DE3001585A1 - Verfahren zur herstellung von interferon typ ii und es enthaltende zubereitungen - Google Patents

Verfahren zur herstellung von interferon typ ii und es enthaltende zubereitungen

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    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/811—Interferon

Description

1. Ken Hayashibara, Okayama, Japan
2. Shin Ashida, Hyogo, Japan
Verfahren zur Herstellung von Interferon Typ II und es enthaltende Zubereitungen
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Interferon, insbesondere Interferon Typ II, und ein Verfahren zur Herstellung von therapeutischen und prophylaktischen Interferonini tteln, die bei Krankheiten wirksam sind, die auf Interferon Typ II ansprechen.
Wie in "Interferon" (Kondansha Co., Ltd., Tokyo, Japan (1975) (Shigeyasu Kobayashi)), "Interferon and Its Clinical Potential" (William Heineman Medical Books Ltd. (London) (1976) (D.A.J. Tyrrell)) und in "Protein, Nucleic Acid and Enzyme", Bd. 21, Nr. 4 (1976) beschrieben ist, ist "Interferon" ein Ausdruck, der eine eiweißartige Substanz bezeichnet, die intrazellular oder extrazellulär induziert wird, indem man lebende Zellen der Wirkung eines Interferonauslösers (interferon inducer) aussetzt, beispielsweise einem Virus, einem Bakterium, einem Protozoon, Rickettsien, einer Nucleinsäure, einem Endotoxin oder Polysaccharid, und die eine derartige Punktion aufweist, daß sie unspezifisch die Vermehrung verschiedener Viren in Zellen hemmt. Wegen seiner Hemmungswirkung auf die Virusvermehrung sah man Interferon schon lange als vielversprechendes
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therapeutisches und prophylaktisches Mittel gegen Viruskrankheiten an, seit es aufgefunden wurde. In letzter Zeit wurde gezeigt, daß Interferon als ein Antitumormittel nicht nur bei Virustumor sondern auch bei nicht durch Virus bedingtem Tumor wirkt, und daher setzte man auf die Verwertung von Interferon als Arzneimittel große Hoffnungen.
Es ist bekannt, daß der Ausdruck "Interferon" Interferone vom Typ I und vom Typ II umfaßt; das erste Interferon, Interferon Typ I bzw. klassische Interferon mit einem Molekulargewicht von etwa 1 bis 3 x 10 wird induziert, indem man lebende Zellen VirusInfektionen aussetzt, und das zweite Interferon, Interferon Typ II bzw. Immuninterferon mit einem Molekulargewicht von etwa 4 bis 7 x 10^" wird in Lymphozyten auf Stimulierung mit Mitogenen oder als Reaktion auf Antigene induziert. Wie in"Texas Reports on Biology and Medicine", Bd. 35, S. 41 bis 56 (1977), University of Texas Medical Branch, Galveston, Texas, USA, (L. B. Epstein) beschrieben ist, ist Interferon Typ II weniger stabil als Interferon Typ I unter harten bzw. heftigen Bedingungen; bei einem pH-Wert von weniger als 2 und von mehr als 10 und/oder bei einer Temperatur von mehr als 56 0C. Da Interferon Typ II jedoch eine enge Beziehung zu Immunreaktionen aufweist, erwartet man von Interferon Typ II, daß es eine viel höhere therapeutische und prophylaktische Wirksamkeit auf Krankheiten aufweist, die auf Interferon ansprechen, als Interferon Typ I.
Wegen seiner hohen Artspezifität kann man die therapeutische und prophylaktische Wirksamkeit auf menschliche Krankheiten nicht mit Interferon verwirklichen, das man aus anderen Quellen als aus lebenden menschlichen Zellen erhalten hat. Bisher verwendete man Leukozyten bei der Herstellung von Interferon Typ II. Die Gewinnung einer großen Menge von Interferon Typ II bei geringen Kosten aus Leukozyten ist ziemlioh schwierig, weil man Leukozyten aus frischem Blut abtrennen und gewinnen muß, und weil sie eine Lagerung über längere Zelträume nicht vertragen.Aufgrund dieser Umstände konnte man eine technische
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Herstellung von Interferon Typ II, das als therapeutisches und prophylaktisches Mittel für menschliche Krankheiten geeignet ist, bisher nicht verwirklichen.
Man untersuchte Methoden dahingehend, daß man sie leicht auf eine Herstellung von Interferon Typ II in technischem Maßstab anwenden kann, und untersuchte die Möglichkeiten dieses Interferons als therapeutisches und prophylaktisches Mittel. Erfindungsgemäß wurde festgestellt, daß man zwarkeine große Menge von Interferon Typ II mit hohem Reinheitsgrad dadurch erhalten kann, daß man etablierte menschliche Zellen, die InterferonTyp II erzeugen, in ein nährendes Kulturmedium in vitro transplantiert und darin vermehrt; daß man jedoch Interferon Typ II leicht erhalten kann, indem man die Zellen in andere warmblütige Tierkörper transplantiert oder die Zellen in ein Kulturmedium einimpft, das man in eine Diffusionskammer einsetzt, die zwischenßeschaltete Filtermembranen (filtermembrane-interposed) aufweist und derart ausgebildet und in oder an den Tierkörper angepaßt ist, daß die Zellen auf seiner nährenden Körperflüssigkeit wachsen können; man vermehrt dabei die transplantierten bzw. eingeimpften Zellen unter Verwendung dieser Körperflüssigkeit in dem warmblütigen Tierkörper oder in der Diffusionskammer, setzt danach die vermehrten Zellen der Wirkung eines Interferon-Typ II-Auslösers in vivo oder in vitro aus, induziert Interferon Typ II und reinigt und trennt das induzierte Interferon Typ II ob ; erfindungsgemäß wurde ferner festgestellt, daß das Interferon Typ II, das man durch das erfindungsgemäße Verfahren erhalten hat, ein ausgezeichnetes therapeutisches und prophylaktisches Mittel für Krankheiten ist, die auf Interferon Typ II ansprechen.
Das Verfahren gemäß der Erfindung unterscheidet sich von den Methoden des Standes der Technik, bei denen man lebende Zellen in vitro vermehrt, und es erzielt den Vorteil» daß man Icein oder viel weniger Nährmedium benötigt, das durch teures Serum ergänzt wird, dafl die Aufreohterhaltung und Kontrollt der Be-
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dingungen während der Vermehrung der etablierten menschlichen Zellen leichter sind, und daß man ein Interferon Typ II mit hohem Reinheitsgrad leicht erzielen kann. Mit dem Verfahren gemäß der Erfindung kann man etablierte menschliche Zellen leicht im Körper eines anderen warmblütigen Tiers unter Verwendung der Körperflüssigkeit vermehren, indem man entweder die Zellen in ihn transplantiert oder in dein oder an den . Tierkörper eine Diffusionskammer anschließt, die man mit einem Kulturmedium beschickt, in dem die genannten Zellen suspendiert sind, während man das Tier auf übliche Weise füttert. Im Vergleich zu üblichen Methoden, bei denen man die Zellen in vitro vermehrt, weist insbesondere das Verfahren gemäß der Erfindung die zusätzlichen Merkmale auf, daß die Vermehrung der Zellen stabiler bzw. gleichmäßiger ist, daß die Vermehrungsgeschwindigkeit höher ist und daß die Ausbeute an induziertem Interferon Typ II pro Zelle viel höher ist.
