DE3130834A1 - Immunometrische und inhibierungsassays unter verwendung von monoclonalen antikoerpern - Google Patents
Immunometrische und inhibierungsassays unter verwendung von monoclonalen antikoerpernInfo
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Description
Immunometrische und Inhibierungsassays unter Verwendung von monoclonalen Antikörpern
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweisen und/oder Bestimmen von Konzentrationen von antigenen
Substanzen in Flüssigkeiten, wie Serum. Sie betrifft weiterhin immunometrische und Inhibierungsassaytechniken.
Schliesslich betrifft sie auch monoclonale Antikörper.
Die Bestimmung der Anwesenheit oder Konzentration von antigenen Substanzen, beispielsweise von solchen, wie
sie bei zahlreichen physiologischen Unstimmigkeiten vorkommen, in Serum oder anderen Körperflüssigkeiten,
macht in zunehmendem Masse von Immunoassaytechniken Gebrauch. Diese Techniken basieren auf der Bildung eines
Komplexes zwischen der zu bestimmenden antigenen Substanz
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und einem Antikörper oder Antikörpern, in denen ein oder mehrere Teile des Komplexes markiert sein können,
1 25 beispielsweise durch ein radioaktives Element, wie J, wodurch dann der Nachweis und/oder die quantitative
Analyse nach der Abtrennung des komplexen markierten Antigens oder Antikörpers von nichtkomplexen markierten
Antigenen oder Antikörpern ermöglicht wird.
Im Falle einer kompetitiven Immunoassaytechnik liegt
die antigene Substanz einer zu untersuchenden Flüssigkeitsprobe im Wettbewerb mit einer bekannten Menge eines
markierten Antigens für eine limitierte Menge an Antikörperbindungsstellen. Daher ist die Menge des markierten,
an den Antikörper gebundenen Antigens umgekehrt proportional zu der Menge des Antigens in der Probe.
Dagegen verwenden immunometrische Untersuchungen einen markierten Antikörper. Bei einer solchen Assay ist
die Menge des mit dem Komplex gebundenen markierten Antikörpers proportional der Menge der in der Flüssigkeits—
probe enthaltenen antigenen Substanz.
Immunometrische Assays sind besonders zum Nachweis von polyvalenten Antigenen, d.h. antigenen Substanzen, die
in der Lage sind, mit zwei oder mehr Antikörpern gleichzeitig einen Komplex zu bilden, geeignet. Bei solchen
Assays werden typischerweise eine Menge eines unmarkierten Antikörpers, gebunden an einen festen Träger, der
in der zu untersuchenden Flüssigkeit unlöslich ist, und eine Menge eines löslichen Antikörpers, der eine Markierung,
wie ein radioaktives Isotop, trägt, verwendet, so dass dann der Nachweis und/oder eine quantitative Bestimmung
der Menge des ternären Komplexes, der sich
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zwischen dem Festphasen-Antikörper, dem Antigen und dem markierten Antikörper ausbildet, möglich wird.
In den bekannten immunometrischen Assays werden typischerweise
"Forward"-Assays angewendet, bei denen der an die feste Phase gebundene Antikörper zunächst mit
der zu untersuchenden Probe in Berührung gebracht wird, um das Antigen aus der Probe durch Bildung eines binären
Festphasen-Antikörper:Antigen-Komplexes zu extrahieren.
Nach einer geeigneten Inkubationsperiode wird der feste Träger gewaschen, um den Rest der Flüssigkeitsprobe, einschliesslich nichtumgesetztem Antigen, falls
vorhanden, zu entfernen, und wird dann mit einer Lösung, die eine bekannte Menge des markierten Antikörpers enthält,
in Berührung gebracht.
Nach einer zweiten Inkubierungsperiode, bei welcher man den markierten Antikörper einen Komplex mit dem Antigen
bilden lässt, das an den festen Träger durch den unmarkierten Antikörper gebunden ist, wird der feste Träger
ein zweites Mal gewaschen, um nichtumgesetzten markierten Antikörper zu entfernen. In einer einfachen
"Ja-Nein"-Assay zur Bestimmung, ob Antigen in der zu
untersuchenden Probe vorhanden ist, wird der gewaschene feste Träger untersucht, um die Gegenwart von markiertem
Antikörper festzustellen, beispielsweise indem man
die emittierte Strahlung misst, wenn die Markierung ein radioaktives Element ist. Die Menge des nachgewiesenen
markierten Antikörpers wird mit der einer negativen Kontrollprobe, die frei von dem Antigen ist, verglichen.
Der Nachweis von markiertem Antikörper in Mengen, die erheblich oberhalb der Hintergrundniveaus sind, wie sie
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durch eine Negativkontrolle angezeigt werden, gibt dann...
die Gegenwart des verdächtigen Antigens an. Quantitative Nachweise sind möglich, indem man die Messungen von markierten
Antikörpern, die man mit kalibrierten Proben, enthaltend bekannte Mengen des Antigens, erhält, vergleicht.
Diese Art der Assay wird häufig als eine "Zwei-Stellen"-
oder "Sandwich"-Assay bezeichnet, weil das Antigen zwei
Antikörper an verschiedenen Stellen seiner Oberfläche gebunden hat. Diese und ähnliche Techniken werden von
Wider auf Seiten 199-206 in "Radioimmunoassay Methods",
herausgegeben von Kirkham und Hunter, E. & S. Livingstone, Edinburgh (1970), beschrieben. Einkauf dieser Technik
basierendes Assay zum Nachweis von bei Serumhäpatitis
125 vorkommenden Antigenen, unter Verwendung von J-markiertem
Antikörper, wird in ÜS-PS 3 867 517 beschrieben.
Trotz der grossen Brauchbarkeit sind die bekannten immunometrischen
Assays doch recht langsam, insbesondere weil zwei Waschstufen erforderlich sind und wegen der langen
Inkubierungszeiten, die man benötigt, um Gleichgewichtszustände herbeizuführen, d.h. den Punkt, bei welchem
sich die Menge des gebildeten Komplexes nicht mehr im Laufe der Zeit verändert.
Um wenigstens eine der bei diesem Verfahren benötigten Waschstufen zu vermeiden, sind schon sogenannte "gleichzeitige"
und "Umkehr"-Assays vorgeschlagen worden. Bei einem "gleichzeitigen" Assay wird nur eine einzige Inkubierungsstufe
angewendet, weil der an den festen Träger gebundene Antikörper und der markierte Antikörper
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beide gleichzeitig zu der zu untersuchenden Probe zugegeben werden. Nach Beendigung der Inkubierung wird
der feste Träger gewaschen, um den Rest der Flüssigkeitsprobe und nicht-komplexen markierten Antikörper
zu entfernen. Die Anwesenheit von markiertem Antikörper auf dem festen Träger wird dann nachgewiesen, wie bei
einer üblichen "Forward"-Sandwich-Assay.
Bei einer Umkehrassay gibt man stufenweise zuerst eine
Lösung des markierten Antikörpers zu der Flüssigkeitsprobe und dann gibt man nach einer geeigneten Inkubierungszeit
einen unmarkierten Antikörper, gebunden an einen festen Träger, zu. Nach einer zweiten Inkubierung
wird die feste Phase von Resten der zu untersuchenden Probe und der Lösung von nichtumgesetztem markierten
Antikörper gewaschen. Die Bestimmung des markierten Antikörpers auf dem festen Träger wird dann vorgenommen
wie bei den "gleichzeitigen" und "Forward"-Assays.
