DE3105768C2 - Verwendung eines Trägers für die Immobilisierung von bioaktiven Materialien - Google Patents

Verwendung eines Trägers für die Immobilisierung von bioaktiven Materialien

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Abstract

Die Erfindung betrifft Träger, die mit einem Copolymeren aus einem hydrophilen Acrylat- oder Methacrylatmonomeren und einer copolymerisierbaren ungesättigten Carbonsäure oder einem ungesättigten Amin überzogen sind und im wesentlichen keine nichtspezifische Adsorption von Proteinen od.dgl. zeigen. Infolge der Seitenkettencarboxyl- oder -aminogruppen des Copolymeren sind diese beschichteten Träger in der Lage, bioaktive Materialien, wie Antigene, Antikörper, Komplemente und Enzyme zu immobilisieren. Diese Träger, auf welchen bioaktive Materialien immobilisiert werden können, eignen sich als klinische, selektive Adsorbentien, affini tätschromatographische Adsorbentien, selektive Elektroden oder Säulen für Analysezwecke.

Description

— C — O — R2—O—R3
Ii ο
worin R.3 für Wasserstoff oder eine Q- C3-Alkylgruppe, gegebenenfalls substituiert mit polaren Substituentengruppen, steht, und eine Seitenkette
— C-OH oder -NH2
Da das Polymere die vorstehend hydrophilen Gruppen aufweist, werden nichtspezifische Adsorptionen verhindert
Als hydrophile Acrylat- oder Methacrylatmonomere der allgemeinen Formel
CH2 = QRi)CO2R2OR3
die erfindungsgemäß eingesetzt werden, seien unter anderem ^-Hydroxyethylacrylat, /-Hydroxypropylacrylat, /7-Alkoxyethylacrylate, /-Alkoxypropylacrylate, Aminoalkoxyethylacrylat, Aminoalkoxypropylacrylat, Hydroxyalkoxyethylacrylate oder dgl. sowie die entsprechenden Metharcylate erwähnt. Die ungesättigte Carbonsäure der allgemeinen Formel
CH2 = QR1)CO2H
besteht aus Methacrylsäure oder Acrylsäure.
Das ungesättigte Amin der allgemeinen Formel
= QR1)CO2R2NHR,
kann beispielsweise aus Aminoethylaciylat, Aminopropylacrylat, Monoalkylaminoethylacrylat, Monoalkylaminopropylacrylaten oder dgl. sowie den entsprechenden Methacrylaten bestehen.
Das Copolymerisationsausmaß der ungesättigten Carbonsäure oder des Amins kann zwischen 1 und 50 Gew.-%, bezogen auf das Gesamtgewicht der Monomeren, und vorzugsweise zwischen ungefähr 10 und 40 Gew.-% schwanken.
Das mit dem vorstehenden Copolymeren zu beschichtende Substrat oder Grundmaterial kann aus verschiedenen Materialien ausgewählt werden, die in Abhängigkeit von dem jeweiligen Verwendungszweck in Frage kommen, im allgemeinen kommen jedoch anorganische Materialien, wie Glas, Aktivkohle, Siliciumdioxid, Aluminiumoxid oder dgl., synthetische hochpolymere Materialien, wie Polystyrol, Polyethylen, Polyvinylchlorid, Nylon, Polyester sowie Methylmethacrylat oder dgl., sowie natürlich vorkommende Hochpolymere, wie Cellulose, in Frage.
Diese Materialien werden in zweckmäßiger Weise in Form von Körnern, Bahnen, Folien, Rohren, Elektroden oder dgl. eingesetzt. Derartige Grundmaterialien werden je nach dem beabsichtigten Verwendungszweck ausgewählt. Ist beispielsweise eine Verwendung als klinisches selektives Adsorbens vorgesehen, dann liegt das Grundmaterial vorzugsweise in Form von Körnern mit einem Teilchendurchmesser von 0,05 bis 5 mm vor. Glaskügelchen sind insofern am geeignetsten, als im Falle ihrer Verwendung nicht das Problem auftritt, daß ein Teil durch Reibung bei der Verwendung zerstört wird und Fragmente ihren Weg in das Blut finden oder in dem Blut aufgelöst und in den Körper übertragen werden.
