DE3008082C2

DE3008082C2 -

Info

Publication number: DE3008082C2
Application number: DE3008082A
Authority: DE
Inventors: Yutaka Kodama; Kaoru Oyama; Ryusaku Shimizu; Masao Nakabayashi; Yoshifumi Nakashima; Takashi Sano; Masaaki Shibata; Kiyoshi Goden
Original assignee: Toyama Chemical Co Ltd
Current assignee: Toyama Chemical Co Ltd
Priority date: 1979-03-05
Filing date: 1980-03-03
Publication date: 1988-02-11
Also published as: GB2046092B; CA1145260A; GB2046092A; US4372949A; IT1145357B; FR2450608A1; SE8001685L; SE459228B; FR2450608B1; DE3008082A1; IT8048066A0; NL8001292A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein carcinostatisches und die Immunreaktion stimulierendes Mittel, welches ein Lysophospholipid und ein Phospholipid enthält.

Lysophospholipide haben eine ausgezeichnete carcinostatische und die Immunreaktion stimulierende Aktivität (s. beispielsweise FR-PS 23 64 656). Trotz ihrer hervorragenden Wirksamkeit konnten jedoch bisher Lysophospholipide nicht als Arzneimittel verwendet werden, da ihre hämolytische Aktivität zu groß ist. Die Lysophospholipide verbinden sich außerdem fest mit Serumproteinen (hauptsächlich Albumin), wobei sie inaktiviert werden und wodurch sich die carcinostatische und die Immunreaktion stimulierende Wirksamkeit verringert.

Andererseits war es aus der DE-OS 26 01 207 bekannt, daß man beliebige Arzneimittel in Phospholipidkügelchen (Vesikel) einschließen kann. Diese Druckschrift beschreibt ferner Verfahren zur Herstellung derartiger Vesikel.

Der vorliegenden Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, bei einem carcinostatischen und die Immunreaktion stimulierenden Mittel mit einem Gehalt an Lysophospholipid die Hämolysewirkung des Lysophospholipids zurückzudrängen, ohne dessen carcinostatischen und die Immunreaktion stimulierenden Effekt zu beeinträchtigen. Das Mittel soll mit großer Sicherheit angewendet werden können und soll selbst bei kontinuierlicher parenteraler Verabreichung keine vaskulären Schwierigkeiten verursachen, und es soll auch in Gegenwart von Serumproteinen keine Verringerung der Wirksamkeit des Mittels eintreten.

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst durch eine carcinostatisches und die Immunreaktion stimulierendes Mittel, enthaltend ein Lysophospholipid der Formel

wobei R¹ eine C_5-22-Acyloxygruppe oder eine C_5-22-Alkoxygruppe bedeutet; R² ein Wasserstoffatom oder eine Hydroxylgruppe, eine C_1-5-Acyloxy- oder C_1-5-Alkoxygruppe bedeutet, und R³ für ein Wasserstoffatom oder eine C_1-5- Alkylgruppe steht, wobei R¹ und R² gegeneinander austauschbar sind, und ein Phospholipid, in Form von Lipidvesikeln, wobei die Lipidvesikel eine Teilchengröße von nicht mehr als 1,0 µm aufweisen.

Vorzugsweise ist die Teilchengröße der in Form von Mizellen oder Lipidvesikeln vorliegenden dispergierten Teilchen nicht größer als 0,5 µm. Sofern das Lysophospholipid in Form von Mizellen oder Lipidvesikeln dispergiert vorliegt, beeinflußt die Addition von Serumproteinen (Albumin) zu der Dispersion in keiner Weise die carcinostatische und die Immunreaktion stimulierende Wirkung der Lysophospholipide.

Das erfindungsgemäß verwendete Phospholipid kann aus Naturprodukten, wie Eigelb, Sojabohnen, Baumwollsamen, Rübsamen, Mais, Erdnüssen usw., erhalten worden sein oder es kann sich um ein rein synthetisches Phospholipid handeln. Bei einem Phospholipid, das einen ungesättigten Fettsäurerest aufweist, kann dieses auch durch ein geeignetes Verfahren, wie z. B. eine Hydrierung, in einem Typ mit gesättigtem Fettsäurerest umgewandelt werden. Als Beispiele für das Phospholipid seien folgende genannt: Lecithin, Phosphatidyl-äthanolamin, Phosphatdylserin, Sphingomyelin, Phosphatidylinosit und Phosphatidsäure; diese Substanzen können entweder einzeln oder als Mischung verwendet werden. Vorzugsweise wird Lecithin verwendet, das aus einem Naturprodukt, insbesondere Eigelb, erhalten wurde.

Erfindungsgemäß brauchbare Lysophospholipide umfassen beispielsweise Glycerophospholipide (Phosphoglyceride), bei denen nur eine Fettsäure entfernt wurde, wie z. B. Lysolecithin, Lysokephalin, Lysoplasmalogen, Lysophosphatidsäure, Lysophosphatidylinosit, sowie Verbindungen der folgenden allgemeinen Formel

wobei R¹ eine C_5-22-Acyloxy- oder C_5-22-Alkoxygruppe bedeutet, R² ein Wasserstoffatom oder eine Hydroxyl-, C_1-5-Acyloxy- oder C_1-5-Alkoxygruppe bedeutet und R³ für ein Wasserstoffatom oder eine C_1-5-Alkylgruppe steht, und wobei R¹ und R² gegeneinander austauschbar sind. Diese Lysophospholipide können aus Naturprodukten, z. B. Schweinehirn, erhalten worden sein oder sie können enzymatisch oder durch chemische Synthese aus den Phospholipiden erhalten worden sein. Als Beispiele für die C_5-22-Acyloxygruppen, für die R¹ in der Formel (I) steht, seien C_5-22- Alkanoyloxy- oder C_5-22-Alkenoyloxygruppen genannt. Bevorzugte Beispiele für die Lysophospholipide, die erfindungsgemäß verwendet werden, sind Lysolecithin mit einer C_14-18-Alkanoyloxy- oder C_14-18-Alkenoyloxygruppe und Lysolecithine vom Äthertyp [eine Verbindung der Formel (I), bei der R¹ eine Octadecyloxygruppe, R² eine Methoxygruppe und R³ eine Methylgruppe bedeutet).

Die erfindungsgemäß verwendeten Phospholipide und Lysophospholipide kommen gewöhnlich in D-, L- oder DL-Formen vor, und es kann irgendeine dieser Formen verwendet werden, wenn auch die L-Form besonders bevorzugt ist.

Das Mischungsverhältnis von Phospholipid zu Lysophospholipid in dem erfindungsgemäßen carcinostatischen und die Immunreaktion stimulierenden Mittel kann vorzugsweise in dem Bereich von 1,0 bis 500 : 1, bevorzugt 5 bis 20 : 1, (Gewichtsverhältnis) liegen.

