, kalibriert wird, und sodann in Standard-Lösungen, die nur die D-Form der Aminosäure enthalten. Die Kalibrierung wird so durchgeführt, dass man die Sensoren von einer gerührten Phosphatpufferlösung (pH =8) in eine mit konstanter Geschwindigkeit gerührte Standard-Lösung mit gleichen pH-Wert verlegt; dann wird die infolge der -o,6 V Polarisationsspannung entstehende Stromintensitätsänderung {Ai) gemessen. Wenn man die Δ i-Werte als Funktion der Konzentration der Standardlösungen darstellt, können die Kalibrierungskurven aufgestellt werden. Mit Hilfe der Kalibrierungskurven kann nach der ... Mes-s-ung täer-^:iii*-Wexte das Verhältnis" der" optischen Isomere der verschiedenen Aminosäuren bestimmt werden.

Der Gebrauch des beispielgemäss hergestellten komplexen Sensors ist bei Untersuchungen der Wirksamkeit von Resolvationsprozessen ausserordentlich vorteilhaft.

Zur Bestimmung des Isomerenverhältnisses kann die in dem Beispiel 1 beschriebene Additionstechnik auch gut angewandt werden. Entsprechend Beispiel 4 können in ähnlicher Weise weitere, vorteilahft anwendbare, bifunktionelle molekülselektive Sensoren hergestellt werden. Darüber gibt die Tabelle 4 eine Übersicht.

In der zweiten Kolonne der Tabelle sind die Namen der auf einem Teil der Oberfläche immobilisierten Enzyme, und in der dritten Kolonne der auf einem anderen Teil der Oberfläche immobilisierten Enzyme aufgezählt.

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Tabelle

zu bestimmende auf einem Teil Komponente der Membran im-

mobilis iertes

Enzym

zu bestimmende
Komponente

auf einem anderen Teil der Membran immobilisiertes Enzym

Glucose
Glucose
Harnstoff

Glucose

Harnstoff

Glucose

Glucoseoxidase E.C.1.1.3.4.

Urease

E.C.3.5.1.5.

Glucoseoxidase E.C.1.1.3.4.

Urease

E.C.3.5.1.5.

Glucoseoxidase E.C.1.1.3.4.

Alkohol

Mannose

Kreatinin

Harnsäure
L-Phenylalanin

Arginin
Amygdalin

Alkoholoxidase E.C.1.1.3.1.9.

Hexoseoxidase E.C.1.1.3.5.

Kreatininase E.C.3.5.3.3.

Urease

E.C.3.5.1.5.

Uricase
E.C.1.7.3.3.

L-Phenylala-

ninase

E.C.1.14.3.1.

Arginindecar-

boxilase

E,C.4.1.1.19.

Glucosidase E.C.3.2.1.21.

Glucoseoxidase E.C.1.1.3.4.

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Beispiel 5

In dem Beispiel 5 wird die Herstellung eines erfindungsgemäss hergestellten multifunktionellen molekülselektiven Sensors beschrieben, der zur parallelen Bestimmung verschiedener Aminosäuren geeignet ist. Der Aufbau des multifunktionellen Sensors ist ähnlich dem in Beispiel 4 hergestellten bifunkttionellen Sensor; der Unterschied besteht darin, dass dieser kein gasdurchlässiges Häutchen 6 enthält, und weiterhin, dass in der in dem Umhüllungskörper 1 befindlichen Elektrolytlösung 2 drei wasserstoffionenselektive Glaselektroden 4 eingetaucht sind, die mit einer Membran 7 in Kontakt stehen, an welcher auf drei gut getrennten Oberflächenteilen drei verschiedene Reaktionsschichten/ die je eine andere selektive Aminosäuredecarboxylase (z.B. L-Lysindecarboxylase., L-Tyrosindecarboxylase, L-Phenylalanindecarboxylase) in immobiliserter Form enthalten, ausgebildet sind.

Die Herstellung der Reaktionsschichten geschieht genauso, wie es in Beispiel 4 beschreiben ist.

Mit Hilfe dieses molekülselektiven Sensors kann der L-Tyrosin-, L-Lysin- und L-Phenylalanin—Gehalt der Proben mit Aminosäuren selektiv bestimmt werden. Die Bestimmungen können unter Anwendung von drei (entsprechend den drei Aminosäuren) Potential-Konzentraticns-Kalibrierungskurven durchgeführt werden. Entsprechend dem als Beispiel gezeigten multifunktionellen molekülseiektiven Sensor können auch ähnliche Varianten hergestellt werden. Die einzelnen Reaktionsschichtpartien enthalten die folgenden Enzyme in immobolisierten Form: L-Arginindecarboxylase, L-Glutaminsäuredecarboxylase, L-Glutamindecarboxylase, L-Histidindecarboxylase, Urease.