Man kann beliebige etablierte menschliche Zellen verwenden, sofern sie sich leicht vermehren, wenn man sie in den Körper eines anderen warmblütigen Tiers transplantiert; beispielsweiße HPB-ALL-Zellen, MOLT-3-Zellen, P 12/Ichikawa-Zellen, HPB-MLT-Zellen, P 8/Seki-Zellen, JBI-Zellen, HCL-Zellen und P1O/ Shibata-Zellen, die in "Protein, Nucleic Acid and Enzyme", Bd. 23, Nr. 6, S. 697-711 (1978) beschrieben sind; Namalva-Zellen, die im "Journal of Clinical Microbiology", Bd. 1, S. 116-117 (1975) beschrieben sind; und BALL-1-Zellen, TALL-1-Zellen und NALL-1-Zellen, die in "Nature", Bd. 267, S. 843 bie 844 (1977) (I. Miyoshi) beschrieben sind. Insbesondere bevorzugt man menschliche lymphoblastartige Zellinien (cell lines). Etablierte menschliche Zellen, die man erfindungsgemäß verwenden kann, kann man aus den genannten Zellen auswählen, obwohl sie nicht darauf beschränkt sind. In den Stufen vor der Induktion von Interferon Typ II kann man die genannten Zellen allein oder in Kombination miteinander verwenden. Zu diesen Zellen mischt man gegebenenfalls menschliche Leukozyten, die man aus frischem menschlichen Blut gewonnen hat.
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Man kann ein beliebiges warmblütiges Tier gemäß der Erfindung verwenden, sofern sich etablierte menschliche Zellen darin vermehren können: Beispielsweise Vögel, z.B. Küken oder Tauben; und Säugetiere, z.B. Hund, Katze, Affe, Ziege, Schwein, Rind, Pferd, Kaninchen, Meerschweinchen, Ratte, Hamster, Maus und nackte Maus. Da die Transpiatation von menschlichen Zellen in die genannten Tierkörper leicht unerwünschte Immunreaktionen bewirkt, sollte man Tiere in möglichst unausgewachsenem Zustand, nämlich als Ei, Fetus, Embryo oder Neugeborenes oder junges Tier auswählen, um die Immunreaktionen soweit als möglich zu unterdrücken. Vor der Transplantation der Zellen kann man das Tier mit Röntgenstrahlen oder gamma-Strahlen von etwa 200 bis 600 rem bestrahlen, oder ein Antiserum oder ein immunsuppressives Mittel injizieren und die Immunreaktionen unterdrücken. Man bevorzugt nackte Mäuse, sogar als Erwachsene, als warmblütiges Tier, weil sie weniger dazu neigen, unerwünschte Immunreaktionen zu bewirken, und man etablierte menschliche Zellen ohne Vorbehandlung in sie transplantieren und darin rasch vermehren kann. Durch Transplantation von vermehrten menschlichen Zellen von einem Körper eines warmblütigen Tieres in einen anderen Körper eines warmblütigen Tiers kann man die Vermehrung der Zellen viel gleichmäßiger bzw. stabiler gestalten und eine viel größere Menge an Interferon Typ II erzielen, das in den Zellen induziert wird; beispielsweise transplantiert man etablierte menschliche Zellen in Hamster und vermehrt sie darin, erntet danach die vermehrten menschlichen Zellen und transplant iert sie in nackte Mäuse. In diesem Fall kann man die vermehrten Zellen weiter von einem Körper eines warmblütigen Tiers in einen anderen Körper eines warmblütigen Tiers der gleichen Art, Gattung, Klasse oder Ordnung transplantieren. Etablierte menschliche Zellen kann man ferner in einen beliebigen Teil eines Tierkörpers transplantieren, sofern sie sich darin leicht vermehren; z.B. intraperitonal, intravenös, subkutan oder in eine Allantοishöhlung.
Statt die.etablierten menschlichen Zellen in den Körper eines anderen warmblütigen Tiers zu transplantieren und aarin zu
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vermehren,kann man beliebige der genannten Zellen in die Nährflüssigkeit eines Körpers eines anderen warmblütigen Tiers in einer üblichen Diffusionskammer einimpfen und darin vermehren, die beispielsweise intraperitonal derart eingebettet und ausgebildet ist, daß sie den Zellen gestattet, die genannte Körperflüssigkeit zu verwenden. Die Kammern, die erfindungsgemäß verwendbar sind, können verschiedene Formen und Größen aufweisen und sollten zwischengeschaltete Filtermembranen aufweisen, z.B. Membranfilter, Ultrafilter oder Hohlfibern (hollow fiber), um ein leckwerden der Zellen zu verhindern. Insbesondere bevorzugt man Kammern mit zwischengeschalteten Filtermembranen einer Porengröße von etwa 10 ' bis 10 ^m. Gegebenenfalls kann man die Diffusionskammer derart ausbilden und beispielsweise auf der Oberfläche des Tierkörpers anordnen, daß die nährende Körperflüssigkeit des Tieres durch die Kammer zirkulieren kann und man die Entwicklung der etablierten menschlichen Zellen, die man in die Kammer eingeimpft hat, durch ein transparentes Seitenfenster in der Kammerwand beobachten kann. Die Diffusionskammer kann man ferner derart ausbilden und ausstatten, daß man sie in regelmäßigen Zeitabständen vom Tierkörper trennen kann und sich die Zellen während des gesamten Lebens des Tiers ohne unnötiges Töten des Tiers vermehren, so daß man weiter die Ausbeute der vermehrten Zellen pro Tier steigert. Die Methode unter Verwendung der genannten Diffusionskammer weist ferner das weitere Merkmal auf, daß man abgesehen vom leichten Ernten der vermehrten menschlichen Zellen, weil kein direkter Kontakt der Zelle mit den tierischen Zellen besteht, verschiedene warmblütige Tiere ohne irgendeine Vorbehandlung zur Unterdrückung ihrer Immunreaktionen verwenden kann, weil geringere Möglichkeiten zur Verursachung von Immunreaktionen bestehen.
Das Verfahren gemäß der Erfindung bietet den Vorteil, daß das Tier, in das man die etablierten menschlichen Zellen transplantiert, auf übliche Weise füttern kann, und daß man keine Spezialbehandlung sogar nach der Transplantation der Zellen benötigt. Der Zeitraum, den man für eine ausreichende Vermehrung der transplantierten etablierten menschlichen Zellen benötigt,
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beträgt im allgemeinen 1 bis 10 Wochen.
Die Zahl der vermehrten menschlichen Zellen zählte man und
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stellte fest, daß sie etwa 10' bis 10 oder mehr pro !Eier betrug. Das Verfahren gemäß der Erfindung ist demgemäß außerordentlich vorteilhaft zur Herstellung von Interferon Typ II, weil die Zahl der Zellen, die man in bzw. auf den Tierkörper bzw. die Diffusionskammer transplantiert bzw. eingeimpft hat,
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sich um das etwa 10 - bis 10 -fache oder mehr durch das genannte Verfahren vermehrt; das ist das 10-bis 10 -fache oder mehr der Zahl, die man durch Einimpfen und Vermehren der gleichen Zellen in nährenden Kulturmedien in vitro erzielte.