Das erfindungsgemäße Mittel der oben erwähnten Zusammensetzung kann außerdem ein Fett und Öl enthalten. Erfindungsgemäß kann irgendein bekannter Fett- oder Öltyp verwendet werden, vorausgesetzt, daß es sich um pharmazeutisch akzeptable Typen handelt. Es ist jedoch erwünscht, ein eßbares Öl, wie z. B. Baumwollsaatöl, Sojabohnenöl, Maisöl, Kokosnußöl, Rübsamenöl, Sesamöl oder Erdnußöl, zu verwenden. In diesem Fall kann das Mischungsverhältnis von Lysophospholipid, Phospholipid und Fett und Öl vorzugsweise derart sein, daß pro 1 Gew.-Teil Lysophospholipid die Mengen an Phospholipid und Fett und Öl 1,0 bis 500 Gew.-Teile bzw. nicht mehr als 200 Gew.-Teile betragen, und besonders bevorzugt derart sein, daß sie 5 bis 20 Gew.-Teile bzw. nicht mehr als 20 Gew.-Teile betragen.

Die für das erfindungsgemäße carcinostatische und die Immunreaktion stimulierende Mittel brauchbaren Fettemulsionen umfassen solche, die aus 0,1 bis 50 Gew.-Teilen eines Emulgiermittels, wie z. B. dem genannten Phospholipid, und 5,0 bis 200 Gew.-Teilen Wasser/10 Gew.-Teile eines Fetts und Öls zusammengesetzt sind. Als bevorzugte Beispiele derartiger Fettemulsionen seinen Intrafat oder Intralipid (beides eingetragene Warenzeichen) genannt, die aus 10 Gew.-Teilen Sojabohnenöl, 1,2 Gew.-Teilen Eigelbphospholipid, 86,3 Gew.-Teilen Wasser und 2,5 Gew.- Teilen konz. Glycerin, welches ein isotonisches Mittel ist, bestehen. Es seien weiter genannt: Fatgen (eingetragenes Warenzeichen), Lipofundin-S (Warenzeichen), Lipihysan (Warenzeichen). In diesem Fall kann das Mischungsverhältnis von Lysophospholipid zu der Fettemulsion so sein, daß das Lysophospholipid in einer Menge von 0,1 bis 50 mg/1 ml Fettemulsion enthalten ist. Vorzugsweise enthält die Zusammensetzung das Lysophospholipid in einer Menge von 1 bis 10 mg/1 ml Fettemulsion, welche 5 bis 30 Gew.-% Lipid enthält.

Falls das carcinostatische und die Immunreaktion stimulierende Mittel gemäß der vorliegenden Erfindung Lysophospholipid, Phospholipid und die oben erwähnte Fettemulsion umfaßt, kann die Menge der Fettemulsion so sein, daß sie nicht mehr als 5000 ml/1mg Lysophospholipid der Mischung aus Lysophospholipid und Phospholipid ausmacht.

Das erfindungsgemäße Mittel kann zusätzlich zu den genannten Bestandteilen andere Zusatzstoffe enthalten, die herkömmlicherweise bei medizinischen Präparationen verwendet werden, z. B. isotonische Mittel, wie z. B. Glycerin, Sorbit, Xylit, Natriumchlorid, Dextrose oder dergl.; Antioxidantien, wie Vitamin A, Vitamin E oder dergl.; Cholesterin; Stearylamin; Dicetylphosphat; Dextran; Methionin; Glutathion; oder dergl., je nach Anwendungszweck. Das Mittel kann auch eine isotonische Lösung, wie Wasser, eine 5%ige Dextroselösung, eine physiologische Salzlösung oder dergl., enthalten. Die Verwendung und das Vermischen der Bestandteile kann auf irgendeine herkömmliche Weise durchgeführt werden.

Im folgenden werden die pharmakologischen Effekte des erfindungsgemäßen carcinostatischen und die Immunreaktion stimulierenden Mittels beschrieben.

(A) Hämolyse

Die Hämolyse wird auf folgende Weise bestimmt. Eine Suspension von Kaninchenerythrocyten und der zu untersuchenden Lösung werden vermischt und 1 h bei 37°C geschüttelt. Dann wird die optische Dichte (im folgenden als O. D. bezeichnet) bei 550 mµ des Überstehenden der zentrifugierten Lösung gemessen. Die optische Dichte zur Zeit der perfekten Hämolyse mit destilliertem Wasser wird als 100% angegeben, und die Dichte der Testverbindung bei 50% Hämolyse wird als Index zur Anzeige des Hämolysegrads dargestellt. Falls O. D. unmeßbar ist, wird die Hämolyse mit bloßem Auge bewertet und durch die Zeichen (+) und (-) ausgedrückt. Die Ergebnisse sind in den Tabellen 1 und 2 zusammengestellt.

Tabelle 1

Tabelle 2

Beziehung zwischen Hämolyse und Konzentrationen von Fettemulsion und L-Lysolecithin

(B) Minimale Hemmkonzentration bei Krebszellen (MIC)

Unter Verwendung von Hela S-3 Stamm und Ehrlich′s Ascites- Tumorzellen, jede mit einer Population von 2 × 10⁴ Zellen/ ml, wird bei jeder Testverbindung die Antitumorwirkung bestimmt. Dabei werden folgenden Bedingungen angewendet:

(1) Kulturmedium: Eagle′s MEM + 20% Rinderembryonenserum;
(2) Kultivierungsdauer: 96 h;
(3) Mikroplattenassay: von 5000 µg/ml in 12 Stufen nach unten verdünnt;
(4) Bewertungsverfahren: Die Konzentration der Testverbindung, bei der das Wachstums von Zellen gemäß Giemsa′s Fleckenbildung um mehr als 50% inhibiert wird, wird als MIC-Wert angegeben.

Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 zusammengestellt.

Tabelle 3

(C) Prä-Verabreichungswirkung gegenüber L-1210 (L-1210 Allograft)

Jede Testverbindung wird wiederholt intraperitoneal Mäusen vom ddN-Stamm (männlich, 6 Wochen alt) über einen Zeitraum von 7 Tagen verabreicht. Nach einer eine Woche dauernden Nichtbehandlungsperiode werden den Mäusen 1 × 10⁶ L-1210 leukämische Zellen intraperitoneal eingeimpft und die durchschnittliche Zahl der Überlebenstage der Testtiere wird bestimmt. Die Ergebnisse sind in den Tabellen 4 und 5 zusammengestellt.

Tabelle 4

(Jede Testverbindung wird in der Weise verabreicht, daß die Menge an L-Lysolecithin 40 mg/kg beträgt.)

