DE3110801A1 - Lebendes vakzin fuer die impfung von gefluegel und saeugetieren - Google Patents

Lebendes vakzin fuer die impfung von gefluegel und saeugetieren

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DE3110801A1 DE19813110801 DE3110801A DE3110801A1 DE 3110801 A1 DE3110801 A1 DE 3110801A1 DE 19813110801 DE19813110801 DE 19813110801 DE 3110801 A DE3110801 A DE 3110801A DE 3110801 A1 DE3110801 A1 DE 3110801A1
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Description

- 3 Beschreibung
Die Erfindung betrifft neue Bakterienmutanten, ein Verfahren zu ihrer Herstellung und sie enthaltende, lebende Vakzine. Die Erfindung betrifft "Breitspektrumvakzine" oder Impfstoffe auf der Grundlage neuer Bakterienmutantenstämme und ein Verfahren für die Impfung von Säugetieren und Geflügel mittels solcher lebender Vakzine. Das Vakzin ist besonders wertvoll bei Tieren in der Landwirtschaft und ergibt eine lang andauernde Immunisierung gegenüber einem großen Bereich von Bakterien. Die neuen Mutanten sind nichtzurückschlagend und sind im wesentlichen nicht-pathogen und können für die wirksame Immunisierung von Säugetieren und Geflügel verwendet werden.
Gramnegative Bakterien und insbesondere zu Enterobacteriaceae gehörende Bakterien (enterische Bakterien) stellen in der Medizin und bei der Paarung und Haltung von Tieren ein zunehmend schwierigeresProblem dar. Die Bakterien dieser Art verursachen bei Geflügel, bei Menschen und bei anderen Säugetieren verschiedene Infektionen, und die Behandlung der Krankheiten und Infektionen, die durch einige von ihnen verursacht werden, ist schwierig, bedingt durch die Tatsache, daß ein großer Teil solcher Bakterien eine Resistenz gegenüber einer großen Zahl der derzeit verfügbaren Antibiotika entwickelt hat. Diese Resistenz gegenüber Antibiotika ist vermutlich auf die Tatsache zurückzuführen, daß verschiedene Bakterien infektiöse, arzneimittel-resistente Plasmide tragen.
Eine mögliche Lösung dieser Schwierigkeiten, die durch solche Bakterien hervorgerufen werden, und insbesondere auf dem Gebiet der Tierhaltung und Paarung (wie Züchtung von Geflügel u.a.), ist die Verwendung von wirksamen Impfungen. Solche Impfungen müssen lange andauern und sollten ein großes Spektrum von infektiösen Mitteln abdecken. Da Entero-
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bacteriaceae zu einer großen Vielzahl von Serotypen gehören, ist es schwierig, einen Impfstoff herzustellen, der eine ausreichende Zahl von infektiösen Mitteln abdeckt.
Es wurde jetzt in Laborversuchen gezeigt, daß es möglich ist, Bakterienmutanten herzustellen, denen O-Antigen fehlt, d.h. Bakterien, die als "stark roh " (deep rough) bezeichnet werden können, und daß solche Bakterien ein Immunisierungsspektrum aufweisen, wenn sie in in der Wärme abgetöteten Vakzinen verwendet werden, welches sehr breit ist. Solche Bakterienmutanten, d.h. "stark rohe" Bakterien, können als wärmeabgetötete Vakzine für die Immuniäerung gegenüber einem großen Bereich von Enterobacteria verwendet werden. Die Immunisierung mit in der Wärme abgetöteten Vakzinen ist jedoch nicht sehr wirksam. Eine Vielzahl von Impfungen ist erforderlich, die durch Injektion verabreicht werden müssen. Eine solche Impfung hält außerdem nur während kurzer Zeit an. Die Immunisierung durch Injektion ist in der Humanmedizin nicht geeignet und praktisch bei der Tierhaltung, wenn eine große Zahl von Geflügel o.a. geimpft werden muß, unmöglich. Durch die vorliegende Erfindung werden die Nachteile der bekannten Vakzine und ebenfalls die der in der Wärme abgetöteten Vakzine des "stark rohen" Bakterientyps beseitigt.