Bei der Induktion von Interferon Typ II kann man eine beliebige Methode anwenden, sofern sie Interferon Typ II in den vermehrten lebenden menschlichen Zellen induziert. Die Zellen kann man der Wirkung eines Interferon-Typ II-Auslösers dort aussetzen, wo man sie vermehrt hat. Beispielsweise kann man menschliche Zellen, die man in Ascites in Suspension vermehrt hat, oder die Tumorzellen,die subkutan aufgetreten sind, der Wirkung eines Interferon-Typ II-Auslösers in vivo dort aussetzen, wo sie sich vermehrt haben, und das induzierte Interferon Typ II reinigt man danach und trennt es aus dem Ascites oder dem Tumor ab. Im Gegensatz dazu kann man vermehrte menschliche Zellen nach der Isolierung der Wirkung eines Interferon-Typ II-Auslösers in vitro aussetzen und Interferon Typ II Induzieren. Beispielswelse suspendiert man die vermehrten menschlichen Zellen, die man aus Ascites geerntet hat, oder jene, die man aus den massiven (massive) Tumoren isoliert und getrennt (dissociated) hat, welche subkutan aufgetreten waren, in einem Nährmedium, das man bei etwa 20 bis 40 0C hält, und erzielt eine Zellkonzentration von etwa \Qr bis 10 Zellen/ml und setzt es danach einem Interferon-Typ II-Auslöser aus. Das induzierte Interferon Typ II reinigt man danach und trennt es ab. Wenn man menschliche Zellen in einer Diffusionskammer vermehrt, kann man die Zellen einem Interferon-Typ II-Auslöser in dieser Kammer In vivo aussetzen, oder man kann sie de« Aue-
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löser in vitro aussetzen, nachdem man sie aus der genannten Kammer gewonnen hat.
Bei der Herstellung von Interferon Typ II kann man gegebenenfalls die Menge des induzierten Interferons Typ II weiter auf bekannte Weise vermehren, z.B. durch die Inkubationsmethode (priming method) unter Verwendung von Interferon, das für den Menschen hoch artspezifisch ist, und/oder die Superinduktionsmethode unter Verwendung eines Stoffwechselinhibitors. Ferner kann man die Ausbeute an induziertem Interferon Typ II pro Tier weiter steigern, indem man eine oder mehrere der nachstehenden Methoden anwendet:
(1) Eine Methode, bei der man die vermehrten Zellen zuerst einem Interferon-Typ II-Auslöser zum Induzieren des Interferons dort aussetzt, wo man sie vermehrt hat, und danach nach dem Ernten aus einem bestimmten oder einem ganzen Teil eines Tierkörpers einem Interferon-Typ II-Auslöser aussetzt und das Interferon in vitro induziert.
(2) Eine Methode, bei der man menschliche Zellen, die man zur Herstellung von Interferon Typ II bereits verwendet hat oder wiederholt verwendet hat,der Wirkung eines Interferon-Typ II-Auslösers in vivo oder in vitro zum Induzieren des Interferons aussetzt; und
(3) eine Methode, bei der man eine Diffusionskammer, die man in einen Tierkörper eingebettet hat oder damit verbunden hat, in regelmäßigen Zeitabständen abtrennt und die Anzahl der vermehrten menschlichen Zellen steigert.
Als Interferon-Typ II-Auslöser bevorzugt man übliche Mitogene, wie z.B. Phytohämagglutinin, Concanavalin AjMitogen aus Bärenklau oder aus Kigellaria capensis oder aus Pisonia obtusata (pork weed mitogen), Lipopolysaccharid, Polysaccharid, Endotoxinoder Bakterium. Für sensitivierte Zellen wirkt Antigen ferner als Interferon-Typ II-Auslöser. Die genannten Interferon-Typ II-Auslöser verwendet man üblioherwelee in einer
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Konzentration von etwa 0,001 /ug/ml bis 10 mg/ml. Ferner erhöht die Verwendung von einem oder mehreren Interferon-Typ I-Auslösern, beispielsweise Virus, Nucleinsäure oder Polynucleotid in Kombination mit einem Interferon-Typ II-Auslöser weiter die Ausbeute an induziertem Interferon Typ II und ermöglicht ferner die gleichzeitige Induktion von Interferonen vom Typ I und Typ II.
Das induzierte Interferon Typ II kann man leicht durch übliche Reinigungs- und Abtrennmethoden reinigen und abtrennen, z.B. durch Aussalzen, Dialyse, Filtrieren, Zentrifugieren, Einengen und Gefriertrocknen. Wenn man eine Herstellung von höher gereinigtem Interferon Typ II wünscht, kann man Interferon Typ II höchster Reinheit dadurch erzielen, daß man übliche Methoden, z.B. Adsorption und Desorption durch Ionenaustauscher, Gelfiltration, Affinitätschromatographie, Fraktionieren und Elektrophorese am isoelektrischen Punkt oder Elektrophorese, in Kombination mit den genannten Methoden anwendet.
Die Aktivitäten der Interferone vom Typ I und Typ II, die für den Menschen hoch artspezifisch sind, bestimmte man durch die Fleckenverminderungsmethode (plaque reduction method) mit FL-Zellen, die man aus menschlichem Amnion gewonnen hat, wie in "Protein, Nucleic Acid and Enzyme", Bd. 20, Nr. 6, S. 616 bis 643 (1975), Kyoritsu Shuppan Co., Ltd., Tokyo, Japan, beschrieben ist.
Die Hamagglutinxerungseinheit untersuchte bzw. eichte man gemäß der Methode, die im "Journal of Immunology", Bd. 49, S. 87 bis 98 (1944) (J. E. SaIk) beschrieben ist.
Die Erfindung betrifft also Verfahren, die man leioht auf die technische Herstellung von Interferon Typ II und von Mitteln anwenden kann, die Interferon Typ II enthalten.
Insbesondere beruhen die erfindungsgemäßen Verfahren auf der Feststellung, daß mau eine große Menge von Interferon Typ II mit hohem Reinheitsgrad leioht erhalten kann, Indem man etablier-
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te menschliche Zellen in den Körper eines anderen warmblütigen Tiers transplantiert oder die Zellen in ein Kulturmedium einimpft, das man in eine mit zwischengeschalteten Filtermnmbranen versehene Diffusionskammer eingesetzt hat, die derart ausgebildet ist und in den oder an den Tierkörper angepaßt ist, daß die Zellen auf seiner nährenden Körperflüssigkeit wachsen können; indem man die transplantierten bzw. eingeimpften Zellen in dem Körper des warmblütigen Tiers- oder in der Diffusionskammer unter Verwendung der Körperflüssigkeit vermehrt, danach die vermehrten Zellen der Wirkung eines Interferon-Typ II-Auslösers in vivo oder in vitro zum Indzieren von Interferon Typ II aussetzt und das induzierte Interferon Typ II reinigt und abtrennt; die erfindungsgemäßen Verfahren beruhen ferner auf der Peststellung, daß Mittel mit einem Gehalt an Interferon Typ II, das man gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren erhalten hat, zur Behandlung und Vorbeugung von Krankheiten wirksam und hervorragend sind,welche auf Interferon Typ II ansprechen.