Tabelle 5

Zusammensetzung der Fettemulsion:

Sojabohnenöl10 Glycerin 2,5 Eigelbphospholipid 1,2 Wasser86,3

(D) Hemmwirkung auf Metastasen des Lewis-Lungenkrebses

1×10⁶ Lewis-Lungenkrebszellen werden intravenös BDF₁- Stamm Mäusen (weiblich, 13 Wochen alt) appliziert. Nach 24 h wird L-Lysolecithin (40 mg/kg) intraperitoneal verabreicht, während gleichzeitig eine Mischung aus einer Fettemulsion (20 ml/kg) und L-Lysolecithin (40 mg/kg) intravenös verabreicht wird. Das Verfahren wird jeweils während eines Zeitraums von 10 Tagen wiederholt durchgeführt. Am 11. Tag wird die Brust jeder Testmaus aufgeschnitten und das Trockengewicht der Lunge (mg mittel ± S. E.) wird bestimmt. Der Hemmeffekt wird anhand des Verhältnisses (T/C) zu der Kontrollgruppe bewertet. Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle 6 zusammengestellt.

Tabelle 6

(E) Heilwirkung bei Ehrlich′s Ascitestumor

Ehrlich′s Ascitestumorzellen werden intraperitoneal Mäusen vom ddN-Stamm (weiblich, 6 Wochen alt) eingeimpft. 24 h nach der Impfung wird jede Testverbindung wiederholt intraperitoneal (i. p.) über einen Zeitraum von 7 Tagen oder intravenös (i. v.) über einen Zeitraum von 13 Tagen verabreicht. Es werden die lebensverlängernde Wirkung und der tumorheilende Effekt untersucht. Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle 7 zusammengestellt.

Tabelle 7

(F) Wirkung bei P-388 Leukämiezellen

0,5 ml einer Dispersion der Testverbindung Nr. 1 und 5 × 10⁶ P-388 Leukämiezellen werden gemischt und 1 h bei 37°C geschüttelt. Danach wird sichergestellt (mittels Trypanblau-Fleckenbildung), daß keine Zerstörung der P- 388 Leukämiezellen stattgefunden hat. 0,2 ml der geschüttelten Lösung werden dann Mäusen vom BDF₁-Stamm (weiblich, 12 Wochen alt) intraperitoneal eingeimpft und der lebensverlängernde Effekt der Verbindung wird untersucht. Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle 8 zusammengestellt.

Tabelle 8

(G) Akute Toxizität

Die Ergebnisse der Bestimmung der akuten Toxizität einiger typischer erfindungsgemäß hergestellter Mittel sind in Tabelle 9 zusammengestellt.
Testverbindung Nr.LD₅₀ (mg/kg)

L-Lysolecithin 122 8*) 188***) 9**)< 600***)

(Untersuchungstier: Maus, weiblich, intravenöse Injektion)
Bemerkungen:

*)in Herstellungsbeispiel 9 hergestellte Verbindung **)in Herstellungsbeispiel 5 hergestellte Verbindung ***)Menge an L-Lysolecithin in dem Mittel.

Aus den Tabellen 1 bis 9 geht hervor, daß das erfindungsgemäße carcinostatische und die Immunreaktion stimulierende Mittel eine bemerkenswert reduzierte Hämolysewirkung aufweist, während gleichzeitig die besonderen carcinostatischen und die Immunreaktion stimulierenden Effekte des Lysophospholipids erhalten bleiben. Das Mittel bietet also bei seiner Verwendung ein hohes Maß an Sicherheit.

Versuchsbericht 1

Es werden carcinostatische und die Immunreaktion stimulierende Effekte verschiedener Mittel untersucht, welche verschiedene Lysophospholipide und verschiedene Phospholipide umfassen.

Herstellung der verwendeten Testverbindungen

1) 1,8 g Eigelblecithin und 200 mg 1-Decanoyl-3-DL-glycerylphosphorylcholin werden zu 18 ml einer 5%igen Dextroselösung für Injektionszwecke gegeben. Das Gemisch wird mittels eines Hochgeschwindigkeitsmischers homogenisiert. Die resultierende Dispersion wird einer Ultraschallbehandlung (Apparat: Typ 200 M (Kubota Co. Ltd.); 200 W) während eines Zeitraums von 3 Stunden unterworfen und anschließend unter Druck (etwa 0,2 kg/cm²) unter Verwendung eines Membranfilters aus Celluloseacetat mit einer Maschengröße von 0,3 µ filtriert. Das resultierende Filtrat (18 ml) wird weiter einer Sterilisationsbehandlung unterworfen und auf Ampullen für intravenöse Injektion aufgeteilt.

2) 1,8 g Eigelblecithin und 200 mg 1-Eicosanoyl- 3-DL-glycerylphosphorylcholin werden zu 18 ml einer 5%igen Dextroselösung für Injektionszwecke gegeben. Das Gemisch wird mittels eines Hochgeschwindigkeitsmischers homogenisiert. Die resultierende Dispersion wird einer Ultraschallbehandlung (Apparat: Typ 200 M (Kubota Co., Ltd.); 200 W) während eines Zeitraums von 3 Stunden unterworfen und anschließend unter Druck (etwa 0,2 kg/cm²) unter Verwendung eines Membranfilters aus Celluloseacetat mit einer Maschengröße von 0,3 µ filtriert. Das resultierende Filtrat (18 ml) wird weiter der Sterilisationsbehandlung unterworfen und auf Ampullen für intravenöse Injektionen aufgeteilt.

3) 1,8 g Eigelblecithin und 200 mg 2-Methyl-1-octadecyl- 3-DL-glycerylphosphorlycholin werden zu 18 ml einer 5%igen Dextroselösung für Injektionszwecke gegeben. Das Gemisch wird mittels eines Hochgeschwindigkeitsmischers homogenisiert. Die resultierende Dispersion wird einer Ultraschallbehandlung (Apparat: Typ 200 M (Kubota Co., Ltd); 200 W) während eines Zeitraums von 3 Stunden unterworfen und anschließend unter Druck (etwa 0,2 kg/cm²) unter Verwendung eines Membranfilters aus Celluloseacetat mit einer Maschengröße von 0,3 µ filtriert. Das resultierende Filtrat (18 ml) wird weiter einer Sterilisationsbehandlung unterworfen und auf Ampullen für intravenöse Injektionen aufgeteilt.

4) 1,8 g Eigelblecithin und 200 mg 1-Myristoyl- 3-DL-glycerylphosphorylcholin werden zu 18 ml einer 5%igen Dextroselösung für Injektionszwecke gegeben und das Gemisch wird mittels eines Hochgeschwindigkeitsmischers homogenisiert. Die resultierende Dispersion wird einer Ultraschallbehandlung (Apparat: Typ 200 M (Kubota Co., Ltd.); 200 W) während eines Zeitraums von 3 Stunden unterworfen und anschließend unter Druck (etwa 0,2 kg/cm²) unter Verwendung eines Membranfilters aus Celluloseacetat mit einer Maschengröße von 0,3 µ filtriert. Das resultierende Filtrat (18 ml) wird ferner einer Sterilisationsbehandlung unterworfen und auf Ampullen für intravenöse Injektionen aufgeteilt.