Im Falle eines Adsorbenes für eine Affinitätschromatographie oder einer Säule für eine chromatographische Analyse besteht das Grundmaterial vorzugweise aus Körnern oder einem Rohr aus Glas oder einem synthetischen Harz. Ist das Grundmaterial eine Elektrode, dann kann der Träger für eine quantitative Bestimmung spezifischer Substanzen durch Reaktionen ausgewählt werden, an denen bioaktive Materialien teilnehmen, wie Antigene, Antikörper, Komplemente, Enzyme und dgl. Als Grundmaterialien in Form von Einzelteilchen wird ein poröses Material mit einer großen Oberfläche bevorzugt, da es eine erhebliche Menge an bioaktivem Material pro Einheitsgewicht immobilisiert
Beispiele für bioaktive Materialien, die auf dem erfindungsgemäß verwendeten Träger immobilisiert werden, sind biologische Gewebe, Zellen, Antigene, Antikörper, Antigen-Antikörper-Komplexe, Komplemente, Enzyme und dgl. Von den Antigenen seien Blutproteine, Albumin, Immunoglobuline oder dgl., Nukleinsäuren, wie DNA, RNA oder dgl., Proteine, die durch Bakterien erzeugt werden, wie Protein A, sowie bakterielle extrazellulare Polysaccharide erwähnt. Von den Antikörpern kommen diejenigen verschiedenen Antikörper in Frage, die den Antigenim entsprechen. Die einsetzbaren Komplemente umfassen alle Q—Ce-Komplemente und die Rezeptoren den Fc-Rezeptor, den Acetylcholinrezeptor sowie verschiedene Hormonrezeptoren. Die Enzyme können aus Acetylcholinesterase, Alkoholdehydrogenase, alkalischer Phosphatase, Aminopeptidase, Λ-Amylase, Aspartataminotransferase, Catalase, Cellulase, Cholesterinesterase, «-Chymotrypsin, Desoxyribonuclease, Glucoseoxidase, L-Glutaminatdecarboxylase, Lactatdehydrogenase, Lipase, Lysozym, Nuclease, Pepsin, Peroxidase, Protease, Ribonuclease, Ligase, Trypsin, Urease oder dgl. bestehen.
Der erfindungsgemäß verwendete Träger für die Immobilisierung von bioaktiven Materialien kann in der folgenden Weise hergestellt werden. Zuerst wird eine Copolymeransatzlösung durch herkömmliche Lösungspolymerisation unter Verwendung der vorstehend erwähnten hydrophilen Acrylat- oder Methacrylatmonomeren sowie der vorstehend genannten copolymerisierbaren ungesättigten Carbonsäure oder des ungesättigten Amins als Ausgangsmaterialien hergestellt und die Oberflächen der vorstehend erwähnten Grundmaterialien mit den Copolymeransatzlösungen in herkömmlieher Weise beschichtet, beispielsweise durch Aufsprühen, Eintauchen, Phasentrennung oder dgl. Die vorstehend beschriebene Copolymeransatzlösung kann auch unter Zugabe einer kleinen Menge eines Epoxygruppen-enthaltenden Monomeren, wie Glycidylacrylat, Glycidylmethacrylat oder dgl., als copolymeri'sierbare Komponente hergestellt werden, ferner kann eine derartige copolymere Komponente der vorstehend erwähnten Copolymeransatzlösung zugegeben werden. In beiden Fällen bewirkt eine Vernetzungsbehandlung nach dem Beschichten eine Eluierung aus der Beschichtungsschicht.
Ein in der vorstehend beschriebenen Weise beschichtetes Grundmaterial ist mit einer hydrophilen Oberfläche bedeckt, die Carboxyl- oder Aminogruppen trägt, so daß bioaktive Materialien entweder direkt an diesen Carboxyl- oder Aminogruppen oder durch andere Gruppen mit vergleichsweise niedrigem Molekulargewicht immobilisiert werden können. Im ersteren Falle
einer direkten Kupplung können die Amino- und Carboxylgruppen des Trägers und der bioaktiven Materialien durch Kondensation in Gegenwart eines Kondensationsmittels, wie Dicyclohexylcarbodiimid (DCC)1 l-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodümidhydrochlorid (EDC) oder dgl. vereinigt werden. Wahlweise kann jede Carboxylgruppe des Trägers in einen aktiven N-Hydroxysuccinimidester umgewandelt und das bioaktive Material durch Substitution eingeführt werden. Der vorstebend erwähnte aktive Ester ist vergleichsweise stabil und daher lagerungsfähig. Im Falle einer indirekten Kupplung kann ^-Aminocapronsäure mit den vorstehend erwähnten Carboxylgruppen verknüpft und das bioaktive Material durch die endständige Carbonsäure unter Einsatz der vorstehend erwähnten aktiven Estermethode immobilisiert werden. Als Alternative kann Diaminoheptan mit der Carboxylgruppe vereinigt werden, worauf die endständige Aminogruppe und ein bioaktives Material mittels Glutaraldeh^ d oder eines Carbodiimids verkuppelt werden können. Wahlweise können die Aminogruppen des Trägers mit dem bioaktiven Material mittels Glutaraldehyd verkuppelt werden.
Anschließend an die Immobilisation des bioaktiven Materials können nichtumgesetzte Materialien leicht durch Waschen mit einer Pufferlösung entfernt werden, wobei die Entfernung anhand eines UV-Spektrums oder einer Farbreaktion der Waschlösungen bestätigt werden kann.