Sowohl die "gleichzeitige" als auch die "Umkehr"-Assaytechnik
erfordert eine ausreichende überschussmenge an Festphasen-Antikörper, um den grössten Teil oder das gesamte
vorhandene Antigen zu binden, um einen Hochdosen-Haken-Effekt zu vermeiden, bei dem künstlich negative
oder niedrige Mengen von Antigen festgestellt werden bei ausserordentlich hohen Konzentrationen von Antigen.
Aus diesem Grund ist die "Forward"-Assay beim bisherigen Stand der Technik bevorzugt worden. Dies liegt daran,
dass grosse Mengen an hochgereinigtem aktiven Antikörper, der gegenüber dem interessierenden Antigen spezifisch
ist, für die Herstellung einer Festphase mit einer ausreichenden Antigen-Bindungskapazität schwierig aus den
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polyclonalen Antikörpern, wie sie bisher verwendet wurden, zu erhalten sind. Wird eine immunogene Substanz
in einen lebenden Körper eingeführt, so reagiert das Körperimmunsystem indem es an allen Stellen, an denen
das Immunogen erkannt wird, Antikörper bildet. Ein grosses immunogenes Proteinmolekül kann Dutzende von Stellen
haben und eine "Fremdzelle kann Hunderte davon haben. Während jede Antikörper bildende Zelle Antikörper produziert,
die spezifisch für eine einzelne antigene Stelle sind, hat das Immunsystem eine Spezies von spezifischen
Antikörper produzierenden Zellen für jede erkannte immunogene Stelle entwickelt. Ausserdem bildet der Körper
verhältnismässig grosse Mengen an Antikörpern für solche
Antigene, die nicht diejenigen sind, die gerade von Interesse sind, so dass die meisten der Antikörper in
dem polyclonalen Gemisch nicht spezifisch für das interessierende Antigen sind. Infolgedessen sind die bei den
bisherigen immunometrischen Assays verwendeten Antikörper notwendigerweise "polyclonal", weil sich diese Antikörper
von Antisera ableiten, die in üblicher Weise in Tieren entwickelt wurden und deren Reinigung schwierig
ist. Verfahren zum Affinitätsreinigen solcher Antikörper sind im allgemeinen zeitraubend und ergeben nur niedrige
Ausbeuten und den Verlust von Antikörpern mit hoher Affinität.
Wendet man übliche polyclonale Antikörpergemische bei Umkehr- und Gleichzeitig-Assays an, so ist die Bildung
eines "Sandwich" aus dem Antigen, mit zwei oder mehr markierten Antikörpern, wobei das Antigen an verschiedenen
Stellen gebunden ist, möglich. Diese Komplexe können in der zu untersuchenden Probe löslich
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bleiben und in der nachfolgenden Waschstufe entfernt werden und zählen nicht mit, wenn die Festphase für
den an der Festphase gebundenen markierten Antikörper analysiert wird. Wenn dies in grösserem Ausmass stattfindet,
wird die Empfendlichkeit der Assay vermindert und es können falsche Ergebnisse eintreten. Gibt man
jedoch unmarkierten, gebundenen Antikörper zuerst zu der Probe, wie bei der "Forward-Sandwich"-Assay, wird
durch sterische Überlegungen die Bildung eines Sandwich aus dem Antigen, das mit zwei oder mehr unmarkierten
Antikörpern komplex verbunden ist, verhindert, so dass der markierte Antikörper sich nicht mit dem Antigen verbinden
kann. Infolgedessen kann das Antigen frei mit dem markierten Antikörpermolekül reagieren. Trotzdem wurde
vorgeschlagen, eine gleichzeitige Assay für humanes thyroidstimmulierendes Hormon (HTSH) anzuwenden, indem
man einen grossen Überschuss an nichtmarkiertem Antikörper, gebunden an eine feste Phase, verwendet, um die
Bildung eines löslichen Komplexes durch einen löslichen markierten Antikörper zu minimalisieren (siehe Jeong et
al, "Comparison of Radioimmunoassay" (RIA) with an Unique, Single-Incubation Two-Site Immunoradiometric
Assay (IRMA) as Applied to the Determination of Human Thyroid Stimulating Hormone (HTSH)", Bio-Rad Laboratories,
1979.
Eine Variation einer "Gleichzeitig"-Assay wird in US-PS 4 174 384 beschrieben. Bei dieser Assay werden abgeteilte
Anteile von Anti-IgG (Human) mit einem fluoreszierenden
Chromophor (Fluorescein) bzw. einem Chromophor (Rhodamin), welcher das von dem Fluorescein emittierte Licht absorbiert,
markiert. Beide Antikörper v/erden in löslicher
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Form mit der Human-IgG enthaltenden Probe in Berührung
gebracht. Die Umsetzung des Anti-IgG mit IgG kann zwei
Chromophore nahe genug aneinanderbringen, d.h. innerhalb 100 Λ oder weniger, dass die Emission des Lichtes durch
den fluoreszierenden Chromophor von dem anderen absorbiert wird. Der Prozentsatz der Maximalfluoreszenz bei dieser
Probe wird bestimmt und als Mass für die Menge an IgG in der Probe genommen.
Es wurde auch vorgeschlagen, für HTSH, häpatitisassoziiertes Antigen (HAA) und carcinoembryonisches Antigen (CEA)
eine Umkehrassay anzuwenden, indem man eine Menge an markiertem Antikörper verwendet, die ausreicht für einen
markierten Antikörper-Antigen-Komplex, die aber nicht ausreicht
zur Bildung eines "Sandwich" des gesamten in der Probe vorhandenen Antigens, siehe US-PS 4 093 876.
Da alle drei Verfahrensweisen des Standes der Technik polyclonale Gemische von Antikörpern verwenden, wird
die Möglichkeit für Kreuzreaktionen mit anderen Materialien in dem Serum oder anderen Flüssigkeiten als dem Antigen,
für welches der Test durchgeführt v/ird, erhöht. Das Auftreten der Kreuzreaktivität mit anderen Antigenen vermindert
auch die Empfindlichkeit des Testes für das verdächtige Antigen und erhöht die Aussichten auf ein
"Falsch-Positiv-Assay". Darüber hinaus erfordert die Anwendung
von polyclonalen Antikörpern bei einer Gleichzeitig- oder Umkehrassay eine sorgfältige Abwägung der
Mengen der verwendeten markierten Antikörper, relativ zu der Menge an vorhandenem Festphasen-Antikörper und/oder
Antigen. Im Falle der Verwendung von Fluoreszenzabsorption wird die Empfindlichkeit vermindert, weil bei
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Verwendung von polyclonalen Antikörpern der Minimalabstand zwischen dem fluoreszierenden Chromophor und
dem absorbierenden Chromophor nicht gewährleistet ist.
Aufgrund dieser Nachteile sind die Grenzen der bekannten immunometrisehen Verfahrensweisen klar ersichtlich.
Die üblichen Forward-Assays werden mit weniger Stufen erzielt, benötigen aber grosse Mengen an festphasenspezifischen
Antikörpern und sind nicht gut geeignet zur Bestimmung von kleinen Antigenkonzentrationen, weil
die Bildung eines Sandwich des Antigens mit einer Vielzahl von markierten Antikörpermolekülen im Wettbewerb
steht mit der Bildung des Sandwiches, das den gebundenen Antikörper:Antigen!markierten Antikörper enthält oder,
im Falle einer Fluoreszenzabsorption, weil die Bildung eines Sandwich möglich wirdf ohne dass sich ein Fluores-zenzchromophor
mit einem absorbierenden Chromophor paart. Es können sich deshalb Missinterprätationen oder Falsch-Positiv-Angaben
aufgrund der polyclonalen Natur des Antikörpers ergeben.