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ORIGINAL f;\!3PECTED

Claims

PATENTANWÄLTE ^έ

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OIPL.-ING. K.FOCHSLE - DR. RER. NAT. ß. HANSEN ARABELLASTRASSE 4 (STERN HAUS) · »-8G00 MO NCH EN 81 ■ TELEFON (089) 911087 . TELEX 05-2965? (PATHE)

32 226 m/fg

"RADELKIS" Elektrokemiai Müszergyärto Szövetkezet Budapest / Ungarn

Industrieller molekulselektiver Sensor sowie Verfahren zur Herstellung desselben

Patentansprüche

Industrieller molekülselektiver Sensor, welcher einen offenen, hohlen, mit Elektrolytlösung gefüllten Umhüllungskörper, in welchen die potentiometrischen oder voltammetrischen Indikatorelektrode und die Bezugselektrode eintauchen, ein für Gase oder für Gase und gelöste Stoffe durchlässiges Häutchen,

öffnung verschliesst, eine mit dem Häutchen in Berührung stehende Reaktionsschicht, welche das für den zu bestimmenden Stoff selektive Enzym in chemisch gebundenem Zustand enthält,

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und eine polarisierende Spannungsquelle und Stromstärke-Messeinheit oder eine Spannungsmesseinheit, welche mit den Elektroden des Sensors in Verbindung stehen, umfasst, zur Bestimmung der Konzentration von in der Lösung anwesenden Molekülen oder Ionen, dadurch gekennzeichnet , dass die an der Seite der Indikatorelektrode (4) befindliche öffnung des Umhüllungskörpers (1) mit einem oder mehreren kontinuierlichen oder perforierten Membranen (7) abgeschlossen ist, welche ein Häutchen natürlichen Ursprungs oder ein inertes Kunststoffhäutchen oder ein aus albuminösem Stoff oder inertem Kunststoff verfertigtes Netz und auf oder in dieser Trägermatrix in chemischer oder physikalischer Bindung, oder ohne Trägermatrix in dem Raumgitter eines Kunststoffes befindliches Albumin und/oder ein von den Molekülen eines oder mehrere Enzymsorten aufgebautes aktiviertes Raumgitter umfassen, wobei die Membran (7) gegebenenfalls mit einem für Gase oder für Gase und gelöste Stoffe durchlässigen Häutchen in Berührung ist, und ausserdem gegebenenfalls zwischen dem Umhüllungskörper (1) und der Indikatorelektrode (4) eine Isolationsschicht (11) und in der Wand des Umhüllungskörpers (1) ein für die Elektrolytlösung durchlässiges Filter eingebaut ist.
2. Sensor gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Membran (7) mit einem aus inertem Stoff hergestellten Schutznetz oder Gewebe in Verbindung steht.
3. Sensor gemäss Anspruch 1 und/oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass er mehrere Indikatorelektroden (4) enthält.
4. Sensor gemäss Ansprüchen 1,2 und 3, dadurch gekennzeichnet , dass in der Oberschicht der

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Membran (7) eine für Gase oder für Gase und gelöste Stoffe durchlässige Schicht ausgebildet ist.
5. Verfahren zur Herstellung eines molekülselektiven Sensors, dadurch gekennzeichnet , dass die Membran, welche das immobilisierte Enzym enthält, durch Zusammengiessen von Pufferlösungen hergestellt wird, die falls die Membran auf oder in einer Trägermatrix aus einem Häutchen albuminöser Struktur oder aus einer inerten Kunststofffolie oder aus einem albuminösen Netz oder einem inerten Kunststoffnetz gebildet wird, und mit welcher sie in chemischer oder physikalischer Bindung steht, 1 bis 2o Gew.-% Monomer(ej und/oder 1 bis 2o Gew.-%. Polymer(e) (z.B. Acrylamid und Polyvinylalkohol) und o,1 bis 5 Gew.-% vernetzter Metallsalz, Initiator, o,o1 bis 1o Gew.-% Albumin und/oder ο,οοΐ bis 5 Gew.-% Enzym, o,1 bis 5 Gew.-% Vernetzer und Glyzerinzuschlag enthält, und

falls die Membran ohne Trägermatrix hergestellt ist, 1 bis 2o Gew.-%■Acrylamid und/oder 1 bis 2o Gew.-% Polyvinylalkohol, o,T bis 5 Gew.-% vernetzer Metallsalz, Initiator, o,o1 bis to Gew.-% Albumin und/oder o,oo1 bis 5 Gew.-% Enzym, o,1 bis 5 Gew.-% Vernetzer ; und Glyzerinzuschlag enthält, welche gegebenenfalls mit einem für Gase oder für Gase und gelöste Stoffe durchlässigen Häutchen zusammen auf der öffnung des hohlen ümhüllungskörpers befestigt wird und in die Höhlung, welche Elektrolytlösung enthält, eine oder mehrere Indikatorelektroden und die Bezugselektrode eingesetzt werden.

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