Nachstehend wird die Erfindung durch Beispiele näher erläutert:
Interferonergiebigkeit der Zellen, die man in vitro od®r in vivo vermehrt hat:
Versuch 1: Vermehrung in vitro
BAIL-1-Zellen impfte man in RPMI-164O-Medium, das man mit 20 # fetalem Rinderserum bei einem pH-Wert von 7S2 ergänzt hatte, und kultivierte sie in Suspension bei 37 0C. Die vermehrten Zellen wusch man mit serumfreiem RPMI-164O~Meäium bei einem pH-Wert von 7»2, suspendierte sie in einem frischen Medium der gleichen Zusammensetzung und erhielt eine Zellkonzentration von etwa 1 χ 10 Zellen/ml.
Versuch 2: Vermehrung in vivo
Neugeborenen Hamstern indizierte man vorher Antiserum, das man aus Kaninchen auf bekannte Weise gewonnen hatte, unterdrückte ihre Immunreaktionen und transplantierte ihnen danaoh subkutan
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BALI-1-Zellen ein. Die Hamster fütterte man auf übliche Weise drei Wochen lang. Die massiven Tumoren, die subkutan auftraten, isolierte man, zerschnitt sie fein, trennte sie in einer physiologischen Kochsalzlösung mit einem Gehalt an Trypsin auf und sammelte die vermehrten Zellen. Die derart erhaltenen Zellen wusch man mit serumfreiem RPMI-164O-Medium bei einem pH-Wert von 7,2, suspendierte sie in einem frischen Medium der gleichen Zusammensetzung und erhielt eine Zellkonzentration von etwa 1 χ 106 Zellen/ml.
Versuch 3: Herstellung von Interferon
Die Suspensionen von EALL-1-Zellen aus den Versuchen 1 und 2 mit einer Zellkonzentration von etwa 1 χ 10 Zellen/ml setzte man Phytohämagglutin und/oder Sendai-Virus aus und induzierte Interferon. Wenn man insbesondere Phytohämagglutinin allein verwendete, gab man den Suspensionen Phytohämagglutin in einer Menge von etwa 100 jüg/ml zu, inkubierte bei 37 0C 3 d lang und induzierte Interferon. Wenn man Sendai-Virus allein verwendete, gab man den Suspensionen das Virus in einer Menge von etwa 300 Hämagglutinierungseinheiten/ml (hemagglutination units per ml) zu, inkubierte bei 37 0C 1 d lang und induzierte Interferon. Wenn man sowohl Phytohämmagglutinin als auch Sendai-Virus kombiniert verwendete, gab man den Suspensionen zuerst Phytohämagglutin in in einer Menge von etwa 100 /ig/ml zu, inkubierte bei 37 0C 2 d lang, gab danach Sendai-Virus in einer Menge von etwa 300 HämagglutinierungBeinheiten/ml zu, inkubierte bei 37 0C einen weiteren Tag und induzierte Interferon.
Die derart erhaltenen interferonhaltigen Suspensionen zentrifugierte man. Die erhaltenen überstehenden Flüssigkeiten engte man mit einem Ultrafilter mit einem kritischen bzw. Grenzmolekulargewicht von 6000 ein und fraktionierte sie danach nach den Molekulargewichten mit Dextrangel. Die Aktivität des erhaltenen Interferons Typ I mit einem Molekulargewicht von etwa 25 000 und des erhaltenen Interferons Typ II mit einem Molekulargewicht von 50 000 bestimmte man und bewertete die
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Interferonaktivitäten pro ml Suspension nach der Inkubation. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 gezeigt.
Tabelle 1
Interferonauslöser Vermehrung
in vitro in vivo
Phytohämagglutinin 20 (20) 400 (400)
Sendai-Virus 1700 (0) 6700 (0) Phytohämagglutinin +
Sendai-Virus 1740 (30) 24000 (11000)
Bemerkung: Die bestimmten Interferongesamtaktivitäten nach der Inkubation sind durch Einheiten pro ml Suspension ausgedrückt, und jene von Interferon Typ II sind für jede Zubereitung in Klammern gezeigt.
Wie aus den Ergebnissen von Tabelle 1 ersichtlich ist, wurde nur eine geringe Menge von Interferon in Zellen induziert, die in vitro vermehrt wurden, während eine große Menge Interferon in Zellen induziert wurde, die in vivo vermehrt wurden. Sowohl die Zellen, die man in vitro vermehrt hatte, als auch die Zellen, die man in vivo vermehrt hatte, erzeugten Interferon Typ I, wenn man sie dem Sendai-Virus aussetzte„ Die Zellen, die man in vivo vermehrt hatte, ergaben jedoch eine viermal höhere Aktivität als jene, die man in vitro vermehrt hatte. Hinsichtlich der Interferonaktivitäten der Zubereitungen, die durch Phytohämagglutinin und/oder Sendai-Virus induziert wurden, stellte man einen bemerkenswerten Synergismus, der den Interferonauslösern zuzuschreiben ist, bei der Herstellung von Interferonen von Typ I und Typ II fest, wenn man Zellen verwendete, die man in vivo vermehrt hatte. Insbesondere zeigte Interferon Typ II, das man unter Verwendung von Phytohämagglutin und Sendai-Virus in Kombination induziert hatte, eine etwa 28 mal höhere Aktivität als jenes, das man unter Verwendung von Phytohämagglutinin allein induziert hatte. Man beobachtete jedoch keinen Synergismus, wenn man Zellen verwendete, die
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man in vitro vermehrt hatte.
Nachstehend werden verschiedene Ausführungsformen zur Herstellung von Interferon Typ II gemäß der Erfindung näher erläutert.
Herstellungsbeispiel 1:
Erwachsenen nackten Mäusen transplantierte man subkutan etablierte menschliche BALIi-1-Zellen ein, und man fütterte die Mäuse auf übliche Weise drei Wochen lang. Die massiven Tumoren, die subkutan auftraten, etwa 10 g/nackte Maus, isolierte man, zerschnitt sie fein und trennte sie in einer physiologischen Kochsalzlösung mit einem Gehalt an Trypsin auf und sammelte die vermehrten menschlichen Zellen. Die Zellen wusch man mit einem Medium mit Minimalkonzentrationen aller essentiellen Stoffe (Eagle), das man mit 5 V0I-5S menschlichem Serum bei einem pH-Wert von 7,2 ergänzt hatte, suspendierte in einem frischen Medium der gleichen Zusammensetzung und erhielt eine Zellkonzentration von etwa 5 x 10 Zellen/ml bei 37 0C Zu dieser Suspension gab man ein teilweise gereinigtes Interferon mit hoher menschlicher Artspezifität in einer Menge von etwa 100 Einheiten/ml und inkubierte die Mischung etwa 2 h lang. Phytohämagglutinin gab man danach zu der Mischung in einer Menge von etwa 200 /ag/ml. Danach inkubierte man diese Mischung bei dieser Temperatur weitere 3 d lang und induzierte Interferon Typ II. Die inkubierte Mischung zentrifugierte man bei etwa 1000 χ 9,8 ms"2 (1000 χ g) bei 4 0C, entfernte Niederschläge, wie z.B. Zellabfälle,und dialysierte die erhaltene überstehende Flüssigkeit gegen eine physiologische Kochsalzlösung, die man bei einem pH-Wert von 7»2 mit einem Phosphatpuffer (0,01 Mol/l) gepuffert hatte, 24 h lang. Danach filtrierte man das Ergebnis sorgfältig mit einer PiItermembran, engte das Piltrat mit einem Gehalt an Interferon Typ II ein und gefriertrocknete es zu einem Pulver.