Eine Aufgabe der Erfindung ist es, ein verbessertes immunometrisches
Assay für antigene Substanzen zu zeigen. Insbesondere ist es Aufgabe der Erfindung,, eine schnellere
immunometrische Assaytechnik zu zeigen. Ein weiteres Ziel der Erfindung ist es, empfindlichere immunoraetrische
Assaytechniken zu zeigen. Verbunden mit dieser Aufga.bc
ist es auchr verbesserte "Gleichzeitig"- und "Umkchr"-immunometrische
Assays zu zeigen; und schliesslich ist es eine Aufgabe der Erfindung, verbesserte Inhibierungsassays
zu zeigen.
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Die Art und Weise, wie diese Aufgaben erfindungsgemäss
gelöst werden,gehen aus der nachfolgenden Zusammenfassung
und ausführlichen Beschreibung hervor.
Gemäss der vorliegenden Erfindung werden die polyclonalen
Antikörper, die in einer immunometrischen Assay verwendet v/erden, beispielsweise als unmarkierte Antikörper,
gebunden an einen festen Träger, und die Antikörperr
verwendet als löslicher markierter Antikörper, oder, im Falle von Assays, die auf einer Fluoreszenzabsorption
beruhen, die ein fluoreszierendes oder absorbierendes Chromophor tragenden Antikörper durch wenigstens
ein und im allgemeinen zwei oder mehr unterschiedliche monoclonale Antikörper ersetzt, d.h. jeder Antikörper
ist spezifisch auf eine einzelne antigene Stelle und getrennt von Clonen. hergestellt,. die. sich von
einzigartigen Zellen ableiten.
Erfindungsgemäss wird ein immunometrisches Assayverfahrengezeigt
zur Bestimmung von Flüssigkeitsproben, wobei man einen ternären Komplex aus der antigenen Substanz,
einem ersten Antikörper und einem zweiten Antikörper, der an eine andere Stelle des Antigens als der erste
Antikörper gebunden ist, bildet, indem man die Probe mit dem ersten und dem zweiten Antikörper in Berührung
bringt und wobei die Verbesserung darin besteht, dass man einen monoclonalen Antikörper als ersten und als
zweiten Antikörper verwendet.
Gemäss einer bevorzugten Ausführungsform ist der monoclonale
Antikörper, der als an den festen Träger gebundener Antikörper verwendet wird, das Produkt einer
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anderen Zellinie als der monoclonale Antikörper, der
für den markierten Antikörper verwendet wird und die beiden monoclonalen Antikörper werden so ausgewählt,
dass sie sich an die antigene Substanz an auseinanderliegenden Stellen binden und nicht miteinander an den
Bindungsstellen mit dem Antigen stören. Im Falle einer Fluoreszenzabsorption sind die beiden Antikörper im
allgemeinen die Produkte von unterschiedlichen Zellinien und werden so ausgewählt, dass sie sich nicht gegenseitig
beim Binden störenf aber doch die beiden Chromophore
ausreichend eng aneinanderbringen, um die Absorption der Fluoreszenz zu ermöglich, d.h. innerhalb von etwa
100 A. Die Vorteile der vorliegenden Erfindung,- insbesondere
bei "Gleichzeitig"— und "Umkehr"-Assays, gegenüber
dem Stand der Technik werden ersichtlich,- wenn man die
anliegenden Zeichnungen und die nachfolgende ausführliche Beschreibung heranzieht.
Gemäss der vorliegenden Erfindung werden auch monoclonale
Antikörper in Inhibierungsassays verwendet. Bei solchen Assays wird eine bekannte Menge eines Antigens
und eines monoclonalen Antikörpers mit einer Probe in Berührung gebracht, von der man annimmt, dass sie ein
Antigen enthält, das dem zu dem rconoclonalen Antikörper zugegebenen Antigen entspricht. Das Ausmass, in welchem
eine Inhibierung des Komplexes zwischen dem 7-mtikörper
und dem Antigen eintritt und zwar weil sich ein Komplex aus dem monoclonalen Antikörper und dem Antigen in der
Probe bildet, ist ein Mass für die Gegenwart und/oder Menge des Antigens in der zu untersuchenden Probe.
Die Erfindung betrifft ,somit auch ein Verfahren zum
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Bestimmen der Anwesenheit oder Konzentration einer antigenen Substanz in einer Flüssigkeit, wobei das
Verfahren folgende Stufen umfasst:
(a) Kontaktieren einer Probe der Flüssigkeit mit einer bekannten Menge einer zugegebenen antigenen Substanz
und eines monoclonalen Antikörpers zu der antigenen Substanz, und
(b) Messen der Inhibierung der Bildung eines Komplexes zwischen dem Antikörper und der zugegebenen antigenen
Substanz durch Kombination des monoclonalen Antikörpers und der antigenen Substanz in der Flüssigkeit,
unter Ausbildung eines zweiten Komplexes.
Gemäss einer bevorzugten Ausführungsform sind der Antikörper
bzw. das Antigen an eines der Glieder aus einem Paar von fluoreszierenden und adsorbierenden Chromophoren
gebunden. Die Inhibierung der Bildung eines Komplexes zwischen dem markierten Antigen und Antikörper
durch Antigene in der zu untersuchenden Probe, führt zu einer Verminderung der Adsorption und zu einer Erhöhung
der Fluoreszenz. Das Ausmass der Inhibierung der Adsorption ist ein Mass für die Antigenkonzentration in
der Probe. Gemäss einer weiteren bevorzugten Ausführungsform bei einer Inhibierungsassay werden bekanntes Antigen
und Antikörper des ursprünglichen Komplexes an Teilchen, beispielsweise an Latexteilchen, einer Grosse, welche
eine Agglomerierung zulässt, gebunden. Wird eine Probe, von der man annimmt, dass sie ein Antigen enthält,
mit Antikörper und dem gebundenen Antigen in Berührung gebracht, findet eine Inhibierung der Agglomeratbildung
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statt, aufgrund einer Komplexbildung zwischen dem gebundenen Antikörper und dem Probe-Antigen, die kein Agglomerat
bilden können. Die Verringerung der Agglomerierung kann dann durch Trübungsmessung festgestellt werden.
Fig. 1 ist eine grafische Darstellung der Ergebnisse,
die man bei Verwendung von polyclonalen Antikörpern bei vier Typen immunometrischer
Assays für Human-IgE erhält, und
Fig. 2 ist eine ähnliche grafische Darstellung
und zeigt den Unterschied der Ergebnisse, die man bei Verwendung von monoclonalen
Antikörpern bei den gleichen vier Typen von immunometrischen Assays für Human-IgE erhält.
Wie dargelegt, werden erfindungsgemäss polyclonale
Antikörper für immunometrische Assays für eine antigene Substanz durch monoclonale Antikörper ersetzt. In ähnlicher
Weise werden monoclonale Antikörper in Inhibierungsassays verwendet. Die Erfindung ist für die Bestimmung
der Gegenwart und der Konzentration einer grossen Anzahl von antigenen Substanzen, einschliesslich
polyvalenten antigenen Substanzen,- geeignet. Deshalb bedeutet der hier verwendete Ausdruck Antigen oder
antigene Substanz allgemein Substanzen, gegenüber denen Antikörper gebildet werden können. Solche Substanzen
sind beispielsweise Haptene, Hormone, wie Insulin, und humanes thyroidstimulierendes Hormon (HTSH), Gammaglobuline,
Allergene, Viren, Virus-Subeinheiten, Bakterien, Toxine, wie solche die mit Tetanus und mit
tierischen Giften vorkommen, und auch gewisse Drogen.