Ein Hauptverwendungszweck für den erfindungsge- -mäß verwendete Träger zur Immobilisierung von bioaktiven Materialien, der auf diese Weise erhalten wird, liegt in dem Einsatz als klinisches oder therapeutisches selektives Adsorbens. Die bioaktiven Materialien, die derartigen Anwendungszwecken zugeführt werden, bestehen aus Antigenen, Antikörpern, Enzymen, Komplementen oder dgl. Natürlich wird ein Material, das für die zu behandelnde Krankheit geeignet ist, ausgewählt. Beispielsweise sind die Ursachen für autoimmune Krankheiten, wie autoimmune hämolytische Anemie, Glomerulonephritis, chronische rheumatische Arthritis, systemische Schmetterlingsflechte oder dgl. Autoantikörper oder Immunkomplexe, welche aus dem Kreislaufsystem entfernt werden müssen. Um derartige Antikörper und Immunkomplexe zu beseitigen, werden Protein A, das durch bestimmte Stämme von Staphylococcus aureus erzeugt wird, Fc-Rezeptoren, die auf den Zellwänden von Lymphocyten und Plättchen vorliegen, Komplement-Ci -Komponente, Antiimmunoglobulinantikörper oder dgl., welche in spezifischer Weise die vorerst erwähnten krankheitsverursachenden Mittel bilden, auf dem Träger immobilisiert und als therapeutische selektive Adsorbentien verwendet. Im Falle von Patienten mit Nierenversagen wird, weil Harnstoff in dem Blut nicht metabolisiert wird, sondern sich anreichert, ein Träger, auf welchem Urease, das Enzym, welches Harnstoff zu zersetzen vermag, immobilisiert worden ist, als therapeutisches selektives Adsorbens verwendet. Im Falle von Krebspatienten konnte gezeigt werden, daß verschiedene immunosuppressive Faktoren gegenüber Tumorzellen in dem Blut existieren. Da diese immunosuppressiven Faktoren in der Antikörperfraktion sowie der Antigenproteinfraktion mit einem Molekulargewicht zwischen 10 000 und 100 000 vorkommen, werden die Antikörper zu diesen Antigenen, Protein A, ZeIlwand-Fc-Rezeptoren sowie die Antiimmunoglobulinantikörper auf dem Träger immobilisiert und als therapeutische selektive Adsorbentien verwendet.
Erfolgt im Falle eines derartigen therapeutischen Adsorbenes eine nichtspezifische Adsorption von Proteinen, dann begleitet die Immobilisation von bioaktiven Materialien nicht nur diejenigen kovalent immobilisierten Materialien, sondern auch die physikalisch adsorbierten, wobei dann, wenn das Adsorbens später beispielsweise mit Blut oder Plasma kontaktiert wird, die physikalisch adsorbierte Substanzen desorbiert und in den Körper überführt werden, wo sie ds Antigene wirken und immunologische Reaktionen induzieren. Die ίο wiederholte Verwendung eines derartigen Adsorbenes ist gefährlich, da es einen anaphilaktischen Schock verursachen kann. Demgegenüber verursachen die erfindungsgemäßen therapeutischen selektiven Adsorbentien keine derartigen Probleme, weil die nichtspezifische Adsorption von Proteinen durch das Copolymere, welche das Grundmaterial bedeckt, ausgeschlossen ist Darüber hinaus erfolgen beim Einsatz von erfindungsgemäßen therapeutischen selektiven Adsorbentien Adsorptionen mit sehr hoher Selektivität, so daß gleichzeitig eine Adsorption von wertvollen Komponenten des Blutes oder des Plasmas erfolgreich ausgeschlossen wird.
Ein anderer Anwendungszweck für den erfindungsgemäß eingesetzten Immobilisationsträger besteht in einer Verwendung als affinitätschromatographisches Adsorbens, das zur Trennung und Reinigung von Proteinen, Nuleinsäuren, Polysacchariden, Hormonen, Vitaminen, Zellen oder dgl. verwendet wird. Bei derartigen Anwendungszwecken wird das zu immobilisierende bioaktive Material in Abhängigkeit von der zu reimgenden Substanz ausgewählt. Es ist beispielsweise vorgesehen, T-Zellen aus B-Zellen oder umgekehrt abzutrennen, dann werden zuerst Lymphocyten aus dem Blut in herkömmlicher Weise, beispielsweise durch eine dichte Gradientzentrifugiermethode, gesammelt. Dann wird eine Suspension der Lymphocytenfraktion mit einem affinitätschromatographischen Adsorbens kontaktiert, das Antiimmunoglobulinantikörper trägt, die auf dem Grundmaterial immobilisiert sind, worauf B-Zellen selektiv an dem Adsorbens adsorbiert werden und die T-Zellen aus dem Adsorbens austreten. Die adsorbierten B-Zellen werden mit einer Immunoglobulinlösung desorbiert. Wird ferner ein Antiserum oder eine Lösung, die ein Hormon oder ein Vitamin enthält, mit einem affinitätschromatographischen Adsorbens gemäß vorliegender Erfindung kontaktiert, das Albumin oder Immunoglobulin oder einen Antikörper oder Rezeptor für ein Hormon oder Vitamin in immobilisierter Form trägt, dann wird der Antialbuminantikörper oder der Antiimmunoglobulinantikörper in dem Antiserum oder dem Hormon oder Vitamin selektiv an dem Adsorbens adsorbiert. Die gewünschte Substanz kann dann mit einer Pufferlösung eluiert werden, die einen anderen pH-Wert als einen physiologischen pH-Wert aufweist, wobei eine konzentrierte Salzlösung oder eine Lösung eines grenzflächenaktiven Mittels in Frage kommen. Erfolgt eine nichtspezifische Adsorption an dem affinitätschromatographischen Adsorbens, dann werden andere Substanzen als die gewünschte Substanz ebenfalls adsorbiert. Diese Substanzen werden ebenfalls mit der gewünschten Substanz eluiert, wobei die Reinigungsmethode gefährdet wird. Das erfindungsgemäße chromatographische Adsorbens ermöglicht demgegenüber einen hohen Reinigungsgrad, da keine nichtspezifische Adsorption erfolgt und damit keine Verunreinigung des Eluats mit Verunreinigungen.