5.) 1,8 g Eigelblecithin und 200 g 1-Palmitoyl- 3-DL-glycerylphosphorylcholin werden zu 18 ml einer 5%igen Dextroselösung für Injektionszwecke gegeben und das Gemisch wird mittels eines Hochgeschwindigkeitsmischers homogenisiert. Die resultierende Dispersion wird einer Ultraschallbehandlung unterworfen (Apparat: Typ 200 M (Kubota Co., Ltd.); 200 W) und zwar während eines Zeitraums von 3 Stunden und anschließend unter Druck (etwa 0,2 kg/cm²) unter Verwendung eines Membranfilters aus Celluloseacetat mit einer Maschengröße von 0,3 µ filtriert. Das resultierende Filtrat (18 ml) wird ferner einer Sterilisationsbehandlung unterworfen und auf Ampullen für intravernöse Injektionen aufgeteilt.

II. Verfahren und Ergebnisse der pharmakologischen Tests Test zur Bestimmung der hämolytischen Aktivität

Eine Suspension von Kaninchenerythrozyten und der zu untersuchenden Verbindung werden vermischt und bei 37°C 1 Stunde geschüttelt. Die optische Dichte (im folgenden als O. D. bezeichnet) bei 550 mµ der überstehenden Flüssigkeit der zentrifugierten Lösung wird bestimmt. Die O. D. zum Zeitpunkt der vollständigen Hämolyse mit destilliertem Wasser wird als 100% angegeben. Die erhaltenen Ergebnisse sind in den Tabellen 10 und 11 zusammengestellt.

Tabelle 10

Tabelle 11

2) Minimale Hemmkonzentration bei Krebszellen (MIC)

Unter Verwendung der Hela S-3 Stamm-Krebszellen mit einer Population von 2 × 10⁴ Zellen/ml wird bei jeder der Testverbindungen der Antitumoreffekt bestimmt. Dabei werden folgende Bedingungen angewendet:

(a)Kulturmedium: Eagle′s MEM + 20% Rinderembryonenserum. (b)Kultivierungsdauer: 96 Stunden. (c)Mikroplattenessay: Vom 5000 µg/ml in 12 Stufen nach unten verdünnt. (d)Wertungsverfahren: Die Konzentration der Testverbindung, bei der das Wachstum von Zellen gemäß Giemsa′s Fleckenbildung um mehr als 50% inhibiert wird, wird als MIC Wert angegeben.

Die MIC Verhältnisse der oben erwähnten Testverbindungen, bestimmt auf die oben erwähnte Weise, sind in der Tabelle 12 angegeben.
Testverbindung Nr./Testverbindung Nr.MIC Verhältnis

4/12 5/22 6/32 9/71 10/81

Wirksamkeit hinsichtlich der Stimulierung der Immunreaktion Carbon Clearance Test

Es werden fünf Mäuse (ddY Stamm) pro Gruppe verwendet und die Testverbindung wird intravenös verabreicht, und zwar in einer Menge von 0,2/20 g einmal am Tag während 7 Tagen. 24 Stunden nach der Verabreichung wird 1 ml einer schwarzen Zeichentinte, hergestellt von Retrlag (Art. 59107) mit 4 ml einer Kochsalzlösung, welche 5% Gelatine enthält, zur Herstellung einer Kohlenstoffsuspension vermischt. Diese Suspension wird den Mäusen am Schwanz intravenös injiziert und zwar in einer Menge von 0,2 ml/20 g. 2,7 Minuten und 12 Minuten nach der Injektion werden jeweils 0,02 ml Blut als Probe genommen, und zwar aus einer Orbita mit einer heparinbeschichteten Hämatoritkapillare. Das Blut wird unmittelbar danach mit einer 0,1%igen wäßrigen Natriumcarbonatlösung verdünnt, um das Blut darin aufzulösen. Anschließend wird die resultierende Lösung bei einer Wellenlänge von 660 nm einer Kolorimetrie unterworfen und es wird nach der Halpern et al. Gleichung ein phagazytischer Index (K-Wert) bestimmt.

Außerdem wurde Kontrollmäusen eine Kochsalzlösung in einer Menge von 0,2 ml/20 g verabreicht.

wobei C₀ = die Menge Kohlenstoff im Blut bei t₀ und C = Menge des Kohlenstoffs im Blut bei t.

Die erhaltenen Ergebnisse sind in der Tabelle 13 zusammengestellt.

Tabelle 13

Versuchsbericht 2 1. Zweck des Experiments

Es sollen die hämolytische Aktivität und die carcinostatische Aktivität (die Aktivität hinsichtlich einer Verhinderung der Vermehrung von Tumorzellen) bei einem carcinostatischen Mittel, umfassend ein Lysolecithin und ein Phospholipid für solche Zusammensetzungen untersucht werden, bei dem ein anderes Phospholipid als Eigelblecithin als Phospholipid verwendet wird und für den Fall, daß eine Fett und Öl- oder eine Fettemulsion zusätzlich zu dem Lysolecithin und Phospholipid verwendet wird.

2. Verfahren und Effekte des Experiments (1) Herstellung der bei dem Experiment eingesetzten Testverbindung

I) Zu 135 ml einer 5%igen Dextroselösung für Injektionszwecke gibt man 14,4 g gereinigtes Phosphatidylethanolamin (aus Eigelb erhalten) und 1 g L-Lysolecithin. Das Ganze wird mit einem Mischer 30 min gerührt und gemischt. Anschließend wird diese Suspension einer Ultraschallbehandlung unterworfen (19 KHz, 1200 W) und zwar während 30 min und daraufhin unter Druck unter Verwendung eines Membranfilters mit einer Maschengröße von 0,3 µ filtriert. Das auf diese Weise erhaltene Filtrat wird einer Sterilisationsbehandlung unterworfen, um eine Lösung für Injektionszwecke zu erhalten (im folgenden wird diese Lösung für Injektionszwecke als Testarzneimittel Nr. 1 bezeichnet).

Das oben beschriebene Verfahren wird wiederholt. Es wird jedoch das gereinigte Phosphatidylethanolamin durch gereinigtes Lecithin (aus Sojabohnen stammend) ersetzt. Es wird eine Lösung für Injektionszwecke hergestellt (im folgenden als Testarzneimittel Nr. 2 bezeichnet).

II) Zu 135 ml einer 5%igen Dextroselösung für Injektionszwecke gibt man 14,4 g Lecithin (hergestellt von Asahi Kasei Kogyo K. K.) und 1 g L-Lysolecithin. Das Ganze wird mittels eines Mischers 30 min gerührt und gemischt. Anschließend wird die so erhaltene Suspension 30 min einer Ultraschallbehandlung unterworfen (19 KHz, 1200 W) und daraufhin werden 0,75 g Sojabohnenöl zugesetzt. Das resultierende Gemisch wird weitere 30 min einer Ultraschallbehandlung unterworfen und anschließend unter Druck unter Verwendung eines Membranfilters mit einer Maschengröße von 0,3 µ filtriert. Das resultierende Filtrat wird einer Sterilisationsbehandlung unterworfen, um eine Lösung für Injektionszwecke zu erhalten (im folgenden als Test-Arzneimittel Nr. 3 bezeichnet).