Zu den spezifischen Antigenen, die man nach dem erfindungsgemässen Verfahren untersuchen kannf gehören beispielsweise
carcinoembryonisch.es Antigen (CEA) , Häpatitis A und B, Häpatitis-Nicht-A , -Nicht-B, IgE und
Alphafötoprotein.
Die für die vorliegende Erfindung geeigneten monoclonalen
Antikörper erhält man nach einem Verfahren, das von Milstein und Köhler beschrieben und berichtet wird
in Nature 256, 495-497 (1975). Die Einzelheiten dieses Verfahrens sind bekannt und brauchen hier nicht wiederholt
zu werden. Das Verfahren besteht grundsätzlich darin, dass man eine Maus oder ein anderes geeignetes
Tier mit einem Immunogen injiziert. Anschliessend wird die Maus getötet und Zellen, aus der Milz entnommen,
werden mit Myelomazeilen fusioniert. -Man erhält Hybridzellen,
die als Hybridoma bezeichnet werden, die sich in vitro reproduzieren. Die Population der Hybridoma
wird überwacht und manipuliert, so dass man einzelne Clone isoliert, von denen jedes eine einzige Antikörperspezies
gegenüber dem Antigen abscheidet. Jede auf diese Weise erhaltene individuelle Antikörperspezies
ist das Produkt einer einzigen B-Zelle aus dem Immunotier, die erzeugt wurde als Reaktion auf eine spezifische
antigene Seite der immunogenen Substanz.
Wird eine immunogene Substanz in einen lebenden Wirt
eingeführt, dann reagiert das Immunsystem des Wirts unter Bildung von Antikörpern gegenüber allen erkennbaren
Stellen auf der Substanz. Dieser "Gewehrschuss"-Effekt,
nämlich die Bildung "von Antikörpern im Abwehrkampf
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gegen den Eindringling besteht in der Bildung von Antikörpern verschiedener Affinitäten und Spezifitäten
für die immunogene Substanz„ Wenn man daher die verschiedenen
hybridomen Zellinien so untersucht, dass man diejenigen identifiziert, die gegenüber dem gewünschten
Antigen Antikörper bilden, werden die von den individuellen Hydridom-Zellinien gebildeten Antikörper bevorzugt
untersucht, um diejenigen zu identifizieren, die die höchste Affinität für die immunogene Substanz
haben, indem man ihre ursprüngliche Bildung stimuliert, bevor man sie dann für die vorliegende Erfindung auswählt.
Die auf diesem Kriterium aufbauende Auswahl hilft, die Empfindlichkeit in den immunometrischen und
Inhibierungsassays der vorliegenden Erfindung unter Verwendung von monoclonalen Antikörpern zu erhöhen im Vergleich
zu den gemäss dem Stand der Technik verwendeten polyclonalen Antikörpern, die bestenfalls eine Affinität
zu dem Antigen aufweisen, die grob nur der Durchschnitt der Affinitäten von allen in dem Immunsystem gebildeten
Antikörpern darstellt. Vorzugsweise hat der ausgewählte monoclonale Antikörper eine Affinität, die mit der gewünschten
Empfindlichkeit in dem Bereich in dem in Betracht kommenden Testsystem verträglich ist. Vorzugsweise
hat der Antikörper eine Affinität von wenigstens
10 1/mol und insbesondere eine Affinität von wenigstens
etwa 109 1/mol.
Weiterhin kann man die die höchsten Affinitäten aufweisenden monoclonalen Antikörper weiter durchmustern,
indem man einen simulierten Assay mit Proben durchführt, von denen bekannt ist, dass sie falsche Positiv-Ergebnisse
liefern, wobei man übliche polyclonale Antikörper
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anwendet, um diejenigen monoclonalen Antikörper zu identifizieren, die nicht kreuzreagieren und falsche positive
Ergebnisse liefern.
Da die Zwei-Stellen-immunometrische Assay auf der Bildung
von Antikörper:Antigen:Antikörper-Sandwich beruht,
v/erden im allgemeinen zwei unterschiedliche monoclonale Antikörper, die sich nicht gegenseitig beim Binden
an das Antigen behindern, als gebundener Antikörper ausgewählt und der lösliche markierte Antikörper und das
Antikörperpaar v/erden ausgewählt, wenn Fluoreszenzabsorption angewendet wird. Da beide notwendig sind, um ein
Sandwich zu bilden, kann eine Umkehr- oder Gleichzeitig-Assay ohne Schwierigkeiten durchgeführt werden, z.B.
derart, dass sich ein Komplex aus markiertem Antikörper: Antigen.:markiertem Antikörper bildet, der die Bildung
eines Komplexes zwischen dem Antigen und dem an die feste Phase gebundenen Antikörper ausschliesst und hierin
liegt ein besonderer Vorteil der vorliegenden Erfindung.
Weiterhin kann man eine Forward-Assay durchführen, ohne
die Zwischenwaschstufe, weil sich die beiden Antikörper an zwei unterschiedliche Stellen binden. Deshalb kann
ein solches Verfahren auch als ein schnelles "Forward"-Assay bezeichnet werden.
Insbesondere bei einem Forward-Assay kann man den gleichen monoclonalen Antikörper sowohl als markierten Antikörper
als auch als Antikörper, gebunden an den festen Träger, verwenden, wenn die antigene Substanz identische
Antikörperbindungssteilen enthält, die ausreichend weit
voneinander liegen, so dass mehr als ein Antikörpermolekül gleichzeitig gebunden v/erden kann. Bei einem solchen
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System schliesst die Zugabe von zuerst dem gebundenen Antikörper zu der Probe die Bildung eines Sandwiches
aufgrund sterischer Überlegungen aus. Wenn der markierte monoclonale Antikörper anschliessend zugegeben wird,
kann dieser auch mit dem Antigen, gebunden an den unmarkierten Antikörper,auf der festen Phase einen Komplex
bilden.
Der unmarkierte monoclonale Antikörper, der beim erfindungsgemässen
Verfahren verwendet wird, um die antigene Substanz aus der zu untersuchenden Probe zu extrahieren,
kann auf irgendeinem der üblichen Trägermaterialien, wie sie bei immunometrisehen Assays verwendet werden,
immobilisiert werden. Zu diesen Trägermaterialien gehören Filterpapier, Plastikperlen oder Reagenzgläser aus
Polyethylen, Polystyrol, Polypropylen oder anderem geeigneten Material. Geeignet sind auch feinteilige Materialien,
wie Agarose, vernetztes Dextran und andere Polysaccharide. Die Techniken zum Binden von Antikörpern
an solche Materialien sind dem Fachmann geläufig. Beispielsweise kann man Antikörper an Polysaccharidpolymere
unter Verwendung des in US-PS 3 645 852 beschriebenen Verfahrens binden.