Ein weiterer Verwendungszweck für den erfindungsgemäß eingesetzten Immobilisationsträger liegt in der Verwendung als selektive Elektrode aus einer Metall-
elektrode, beispielsweise aus einer Elektrode aus Platinschwarz, Kupfer oder dgl., einer pH-Elektrode aus Glas, einem FET-Sensor aus Siliciumnitrid oder dgl. als Grundmaterial und einem Enzym, Antigen, Antikörper, Komplement oder dgl., immobilisiert auf der Oberfläche des Grundmaterials. Reagiert das bioaktive Material, das auf der Oberfläche einer derartigen Elektrode immobilisiert ist, mit der aufzuspürenden Substanz, dann wird ein elektrischer Strom in der Elektrode oder eine Veränderung der elektrischen Spannung um die Elektrode herum bewirkt, so daß die spezifische Substanz, die mit dem bioaktiven Material reagiert, selektiv aufgespürt werden kann. Beispielsweise kann im Falle einer selektiven Elektrode, die durch Immobilisieren von Urease auf der Oberfläche einer Glas-pH-Elektrode hergestellt worden ist, der Titer von Harnstoff in einer Probe ermittelt werden, da die Urease den Harnstoff in Ammoniak umwandelt, welcher die pH-Elektrode anregt. Unter Einsatz einer Elektrode, die durch Immobilisation eines Antigens, wie DNA oder Albumin, oder eines Antikörpers, wie eines Antiimmunoglobulinantikörpers, auf der Oberfläche eines FET-pH-Sensors erzeugt worden ist, kann ein Antikörper, wie ein Anti-DNA-Antikörper, ein Antiglobulinantikörper oder dgl., oder das Antigen, wie Immunoglobulin, selektiv aufgespürt werden. Erfolgt eine nichtspezifische Adsorption von Protein oder dgl. auf der Elektrode, dann ist ein Zeigerausschlag oder ein Geräusch festzustellen, weil Veränderungen in der Spannung oder im Strom durch die Adsorption von Substanzen induziert werden, die verschieden sind von dem gesuchten Material auf der Elektrodenoberfläche. Der Zeigerausschlag oder das Geräusch stehen im Gegensatz zu einer stetigen Ablesung oder Wahrnehmung. Da keine nichtspezifische Adsorption von Proteinen oder dgl. erfolgt, gewährleistet die erfindungsgemäße selektive Elektrode sichere und reproduzierbare Bestimmungen.
