DE2949407A1

DE2949407A1 - Verfahren zur gewinnung von (alpha) -2-sb-glykoprotein

Info

Publication number: DE2949407A1
Application number: DE19792949407
Authority: DE
Inventors: Winfried Dr.phil. 8121 Pähl Albert; Walter 8131 Bernried Eberle
Original assignee: Boehringer Mannheim GmbH
Current assignee: Roche Diagnostics GmbH
Priority date: 1979-12-07
Filing date: 1979-12-07
Publication date: 1981-06-11
Also published as: JPS5692297A; JPH0114240B2; EP0030363A2; ATE3981T1; EP0030363A3; EP0030363B1; DE3063994D1; US4325867A

Description

Patentanwälte Dipl.-Ing. H. Weickmann, Dipl.-Phys. Dr. K. Fincke

Dipl.-Ing. F. A.Weickmann, Dipl.-Chem. B. Huber Dr. Ing. H. Liska

«000 MÜNCHEN 16, DEN ^ f DCZ. 1979

POSTFACH 860 820

MOHLSTRASSE 22, RUFNUMMER 98 39 21/22

HCH

2289

BOEHRINGER MANNHEIM GMBH Sandhofer Straße 112-132, 6800 Mannheim-Waldhof

Verfahren zur Gewinnung von «-2-SB-Glykoprotein

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung von •e-2-SB-Glykoprotein, welches auch als Fibronectin, kälteunlösliches Protein oder LETS-Protein bezeichnet wird, aus seinen physiologischen Lösungen, wie z. B. Plasma, Serum, Blut oder Organstroma,

eC-2-SB-Glykoprotein ist eine Substanz, welche man im Blut und Organstroma findet. Das Serumprotein hat die elektrophoretische Beweglichkeit eines tf-2-Globulins und einen Sedimentationskoeffizienten von 12 bis 14 S. Sein Molekulargewicht beträgt etwa 400 000 bis 44o 000. Es besteht aus zwei Untereinheiten, welche durch Disulfidbrücken verbunden sind. Die Konzentration im Plasma von Gesunden liegt bei 300 bis 5oo,ug/ml. Eine nähere Beschreibung findet eich in Natur· 27£ (1978) 179.

öe-2-SB-Glykoprotein ist ein Substrat de· aktivierten Ge-

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rinnungsfaktors XIII, d. h. des Faktors XIIIa (Plasma-Transglutaminase, Fibrinoligase). Es bindet Fibrinogen und Fibrin, vor allem in der Kälte. Da es während der Gerinnung mit Fibrin reagieren kann, findet man im Serum üblicherweise geringere Konzentrationen als im Plasma. Dem tf-2-SB-Glykoprotein wurden auch Affinitäten zur Gelatine und Collagen zugeschrieben.

Die an die Zellmembran gebundene Form des eC-2-SB-Glykoproteins liegt bei verschiedenen transformierten Zellen in wesentlich geringerer Dichte vor. Der veränderte PhM-notyp dieser Zellen kann zu einem gewissen Grad durch die Adsorption von θί-2-SB-Glykoprotein an die Zellmembran korrigiert werden (z. B. Wiederherstellung der Haftung an Kulturgefäßen, Kontaktinhibition etc.).

Eine physiologische Eigenschaft des or-2-SB-Glykoprotelns ist seine nichtimmunologische, opsonierende Wirkung. Z. B. wird die Aufnahme von partikulärere Katerial durch das retikuloendotheliale System (RES) gefördert. Es wurde eine direkte Korrelation zwischen dem «^-2-SB-Glykoprotein-Spiegel im Plasma und der Aktivität des RES postuliert.

Bei bestimmten Erkrankungen, bei welchen es zu intravaskulären Gerinnungsstörungen kommt, tritt ein erhöhter Verbrauch von «f-2-SB-Glykoprotein auf, wobei letzteres als unspezifisches Opsonin konsumiert wird. Der or-2-SB-Glykoprotein-Spiegel kann sich also im Verlaufe von gewissen Erkrankungen ändern. Erhöhte Vierte treten -z. B. bei Erkrankungen des Bindegewebes auf; bei metastasierenden Tumoren wurden häufig erhöhte Werte bei fortgeschrittenen Stadien beobachtet.