Die bei der vorliegenden Erfindung verwendeten markierten monoclonalen Antikörper können mit den gleichen
Markierungen ausgestattet werden, wie bei bekannten immunometrischen Assays. Hierzu gehören fluorogene Markierungen
zum Nachweis durch Fluorimetrie, wie sie in
US-PS 3 940 475 beschrieben werden, und enzymatische Markierungen, wie sie in US-PS 3 654 090 beschrieben
werden. Es wird gegenwärtig bevorzugt, den Antikörper
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mit einem Radioisotop, wie J, zu markieren, wobei
man das Verfahren von Hunter und Greenwood, Nature, (1962), Seite 945, oder das von David et al. Biochemistry,
Bd. 13, Seiten 1014-1021, 1974, anwendet.
Bei einer typischen Assay wird die Menge an markiertem Antikörper, die auf einem unlöslichen Sandwich-Komplex
vorhanden ist, bestimmt, indem man das unlösliche Trägermaterial auf geeignete Weise untersucht.
Es ist jedoch möglich, die Gegenwart oder die Abwesenheit des Antigens in einer zu untersuchenden Flüssigkeitsprobe
in Beziehung zu setzen zu der Menge an markiertem Antikörper r der nicht während der Assay reagiert hat
und in löslicher Form verbleibt.
Die Vorteile der vorliegenden Erfindung, bei welcher monoclonale Antikörper in immunometrischen Assays im
Vergleich zu polyclonalen Antikörpern verwendet werden, sind aus dem nachfolgenden Beispiel ersichtlich. In
diesem Beispiel werden vier Vergleichsassays, ein "Gleichzeitig"-Assay, ein "Umkehr"-Assay, ein "Forward"-Assay
und ein schnelles "Forward"-Assay angewendet, wobei man sowohl monoclonale Antikörper als auch polyclonale
Antikörper verwendet, und ein Standardserum, enthaltend 100 IU/ml von Human IgE als Positivprobe einsetzte.
Normales Pferdeserum, enthaltend IgE wurde als Negativkontrolle verwendet.
Der polyclonale Antikörper zu IgE, wie er als markierter
Antikörper in dem Beispiel verwendet wurde, wurde von Pharmacia Diagnostics of Piscataway, New Jersey/
USA, erhalten. Der polyclonale Antikörper, der an den
- 33 -
festen Träger gebunden war, wurde von Tago Inc. of Burlingame, California/USA, erhalten.
Monoclonaler Antikörper zu IgE wurde nach der vorerwähnten Methode von Milstein und Kohler erhalten. Die
beiden ausgewählten Antikörper zeigten eine Affinität für IgE von mehr als 10 1/mol und
gegenseitig bei der Bindung an IgE.
gegenseitig bei der Bindung an IgE.
für IgE von mehr als 10 1/mol und störten sich nicht
Die Assays wurden durchgeführt unter Verwendung von unmarkierten
Antikörpern, gebunden an Agarose, nach dem Verfahren gemäss US-PS 3 645 852. Die Markierung des Anti-
1 25
körpers erfolgte durch J nachdem vorerwähnten Verfahren von David et al. Zum Waschen aller Proben wurde
phosphatgepufferte Kochsalzlösung, pH 7,4, verwendet.
phosphatgepufferte Kochsalzlösung, pH 7,4, verwendet.
Duplikatproben wurden angesetzt, in denen 10OuI einer
Suspension von Antikörper, immobilisiert auf Agaroseteilchen, mit 100ul der Probe (Serum) und 100ul lös-
125' '
lichem J-markierten Antikörper vermischt wurden. Die Mischung wurde in den in Tabelle 1 (für polyclonale
Antikörper) und Tabelle 2 (für monoclonale Antikörper) angegebenen Zeiten inkubiert plus 30 Minuten. Die
extra 30-minütige Inkubationsfjeriode wurde hinzugefügt, um diese Assaymethode den anderen Assaymethoden, bei denen man eine zusätzliche 30-minütige Inkubationszeit
Antikörper) und Tabelle 2 (für monoclonale Antikörper) angegebenen Zeiten inkubiert plus 30 Minuten. Die
extra 30-minütige Inkubationsfjeriode wurde hinzugefügt, um diese Assaymethode den anderen Assaymethoden, bei denen man eine zusätzliche 30-minütige Inkubationszeit
- 34 -
für ein zweites zugefügtes Reagenz benötigte, anzupassen. Im Anschluss an die Inkubationsperiode wurden
die Agaroseteilchen durch Zusatz von Puffer gewaschen und zentrifugiert. Nach Entfernung der Waschflüssigkeit durch Absaugen,- wurden die zurückbleibenden Agaro-
seteilchen auf gebundenem. J-markierten Antikörper untersucht. Die Zählung, die man bei jedem Komplex nach
der angegebenen Inkubationszeit erhielt, wird in Tabellen 1 und 2 wiedergegeben.
Duplikatproben wurden angesetzt, bei denen 10OuI einer
125
Probe (Serum) mit 100ul J-markiertem löslichen Antikörper
vermischt wurden und die Mischungen wurden in den in Tabellen 1 und 2 angegebenen Zeiten inkubiert.
100 ill einer Suspension eines auf Agaroseteilchen immobilisierten
Antikörpers werden zu dem Gemisch gegeben und dieses lässt man weitere 30 Minuten inkubieren. Die
Agaroseteilchen werden dann gewaschen und gezählt, wie bei der Gleichzeitig-Assay-Methode (simultaneous assay
method) . Die Zählungen v/erden in Tabellen 1 und 2 angezeigt.
Duplikatproben wurden mit 100ul der Probe (Serum) angesetzt und vermischt mit 100ul einer Suspension aus
auf Agaroseteilchen immobilisiertem Antikörper und dann für die in den Tabellen 1 und 2 angegebenen Zeiten
- 35 -
inkubiert. Die Agaroseteilchen wurden einmal durch Zugabe von 2,5 bis 3,0 ml eines Puffers gewaschen, der
nach dem Vermischen abzentrifugiert wurde und die
125 Flüssigkeit wurde abgesaugt. 100ul von J-markiertem
löslichen Antikörper wurden zu dem Gemisch gegeben und weitere 30 Minuten inkubiert. Die Agaroseteilchen
wurden dann gewaschen und wie bei der Gleichzeitig-Assay-Methode
gezählt. Die Zählungen sind in Tabellen 1 und 2 angegeben.
(4) Schnelle_Forward-Assa.Y-Methode
Die Untersuchung wurde doppelt, ähnlich
wie bei der Forward-Assay-Methode durchgeführt, mit der
Ausnahme, dass die Waschstufe zwischen der ersten
Inkubierung der Probe mit Antikörper, immobilisiert auf
1 25 Agaroseteilchen, und die Zugabe von löslichem J-
markierten Antikörper weggelassen wurde.
Die Zählungen/Minute für die Duplikatkontrolle und die Duplikat-Assays der Probe,enthaltend IgE unter Verwendung
von polyclonalem Antikörper und monoclonalem Antikörper, werden in den Tabellen 1 bzw. 2 gezeigt.
Diese Daten wurden für die Anfertigung der Figuren 1 und 2 in folgender Weise verwendet. Der Durchschnitt der
Zählungen/Minute für eine Kontrolle für eine gegebene Inkubierungszeit wurde von dem Durchschnitt der Zählungen/Minute
für die entsprechende IgE-Assay abgezogen. Die Differenz wurde als Prozentsatz der Gesamtzählungen/Minute
von zu der Probe zugegebenem markierten Antikörper berechnet und wird auf der Y-Achse als Prozentsatz
- 36 -
der Gesamtzählungen/Minute an an die Festphase gebundenen Antikörpern aufgetragen. Die Inkubierungszeit
wird auf der X-Achse aufgetragen.