Das oben beschriebene Verfahren wird wiederholt. Dabei wird jedoch anstelle des Lecithins (hergestellt von Asahi Kasei Kogyo K. K.) gereinigtes Lecithin (aus Sojabohnenöl stammend) eingesetzt und das Sojabohnenöl wird durch Sesamöl ersetzt. Es wird eine Lösung für Injektionszwecke hergestellt (im folgenden als Test-Arzneimittel Nr. 4 bezeichnet).

III) Zu 135 ml einer Dextroselösung für Injektionszwecke gibt man 14,4 g Lecithin (hergestellt von Asahi Kasei Kogyo K. K.) und 1 g L-Lysolecithin. Das Ganze wird mittels eines Mischers 30 min gerührt und gemischt. Anschließend wird das gleiche Verfahren wie im obigen Abschnitt I wiederholt, um eine Lösung für Injektionszwecke zu erhalten. Zu 20 ml dieser Lösung für Injektionszwecke werden 10 ml Intrafat (Warenzeichen) gegeben und das resultierende Gemisch wird 2- bis 3mal geschüttelt und anschließend unter Druck filtriert mittels eines membranen Filters mit einer Maschengröße von 0,3 µ. Man erhält eine Lösung für Injektionszwecke (im folgenden als Test-Arzneimittel Nr. 5 bezeichnet).

Das oben beschriebene Verfahren wird wiederholt. Dabei wird jedoch anstelle von Intrafat Intralipid (Warenzeichen) eingesetzt. Es wird eine Lösung für Injektionszwecke erhalten (im folgenden als Test-Arzneimittel Nr. 6 bezeichnet).

(2) Hämolyse

Eine Suspension von Kaninchenerythrozyten und das Testarzneimittel werden vermischt und das resultierende Gemisch wird bei 37°C eine Stunden geschüttelt. Daraufhin wird das Gemisch 5 Minuten zentrifugiert (3000 Upm). Anschließend wird die überstehende Flüssigkeit verworfen und den zurückgebliebenen ausgefallenen Hämatozyten wird destilliertes Wasser zugesetzt, um sie vollständig aufzulösen. Die optische Dichte (O. D.) bei 550 mµ wird bestimmt. Gemäß der nachfolgenden Gleichung wird die Hämolyse des Testarzneimittels bestimmt, wobei als Kontrolle der O. D.-Wert dient, der erhalten wird, wenn man bei dem obigen Verfahren eine Kochsalzlösung anstelle des Testarzneimittels einsetzt:

Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle 14 zusammengestellt.

Tabelle 14

(3) Minimale Hemmkonzentration bei Krebszellen (MIC)

Unter Verwendung von Hela S-3 Stamm in einer Population von 2 × 10³ Zellen/0,2 ml wird der carcinostatische Effekt der Testarzneimittel unter den folgenden Bedingungen bestimmt:

(i)Kulturmedium: Eagle′s MEM + 20% Rinderembryonenserum (ii)Kultivierungsdauer: 120 Std. (iii)Mikroplattenessay: Von 2.000 µg/ml in 12 Stufen nach unten verdünnt (iv)Bewertungsverfahren: Konzentration der Testverbindung, bei der das Wachstum der Zellen gemäß Giemsa′s Fleckenbildung um mehr als 50% inhibiert wird, wird als MIC Wert angegeben.

Die erhaltenen Ergebnisse sind in der Tabelle 15 zusammengestellt.
Test-Arzneimittel Nr.MIC (µg/ml)

1125 2125 3125 4125 5125 6125 7*)125 L-Lysolecithin125

Im folgenden wird ein Verfahren zur Herstellung des erfindungsgemäßen carcinostatischen und die Immunreaktion stimulierenden Mittels beschrieben. Obwohl man die erfindungsgemäßen Mittel gemäß einem herkömmlichen Verfahren herstellen kann, wird es bevorzugt, ein Verfahren anzuwenden, welches gewöhnlich dazu verwendet wird, eine aus feinen Teilchen bestehende Zusammensetzung zu erhalten.

Um eine aus Teilchen mit geringer Größe zusammengesetzte Mischung zu erhalten, werden im allgemeinen Verfahren, wie Ultrazentrifugieren, Dialyse oder ein anderes ähnliches Verfahren, verwendet. Diese Verfahrensweisen sind jedoch im tatsächlichen Betrieb sehr kompliziert und daher zur Massenproduktion eines kommerziellen Produktes nicht in befriedigender Weise geeignet.

Die Erfinder haben daher nach einem industriell vorteilhaften Verfahren gesucht und gefunden, daß mit einem Membranfilterverfahren eine Zusammensetzung des Mittels erhalten werden kann, die dem Ziel der vorliegenden Erfindung voll entspricht. Bei diesem Membranfilterverfahren wird die Dispersion dadurch erhalten, daß man die jeweiligen Komponenten durch ein Membranfilter filtriert, welches solche Eigenschaften aufweist, daß nur Teilchen mit kleinen Teilchengrößen erhalten werden. Das Verfahren ist im Betrieb äußerst einfach und ermöglicht außerdem eine simultane aseptische Behandlung.

Im folgenden wird dieses Verfahren näher erläutert. Man kann ein carcinostatisches und die Immunreaktion stimulierendes Mittel, welches ein Lysophospholipid und ein Phospholipid umfaßt, dadurch erhalten, daß man zunächst das Lysophospholipid und das Phospholipid einheitlich in einem halogenierten Kohlenwasserstoff, wie z. B. Chloroform, Methylenchlorid oder dergl., oder in einem Alkohol, wie Äthanol, Methanol oder dergl., oder in einem gemischten Lösungsmittel derselben unter einer Stickstoffatmosphäre auflöst. Anschließend destilliert man das Lösungsmittel ab und gibt zu dem Rückstand Wasser (gegebenenfalls kann anstelle von Wasser eine isotonische Lösung, wie z. B. eine 5%ige Dextroselösung oder eine physiologische Salzlösung, verwendet werden). Anschließend wird ausreichend durchgemischt. Ein alternatives Verfahren besteht darin, daß man zunächst das Phospholipid einheitlich in dem genannten organischen Lösungsmittel auflöst, anschließend das Lösungsmittel abdestilliert und dem Rückstand eine Lösung zusetzt, die durch einheitliches Auflösen eines Lysophospholipids in Wasser (anstelle von Wasser kann gegebenenfalls ein isotonische Lösung, wie eine 5%ige Dextroselösung oder eine physiologische Salzlösung, verwendet werden) hergestellt wurde und anschließend ausreichend durchmischt. Ein weiteres, alternatives Verfahren besteht darin, daß man das Lysophospholipid und das Phospholipid direkt in Wasser gibt (anstelle von Wasser kann gegebenenfalls eine isotonische Lösung, wie z. B. eine 5%ige Dextroselösung oder eine physiologische Salzlösung, verwendet werden), die Mischung homogenisiert und anschließend alles gründlich durchmischt. Die auf diese Weise erhaltene Dispersion wird dann einer mechanischen Dispergierbehandlung, wie z. B. einer Ultraschallbehandlung, unterworfen oder unter Druck ausgespritzt, um die Größe der Teilchen zu reduzieren. Anschließend wird die Dispersion durch ein Membranfilter filtriert, wobei man eine bevorzugte Dispersion erhält. Diese Dispersion kann unmittelbar verwendet werden oder gegebenenfalls auf herkömmlichem Wege im Vakuum gefriergetrocknet werden, um ein festes Produkt zu bilden.