Die Interferon-Typ H-Aktivität des Pulvers betrug etwa 1 500 000 Einheiten pro nackte Maus.
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Herstellungsbeispiel 2:
Erwachsenen nackten Mäusen transplantierte man intraperitonal etablierte menschliche BALL-1- und TALL-1-Zellen ein und fütterte die Mäuse auf übliche Weise 5 Wochen lang. Den nackten Mäusen injizierte man danach intraperitonal 1 mg Phytohämagglutinin, 24 h später injizierte man ihnen etwa 3000 Hämagglutinierungseinheiten Newcastle-Disease-Virus, dessen Aktivität man fast ganz durch UV-Strahlung vorher inaktiviert hatte. Die nackten Mäuse tötete man und erntete ihre Ascites 24 h nach der Injektion.
ρ Die Ascites zentrifugierte man bei etwa 1000 χ 9,8 ms (1000 χ g) und 4 0O und entfernte Niederschläge, wie z.B. Zellabfälle. Die erhaltene überstehende Flüssigkeit dialysierte man gegen eine physiologische Kochsalzlösung, die man bei einem pH-Wert von 7,2 mit Phosphatpuffer (0,01 Mol/l) gepuffert hatte, 15 h lang. Das Ergebnis filtrierte man danach, engte es sorgfältig mit Filtermembranen ein und erhielt ein Konzentrat mit einem Gehalt an Interferon.
Die Interferongesamtaktivität des Konzentrates betrug etwa 800 000 Einheiten pro 10 nackte Mäuse, wovon etwa 300 000 Einheiten Interferon-Typ II-Aktivität waren.
Herstellungsbeispiel 3:
Neugeborenen Hamstern injizierte man vorher Antiserum, das man aus Kaninchen auf bekannte Weise hergestellt hatte, und unterdrückte ihre Immunreaktionen, und injizierte ihnen danach subkutan etablierte menschliche JBL-Zellen. Die Hamster fütterte man auf übliche Weise 4 Wochen lang. Die massiven Tumoren, die subkutan auftraten, etwa 30 g pro Hamster, isolierte man und behandelte sie gleich wie in Herstellungsbeispiel 1. Die vermehrten Zellen wusch man mit RPMI-164O-Medium, das man mit 10 Vol-$ fetalem Rinderserum bei einem pH-Wert von 7,4 ergänzt hatte, suspendierte sie in einem frischen Medium der gleichen Zusammensetzung und erhielt eine Zellkonzentration von etwa 2 χ 107 Zellen/ml bei 37 0C Zur Mischung gab man ein teilweise
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gereinigtes für den Menschen hoch artspezifisches Interferon Typ II in einer Menge von etwa 200 Einheiten/ml und inkubierte bei 37 0C etwa 1 h lang. Zur inkubierten Mischung gab man danach Concanavalin A in einer Menge von etwa 500 jag/ml, inkubierte 3d lang, gab danach Sendai-Virus in einer Menge von etwa 300 Hämagglutinierungseinheiten/ml zu, inkubierte 16 h lang und induzierte Interferon. Die Mischung reinigte man und engte sie sorgfältig mit Filtermembranen gleich wie in Herstellungsbeispiel 2 ein und erhielt eine interferonhaltige Lösung.
Die Interferongesamtaktivität der Lösung betrug etwa 17 Millionen Einheiten pro Hamster, wovon etwa 6 Millionen Einheiten Interferon-Typ II-Aktivität waren.
Herstellungsbeispiel 4:
Neugeborenen Ratten transplantierte man intraperitonal etablierte menschliche Namalva-Zellen ein und fütterte danach die Ratten auf übliche Weise 4 Wochen lang. Die massiven Tumoren, die subkutan auftraten, etwa 50 g pro Ratte, isolierte man, zerschnitt sie fein und trennte sie gleich wie in Herstellungsbeispiel 1 auf. Die vermehrten menschlichen Zellen behandelte man gleich wie in Herstellungsbeispiel 1 mit der Ausnahme, daß man Maruyama-Vakzine in einer Menge von etwa 1 jug/ml zur Induzierung von Interferon Typ II anstelle von Phytohämagglutinin zugab. Das induzierte Interferon Typ II reinigte man und gefriertrocknete die erhaltene Lösung mit einem Gehalt an Interferon Typ II zu einem Pulver gleich wie in Herstellungebeispiel 1.
Die Interferon-Typ II-Aktivität des Pulvers betrug etwa 8 Millionen Einheiten pro Ratte.
Herstellungsbeispiel 5:
Zuerst bestrahlte man erwachsene Mäuse mit Röntgenstrahlen von etwa 400 rem, unterdrückte ihre Immunreaktionen und träne-
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plantierte ihnen danach subkutan etablierte menschliche TALL-1-Zellen und fütterte die Mäuse auf übliche Weise 3 Wochen lang. Nach Isolierung und feinem Zerschneiden der massiven Tumoren, die subkutan auftraten, etwa 10 g pro Maus, trennte man die Tumorzellen gleich wie in Herstellungsbeispiel 1 auf. Die Zellen behandelte man gleich wie in Herstellungsbeispiel 3 und induzierte Interferon. Das induzierte Interferon reinigte man und engte es gleich wie in Herstellungsbeispiel 2 ein und erhielt ein Konzentrat mit einem Gehalt an Interferon.
Die Interferongesamtaktivität des Konzentrates betrug etwa 9 Millionen Einheiten pro Maus, wovon etwa 3 Millionen Einheiten Interferon-Typ II-Aktivität waren.
Herstellungsbeispiel 6:
Hamstern transplantierte man zuerst subkutan etablierte menschliche MOLT-3-Zellen gleich wie in Herstellungsbeispiel 3 ein, fütterte die Hamster auf übliche Weise 3 Wochen lang und vermehrte die Zellen. 10 Tage alten nackten Mäusen transplantierte man danach intraperitonal die vermehrten Zellen ein und fütterte die Mäuse auf übliche Weise weitere 5 Wochen lang. Die nackten Mäuse betäubte man und erntete ihre Ascites. Die erhaltenen Ascites zentrifugierte man und erntete die vermehrten Zellen. Die Zellen wusch man, behandelte sie gleich wie in Herstellungsbeispiel 1 und induzierte Interferon Typ II. Das induzierte Interferon Typ II reinigte man danach und engte es danach gleich wie in Herstellungsbeispiel 2 zu einem Konzentrat mit einem Gehalt an Interferon Typ II ein.
Die Interferon-Typ II-Aktivität des Konzentrats betrug etwa 500 000 Einheiten pro nackte Maus.