Man nimmt an, daß die Entfernung beschädigten autologen

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Gewebes und von zirkulierenden Bestandteilen, wie z. B. löslichem Fibrin, durch nichtimmunologische Opsonierung ein wichtiger physiologischer Vorgang ist. Aus diesem Grund kann eine beträchtliche Abnahme von cxf-2-SB-Glykoprotein zu Organversagen bei Schwerkranken führen. Durch Infusion von od-2-SB-Glykoprotein konnte ein positiver Effekt auf den Zustand von Patienten mit intravaskulären Gerinnungsstörungen, wie sie bei schweren Infektionen (Sepsis), bei Tumoren, schweren Verletzunger und nach Operationen vorkommen können, erzielt werden (Science 2o1 (1978) 622) .

Voraussetzung für eine gezielte Therapie ist jedoch eine ausreichende Verfügbarkeit von Di -2-SB-Glykoprotein.

Die Affinitätschromatcgraphie von (X -2-SB-Glykoprotein an Sepharose-gebundener Gelatine wurde von Ruoslahti und Engvall (Ann. of the New York

Academy of Sciences 312 (1978) 186) zur Isolierung dieses Proteins genutzt. Das Protein konnte mittels Harnstoff, Natriumthiocyanat, Natriumjodid, Ä'thylenglykol, spezifischen Antikörpern bzw. durch Collagenase-Einv/irkung von der Gelatine enthaltenden Affinitätsmatrix eluiert werden. Nach Blechern. J. 175 (1978) 333 können verschiedene kationische Verbindungen (z. B. Arginin. Spermidin, Putrescin u.a.) dieses Protein von Gelatine-Gepharose eluieren. Diese Methoden haber gewisse flach teile: Bei der EIution mit chaotropen Substanzen muß beispielsweise eine Dialyse angeschlossen werden. Nach der Entfernung dieser Substanzen kommt es dann zu Aggregaticnserscheinungen, wenn die Konzentration von c^-2-SB-Glykoprotein 1 mg/ml übersteigt. Eir auf diese Weise hergestelltes Material läßt sich also nur schwer infundieren. Eei der Elution mit katicr.ischen Substanzen wurde beobachtet, daß die HämagglutinationsaktivLtät von OC-2-SB-Glykoprotein inhibiert wurde,

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Eigene Untersuchungen ergaben darüber hinaus, daß die immunologischen Eigenschaften des oc-2-SB-Glykoproteins nach Isolierung mittels katicnischer Substanzen vermindert werden. In Biochem. J. 169 (1978) 55 wird ein Verfahren beschrieben, bei welchem öd -2-SB-Glykoprotein durch Zusatz von 1 Kol/1 Kaliumbromid eluiert werden konnte. Dieses Verfahren leidet unter den gleichen Nachteilen, wie die eben erwähnten Methoden.

Aufgabe der Erfindung ist es daher, ein Verfahren zu schaffen, welches eine einfache Anreicherung bzw. Isolierung von «<-2-SB-Glykoprotein ermöglicht, ohne daß ierbei Verluste in der immunologischen und physiologischen Aktivität auftreten.

Gelöst wird diese Aufgabe erfindungsgemäß durch ein Verfahren zur Gewinnung von ^-2-SB-Glykoprotein aus seinen physiologischen Lösungen durch Bindung an ein an einem unlöslichen Träger immob^.isiertes bindefähiges Protein, welches dadurch gekennzeichnet ist, dal? anschließend das trägerfixierte Protein mit Pufferlösung, pH 6 bis 8,5, gewaschen und danach das Χ-2-SB-Glykcprotein ir.it einer Pufferlösung von pH 9 oder höher eluiert und aus dem Eluat die gewünschte Substanz Gewonnen wird.

überraschenderweise wurde gefunden, daß sich unter den erfindungsgemäßen pH-Bedingungen eine einfache Gewinnung des reinen Proteins ohne Veränderung seiner Eiaenschaften, insbesondere ohne Aggregation, durchführen läßt.