Die vorliegende Erfindung betrifft neue Bakterienmutanten, die für die wirksame Impfung von Geflügel und Säugetieren verwendet werden können. Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung solcher Mutantenstämme und Impfstoffe oder Vakzine auf der Grundlage der so hergestellten, lebenden Mutantenbakterien. Die Erfindung betrifft weiterhin neue Vakzine auf der Grundlage solcher lebenden Bakterien und ein Verfahren zum Impfen von Tierbeständen mittels solche Vakzine.
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Bei der Herstellung von "stark rohen" Mutanten vorbestiramter Bakterien können isolierte, neue Stämme hergestellt werden, denen das O-Antigen vollständig fehlt. Es können auch Stämme erhalten werden, die keine Zurückschlag-Reversions-Mutation bei der Biosynthese von Lipopolysacchariden aufweisen. Die Mutanten sind Deletionsmutanten (deletion mutants) und können in an sich bekannter Weise gezüchtet werden. Man beobachtet im Labor oder nach der Reisolation von injizierten Tieren keinen Umschlag bzw. keine Reversion. Die Stämme sind im wesentlichen nichtvirulent und nicht-pathogen. Eine große Zahl solcher Bakterien kann in Labortiere, ohne daß nachteilige Wirkungen beobachtet werden, injiziert werden. Die Mutanten sind die wirksamen aktiven Bestandteile lebender Vakzine, die ein breites Schutzspektrum gegenüber Pathogenen ergeben, wobei der Schutzbereich eine Funktion des Typs der verwendeten Bakterien ist.
Gemäß einer besonderen erfindungsgemäßen Ausführungsform werden Deletionsnmtanten von Enterobacteriaceae zur Verfügung gestellt, denen im wesentlichen das O-Antigen fehlt (d.h. sie können als "stark roh" bezeichnet werden). Sie ergeben eine wirksame und langdauernde Immunisierung gegenüber einem großen Bereich von Bakterien, die zu Enterobacteriaceae gehören. Die neuen Vakzine können in Arzneimitteln verwendet werden. Sie sind bei der Tierhaltung und Paarung von besonderem Wert. Es ist ein ausgeprägter Vorteil solcher lebenden Vakzine, daß sie als Aerosole verabreicht werden können. Versuche haben gezeigt, daß Küken und Hühner, die durch Einwirkung eines Aerosols eines solchen Vakzins immunisiert wurden, einen langdauernden Schutz gegenüber einem großen Spektrum von Vogelpathogenen erhalten.
Eine besonders bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft einen neuen Mutantenstamm von Escheri-
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chia coll K-12, der selbst ein nicht-pathogener Stamm ist und in dem man Rekombinations-DNA-Experimente "EK1" durchführen kann. Die neuen Mutanten sind im wesentlichen nichtvirulent und können als lebende Vakzine verwendet werden. Solche Vakzine können in Form von Aerosolen für die wirksame Immunisierung von Säugetieren verwendet werden. Der neue Stamm ist eine Mutante, der das O-Antigen als Folge einer nicht-zurückschlagenden Deletion fehlt. Da solche 0-Antigene für Species, die für Sero-Typen spezifisch sind, verantwortlich sind, ergibt eine Mutante, die bei der Biosynthese der O-Antigene fehlt, eine Immunisierung gegenüber solchen Antigenen, die allen enterischen Bakterien gemeinsam sind, d.h. KDO und Lipid A. Die Mutante ist wirksam, um eine wirksame Immunisierung gegenüber einem großen Bereich von Enterobacteriaceae zu ergeben. Die neue Mutante des K-12 Stamms wird als LR-2 bezeichnet und ist bei der Deutschen Sammlung für Mikroorganismen unter DSM Nr. 2051 hinterlegt (Hinterlegungsdatum 25.2.1981). Sie wird im folgenden näher charakterisiert.
Die Mutagenese bzw. Mutation erfolgt unter Verwendung von Salpetrigsäure und unter Auswahl des gewünschten Mutantenstamms. Der Stamm ist nicht-zurückschlagend, die Rever-
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sionsrate 1st geringer als 10 .Es wurden keine Revertanten nach wiederholten Injektionen in Tiere isoliert. Die Mutagenese kann durch Bestrahlung, phageninduzierte Auslöschungen, wie eine Phase ai usw., induziert werden.
Die Erfindung kann mit einem großen Bereich von Bakterien durchgeführt werden. Sie wird im folgenden unter Bezugnahme auf die Bildung eines spezifischen, neuen Mutantenstamms, der sich von Escherichia coil K-12 ableitet, näher erläutert.