Bei der Durchführung des obigen Verfahrens sollten folgende Anweisungen beachtet werden. Die Menge des verwendeten organischen Lösungsmittels, die keinen speziellen Beschränkungen unterliegt, kann mehr sein als die zur vollständigen Auflösung des zu lösenden Stoffes benötigte Menge. Das verwendete Lösungsmittel wird bei einer so tiefen Temperatur wie möglich abdestilliert, und zwar vorzugsweise bei nicht mehr als 40°C. Anschließend wird zu der Lösung Wasser oder eine isotonische Lösung gegeben, welche ein Lysophospholipid enthalten kann, und die Mischung wird bei Zimmertemperatur während eines Zeitraums von 30 min bis 3 h vermischt. Um die Mischwirkung zu verbessern, wird in diesem Fall empfohlen, eine geeignete Menge Glaskügelchen zuzusetzen und die Gefäße selbst rotieren zu lassen oder Lysophospholipid und Phospholipid direkt dem Wasser (anstelle von Wasser kann gegebenenfalls eine isotonische Lösung, wie eine 5%ige Dextroselösung oder eine pharmakologische Salzlösung, verwendet werden) zuzusetzen und die Mischung anschließend mittels eines Hochgeschwindigkeitsmischers zu vermischen und, wie oben erwähnt, einer mechanischen Dispergierbehandlung zu unterwerfen.

Die gemischte Lösung (nach Entfernung der Glaskügelchen, wenn solche verwendet wurden) wird anschließend einer mechanischen Dispergierbehandlung ausgesetzt. Es kann z. B. eine Ultraschallbehandlung bei 9 bis 200 kHz und 50 bis 1500 W während eines Zeitraums von 10 min bis 10 h durchgeführt werden. Anschließend wird bei Atmosphärendruck, Unterdruck (3 bar oder weniger) oder bei vermindertem Druck filtriert. Dabei wird ein Membranfilter (z. B. Celluloseacetat oder Tetrafluoräthylenpolymerisat und dergl.) mit einer Maschengröße von nicht mehr als 1 µ, vorzugsweise nicht mehr als 0,5 µ, verwendet. Falls das Filtrat gefriergetrocknet wird, wird die Gefriertrocknung vorzugsweise im Vakuum durchgeführt, wobei man während der Endstufe die Temperatur unter 30°C hält.

Fall eine Zusammensetzung angestrebt wird, die zusätzlich zu den genannten Komponenten ein Fett und Öl enthält, wird das Fett und Öl der mittels des oben beschriebenen Verfahrens erhaltenen Dispersion zugesetzt. Das Fett und Öl kann auch einer Dispersion zugesetzt werden, die durch einheitliches Auflösen eines Lysophospholipids und eines Phospholipids in einem halogenierten Kohlenwasserstoff, wie Chloroform oder Methylenchlorid, oder einem Alkohol, wie Methanol oder Äthanol, oder einem gemischten Lösungsmittel derselben unter Stickstoffatmosphäre, Entfernen des Lösungsmittels durch Destillation, Zugabe von Wasser (anstelle von Wasser kann gegebenenfalls eine isotonische Lösung, wie z. B. eine 5%ige Dextroselösung oder eine physiologische Salzlösung, verwendet werden) zu dem Rückstand und anschließendes gründliches Durchmischen erhalten worden ist. Die resultierende Mischung wird gründlich vermischt und anschließend einer Ultraschallbehandlung ausgesetzt und auf die oben beschriebene Weise durch ein Membranfilter filtriert, um eine Dispersion zu erhalten. Ein alternatives Verfahren besteht darin, das Lysophospholipid, das Phospholipid und das gewünschte Fett und Öl einheitlich in einem organischen Lösungsmittel, wie z. B. dem oben erwähnten, aufzulösen, das Lösungsmittel durch Destillation zu entfernen und dem Rückstand Wasser (anstelle von Wasser kann gegebenenfalls eine isotonische Lösung, wie eine 5%ige Dextroselösung oder eine physiologische Salzlösung, verwendet werden) zuzusetzen. Diese Mischung wird nach ausreichendem Verfahren einer mechanischen Dispergierbehandlung unterworfen und auf die oben beschriebene Weise durch ein Membranfilter filtriert, um eine angestrebte Dispersion zu erhalten.

Um eine Zusammensetzung zu erhalten, die ein Lysophospholipid, ein Phospholipid und eine Fettemulsion enthält, kann folgendermaßen vorgegangen werden. Die Fettemulsion wird zu einer Dispersion gegeben, welche das Lysophospholipid und das Phospholipid enthält, wobei die Dispersion auf die oben beschriebene Weise erhalten wurde, und die resultierende Mischung wird mehrere Male geschüttelt. Da in diesem Fall die dispergierten Teilchen alle eine geringe Größe aufweisen, braucht die beschriebene Dispergierbehandlung und die Filtration durch ein Membranfilter nur bei entsprechenden Umständen durchgeführt zu werden.

Um ein carcinostatisches und die Immunreaktion stimulierendes Mittel, enthaltend ein Lysophospholipid und eine Fettemulsion, zu erhalten, kann folgendermaßen vorgegangen werden. Das Lysophospholipid wird in Wasser aufgelöst (anstelle von Wasser kann gegebenenfalls eine isotonische Lösung, wie eine 5%ige Dextroselösung oder eine physiologische Salzlösung, verwendet werden), dieser Lösung wird die Fettemulsion zugesetzt und nachfolgend wird die resultierende Mischung mehrere Male geschüttelt. Da in diesem Fall die Teilchen im allgemeinen klein sind, braucht die beschriebene Dispergierbehandlung und die Filtration durch ein Membranfilter nur gegebenenfalls durchgeführt zu werden. Die Bedingungen bei diesen Verfahren sind die gleichen wie die bei den zuvor beschriebenen Herstellungsverfahren.

Das erfindungsgemäße carcinostatische und die Immunreaktion stimulierende Mittel kann in jede beliebige Darreichungsform eines Medikaments formuliert werden. Dabei können je nach Verwendungszweck oder Darreichungsform des Medikaments allgemein bekannte Additive oder solche Additive verwendet werden, wie sie oben erwähnt wurden.