Ferner kann der erfindungsgemäß verwendete Immobilisationsträger als Säule für Analysen, insbesondere für kontinuierliche Analysen einer Vielzahl von Proben während einer kurzen Zeitspanne dienen. Die Säule kann eine Säule aus Glas, einem organischen Polymeren oder aus Metall sein, wobei sie mit Körnern oder Kügelchen aus Glas oder einem organischen Polymeren gepackt sein kann. Ferner kommt eine Säule in Frage, deren Innenwand als Träger für ein bioaktives Material dient Die für diesen Anwendungszweck eingesetzten bioaktiven Materialien können aus Antigenen, Antikörpern, Komplementen und Enzymen je nach dem beabsichtigten Verwendungszweck bestehen. Beispielsweise wird eine Analysensäule in der Weise hergestellt daß eine Hälfte des Raums in Richtung auf den Einlaß einer Glassäule mit einem erfmdungsgemäßen Träger gepackt wird, der aus Glaskügelchen besteht, welche GIukoseoxidase in immobilisierter Form tragen, während der verbleibende halbe Raum mit einem ähnlichen Träger gefüllt wird, welcher Peroxidase trägt Eine Glukose enthaltende Probe wird durch die Säule geschickt Die Glukoseoxidase zersetzt die Glukose unter Gewinnung von Glukonsäure und Wasserstoffperoxid. Die Peroxidase reagiert mit dem Wasserstoffperoxid quantitativ, wobei durch eine oxidative Kupplung Phenol und 4-Aminoantipyrin unter Gewinnung eines roten Farbstoffes gekuppelt werden. Die Absorption bei 505 nm wird dann mit der Fließzelle eines Spektrophotometers zur Bestimmung der Konzentration an Glukose in der Probe gemessen. Wird der Antikörper zu «-Fetoprotein, der im Blut von Krebspatienten gefunden wird, in der erfindungsgemäßen Analysensäule immobilisiert, und wird eine Plasma- oder Serumprobe durch die Säule geschickt, dann wird das «-Fetoprotein allein in der Säule festgehalten. Wird nach dem Waschen der Säule das kovalente Konjugat des Antikörpers zu Λ-Fetoprotein mit Peroxidase in die Säule eingeführt, dann wird die Menge an Peroxidase, die der festgehaltenen Menge an Λ-Fetoprotein entspricht, in der Säule festgehalten. Die Säule wird zur Entfernung von nichtfestgehaltener Peroxidase gewaschen, worauf eine Färbemittelmischung aus Phenol und 4-Aminoantipyrin durch die Säule geschickt wird. Dabei bildet sich ein roter Farbstoff in einer Menge, welcher der Peroxidasemenge entspricht. Die Absorption bei 505 nm wird dann mit einem Spektrophotometer zur Bestimmung der Konzentration von Λ-Fetoprotein in der Probe gemessen. Wird nach dieser Bestimmung das Adsorbens mit einer Lösung eines grenzflächenaktiven Mittels oder einer konzentrierten Salzlösung gewaschen, dann werden das festgehaltene Ä-Fetoprotein, die Oxidase oder dgl. desorbiert und die Säule für eine Analyse der nächsten Probe vorbereitet. Erfolgt jedoch eine nichtspezifische Adsorption von Proteinen oder dgl. in der Analysensäule, dann wird das immobilisierte bioaktive Material mit den adsorbierten Materialien bedeckt, so daß es nicht mehr in ausreichendem Maße reaktiv ist, wobei ferner Reaktionen von adsorbierten Proteinen oder dgl. die gewünschte Reaktion der Probe beeinflussen oder eine Farbuntersuchung schwierig machen können. Diese Erscheinungen führen zu ungenauen Analysen und verkürzen die Gebrauchsdauer der Analysensäule. Demgegenüber erfolgt im Falle einer unter Einsatz eines erfindungsgemäß verwendeten Trägers hergestellten analytischen Säule keine spezifische Adsorption von Proteinen oder dgl., so daß über viele Stunden hinweg reproduzierbare Analysen durchgeführt werden können.
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung, ohne sie zu beschränken.
Beispiel 1
Amberlite XAD-7, ein poröses Methacrylatadsorbens, wird in eine 0,5%ige wäßrige Ethanollösung eines Copoiymeren aus 20 Gew.-% Methacrylsäure, 79,5 Gew.-% Hydroxyethylmethacrylat und 0,5 Gew.-% Glycidylmethacrylat eingetaucht Nach dem Trocknen wird eine Härtungsreaktion bei 1200C während 2 Stunden durchgeführt Wie aus den Tabellen I und II zu ersehen ist, adsorbiert nichtbeschichtetes XAD-7 merkliche Mengen an Rinderserumalbumin und Rinderserum-/-globulin, während das in der vorstehend beschriebenen Weise beschichtete XAD-7 nicht wesentlich die zwei Proteine adsorbiert
Tabelle I
Adsorption von Rinderserumalbumin, 37"C1 10 ml phosphatgepufferter Salzlösung/l g trockenes XAD-7
Konzentration von Albumin
in der überstehenden
Flüssigkeit (g/dl)
anfängliche nach 2 h
Konzentration
Nichtbeschichtetes 1,5 0,5
XAD-7
Beschichtetes 1,8 1,7
XAD-7
Tabelle II
Adsorption von Rinder-/-globulin (gleiche Bedingungen wie in der Tabelle I)
Konzentration von /-Globu nach 2 h
lin in der überstehenden
Flüssigkeit (g/dl) 0,9
anfängliche
Konzentration 1,5
Nichtbeschichtetes 1,5
XAD-7
Beschichtetes 1,5
XAD-7
Das beschichtete XAD-7 wird mit N-Hydroxysuccinimid in Dioxan zur Gewinnung des aktiven Esters umgesetzt, worauf Urease in einem Phosphatpuffer für die Immobilisation umgesetzt wird. Die Urease wird ohne Verlust ihrer enzymatischen Aktivität immobilisiert, und das Produkt zeigt die in der Tabelle III zusammengefaßte Ureaseaktivität.
Die BET-Oberfläche von nicht-beschichtetem XAD-7 beträgt 480 m2/g und diejenige von beschichtetem XAD-7 410 m2/g, was nur eine geringe Oberflächenverminderung bedeutet.