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Herstellung des Mutantenstamms
Die Mutagenese erfolgt mit Salpetrigsäure, welche gerade vor der Verwendung durch Vermischen gleicher Mengen von Natriumnitrit (0,1 M) und 0,1 M Acetatpuffer, pH 4,6 bis zur Endkonzentration von 0,05 M, bezogen auf das Nitrit, hergestellt wurde. Eine einzige Kolonie von Escherichia coli K-12 wird über Nacht unter Schütteln bei 370C in einem Nährmedium LB gezüchtet, welches 10 g Bacto trypton, 5 g Hefeextrakt und 10 g Natriumchlorid/l enthält. Dann wird mit einem gleichen Volumen Acetatpuffer gewaschen und in 0,3 ml Salpetrigsaure (0,05 M) erneut suspendiert. Nach der Inkubation während 10 min bei 37°C werden die Zellen gewaschen, erneut in 10 ml Medium LB suspendiert und über Nacht bei 370C inkubiert.
Die Mutanten werden wie folgt bewertet: Es wird ein Screening durchgeführt. Die Übernacht-Kultur wird in 1:100 in frischem LB-Medium verdünnt und bei 37°C unter Schütteln gezüchtet. Nachdem das Wachstum wieder angefangen hat, wird Bacteriophage T^ in einer Multiplizität von 5 Infektionen zugegeben und die Inkubation wird weitergeführt, bis eine Lysis stattfindet. Die überlebenden Bakterien werden auf LB-Agarplatten gegeben und die Kolonien werden auf ihre antibiotische Empfindlichkeit und Phagenresistenz geprüft.
Die neue Mutante, die als LR-2 bezeichnet wird, besitzt die folgenden Eigenschaften:
Erforderliche Nährstoffe
Leucin, Adenin, Tryptophan, Histidin, Arginin, Isoleucin, Valin, Methionin, Thiamin.
Der Stamm fermentiert die folgenden Verbindungen nicht
Lactose, Galactose, Xylose, Mannit, Maltose.
Der Stamm ist resistent gegenüber
ColiPhage T1, Coli Phage T^, Coli Phage T^, Coli Phage P1;
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die Empfindlichkeit gegenüber anderen Phagen wurde nicht geprüft, und man nimmt an, daß der Stamm gegenüber anderen CoIi Phagen resistent ist.
Hochempfindlich gegenüber
Kristallviolett, Gentianviolett, Methylenblau, Eosin und anderen Farbstoffen; Antibiotika mit hohem Molekulargewicht (hydrophob); Novobiocin, Rifampicin, Erythromycin und dergl.
Der Mikroorganismus wurde bei der Deutschen Sammlung für Mikroorganismen in GSttingen unter der Nr. DSM 2051 am 25.2.1981 hinterlegt.
Die Reversionsrate wurde geprüft, und man stellte fest, daß
-11
sie unter 10 liegt. Auf Platten wurden nach mehrfacher Injektion gegenüber Tieren keine Revertanten isoliert. Man nimmt an, daß die Mutante, die die Bildung von 0-Antigen blockiert, eine Auslöechungsmutante (deletion) ist. Das Verfahren für die Induzierung der Mutation ist eines, von dem bekannt ist, daß es eine hohe Ausbeute an Auslöschungen ergibt.
Die chemische Analyse des gereinigten Lipopolysaccharide aus dem Stamm LR.-2 hat gezeigt, daß die Mutante Lipid A und KDO enthält. Es konnten keine O-Antigen-Kohlenhydrate festgestellt werden.
Herstellung des Vakzins
Für die Herstellung des Vakzins wird eine einzige Kolonie von LR-2 über Nacht auf LB-Medium gezüchtet und 1:100 in dem gleichen Medium auf große Volumen verdünnt. Die ZeI-len werden bei etwa 5 x 10 Bakterien/ml geerntet, dreimal durch Zentrifugieren in 1%iger Natriumchloridlösung gewaschen und erneut in der gleichen Lösung suspendiert. Zu diesem Zeitpunkt ist es möglich, die Kultur zu lyophili-
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sieren und eine hochwirksames, lebendes Vakzin herzustellen,
Immunisierung
Mäuse und Küken werden mit 10° lebenden Bakterien/Tier injiziert. Man beobachtet keine nachteiligen Reaktionen, und die Uberlebensrate beträgt 100#. Mäuse werden mit einem Impfstoff injiziert, der 10' Bakterien/Maus (i.p.-Injektionen) enthält, und dies ergibt einen langdauernden Schutz für mehr als 2 Wochen gegenüber einer letalen Dosis von K. pneumonia, die i.p. injiziert wird. Ein Titer von 1:640 in Hämaglutination wird nach 6 i.p ,-Injektionen erhalten.