Herstellungsbeispiel 7:
Unter Verwendung einer zylindrischen Diffusionskammer aus Kunststoff mit zwischengesohalteten Membranfiltern einer Porengröße von 0,5 pm und einem Fassungsvermögen von ca. 10 ml suspen-
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dinrie nnn ntnbl i orte nmnr.chl i elm JBL-Zellen in phyniolo^iricher Kochsalzlösung. Die Kammern bettete man intraperitonal in erwachsene Ratten ein. Die Ratten fütterte man auf übliche Weise 4 Wochen lang und entfernte danach die Kammern. Die Konzentration an vermehrten menschlichen Zellen in den Kammern betrug etwa 5 x 10 Zellen/ml, was eine etwa 1000 mal höhere Zahl oder mehr ist, als jene, die man in vitro in einem Nährmedium unter Verwendung eines COg-Inkubators erzielte. Zu der Suspension der erhaltenen Zellen gab man MOLT-3-Zellen von Herstellungsbeispiel 6, so daß man eine Konzentration von etwa 20 Vol-$ erhielt, behandelte die Mischung gleich wie in Herstellungsbeispiel 1 und induzierte Interferon Typ 2. Das induzierte Interferon Typ II reinigte man und engte es zu einem Konzentrat mit einem Gehalt an Interferon Typ II ein, das man danach zu einem Pulver gefriertrocknete.
Die Interferon-Typ II-Aktivität des Pulvers betrug etwa 4 Millionen Einheiten pro Ratte.
Herstellungsbeispiel 8:
Etablierte menschliche NALL-1-Zellen transplantierte man in die Allantoishöhlungen von Eiern mit Embryonen, die man vorher bei 37 0C 5 d inkubiert hatte, und inkubierte die Eier bei dieser Temperatur weitere 7 d lang. Die Eier öffnete man und erntete die vermehrten menschlichen Zellen. Zu der Zellsuspension gab man das gleiche Volumen an TALL-1-Zellen von Herstellungsbeispiel 5» behandelte sie gleich wie in Herstellungsbeispiel 1 und induzierte Interferon Typ II. Das induzierte Interferon Typ II reinigte man und engte es gleich wie in Herstellungsbeispiel 2 ein und erhielt ein Konzentrat mit einem Gehalt an Interferon Typ II.
Die Interferon-Typ II-Aktivität des Konzentrates betrug etwa 300 000 Einheiten pro 10 Eier mit Embryonen.
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Heratellungsbeiapiel 9:
Ein Pulver, das man gemäß der Methode von Herstellungsbeispiel
1 hergestellt hatte, reinigte man weiter sorgfältig in einem pH-Bereich von 4 bis-9 mit üblichen Methoden, wie z.B. Adsorption und Desorption durch Ionenaustauscher, Fraktionieren nach dem Molekulargewicht durch Gelfiltration, Einengen und sorgfältiges Filtrieren, wie im Bericht von Bodo, "Symposium on Preparation, Standardization and Clinical Use of Interferon, 11th International Immunobiological Symposium, 8.+ 9. Juni 1977, Zagreb, Jugoslawien" beschrieben ist. Eine hoch gereinigte Interferonzubereitung mit einer spezifischen Aktivität von
2 χ 10 Einheiten/mg Protein erhielt man;und die Gesamtausbeute betrug etwa 40 $>.
Die Ergebnisse der nachstehenden Anwendungsversuche zeigen, daß das Interferon Typ II, das man gemäß den Methoden der genannten Beispiele erhalten hatte, allein, in Kombination mit Interferon Typ I oder in Mischungen mit einer oder mehreren anderen Substanzen als wirksames therapeutisches und/oder prophylaktisches Mittel, das man als Injektion oder Medikament zur äußeren oder inneren Verabreichung anwenden kann, für Krankheiten verwenden kann, die auf Interferon Typ II ansprechen.
Therapeutische und prophylaktische Wirkungen von Interferon Typ II auf Krankheiten, die auf Interferon ansprechen:
Anwendungsversuch 1: Therapie von Viruskrankheiten mit Interferon Typ II (Hemmungswirkung auf die VirusVermehrung in vitro):
Auf einzellige Schichten .von menschlichen Embryonenlungenzellen, die man durch Primärkultur in Petri-Schalen von 6 cm Durohmesser gebildet hatte, gab man 0,1, 1,0 bzw. 10,0 Einheiten Interferon Typ II, das man gemäß der Methode von Herstellungsbeispiel 9 erhalten hatte, and man inkubierte die
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erhaltenen Mischungen in einem Inkubator mit 5 Vol-# CO2 bei 37 °C 20 h lang. Zu den Zellen gab man Varicella-Zoster-Virus oder menschliches Cytomegalovirus in einer Menge, daß sich 100 Flecken in Abwesenheit von Interferon Typ II bildeten. Diese Mischungen inkubierte man und zählte die Anzahl der gebildeten Flecken.
Die Hemmungswirkung von Interferon Typ II auf die Virusvermehrung bestimmte man gemäß der nachstehenden Gleichung:
Verminderung der Fleckenzahl
worin A die Zahl der Flecken bedeutet, die sich in Abwesenheit von Interferon Typ II bildeten, und B die. Anzahl der Flecken bedeutet, die sich in Gegenwart von Interferon Typ II bildeten. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 gezeigt.
Tabelle 2
Interferon Typ II Varicella-Zoster- menschliches Cyto-
Virus megalovirus
0 Einheiten 0 i» 0 96
0,1 Einheiten 8 96 6 96
1,0 Einheiten 49 $> 54 %
10,0 Einheiten 88 $> 83 96
Wie aus den Ergebnissen von Tabelle 2 ersiohtlioh ist, hemmte das erfindungsgemäß verwendete Interferon Typ II wirksam die Vermehrung des Virus, das die Viruskrankheit verursachte. Beim Test verursachte eine Zugabe von Interferon Typ II keine Abnormalität in den menschlichen Zellen.
Anwendungsversuch 2: Therapie von nicht duroh Virus verursachten Krankheiten mit Interferon Typ II:
(1) Hemmung der Vermehrung von Tumorzellen in vitro: A Λ H - P271279
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Interferon Typ II, das man gemäß der Methode von Herstellungsbeispiel 9 hergestellt hatte, gab man zu einem RPMI-1640-Medium, das man mit 15 Vol-$ fetalem Rinderserum ergänzt hatte, und erhielt eine Endkonzentration von 5, 50 bzw. 500 Einheiten/ ml. In die Mischungen transplantierte man verschiedene Tumorzellen und erzielte eine Konzentration von 5 χ 10^ Zellen/ml. Die Mischungen inkubierte man danach in einem Inkubator mit 5 Vol-# CO2 bei 37 0C 5 d lang und zählte die Anzahl der Zellen pro ml Medium. Kontrollversuche führte man gleich wie die genannten Versuche mit der Ausnahme durch, daß man ein Interferon Typ II verwendete, das man vorher durch Erwärmen bei 100 0C 30 min lang inaktiviert hatte.
Die Hemmungswirkung von Interferon Typ II auf die Vermehrung von Tumorzellen bestimmte man gemäß der nachstehenden Gleichung:
Hemmung der Vermehrung der Tumorzellen
m (A- 5 x 105) - (B- 5 x 105) χ 100 (A - 5 x 10^)
worin A die Zahl der Zellen des Vergleichsversuche bedeutet und B die Zahl der Zellen des Versuchs mit Interferon Typ II bedeutet. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 gezeigt.