Das erfindungsgemäße carcinostatische und die Immunreaktion stimulierende Mittel kann zur Behandlung verschiedener Krebstypen appliziert werden. Als Krebstypen seien beispielsweise genannt: Krebs der inneren Organe, z. B. Lunge, Leber, Bauchspeicheldrüse, Verdauungsorgane usw., sowie andere Erkrankungen, wie z. B. Leukämie und Sarkome, z. B. Osteosarcom. Die Art der Verabreichung, die Anzahl der Verabreichungen und die Dosierung kann gemäß dem Zustand des Patienten entsprechend variiert werden. Im allgemeinen wird jedoch ein Arzneimittel, das 0,1 bis 200 mg/kg eines Lysophospholipids enthält, entweder oral oder parenteral 1- bis 4mal am Tag einem Erwachsenen verabreicht. Als Verabreichungsverfahren wird eine intravenöse oder intramuskuläre Injektion, insbesondere eine intravenöse Tropfinjektion, bevorzugt.

Im folgenden wird die Erfindung anhand von Beispielen und Vergleichsbeispielen näher erläutert.

Herstellungsbeispiel 1

9,6 g Eigelblecithin, 1,0 g L-Lysolecithin und 1,0 g Vitamin E werden in 40 ml Chloroform aufgelöst. Das Chloroform wird durch Destillation unter vermindertem Druck bei einer Temperatur von nicht mehr als 40°C abdestilliert. Anschließend wird der Rückstand bei Zimmertemperatur weitere 2 h im Vakuum getrocknet. Zu dem resultierenden Produkt gibt man 100 g Glaskügelchen und 100 ml einer 5%igen Dextroselösung zu Injektionszwecken und rotiert das Gefäß 1,5 h, um eine Dispersion zu erhalten. Die Glaskügelchen werden durch Filtration entfernt und das Filtrat wird einer Ultraschallbehandlung ausgesetzt (28 kHz, 150 W), und zwar 2,5 h lang. Anschließend wird unter Druck unter Verwendung eines Membranfilters mit einer Maschengröße von 0,3 µ filtriert. Das resultierende Filtrat wird anschließend sterilisiert und in 25 ml Ampullen für intravenöse Injektion aufgeteilt. Die Ampullen werden abgeschmolzen, um Injektionsmittel zu erhalten. (Trübung 6%, gemessen unter Verwendung eines Trübungsmeßgeräts vom Typ SEP-PL, das nach einem Kugelverfahren arbeitet und in dem die Testprobe in eine Küvette mit 10 mm Weglänge placiert wird und eine Birne von 12 V und 15 W verwendet wird.)

Herstellungsbeispiel 2

50 ml der Dispersion für intravenöse Injektion, die in Herstellungsbeispiel 1 erhalten wurde, und 50 ml einer getrennt hergestellten Fettemulsion (200 ml einer wäßrigen Emulsion, enthaltend 20 g Sojabohnenöl, 5,0 g konz. Glycerin und 2,4 g Eigelbphospholipid) werden vermischt. Die Mischung wird auf die gleiche Weise wie in Herstellungsbeispiel 1 beschrieben einer Ultraschallbehandlung unterworfen und durch ein Membranfilter filtriert, um eine intravenöse Tropfinjektion zu erhalten.

Herstellungsbeispiel 3

20 ml der Dispersion für intravenöse Injektion, die in Herstellungsbeispiel 1 erhalten wurde, gibt man zu 200 ml einer im Handel erhältlichen Fettemulsion (Intrafat) und schüttelt die Mischung zwei- bis dreimal, um eine intravenöse Tropfinjektion zu erhalten.

Herstellungsbeispiel 4

10 ml der Dispersion für intravenöse Injektion, die in Herstellungsbeispiel 1 erhalten wurde, wird im Vakuum gefriergetrocknet. Dabei erhält man eine intravenöse Tropfinjektion, die bei Gebrauch auf die erforderliche Konzentration eingestellt werden könnte.

Herstellungsbeispiel 5

1

1 g L-Lysolecithin, 9,6 g Eigelblecithin und 1 g Sesamöl werden in 40 ml Chloroform aufgelöst. Das Chloroform wird durch Destillation unter vermindertem Druck bei einer Temperatur von nicht mehr als 40°C entfernt. Anschließend wird der Rückstand weitere 2 h bei Zimmertemperatur im Vakuum getrocknet. Das resultierende Produkt wird mit 100 g Glaskügelchen und 100 ml einer 5%igen Dextroselösung für Injektionszwecke vermischt. Das Gefäß wird 1,5 h rotiert, um eine Dispersion zu erhalten. Die Glaskügelchen werden durch Filtration abgetrennt. Anschließend wird das Filtrat 2,5 h einer Ultraschallbehandlung unterworfen (28 kHz; 150 W) und daraufhin unter Druck filtriert, wobei man ein Membranfilter mit einer Maschengröße von 0,3 µ verwendet. Das resultierende Filtrat wird sterilisiert und anschließend in 2 ml Ampullen für intravenöse Injektion aufgeteilt. Die Ampullen werden verschlossen, und man erhält auf diese Weise Injektionen (Trübung 20%).

Herstellungsbeispiel 6

9,6 g Eigelblecithin und 1,6 g L-Lysolecithin werden in 40 ml Chloroform aufgelöst. Das Chloroform wird durch Destillation unter vermindertem Druck bei einer Temperatur von nicht mehr als 40°C entfernt. Anschließend wird der Rückstand weitere 2 h bei Zimmertemperatur im Vakuum getrocknet. Zu diesem Produkt gibt man dann 100 g Glaskügelchen und 100 ml einer 5%igen Dextroselösung für Injektionszwecke und rotiert das Gefäß 1,5 h, um eine Dispersion zu erhalten. Die Glaskügelchen werden durch Filtration abgetrennt. Das Filtrat wird 2,5 h einer Ultraschallbehandlung (28 kHz; 150 W) ausgesetzt und daraufhin durch ein Membranfilter mit einer Maschengröße von 0,3 µ filtriert. Das erhaltene Filtrat wird sterilisiert und in 2 ml Ampullen für intravenöse Injektionen aufgeteilt. Die Ampullen werden verschlossen, und man erhält Injektionen.

Herstellungsbeispiel 7

20 ml der in Herstellungsbeispiel 1 hergestellten Dispersion für intravenöse Injektion werden zu 200 ml einer im Handel erhältlichen Fettemulsion (Intrafat) gegeben. Die Mischung wird zwei- oder dreimal geschüttelt, und man erhält ein Mittel für intravenöse Tropfinjektion.