Antikörper, die sich nach 6 Injektionen bilden, kreuz-reagieren mit Lipppolysaccharid (LBS) aus C. coli 075, K.pneumonia und Enterobacter aerogenes.
Sechs Injektionen (i.p.) von 10' Bakterien ergeben je eine wirksame Immunisierung gegenüber der i.V.-Injektion von letalen Dosen an E. coli 075 (vergl. Tabelle 3).
Test für die Virulenz
Küken (1, 7, 14 und 28 Tage alt) werden einer großen Dosis von Impfstoff ausgesetzt. Eine Menge von 10 Bakterien wird direkt in den Luftsack der Küken eingeführt oder i.p. injiziert, und man beobachtet keine schädlichen Nebenwirkungen.
Verschiedene Labortiere (Mäuse, Ratten) werden mit einer hohen Zahl (mehr als 10^/Tier) injiziert und man beobachtet keine schädlichen Wirkungen· Das lebende Vakzin ist sicher und nicht-pathogen und kann für die Impfung von Säugetieren und Geflügel ohne schädliche Nebenwirkungen verwendet werden.
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- ίο -
Immunisierung von Küken
Die Küken werden durch Einwirkung eines Aerosols des Vakzins, welches 3 χ 10 Bakterien/ml enthält, immunisiert. Eine Menge von 10 ml wird in ein Volumen von 20 1, in dem 36 Küken vorhanden sind, als Aerosol versprüht, und die Küken werden diesem Aerosol 10 min ausgesetzt. Ein weiterer Versuch wird durchgeführt, indem man das Vakzin in Trinkwasser gibt. Bei diesem Versuch wird eine Menge von 3x10 Bakterien/ml verwendet. Ein dritter Versuch wird
durchgeführt, indem man in den Luftsack 2 χ 10 Bakterien/ Küken injiziert. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 aufgeführt. Die immunisierten Küken werden E. coli O2 und E. coli O7Q, die Vogel-Pathogene sind, ausgesetzt.
Tabelle 1
Schutz von Küken durch Impfen mit LR-2 gegen den Angriff (Injektion in den Luftsack) von E. coli Op
Der Angriff erfolgt mit 10 Bakterien, die in den Luftsack injiziert werden.
Es sind 20 Küken in jeder Gruppe.
Alter der Immunisierungsverfahren Alter beim Gew.%
Immuni slerung
(Tage)		 1+7 Sprühen, Sprühen Angriff Zunahme ,5
I. 1+7
1+7		 Sprühen, Trinkwasser
Kontrolle		 28 50 ,6
Λ
. 1+7 Sprühen, Sprühen 28
28		 57
20
II. 1+7 Kontrolle 30 12
30 -3
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Tabelle 2
Schutz der Küken durch Impfung mit LR-2 gegen den Angriff durch E. coli O70
Die Immunisierung erfolgt durch Einwirkung eines Aerosols, 3 χ 10 /ml, 10 ml in einem 20 1 Volumen während 10 min. Es werden Gruppen von 20 Küken verwendet.
Alter der
Immunisierung
(Tage)		 Alter des Angriffs
(Tage)		 Gewi chts zunähme
nach d.Angriff(%)
I. 1+14 30 5,7
1+21 30 9,2
21 30 11,3
Kontrolle 30 0,02
II. 1 + 21 50 -6
1+14+40 50 6,9
40 50 6,1
Kontrolle 50 -5
Der Angriff erfolgt mit 10^ Bakterien, die in den Luftsack eingebracht werden.
Mäuse werden durch 6 Impfungen, i.p. von 2 χ 10 lebenden Bakterien, während 2 Wochen immunisiert und ein Zusatzmittel wird i.p. bei der Woche 3 und bei der Woche 4 verabreicht. Der Angriff erfolgt am Ende der 6. Woche.
Tabelle 3 Überlebende Tiere nach dem Angriff mit E. coli 0«,-
(2 χ 107 t i.v.)