Tabelle 3
Konzentration an Interferon menschliche Tumorzellen
Typ II (Einheiten/ml) BAL^1 TAM,1 NALL,1 JEL
+17 7& +13 96 +19 96 +18 96
+55 96 +59 96 +61 96 +50 #
+84 96 +80 +86 96 +89 96
50 500
Aus den Ergebnissen von Tabelle 3 ist ersichtlich, daß Interferon Typ II, das man erfindungsgemäß verwendete, wirksam die Vermehrung der. Tumorzellen hemmte, wie z.B. der BALL-1-Zellen, TAIL-1-Zeilen, NALL-1-Zellen und JBL-Zellen, und über einen aktiven Konzentrationsbereich von 5 bis 500 Einheiten/ml wirksam war.
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(2) Hemmung der Vermehrung der Tumorzellen in vivo:
Den Test führte man mit 8 nackten Mäusen aus, die etwa 2 Monate alt waren.
TALL-1-Zellen transplantierte man subkutan in alle 8 nackten Mäuse in einer Menge von 7,5 x 10 Zellen pro nackte Maus. Ab dem zweiten Tag nach der Transplantation gab man 4 nackten Mäusen drei intraperitonale Injektionen von 1000 Einheiten Interferon Typ II, das man gemäß der Methode von Herstellungsbeispiel 6 hergestellt hatte, pro Woche, insgesamt 20 Injektionen. 48 Tage später tötete man die nackten Mäuse und wog die Feuchtgewichte (wet weights) der aufgetretenen massiven Tumoren. Einen Vergleichsversuch führte man mit den übrigen vier nackten Mäusen gleich wie im genannten Versuch mit der Ausnahme durch, daß β ie kein Interferon Typ II erhielten.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 gezeigt:
Tabelle 4
Versuch Nr. Vergleichsversuch (g) mit Interferon
Typ II behandelte nackte Maus (g)
1 5,6 1,3
2 4,5 0,8
3 9,0 0
4 6,3 0
Durchschnittsgewicht 6,3 0,5
(3) Hemmung der Vermehrung von Tumorzellen in vivo:
Den Test führte man mit 8 nackten Mäusen aus, die etwa 2 Monate alt waren.
JBL-Tumorzellen transplantierte man subkutan In alle 8 naokten A & H - P271279 fJ3003i/Ö?U
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Mäuse in einer Menge von 1 χ 10 Zellen pro nackte Maus.
Ab der zweiten Woche nach der Transplantation verabreichte man 4 nackten Mäusen zwei intraperitonale Injektionen von 1000 Einheiten Interferon Typ II, das man gemäß der Methode von Herstellungsbeispiel 2 hergestellt hatte, pro Woche-, insgesamt 8 Injektionen. 42 Tage später tötete man die nackten Mäuse und wog die Feuchtgewichte der aufgetreteten massiven Tumoren. Einen Vergleichsversuch führte man mit den restlichen vier nackten Mäusen gleich wie im genannten Versuch mit der Ausnahme durch, daß die Mäuse kein Interferon Typ II erhielten. Die Ergebnisse sind in Tabelle 5 gezeigt.
Tabelle 5
Versuch Nr. Vergleichsversuch (g) mit Interferon Typ II
behandelte nackte Maus (g)
1 4,7 0,5
2 6,2 0,5
3 15,3 0,5
4 16,9 0,8
Durchschnittsgewicht 10,8 0,6
Wie aus den Ergebnissen der Tabellen 4 und 5 ersichtlich ist, hemmte die Injektion von Interferon Typ II die Tumorbildung und hemmte ferner außerordentlich seine Entwicklung, selbst wenn er auftrat; die Feuchtgewichte der aufgetretenen massiven Tumoren bei den mit Interferon Typ II behandelten nackten Mäusen waren viel geringer alB jene der Vergleichsversuche. Ferner zeigten die mit Interferon Typ II behandelten nackten Mäuse einen besseren Appetit und waren viel aktiver als die der Vergleichsversuche.
Test auf akute Toxizität:
Den Test auf akute Toxizität der Zubereitung mit Interferon Typ II, das man gemäß der Methode von Herstellungsbeispiel 9 hergestellt hatte, führte man mit 20 Tage alten Hausen duroh
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und zeigte, daß die Toxizität dieser Zubereitungen mit Interferon Typ II extrem niedrig war: Der LD50-Wert betrug 20 Millionen Einheiten oder mehr pro kg im Fall der intraperitonalen Injektion.
Wie aus den genannten Versuchen ersichtlich ist,sind die Krankheiten, die auf Interferon Typ II ansprechen und auf die hier Bezug genommen wird, jene, die man mit dem Interferon behandeln und verhüten kann, das man erfindungsgemäß hergestellt hat; z.B. Viruskrankheiten, beispielsweise epidemische Keratokonjunktivitis, herpesartige Keratitis, Grippe, Röteln und Serumhepatitis; und nicht durch Viren verursachte Krankheiten, z.B. Leukämie und Osteosarkom.
Die therapeutischen und prophylaktischen Mittel mit einem Gehalt an Interferon Typ II, die man gegen die genannten Krankheiten anwenden kann, die auf Interferon Typ II ansprechen, kann man in verschiedenen Formen und Phasen entsprechend der Anwendungsweise herstellen, z.B. als flüssige Zubereitungen für Nebel, Augenwasser, Nasentropfen, Gurgelmittel und Injektionsmittel; pastöse Zubereitungen, wie z.B. Salben; und feste Zubereitungen als Pulver, Granulat und Tabletten. Die Mittel sind ausreichend wirksam, wenn der Gehalt an Interferon Typ II 1 bis 10 000 000 Einheiten/g beträgt, und man kann es gegebenenfalls in Kombination oder als Mischung mit einer oder mehreren anderen Substanzen verwenden, z.B. mit einem therapeutischen Mittel, Trägerstoff, Füllstoff oder Stabilisator.
Da insbesondere Interferon nach intravenöser Injektion leicht aus dem Blut innerhalb von 10 min entfernt wird und aus dem System ausgeschieden wird, erzielt man durch Verabreichung als Instillatio bzw. durch Eintropfen von Interferon, beispielsweise durch Einarbeiten von Interferon in Zuckerergänzungslösungen für Instillatio (sugar supplement solution) eine Maßnahme zur Verlängerung der Verabreichungszeit, so daß man eine volle und wirksame Ausnützung des eingetropften Interferons erzielt und weiter die therapeutische und prophy-
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laktische Wirkung von Interferon auf Krankheiten verbessert, die auf Interferon ansprechen.
Nachstehend sind mehrere Ausführungsformen für Zubereitungen mit einem Gehalt an Jnterferon Typ II gemäß der Erfindung näher erläutert.
Zubereitungsbeispiel 1: Flüssige Zubereitung
Eine flüssige Zubereitung stellte man her, indem man ein Pulver mit einem Gehalt an Interferon Typ II, welches man gemäß der Methode von Herstellungsbeispiel 1 hergestellt hatte, in einer physiologischen Kochsalzlösung in einer Menge von etwa 500 Einheiten/ml auflöste.
Die Zubereitung war als Nebel, Augenwasser, Nasentropfen und Gurgelmittel zur Behandlung und Vorbeugung von Viruskrankheiten geeignet; insbesondere von epidemisoher Keratooonjunktivitie und Grippe.