Ein Vergleich der Punkte in Fig. 2, in denen die Ergebnisse von Assays unter Verwendung von monoclonalen
Antikörpern gezeigt wird, mit denen von Fig. 1 von Assays unter Verwendung von polyclonalen Antikörpern
zeigt, dass bei jeder Assay-Artr bei der gleichzextigen,
bei der Umkehr-, bei der Forward- und bei der schnellen Forward-Assay, das Assay unter Verwendung von monoclonalen
Antikörpern empfindlicher war, was durch den höheren Prozentsatz der Gesamtzählungen/Minute, gebunden
an die feste Phase mit 100 IU IgE/ml Probe ersichtlich
wird. Unerwarteterweise wurde bei den gleichzeitigen und bei den Umkehr-Assays gefunden, dass solche Ansätze
mit monoclonalen Antikörpern das Gleichgewicht schneller erreichen als die entsprechenden Assays unter Verwendung
von polyclonalen Antikörpern. Wenn man daher monoclonale Antikörper bei diesen Verfahren anwendet, kann
man die Zeit für die Assays erheblich über die Zeit hinaus vermindern, die man einspart, indem man lediglich
die Waschstufe fortlässt. In dieser Hinsicht erreichte die Umkehr-Assay mit monoclonalen Antikörpern das Gleichgewicht
in weniger als 1 Stunde. Beim gleichen Ansatz mit einer polyclonalen Assay wurde das Gleichgewicht
erst ncich 4 Stunden erreicht. Bei der gleichzeitigen
Assay wurde das Gleichgewicht unter Verwendung von monoclonalem Antikörper innerhalb 8 Stunden erreicht, während
bei der Assay mit polyclonalen Antikörpern das Gleichgewicht nicht innerhalb 24 Stunden erreicht v/erden
konnte. Infolgedessen ergibt die vorliegende Erfindung
- 37 -
wesentlich schnellere und empfindlichere Gleichzeitig-
und Umkehr-Assays gegenüber den Verfahren des Standes der Technik und eliminiert die Bedenken, dass die Bildung
eines löslichen "Sandwich"-Komplexes mit der Bildung des gewünschten unlöslichen Komplexes in Wettbewerb
tritt.
- 38 -
Assay-Ergebnisse unter Verwendung von polyclonalen Antikörpern
Gleichzeitig-Assay | IgE Probe |
Umkehr-Assay | IgE Probe |
Forward-Assay | IgE Probe |
schnelle Assay |
Forward- | |
Inkubations zeit (h) |
Kontrolle Probe |
2705,2667 | Kontrolle Probe |
2558,2581 | Kontrolle Probe |
2092.2077 | Kontrolle Probe |
IgE Probe |
0/25 | 372,314 | 2391,236S | 302,243 | 2953,2999 | 357;326 | .1905,1317 | 396,293 | 2271.2238 |
0,50 | 348,265 | 2793,2703 | 284.262 | 3154,3213 | 288,233 | 2157,2255 | 1 1 -»—— | , I. I IB — J I |
1,00 | 315,277 | 2897,2887 | 305,277 | 3377,3212 | 355,424 | 1946,2019 | 304,284 | 1789,1706 |
2/00 | 342,356 | 3695,3746 | 290,274 | 3413,3651 | 302,314 | 2019,2392 | 288,312 | 1728,1867 |
4/00 | 421,385 | 4028,4101 | 28,280 . | 3762,3643 | 274,255 | 1750,1452 | 283,292 | 1720,1683 |
6/00 | 447,436 | 4564,4628 | ,296{281 | 3551,3546 | 241,267 | 1553,1604 | ■ 301,257 | 1283,1424 |
24,00 | 526,577 | 233,263 | 320,277 | 273,256 | 1450r1470 |
I co
CO
CO O OO CO JCS
Tabelle 2■ . . y Assay-Ergebnisse unter Verwendung von monoclonalen Antikörpern
Gleichzeitig-Assay | IgS Probe |
Umkehr-Assay | IgE Probe |
Forward-Assay | IgE Probe |
schnelles Assay |
Forward- | |
Inkubations zeit (h) |
Kontrolle Probe |
5610,5303 | Kontrolle Probe |
8407,8338 | Kontrolle Probe |
4618,4894 | Kontrolle Probe |
IgE Probe |
0,25 | 135,132 | 7472,7115 | 383,594 | 8233,8271 | 210,205 | 4987,5273 | 194.183 | 4859,4906 |
0,50 | 558,459 | 6239,6529 | 240,231' | 8010,8377 | 223,223 | . 3453,4308 | 190,197 | 5024,5152 |
1,00 | 253,265 | 6787,6734 | 325,265 | 7856,7644 | 230,187 | 4834,4268 | 215.192 | 4887,4901 |
2,00 | 282,275 | 8150,8155 | 255;305 | 8017,7788 | 226f197 | 5269,4420 | 192,210 | 4937,4944 |
4.00 | 303,272 | 8884,3434 | 343,305 | 7S70f7358 | 231,216 | 2006,3631 | 218,187 | 4929,5071 |
6,00 | 549,667 | 8669,9044 | 698,850 | 7037,7359 | 226,361 | 2465,2586 | 405,243 | 3033,3713 |
■ 25,55 | 426f420 · | 497,323 | 194,201 | 246,233 | 3945,2943 |
CO CD GO CO
Bei der vorhergehenden Diskussion wurde der Schwerpunkt auf Zwei-Stellen- oder Sandwich-Assays gesetzt, bei denen
einer der Antikörper insolubilisiert ist, während der andere in dem zu analysierenden Medium löslich ist. Weitere
Veränderungen sind möglich. Eine bevorzugte Variante verwendet Antikörper, die an Teilchen gebunden sind,
beispielsweise an Latexteilchen, derart, dass jedes Teilchen eine Vielzahl von Antikörpern trägt. Wenn eine
Menge der Teilchen, an welche ein erster monoclonaler
Antikörper gebunden ist, mit beispielsweise einer Teilchenmenge vermischt wird, an welche ein zweiter monoclonaler
Antikörper gebunden ist, entsteht eine milchige Suspension. Wird jedoch eine Probe, enthaltend polyvalentes
Antigen, für welches die Antikörper spezifisch sind, in die Suspension eingeführt, so tritt eine
Agglomerisierung oder Agglutinisierung der Teilchen ein, unter Ausbildung von leicht nachweisbaren verklumpten
Teilchen.
Der visuelle Nachweis von Agglumeratbildung kann in einem Screening-Test für den Nachweis von Antigen angewendet
v/erden. Diesen Nachweis kann man erleichtern, wenn man die Teilchen, die den einen monoclonalen Antikörper
tragen, unterschiedlich von den Teilchen, die den anderen tragen, färbt. Das Ausmass der Agglomerisierung
kann aber auch als ein Mass für die Menge des in der Probe vorhandenen Antigens angesehen werden. Beispielsweise
kann man die Veränderung der Trübung messen unter Verwendung von Standardverfahren, wie der Nebelmessung.
Gegenwärtig bevorzugt man es, Latexteilchen zu verwenden,
an denen der Antikörper kovalent gebunden ist,
- 41 -
unter Anwendung von Verfahren, die dem Fachmann geläufig sind. Es können jedoch auch andere teilchenförmige
Träger verwendet werden. Dazu gehören beispielsweise Siliziumdioxid, Glas, Zellen, Polyacrylamide, Polymethylmethacrylat
und Agarose. Vorzugsweise haben die Teilchen eine Grosse zwischen etwa 0,2 und etwa 10 um.