Immunisieren mit
E.coli 07e (in der Wärme
abgetötet5 17/18 94%
Iil-2 22/31 70%
P.aeruginosa (in der Wärme
abgetötet) 12/38 31%
NaCl (1%), Kontrolle 12/36 33%
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Das oben beschriebene Verfahren für die Induzierung der Mutation kann mit einer Vielzahl ähnlicher Bakterien, wie z.B. anderen Vertretern von Enterobacteriaceae und Pseudomonas, verwendet werden, und die entstehenden Mutanten, die frei von O-Antigen sind, können für eine Immunisierung von Säugetieren in Form eines lebenden Vakzins mit weitem Spektrum verwendet werden. Immunisierung durch Anwendung eines Aerosols des Vakzins ist ein sehr geeigneter und wirksamer Weg für die Immunisierung durch diese Art von Impfstoff.
Polyvalentes Vakzin
Die Immunisierung mit LR.-2 schützt Mäuse gegenüber dem Angriff eines großen Bereichs von Enterobacteriaceae.
Tag der Immunisierung Zum Angriff
verwendeter
Organismus		 Tage des
Angriffs		 Überlebende
Tiere, %
1 K.pneumonia 7 100
1 It 14 0
1, 7 π 21 90
1, 7 η 28 20
1, 7, 14, 21 η 42 30
Kontrolle η 0
1 P. vulgaris 7 100
1 η 14 0
1. 7 Il 21 100
Kontrolle 0
Die Immunisierung und der Angriff erfolgen i.p. in CJrieß
Mäuse. Immunisierung - 2 χ 10' Bakterien/Maus; Angriff -
Ende der Beschreibung.
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Claims (10)

KRAUS & WEI&ERT PATENTANWÄLTE DR. WALTER KRAUS DIPLOMCHEMIKER · DR-ING. ANNEKÄTE WEISERT DIPL.ING. FACHRICHTUNG CHEMIE IRMGARDSTRASSE 15 · D-8OOO MÜNCHEN 71 · TELEFON 089/797077-797078 · TELEX O5-212156 kpatd TELEGRAMM KRAUSPATENT 2836 AW/My RAMOT UNIVERSITY AUTHORITY FOR APPLIED RESEARCH AND INDUSTRIAL DEVELOPMENT LTD. Tel Aviv, Israel Lebendes Vakzin für die Impfung von Geflügel und Säugetieren Patentansprüche
1. Lebendes Vakzin für die Impfung von Geflügel und Säugetieren gegen eine Vielzahl von gramnegativen Pathogenen, die zu Enterobacteriaceae gehören, dadurch gekennzeichnet, daß es eine bakterielle Deletionsmutante enthält, die sich von einem nicht-pathogenen Stamm von E. coli ableitet.
2. Lebendes Vakzin nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die bakterielle Mutante eine "stark rohe"1 Mutante ist, die sich von E. coli K-12 ableitet.
3. Lebendes Vakzin nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Mutante E. coli LR-2 ist (= DSM Nr.2051)
4. Verfahren zur Herstellung eines bakteriellen Mutantenstamms, der in einem lebenden Vakzin nach Anspruch 1 ver-
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-Z-
wendet wird, dadurch gekennzeichnet, daß man einen nichtpathogenen Stamm von E. coli einem eine Mutation induzierenden Mittel aussetzt und die Stämme, die frei von O-Antigenen sind, isoliert und sie zur Herstellung von Bakterien, die in einem solchen lebenden Vakzin verwendet werden, kultiviert.
5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß man als Mittel Salpetrigsaure verwendet.
6. Der Mutantenstamm E. coli LR-2 (DSM 2051).
7. Lebendes Vakzin nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Bakterien zu dem Mutantenstamm E. coli LR-2 (DSM 2051) gehören.
8. Verfahren zur Immunisierung von Geflügel und Säugetieren gegenüber Enterobacteriaceae, dadurch gekennzeichnet, daß man dem Vogel oder dem Säugetier eine wirksame Dosis eines Vakzins nach einem der Ansprüche 1 bis 3 oder 7 auf oralem Weg oder als Aerosol verabreicht.
9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß das Vakzin Geflügel verabreicht wird.
10. Lebendes Vakzin für die Immunisierung von Säugetieren und Vögeln gegenüber Enterobacteriaceae, dadurch gekennzeichnet, daß es eine Deletionsmutante von E.coli, wie zuvor beschrieben, enthält.
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