Als bindefähiges Protein v/erden Gelatine, Collagen und Fibrin bevorzugt, die alleine oder in Mischung angewendet werden können. Ebenfalls geeignet sind jedoch auch andere bindefähicre Proteine. Als Träger für das bindefähige Protein eignen sich die üblicherweise für die Immobilisierung

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von Proteinen verwendeten Trägermaterialien. Bevorzugt werden Träger auf Basis eines Kohlehydrats, wie Zellulose, Agarose oder dergleichen. Auch andere hydrophile organische oder anorganische Trägersubstanzen können verwendet werden. Typische Beispiele hierfür sind polymere Derivate der Acrylsäure oder Methacrylsäure, welche polare Substituenten, wie Hydroxylgruppen, Aminogruppen oder dergleichen tragen können.

Die Art der Bindung des bindefähigen Proteins am Träger ist nicht von Bedeutung, solange sie eine Auswaschung des immobilisierten bindefähigen Proteins vom Träger unter den Verfahrensbedingungen unmöglich macht. Bevorzugt werden kovalent fixierte Proteine. Zur kovalenten Trägerfixierung von Proteinen geeignete Verfahren sind in größerer Anzahl dem Fachmann bekannt und brauchen hier nicht näher erläutert zu werden. Die Fixierung kann beispielsweise durch Aktivierung des Trägers, wie bromcyanaktivierte Kohlehydrate, durch Aktivierung des Proteins oder mittels difunktionellen Brtickenbildnersubstanzen erfolgen.

Die physiologische tt-2-SB-Glykoproteinlösung wird mit dem immobilisierten bindefähigen Protein kontaktiert und so lange in Kontakt gelassen, bis alles OC-2-SB-Glykoprotein an den Träger gebunden vorliegt, üblicherweise erfordert dies etwa o,5 bis 2 Stunden. Während der Kontaktierung wird zweckmäßig die Mischung gerührt. Je nach der Art der physiologischen Lösung, ihrer Vorbehandlung, z. B. Citratplasma oder EDTA-Plasma (EDTA = Äthylendiarrinotetraessigsäure) , der Art des trägerfixierten bindefähigen Proteins und des Trägers kann jedoch die Dauer der Kontaktierung auch höher oder niedriger sein. Die Kontaktierungsdauer hängt außerdem vom Verhältnis der Menge des eingesetzten immobilisierten bindefähigen Proteins und des in der Lösung vorhandenen Proteins ab.

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Nach Beendigung der Kontaktierung bzw.Inkubation wird die Hauptmenge des ursprünglich in der Lösung vorhandenen Proteins ir.it einer Pufferlösung vcn pH 6 bis 8,5 ausgewaschen. Eescnders geeignet ist der pH-Bereich von 7 bis 8, beste Ergebnisse werden bei pH 7,3 bis 7,7 erzielt. Die Pufferkonzentration kann in weiten Grenzen variiert werden. Gute Ergebnisse erhält rran irr. allgemeinen bei Konzentrationen zwischen etwa o,o1 und etwa o,3 Hol/l. Zweckmäßig wird der Pufferlösung zur Erhöhung der Ionenstärke ein neutrales Salz zugesetzt. Wird ein solches verwendet, so beträgt seine Konzentration vorzugsweise o,5 bis 2 WoI/1. Geeignete neutrale Salze sind beispielsweise Alkalichloride, wie Natriumchlorid, Kaliumchlorid, Lithiumchlorid usw., welche bevorzugt werden. Es können jedoch auch andere Salze starker Basen r.it starken Säuren verwendet werden. Die Waschung der Trägersubstanz wird so lange durchgeführt, bis sich kein Protein mehr bei den angegebenen pH-Bedingungen auswaschen läßt.

Anschließend erfolgt die Eluticn des oc-2-SB-Glykcproteins vom Träger mit Hilfe einer Pufferlösung von pH 9 oder höher, vorzugsweise von pH 1o bis 12. Beste Ergebnisse werden bei pH-Werten zwischen 1o,5 und 11,5 erzielt. Die so erhaltene von Fremdprcteinen praktisch freie Lösung von te -2-SB-Glykoprctein kann nach Entfernung der Puffersubstanz durch Dialyse zur Trockne gebracht werden, beispielsweise durch Lyophilisation oder Eindampfen. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform verwendet man zur Elution eine flüchtige Puffersubstanz, so dsi? das erhaltene Eluat ohne vorherige Dialyse direkt der Lyophilisierung unterworfen werden kann.