Tabelle III
Ureaseaktivität, 37
Konzentration an 1		 0C
Harnstoff (mg/dl)		 Nach 2
h
Anfängliche
Konzentration		 14
24
XAD-7
(Beispiel 1)
GPG-10-700
(Beispiel 2)		 50
85
Beispiel 2
CPG-10-700, ein poröses Glas, wird mit 3-Aminopropyltriethoxysilan behandelt und dann mit dem gleichen Copolymere»! überzogen, das gemäß Beispiel 1 eingesetzt worden ist. Wie aus den Tabellen IV und V hervorgeht, adsorbiert das nichtbeschichtete CPG-10-700 merkliche Mengen an Rinderserumalbumin und Rinder-/-globulin, während das beschichtete CPG diese Proteine nicht in merklichem Ausmaße adsorbiert.
Wird Urease auf dem Träger wie im Falle des Beispiels 1 immobilisiert, dann erfolgt kein wesentlicher Verlust der Ureaseaktivität, wie aus Tabelle III hervorgeht.
Tabelle IV
Adsorption von Rinderserumalbumin (gleiche Bedingungen wie in Tabelle Ί)
Konzentration des Albumins nach 2 h
in derüberstehenden
Flüssigkeit (g/di 1,0
anfängliche
Konzentration 2,0
Nichtbeschichtetes 1,8
CPG-10-700
Beschichtetes ',8
CPG-10-700
Die BET-Oberfläche und das Porenvolumen von nichtbeschichtetem CPG-10-700 betragen 37 m2/g bzw. 1,25 cm3/g und die entsprechenden Werte von beschichtetem CPG-10-700 32m3/g bzw. 1,11 cm3/g. Daher ist die Abnahme der Porosität vernachlässigbar.
Beispiel 3
Glaskügelchen mit einem Durchmesser von 0,2 bis 0,6 mm werden in eine 50%ige Fluorwasserstoffsäure bei Zimmertemperatur 1 h eingetaucht und dann in einer 10-m-NaOH-Lösung bei 80°C 1 h wärmebehandelt. Die Glaskügelchen werden dann mit einer 0,5%igen Ethanollösung eines Copolymeren aus 79 Gew.-% Hydroxyethylmethacrylat, 20 Gew.-% Methacrylsäure und 1 Gew.-% Glycidylmethacrylat besprüht Das Gewichtsverhältnis des Copolymeren beträgt ungefähr 0,5 Gew.-% bezüglich der Glaskügelchen. Der erhaltene Träger für eine Immobilisation von bioaktiven Materialien absorbiert kein Rinderserumalbumin und/oder γ-Giobulin.
20 g dieses Trägers werden nach der in Beispiel 1 beschriebenen Weise aktiviert, worauf 50 mg Rinderserumalbumin darauf immobilisiert werden. Eine Säule wird mit dem vorstehend beschriebenen Träger gefüllt und 20 ml einer Kaninchen-ACD-Plasmaprobe, die ungefähr 6,9 mg Antirinderserumalbuminantikörper enthält, mit einer Fließgeschwindigkeit von 6,2 ml/min umlaufen gelassen. Während das Plasma vor dem Umlau-
3ö fenlassen Niederschläge mit einer 20-mg/dl-Phosphatpuffersalzlösung von Rinderserumalbumin bildet, sind nach 2stündigem Umlaufenlassen keine Niederschläge mehr festzustellen. Daher kann unter Einsatz des Trägers mit daran immobilisiertem Rinderserumalbumin gemäß vorliegender Erfindung der Antirinderserumalbuminantikörper in dem Hundeplasma in erfolgreicher Weise adsorbiert und entfernt werden.
Beispiel 4
Eine Säule wird mit 15 g eines Trägers gefüllt, auf dem ungefähr 2,3 mg Antirinderserumalbuminantikörper nach der in Beispiel 3 beschriebenen Weise immobilisiert worden sind. 10 ml einer phosphatgepufferten Salzlösung, die 2,2 mg Rinderserumalbumin enthält, wird durch die Säule umlaufengelassen.
Bei einer vierfachen Verdünnung der Lösung vor dem l'mlaufenlassen werden bei Verwendung einer wäßrigen Lösung von Antirinderserumalbuminantikörper (46 ml/dl) Niederschläge gebildet, während eine vierfache Verdünnung der Lösung nach einem lstündigen Umlaufenlassen keine Niederschläge mehr verursacht. Daher ist es unter Einsatz des erfindungsgemäßen Trägers mit Antirinderserumalbuminantikörper möglich, das Rinderserumalbumin in der Lösung erfolgreich zu adsorbieren und zu entfernen.