Zubereitungsbeispiel 2: Injektion
Eine Injektionslösung stellte man her, indem man das Interferon Typ II, das man gemäß der Methode von Hersteilungsbeispiel 9 hergestellt hatte, in physiologischer Kochsalzlösung in einer Menge von etwa 100 000 Einheiten/ ml auflöste.
Die Injektionslösung war zur Behandlung und Vorbeugung von Krankheiten geeignet, die auf Interferon Typ II anspreohen, einschließlich von Virus- und Tumorkrankheiten bzw. tumorartigen Krankheiten.
Zubereitungsbeispiel 3: Zucker-Ergänzungslösung zur Injektion
Eine Zucker-Ergänzungslösung zur Injektion für intravenöse Instillatio stellte man her, indem man 1 Million Einheiten einer Interferonzubereitung mit einem Gehalt an Interferonen
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Typ I und Typ II, die man beide gemäß der Methode von Herstellungsbeispiel 5 hergestellt hatte, und 100 mg Cyclophosphamid in 500 ml einer wässerigen Maltoselösung (10 $> Gewicht/Volumen) mischte.
Die Zucker-Ergänzungslösung zur Injektion war als lösung für kontinuierliche intravenöse Infusion zur Behandlung und Vorbeugung von tumorartigen Krankheiten bzw. Tumorkranicheiten geeignet.
Zubereitungsbeispiel 4: Injektionslösung
Eine Injektionslösung stellte man her, indem man 500 000 Einheiten einer Interferonzubereitung mit einem Gehalt an Interr feronen vom Typ I und Typ II, die man gemäß der Methode von Herstellungsbeispiel 2 hergestellt hatte, und 2 mg Mitomycin C in 100 ml einer wässerigen Maltoselösung (10 $> Gewicht/Volumen) löste.
Die Injektionslösung war zur Behandlung und Vorbeugung von Tumorkrankheiten bzw. tumorartigen Krankheiten geeignet.
Zubereitungsbeispiel 5: Salbe
Eine Salbe stellte man gemäß der üblichen Methode her, indem man das Pulver, das man gemäß der Methode von Herstellungsbeispiel 4 hergestellt hatte, flüssiges Paraffin und Vaseline mischte und eine Interferon-Typ II-Aktivität von 10 000 Einheiten/g erzielte.
Die Salbe war zur Behandlung von Virus-Hautkrankheiten geeignet. Zubereitungsbeispiel 6: Tabletten
Tabletten stellte man gemäß der üblichen Methode her, indem man eine Mischung des Pulvers mit einem Gehalt an Interferon Typ II, das man gemäß der Methode von Herstellungsbeleplel 7 hergestellt hatte, Stärke und Maltose tablettierte und «Ine
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Interferon-Typ II-Aktivität von etwa 1000 Einheiten/Tablette (etwa 100 mg) erzielte.
Die Tabletten waren zur Behandlung und Vorbeugung von Viruskranlcheiten geeignet, die im Verdauungssystem auftreten.
Zubereitungsbeispiel 7: PlUsöige Zubereitung
Eine flüssige Zubereitung zur oralen Verabreichung stellte
man her, indem man 5 mg Methotrexat und das Konzentrat mit
einer Interferon-Typ II-Aktivität von 200 000 Einheiten, das man gemäß der Methode von Herstellungsbeispiel 8 hergestellt hatte, in 10 ml einer wässerigen Maltoselösung (10 ^ Gewioht/ Volumen) auflöste.
Die Zubereitung war zur Behandlung und Vorbeugung von tumorartigen Krankheiten bzw. Tumorkrankheiten geeignet.
Die Offenbarling umfaßt auch den korrespondierenden englischen Text.
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Claims (14)

Patentansprüche
1. Verfahren zur Herstellung von Interferon Typ II, dadurch ge kennzeichnet , daß man Interferon Typ II erzeugende etablierte menschliche Zellen in den Körper eines anderen warmblütigen Tiers transplantiert oder die Zellen in ein Kulturmedium einimpft, das man in eine Diffusionskammer eingesetzt hat, die mit zwischengeschalteten Filtermembranen versehen ist und derart ausgebildet und in oder an den Tierkörper angepaßt ist, daß die Zellen auf seiner nährenden Körperflüssigkeit wachsen können; daß man die transplantierten oder eingeimpften Zellen in dem Körper des warmblütigen Tieres oder in der Diffusionskammer unter Verwendung von dessen Körperflüssigkeit vermehrt, die vermehrten menschlichen Zellen der Wirkung eines Interferon-Typ II-Auslösers in vivo oder in vitro aussetzt, Interferon Typ II induziert und das induzierte Interferon Typ II reinigt und abtrennt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man menschliche Lymphoblasten-Zellinien oder menschliche lymphoblastartige Zellstämme als etablierte menschliche Zellen verwendet, die Interferon Typ II erzeugen.
3. Verfahren naoh Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als etablierte menschliche Zellen, die Interferon Typ II erzeugen, HPB-AI.I-Zeilen, MOIT-3-Zeilen, P12/Ichikawa-Zellen, HPB-MLT-Zellen, P 8/Seki-Zellen, HCI-Zellen, P 1O/Shibata-Zellen,Namalva-Zellen, BAIL-1-Zellen, TAIL-1-Zellen, NALL-1-Zellen oder JBI-Zeilen verwendet.
4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man mehr als eine Art von etablierten menschlichen Zellen verwendet.
5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man Säugetiere als warmblütige Tiere verwendet.
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6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß man Hunde, Katzen, Affen, Schweine, Rinder, Pferde, Ziegen, Kaninchen, Meerschweinchen, Hatten, Hamster, Mäuse und/oder nackte Mäuse als Säugetiere verwendet.
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7. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, daduroh gekennzeichnet, daß man eine Diffusionskammer verwendet, die zwischengeschaltete Filtermembranen mit einer Porengröße von etwa 10 ' bis 10 J m aufweist.
8. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, daduroh gekennzeichnet, daß man Auslöser für Interferon Typ I und Interferon Typ II kombiniert verwendet.
9. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüohe, daduroh gekennzeichnet, daß man die Suspension der vermehrten menschlichen Zellen der Wirkung eines Interferoneualösers bei einer Konzentration des Interferonauslösers von etwa 0,001 Jig/ml bis 10 mg/ml aussetzt.
10. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, daduroh gekennzeichnet, daß man die vermehrten menschlichen Zellen der Wirkung eines Interferonauslösers bei einer Temperatur von etwa 20 bis 40 0O aussetzt.
11. Zubereitungen zur Behandlung und/oder Vorbeugung von Krankheiten, die auf Interferon Typ II ansprechen, gekennzeichnet durch einen Gehalt an Interferon Typ II, das man mit dem Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüohe hergestellt hat, neben üblichen Hilfe- und Trägerstoffen.
12. Zubereitungennach. Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß sie zusätzlich Interferon Typ I enthalten.
13. Zubereitungen nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß sie Interferon Typ II in einer Menge von 1 bis 10 000 000 Einheiten/g enthalten«
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14. Zubereitungen nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß sie die Form von flüssigen Zubereitungen, Injektionslösungen, Salben oder Tabletten aufweisen.
15- Zubereitungen nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß sie zur Behandlung und/oder Vorbeugung von tumorartigen Viruskrankheiten geeignet sind.
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