Visuelles Screening erfordert jedoch Teilchen von wenigstens etwa 1,0 um.
Gemäss einer anderen Variante wird einer der Antikörper
auf einer Perle an der Wand eines Reagenzglases oder auf einem anderen makroskopischen festen Träger
insolubilisiert und der andere wird auf kleinen Latexteilchen oder anderen geeigneten Materialien gebunden.
In Gegenwart des Antigens bildet sich ein Sandwich aus dem Antigen zwischen dem makroskopisch gebundenen Antikörper
und den an ein Teilchen gebundenen Antikörper. Indem man z.B. die Teilchen färbt, kann man die Bildung
des Sandwich visuell feststellen. Eine Fluoreszenz-, enzymatischem radioaktive oder andere Markierung auf
dem an Teilchen gebundenen Antikörper kann man zur quantitativen Bestimmung genauso verwenden, wie bei Verwendung
der vorerwähnten löslichen Antikörper.
Bei einer weiteren bevorzugten Variante der Zwei-Stellen-Assay
wird wenigstens einer von zwei unterschiedlichen rnonoclonalen Antikörpern an ein Enzym gebunden, welches
eine Reaktion katalysiert, bei der eine an den anderen monoclonalen Antikörper gebundene Substanz entweder eine
nachweisbare Substanz produziert oder in irgendeiner anderen Weise mit der Substanz auf dem zweiten Antikörper
in Reaktion tritt, um dadurch den Nachweis des
42 -
Antikörper:Antigen:Antikörper-Komplexes zu ermöglichen.
Der Nachweis kann beispielsweise durch Colorimetrie, Fluorometrie, Lumineszenz, Spektrofotometrie oder auf
ähnliche Weise erfolgen. Bei Anwendung solcher Verfahren muss keiner der Antikörper insolubilisiert werden,
was die Assay erheblich vereinfacht.
Bei der gegenwärtig bevorzugten Ausführungsform ist
die Substanz auf dem zweiten Antikörper auch ein Enzym und die Assay verwendet ein Paar von enzymmarkierten
Antikörpern, um die nacheinander ablaufenden Reaktionen, bei denen eine ein Produkt produziert, das von der
anderen benötigt wird, zu katalysieren. Bei diesen Reaktionen werden die beiden Antikörper so ausgewählt, dass
dann, wenn sie sich mit dem Antigen binden, sie sterisch so positioniert sind, dass das Produkt der ersten enzymatischen
Reaktion in einer so nahen Nachbarschaft zu dem zweiten enzymmarkierten Antikörper erzeugt wird,
dass die zweite Reaktion eintritt,bevor eine merkliche
Diffusion des Produktes der ersten Reaktion in das Umgebungsmedium ablaufen kann.
Dieses Verfahren kann man illustrieren unter Verwendung eines Paares von monoclonalen Antikörpern, von denen
eines mit Hexokinase (HK) und das andere mit Glukose-6-phosphatdehydrogenase
(G-6-PDH) markiert ist, in der folgenden Reaktionsreihe anwendet.
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HK (1) Adenosintriphosphat + Glukose
(ATP)
Adenosindiphosphat + Glukose-6-phosphat (ADP)
(2) Glukose-6-phosphat + Nikotinamidadenindinukleotid G-6-PDH
(NAD+)
■ -> Glukonolakton-6-phosphat +
Dihydronikbtinamidadenindinukleotid (NADH)
Das Assay wird durchgeführt, indem man zu der Probe, die das verdächtige Antigen enthält, den markierten Antikörper
zu dem Antigen, ATP, Glukose und das Coenzym NAD gibt. Ist das Antigen vorhanden, bildet sich der nachfolgende
Komplex:
Ab(HK)
Ag
Ag
Ab (G-6-PDH)
Der HK-markierte Antikörper katalysiert die Bildung von Glukose-6-phosphat in dem G-6-PDH-markierten Antikörper
wo er in Glukonolakton-6-phosphat umgewandelt wird. Das bei dieser Reaktion durch Reaktion von NAD gebildete
NADH kann spektrofotometrisch nachgewiesen v/erden, aufgrund der starken Absorption bei 340 rau, die für ein
Dihydronikotinamid charakteristisch ist.
Die gleiche Umwandlung von Glukose in Glukonolakton-6-phosphat
unter Bildung von NADH kann auch in dem Medium selbst, katalysiert durch die nicht-komplexgebundenen
- 44 -
markierten Antikörper, stattfinden, jedoch mit einer viel geringeren Geschwindigkeit als wenn zwei Antikörper
nahe beieinander in dem Antikörper:Antigen:Antikörper-Komplex
positioniert sind. Infolgedessen bestätigt eine Erhöhung der Absorption bei 340 nm im Vergleich
zu der Kontrollprobe,die Gegenwart von Antigen in der Probe. Die Erhöhung der Absorption kann auch in bezug
gebracht werden zu der Menge des Antigens in dem Komplex.
Jedes beliebige andere Paar von geeigneten in Reihenfolge ablaufenden enzymatisch katalysierten Reaktionen kann
bei einer Zwei-Stellen-Assay mit entsprechend markierten
Antikörpern für ein verdächtiges Antigen angewendet werden. Dazu gehört z.B. die Reaktion von Glukose, katalysiert
mit Glukoseoxidase, unter Bildung von Glukono- •lakton und Wasserstoffperoxid, worauf sich die Umsetzung
von Wasserstoffperoxid mit Orthophenylendiamin, katalysiert
durch Peroxidase unter Bildung einer gefärbten Gruppe, anschliesst. Bei dieser Assay wird einer der
monoclonalen Antikörper mit Glukoseoxidase markiert und der andere mit Peroxidase. Die Intensität der gebildeten
Färbung, verglichen mit einer Kontrolle, kann in Beziehung gebracht werden zu der Anwesenheit und/oder
der Menge des Antigens in der untersuchten Probe. Selbstverständlich kann man andere Substanzen, die in
Gegenwart eines Enzyms zu einer gefärbten Gruppe oxidiert werden können, anstelle von Orthophenylendiamin
verwenden.
Ein weiteres geeignetes Paar für der Reihe nach ablaufende
Reaktionen unter Verwendung eines Paars von Antikörpern für ein gewünschtes markiertes Antigen, mit
- 45 -
-NAD-Oxidoreduktase bzw. Luziferase ist das folgende:
NAD-Oxidoreduktase (1) NADH + Riboflavin-5'-phosphat >
(FMN)
FMNH2 + NAD'
Luziferase
(2) FMNH2 + RCHO + O2 ->
FMN* + RCOOH +
RCHO ist ein typisches geradkettiges Aldehyd mit 10 oder mehr Kohlenstoffatomen.
Der Erzeugung von FMN*, einem angeregten Zustand von FMN, folgt die Emission eines Photons, das fotometrisch
nachgewiesen werden kann und in Beziehung gebracht v/erden kann mit einer Kontrollprobe, um die Gegenwart
und/oder Menge eines Antigens in einer zu untersuchenden Probe zu bestimmen.