Im Rahmen der Erfindung sind generell Puffersubstanzen geeignet, welche irr angegebenen oH-Wertbereich zu puffern vermögen. Typische Beispiele für geeignete, nichtflüchtige Puffer sind Tris-Salzsäurepuffer, Boratpuffer, Veronalpuffer, Glycin/Natronlaugepuffer und Carbonatpuffer. Beispie-

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le für geeignete flüchtige Puffer sind Triäthylammoniumbicarbonatpuffer, Airmoniurrbicarbcnat/Kohlendioxidpuf fer, Ammoniurcarbonatpuff er , Collidinacetatpuf fer, Pyridiniuir.acetatpuffer und Cyclohexylairinpropansulfonat-puffer.

Das erfindungsgeiräße Verfahren ist einfach durchzuführen und enr.öcrlicht die Gewinnung eines reinen θί-2-SE-Glykoproteins, dessen iirjr.unoloaische Aktivität und Bindeeigenschaften unverändert bleiben. Aufgrund der bekannten kiebstoffartigen Eigenschaften des Oi"-2-SB-Glykoproteins ist es als sehr überraschend anzusehen, daß es an einen unlöslichen Träger qebundenen und von diesen unter bilden Bedingunaen wieder eluiert werden kann, chne daß eine /ujaregation auftritt.

Das fcloende Beispiel erläutert die Erfindung weiter. Beispiel

An bromcyanidaktivierte Sepharcse (Handelsprodukt der Fa. Pharmacia) wurden nach den /.ngaben des Herstellers 1 irg Gelatine/irl Sepharose kovalent gebunden.

2o 1 Huitianplasrr.a wurden rrit 1o 1 Gelatine-Sepharose geirdscht und über einen Zeitraun· von 2 Stunden unter P.ühren inkubiert,

Anschließend wurde die Sepharose über einer Glasfritte mit o,o5 Mol/l Tris-Salzsäurepuffer, pH 7,5, welche 1 McI/1 NaCl enthält, gewaschen, bis kein Protein niehr in der Waschlösung nachweisbar war.

Das gebundene oC-2-SB-Glykcprotein wurde anschließend mit o,o5 Mol/l Cyclchexy lairdnoprcpansulfcnsäure, welche durch Zugabe von 1 Mol/l Natronlauge auf einen pH von 11,ο eingestellt wurde, eluiert. Die Gesamtausbeute betrug 4 g oi~2-SB-Glykoprotein.

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Das erhaltene Protein war immunelektrophoretisch reines ät-2-SE-Glykcprctein. Dieses Protein vies nach eier Elution volle immunologische Aktivität auf, seine Bindeeiqenschaft zu den Affinitätsabsorbentien nach Neutralisation blieb erhalten.

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Claims

Patentansprüche

1. Verfahren zur Gewinnung von c^-2-SB-Glykcprctein aus seinen physiologischen Lösungen durch Bindung an ein an einem unlöslichen Träger iirr.cbilisiertes, bindefähiees Protein, dadurch gekennzeichnet, daß anschließend das trägerfixierte Protein mit Pufferlösung, pH 6 bis 8,5, gewaschen und danach das OC-2-SB-Glykoprotein mit einer Pufferlösung von pH 9 oder höher eluiert und aus dem Eluat gewonnen wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , daß als bindefähiges Protein Gelatine, Collagen oder/und Fibrin verwendet wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Träger auf Basis eines Kohlehydrats verwendet.

4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man ein am Träger covalent fixiertes, bindefähiges Protein verwendet.

5. ' Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man das trägerfixierte Protein mit o,o1 bis c,3 Mol/l Puffer, pH 7 bis 8, welcher o,5 bis 2 Mol/l neutrales Salz enthält, wäscht.

6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß man als neutrales Salz ein Alkslichlorid verwendet.

7. Verfahren nach einem, der verhergehenden Ansprüche, dadurch σ e k e η η ;: e i c h η e t , daß man mit Puffer,

ORIGINAL INSPECTED

pH 1o bis 12, eluiert.

8. Verfahren nach einein der verhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet , daß man mit einer flüchtigen Puffersubstanz eluiert.

9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet , daß man das Eluat direkt lyophilisiert.