Herstellungsbeispiel 8

9,6 g Eigelblecithin und 1 g L-Lysolecithin werden in 40 ml Chloroform gelöst. Das Chloroform wird durch Destillation unter vermindertem Druck bei einer Temperatur von nicht mehr als 40°C entfernt. Anschließend wird der Rückstand weitere 2 h bei Zimmertemperatur im Vakuum getrocknet. Zu diesem Produkt gibt man 100 g Glaskügelchen und 100 ml einer 5%igen Dextroselösung für Injektionszwecke und rotiert das Gefäß 1,5 h, um eine Dispersion zu erhalten. Die Glaskügelchen werden durch Filtration abgetrennt. Das Filtrat wird 2,5 h einer Ultraschallbehandlung (28 kHz; 150 W) ausgesetzt und daraufhin durch ein Membranfilter mit einer Maschengröße von 0,3 µ filtriert. Das erhaltene Filtrat wird sterilisiert und in 2 ml Ampullen für intravenöse Injektionen aufgeteilt. Die Ampullen werden verschlossen, und man erhält Injektionen.

Herstellungsbeispiel 9

1,0 g sterilisiertes L-Lysolecithin wird in 100 ml einer physiologischen Salzlösung für Injektionszwecke aufgelöst. Die Lösung wird einer aseptischen Filtration unterworfen und in 2 ml Ampullen für Injektionszwecke gefüllt. Diese werden verschlossen, und man erhält Injektionen. Diese Injektionsampullenlösung gibt man in einer Menge von bis zu 10 Ampullen, je nach Verwendungszweck, zu einer getrennt hergestellten Fettemulsion (200 ml einer wäßrigen Lösung, enthaltend 20 g Sojabohnenöl, 5,0 g konz. Glycerin und 2,4 g Eigelbphospholipid). Die gemischte Lösung wird zwei- bis dreimal geschüttelt, um ein Mittel für intravenöse Tropfinjektion zu erhalten.

Herstellungsbeispiel 10

Eine Ampullentropfinjektionslösung (die bereits einer aseptischen Filtration unterworfen war), bestehend aus 200 mg L-Lysolecithin, gelöst in 20 ml einer physiologischen Salzlösung, gibt man zu 500 ml einer im Handel erhältlichen Fettemulsion (Intrafat). Die gemischte Lösung wird zwei- bis dreimal geschüttelt, und man erhält ein Mittel für eine intravenöse Tropfinjektion.

Herstellungsbeispiel 11

15 g Sojabohnenlecithin, 1,0 g L-Lysolecithin und 1,0 g Vitamin E werden in 40 ml Chloroform gelöst. Das Chloroform wird durch Destillation unter vermindertem Druck bei einer Temperatur von nicht mehr als 40°C entfernt. Anschließend wird der Rückstand weitere 2 h bei Zimmertemperatur im Vakuum getrocknet. Zu dem resultierenden Produkt gibt man 100 g Glaskügelchen und 100 ml einer 5%igen Dextroselösung für Injektionszwecke und rotiert das Gefäß 1,5 h, um eine Dispersion zu erhalten. Die Glaskügelchen werden durch Filtration abgetrennt und das Filtrat wird 2,5 h einer Ultraschallbehandlung (19 kHz; 1200 W) unterworfen und dann unter Druck durch ein Membranfilter mit einer Maschengröße von 0,5 µ filtriert. Das erhaltene Filtrat wird anschließend sterilisiert, in 25 ml Ampullen für intravenöse Injektionszwecke aufgeteilt und die Ampullen werden verschlossen. Man erhält auf diese Weise Mittel für Injektionszwecke.

Herstellungsbeispiel 12

9,6 g Eigelblecithin und 1,0 g 1-Octadecyl-2-methyl-3- phosphorylcholin werden in 40 ml Chloroform aufgelöst. Das Chloroform wird durch Destillation unter vermindertem Druck bei einer Temperatur von nicht mehr als 40°C entfernt. Anschließend wird der Rückstand weitere 2 h bei Zimmertemperatur im Vakuum getrocknet. Nachdem man zu dem Rückstand 100 g Glaskügelchen und 100 ml einer physiologischen Salzlösung gegeben hat, wird das Gefäß 2 h rotiert, um eine Dispersion zu erhalten. Anschließend werden die Glaskügelchen durch Filtration abgetrennt. Das Filtrat wird 2,5 h einer Ultraschallbehandlung (28 kHz; 150 W) unterworfen und unter Druck durch ein Membranfilter mit einer Maschengröße von 1 µ filtriert. Das resultierende Filtrat wird anschließend sterilisiert und in 25 ml Ampullen für intravenöse Injektionszwecke aufgeteilt. Daraufhin werden die Ampullen verschlossen, und man erhält so Mittel für Injektionszwecke.

Herstellungsbeispiel 13

50 ml der Dispersion für intravenöse Injektion, die in Herstellungsbeispiel 1 hergestellt wurde, und 50 ml einer getrennt hergestellten Fettemulsion (200 ml einer wäßrigen Emulsion, enthaltend 20 g Sesamöl, 5,0 g konz. Glycerin und 2,4 g Eigelbphospholipid) werden vermischt und die Mischung wird einer Ultraschallbehandlung unter den gleichen Bedingungen wie bei Herstellungsbeispiel 1 unterworfen. Anschließend wird durch ein Membranfilter mit einer Maschengröße von 0,2 µ filtriert, und man erhält auf diese Weise ein Mittel für intravenöse Tropfinjektion.

Herstellungsbeispiel 14

9,6 g Eigelblecithin und 1,0 g L-Lysolecithin werden zu 90 ml einer 5%igen Dextroselösung für Injektionszwecke gegeben. Die Mischung wird durch einen Hochgeschwindigkeitsmischer während eines Zeitraums von 30 min homogenisiert. Die resultierende Dispersion wird 1 h einer Ultraschallbehandlung (19 kHz, 1200 W) unterworfen und anschließend unter Druck (0,5 bis 1 bar) unter Verwendung eines Membranfilters aus Celluloseacetat mit einer Maschengröße von 0,2 µ filtriert. Das resultierende Filtrat wird anschließend sterilisiert und in 25 ml Ampullen für intravenöse Injektionszwecke aufgeteilt.

Claims

1. Carninostatisches und die Immunreaktion stimulierendes Mittel, enthaltend ein Lysophospholipid der Formel wobei R¹ eine C_5-22-Acyloxygruppe oder eine C_5-22-Alkyloxygruppe bedeutet; R² ein Wasserstoffatom oder eine Hydroxylgruppe, eine C_1-5-Acyloxy- oder C_1-5-Acyloxygruppe bedeutet, und R³ für ein Wasserstoffatom oder eine C_1-5-Alkylgruppe steht, wobei R¹ und R² gegeneinander austauschbar sind, und ein Phospholipid, in Form von Lipidvesikeln, wobei die Lipidvesikel eine Teilchengröße von nicht mehr als 1,0 µm aufweisen.

2. Mittel nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Phospholipid aus der Gruppe Lecithin, Phosphatidylethanolamin, Sphingomyelin, Phosphatidylserin, Phosphatidylinosit und Phosphatidsäure gewählt ist.

3. Mittel nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Lysophospholipid Lysolecithin ist.