Beispiel 5
Nach der in Beispiel 3 beschriebenen Arbeitsweise wird Antirinderserumalbuminantikörper (Kaninchen) mit Amberlite XAD-4, einem porösen Styrolharz, zur Herstellung eines Adsorbenes für eine Affinitätschromatographie verkuppelt. 15 g des vorstehend beschriebenen Adsorbenes werden in eine Polypropylensäule eingefüllt, die mit einem Stütznetz an jedem Ende versehen ist Nachdem die Säule gründlich mit phosphatgepufferter Salzlösung (FBS pH 7,4) gewaschen worden
11
ist, werden 100 ml einer Lösung, die jeweils 5 mg/dl Rinderserumalbumin und Rinderserum-^-globulin enthält, durch die Säule geschickt. Die Säule wird mit PBS gewaschen, worauf 100 ml einer Sm-Kaliumthiocyanat/PBS-Lösung durchgeschickt werden. Das Eluat wird gegen PBS bei 4° C 24 h dialysiert. Die gesamte Proteinkonzentration dieser Lösung wird nach der Biorettmethode gemessen und die Albuminkonzentration nach der Bromkresolgrünmethode zur Ermittlung der Reinheit und des Prozentsatzes der Gewinnung von Albumin ge- ίο messen. Die Ergebnisse sind folgende: Gesamtprotein 2,0 g, Albumin 2,0 mg, Albuminreinheit 100%, Prozentsatz Albumingewinnung 40%.
Beispiele
Eine Glas-pH-Elektrode wird in eine 5%ige Ethanollösung des Copolymeren aus 79 Gew.-% Hydroxyethylmethacrylat, 20 Gew.-% Methacrylsäure und 1 Gew.-% Glycidylmethacrylat eingetaucht, worauf ein Trocknen in einem Heißluftofen durchgeführt wird. Die vorstehende Methode wird insgesamt dreimal wiederholt. Dann wird in einem Phosphatpuffer Urease auf dem beschichteten Träger in Gegenwart von l-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid-hydrochlorid zur Herstellung einer Elektrode zur Aufspürung von Harnstoff immobilisiert. Diese Elektrode wird mit einem pH-Meter zur Ermittlung des Unterschiedes zwischen der Harnstofflösung und der harnstofffreien Lösung verbunden. Man stellt fest, daß die Harnstofflösung eine pH-Zunahme zeigt, die im wesentlichen proportional zu der Harnstoffkonzentration ist. Dies bedeutet, daß diese Elektrode eine kontinuierliche Untersuchung von Harnstoff ermöglicht
35
Beispiel 7
1 g des gemäß Beispiel 1 beschichteten Amberlite XAD-7 wird mit Glukoseoxidase (Aktivität 25 U/mg) in einem Phosphatpuffer (pH 7,0) behandelt, ferner wird 1 g des gleichen Materials mit Peroxidase (Meerrettich, Aktivität 100 U/mg) behandelt Diese zwei immobilisierten Enzyme werden der Reihe nach in eine Glassäule mit einem Innendurchmesser von 6 mm zur Herstellung einer chromatographischen Säule eingefüllt. Das Auslaßende der Säule in der Nähe der Peroxidase v/ird mit der Fließzelle eines Spektrophotometers verbunden. Fließt eine Lösung, welche Glukose enthält, von dem Einlaßende der Säule (nahe der Glukoseoxidase) hindurch, dann wird die Absorption bei 505 nm erhöht. Diese Zunahme der Absorption ist proportional zu der Glukosekonzentration der Lösung. Man stellt daher fest, daß diese Analysesäule für eine quantitative Bestimmung von Glukose geeignet ist
55
60
65

Claims (5)

Patentansprüche:
1. Verwendung eines Trägers aus einem Grundmaterial, das mit einen1 Copolymeren aus (i) einem hydrophilen Acrylat- oder Methacrylatmonomeren der allgemeinen Formel
CH2 = C(Ri)CO2R2OR3
worin Ri für H oder Methyl steht, R2 ein substituierter oder nichtsubstituierter zweiwertiger Alkylenrest mit 2 bis 3 Kohlenstoffatomen oder ein Polyoxyalkylenrest ist, R3 für H oder einen Alkylrest mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen steht, wobei dieser Alkylrest außerdem durch polare Substituentengruppen substituiert sein kann, und (ii) einer copolymerisierbaren ungesättigten Carbonsäure der allgemeinen Formel
CH2=C(R1)CO2H
worin Ri für H oder Methyl steht, oder (iii) einem copolymerisierbaren ungesättigten Amin der allgemeinen Formel
CH2 = C(Ri)CO2R2NHR3
worin Rj für H oder Methyl steht, R2 ein zweiwertiger Alkylenrest mit 2 bis 3 Kohlenstoffatomen ist und R3 für H oder einen Alkylrest mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen steht, und die copolymerisierbare Komponente in einer Menge von 1 bis 50 Gew.-%, bezogen auf das Gesamtgewicht der Monomeren, vorliegt, beschichtet ist, für die Immobilisierung von bioaktiven Materialien.
2. Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Grundmaterial aus Glas, Aktivkohle, Siliciumdioxid, Aluminiumoxid oder organischen Verbindungen mit hohen Molekulargewichten besteht und in Form von Körnern, Kügelchen, Bahnen, Folien oder Rohren verwendet wird.
3. Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Grundmaterial ein poröses oder nichtporöses Glas mit einem Teilchendurchmesser von 0,05 bis 5 mm ist.
4. Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Copolymere zusätzlich eine ausreichende Menge eines epoxienthaltenden Monomeren enthält.
5. Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die copolymerisierbare Komponente in dem Copolymeren in Mengen von 10 bis 40 Gew.-% vorliegt.
Die Erfindung betrifft die Verwendung eines nachfolgend näher definierten Trägers für die Immobilisierung von bioaktiven Materialien, indem sie eine spezifische biochemische Reaktion ermöglicht, an der das bioaktive .Material teilnimmt. Unter den Begriff »bioaktives Material« fallen Gewebe, Zellen, Enzyme, Antigene, Antikörper, Immunkomplexe, Komplemente sowie andere Serumproteine oder Polysaccharide oder Komplexe davon.
Es ist bekannt, daß eine Reaktion von bioaktiven Materialien auf einem Immobilisationsträger eine quantitative und selektive Bestimmung einer Substanz ermöglicht, die in Gegenwart bestimmter Antikörper oder Antigene entweder in vivo oder in vitro reaktiv ist, oder eine selektive Entfernung von bestimmten Substanzen während des Verlaufs einer chemischen Reaktion ermöglicht, so daß eine derartige Reaktion auf einem Träger ganz allgemein auf dem Gebiet der physiologischen Chemie und der Medizin eingesetzt werden kann. Träger dieses Typs, die bisher im allgemeinen verwendet worden sind, bestehen aus porösem Glas oder einer hochpolymeren Substanz, Polystyrolkügelchen oder dgl., wobei funktioneile Gruppen, die sich mit Molekülen eines bioaktiven Materials verbinden, vorgesehen sind. Der Einsatz derartiger Träger ist jedoch begrenzt, da sie nicht spezifisch genug sind, um alle Substanzen mit Ausnahme des gesuchten bioaktiven Materials abzustoßen. Versucht man, funktionell Gruppen in ein derartiges Trägermaterial einzuführen und das gesuchte bioaktive Material daran zu binden, dann wird das nichtumgesetzte Material, das in nichtspezifischer Weise adsorbiert worden ist, nicht gründlich entfernt, sondern bleibt an dem Träger zurück. Führt man eine Reaktion eines derartigen immobilisierten bioaktiven Materials mit einer Lösung (einschließlich Körperflüssigkeiten, wie Blut, Plasma, Serum oder Urin) aus einem anderen Material (beispielsweise dem Substrat im Falle einer enzymatischen Reaktion oder dem Antigen oder Antikörper einer immunologischen Reaktion) durch, dann erfolgt eine bisher unvermeidbare nichtspezifische Adsorption von Substanzen neben den gewünschten Materialien, so daß eine Herabsetzung der Spezifität der Reaktion die Folge ist. Insbesondere dann, wenn das immobilisierte bioaktive Material für therapeutische Zwecke -verwendet wird, wird das nichtumgesetzte Material in den Körper als heterologe Substanz eingeführt, wobei Blutkoagulationsfaktoren sowie Plättchen adsorbiert werden und ein Gerinnen oder eine Aktivierung des Lymphocytensystems bewirken, was zur Folge hat, daß dieser Reaktionstyp nicht in die klinische Praxis eingeführt werden kann.
Die Erfindung hat sich die Aufgabe gestellt, die vorstehend geschilderten Nachteile zu beseitigen.
Diese Aufgabe wird durch die erfindungsgemäße Verwendung des in Anspruch 1 beschriebenen Trägers gelöst. Dieser Träger gewährleistet eine minimale nichtspezifische Adsorption und beseitigt damit die geschilderten Nachteile.
Als polare Substituentengruppen an dem Substituenten R3 kommen OH, NH2 oder dergleichen in Frage.
In der DE-OS 27 35 179 werden Adsorbentien für eine Hämoperfusion beschrieben, eine Verwendung als Träger für eine Immobilisierung von bioaktiven Materialien wird jedoch nirgends erwähnt.
Demgegenüber wird durch die Erfindung ein Träger für die Immobilisierung von bioaktiven Materialien zur Verwendung für die Immobilisierung von bioaktiven Materialien zur Verfügung gestellt, der ein Minimum an nichtspezifischer Adsorption gewährleistet. Wesentlich ist dabei die Beschichtung des Substrats, das aus einem Polymethacrylat bestehen kann, mit einem spezifischen Acrylat- oder Methacrylatcopolymeren, das aus 1. einem hydrophilen Acrylat- oder Methacrylatmonomeren und 2. Acrylsäure oder Methacrylsäure oder 3. einem Aminderivat von Acrylsäure oder Methacrylsäure hergestellt wird. Wird das Substrat mit einem vorstehend beschriebenen Copolymeren beschichtet, dann liegt eine Oberfläche mit folgender Seitenkette
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