Gemäss einer weiteren Ausführungsform unter Anwendung
eines Paars von Antikörpern, welche mit Enzym markiert sind, kann das Produkt der ersten enzymatisch katalysierten
Reaktion entweder ein allosterischer Aktivator oder Inhibitor der nachfolgenden enzymkatalysierten
Reaktion sein. Ein allosterischer Abbinder wird nicht bei der nachfolgenden zweiten Reaktion verbraucht, sondern
wirkt mit dem Enzym unter Verstärkung dessen Affinität für ein Substrat oder um den Umwandlungsgrad des
Substrates für das Produkt zu erhöhen, nachdem der
- 46
Enzyin-Substrat-Komplex gebildet ist. Allosterische Inhibitoren
andererseits haben die umgekehrte Wirkung und vermindern die Enzymaffinität für ein Substrat oder
vermindern den Umwandlungsgrad des Substrates in das Produkt. Die allesterische Inhibierung kann vom kompetitiven
oder nichtkompetitiven Typ sein.
Ein Beispiel für eine Assay unter Verwendung der allosterischen
Aktivierung v/endet ein Paar markierter Antikörper an, wobei diese mit Phosphofruktokinase bzw.
Phosphoenolpyruvat markiert sind und folgendes Reaktionsschema abläuft:
Phosphatfruktokinase (1) Fruktose-6-phosphat + ATP
Fruktose-1,6-diphosphat + ADP
(2) HC03~ + Phosphoenolpyruvat
(PEP)
Phosphoenolpyruvat Carboxylase
-» Oxaloacetat (OAA)
Malatdehydrogenase (3) OAA + NADH > MaIat + NAD
Das in Reaktion (1) gebildete Fruktose-1,6-diphosphat
reagiert allosterisch mit der Phosphoenolpyruvatcarboxylase und aktiviert die Katalyse der Reaktion (2)f nämlich
der Bildung von Oxaloacetat aus PEP. Reaktion (3) läuft
- 47 -
im Umgebungsmedium ab, d.h. es ist nicht erforderlich, der Malatdehydrogenase an einen dritten mon'oclonalen
Antikörper zu binden. Die Gegenwart und/oder Menge eines verdächtigen Antigens wird bestimmt, indem man
die Reduktion der Adsorption bei 340 nm durch NADH, die in der Reaktion (3) in NAD oxidiert wird, in Beziehung
setz-t.
Ein Beispiel für ein Assay unter Verwendung von allosterischer Inhibierung und Anwendung eines Paars von markierten
Antikörpern, die mit Aspartataminotransferase (AST)
bzw. Phosphoenolpyruvatcarboxylase markiert sind, verläuft nach folgendem Reaktionsschema:
AST (T) Oxaloacetat + Glutamat 5> Aspartat +
-Ketoglutorat
Phosphoenolpyruvatcarboxylase (2) PEP + NADH >
OAA + NAD
Das bei der Reaktion (1) gebildete Aspartat inhibiert die zweite Reaktion durch allosterische Reaktion mit
der Phosphoenolpyruvatcarboxylase. Dadurch wird die Rate, mit welcher NADH zu NAD oxidiert wird, vermindert.
Die Abnahme in der Adsorption bei 340 nm, die durch NADH bewirkt wird, kann in Beziehung gesetzt werden zur
Gegenwart und/oder Menge von Antigenen in der zu untersuchenden Probe und eine geringere Abnahme als die, die
bei einer Kontrollprobe auftritt, zeigt die Gegenwart von Antigen an.
Für den Fachmann ist es ersichtlich, dass zahlreiche
weitere Reaktionspaare, bei denen eine Aktivierung oder Inhibierung bei der zweiten enzymatischen katalysierten
Reaktion auftritt, anstelle der vorher dargelegten Beispiele für eine Zwei-Stellen-Assay verwendet werden
können.
Gemäss einer v/eiteren Ausführungsform wird nur einer
der in dem Antikörperpaar vorhandenen Antikörper mit einem Enzym markiert und der zweite wird mit einer Substanz
markiert, beispielsweise einer solchen, die eine durch ein Enzym katalysierte Reaktion eingeht und dabei
ein zweites Produkt bildet, das dann colorimetrisch, fluorimetrisch, durch Lumineszenz oder Spektrofotometrie
oder andere Techniken nachgewiesen und/oder quantifiziert werden kann. Bei einem solchen Beispiel wird
ein Paar von monoclonalen Antikörpern verwendet, von
denen das eine mit Peroxidase und das andere mit Luminol markiert ist und wobei die Reaktion in folgender Weise
abläuft:
NH
NH0 O
Peroxidase
-H +
-H
-H
Luminol
Das Photon [hO ) r das durch diese Reaktion emittiert
wird, kann durch fotometrische Verfahren nachgewiesen werden und in Beziehung gesetzt werden zur Anwesenheit
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und/oder Menge des in der zu untersuchenden Probe enthaltenen Antigens.
Gemäss einer weiteren bevorzugten Variante des Zwei-Stellen-Assays
werden die beiden monoclonalen Antikörper mit einem fluoreszierenden Chromophor bzw. einem
absorbierenden Chromophor, das Licht der Wellenlänge die durch Fluoreszenz emittiert wird, absorbiert, konjugiert.
Die beiden Antikörper werden so ausgewählt, dass dann, wenn sie mit dem Antigen, für das sie spezifisch
sind, kombinieren, die beiden Chromophore genügend dicht aneinander sind, um das durch Fluoreszenz
emittierte Licht von dem anderen Chromophor absorbieren zu lassen. Im allgemeinen liegen sie in einem Abstand
von etwa 100 A und vorzugsweise innerhalb von etwa 50 Ä zueinander. Die Auswahl
von geeigneten Antikörpern kann man durch ein Screening-Verfahren vornehmen, bei welchem ein Gemisch von fluoreszenzmarkierten
und absorptionsmarkierten monoclonalen Antikörpern mit einer Probe in Berührung gebracht
wird, die eine bekannte Menge des Antigens enthält. Die Verringerung der Fluoreszenz ist ein Zeichen dafür,
dass zwei Chromophore genügend eng beieinander positioniert sind.
Bei der Fluoreszenzabsorption ist es nicht erforderlich, einen der beiden Antikörper zu insolubilisieren. Quantitative
Messungen kann man in einfacher Weise vornehmen, indem man die Abnahme der maximalen Fluoreszenz misst,
d.h, die Menge an Fluoreszenz, die von einer Kontrollprobe emittiert wird, welche frei von jeglichem Antikörper
ist oder indem man die Fluoreszenz der Probe mit der
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einer Kontrollprobe, die eine bekannte Menge an Antigen enthält, vergleicht. Fluoreszenz-Absorptions-Chromphor-Paare
können auch in Kombination mit der Teilchenagglomerationstechnik angewendet werden und bei einer Technik,
wobei einer der Antikörper insolubilisiert wird, indem er an einen festen Träger, wie an die Wand eines Reagenzglases
oder an Perlen gebunden wird, weil eine Paarbildung der Fluoreszenz-Absorptions-Chromophoren
abläuft. Die Abnahme der Fluoreszenz ist ein Anzeichen für die Gegenwart oder die Menge des in der Probe enthaltenen
Antigens.
Geeignete Fluoreszenz- und Absorptions-Chromophore und -Verfahren für die Konjugation mit den Antikörpern
werden in US-PS 4 174 384 beschrieben, das zum Zwecke der Offenbarung hier mit eingeschlossen wird. Derzeit
verwendet man vorzugsweise Fluorescein bzw. Rhodamin als Fluoreszenz- bzw. Absorptions-Chromophore.
Bei der bisherigen Beschreibung der Erfindung wurde die Fluoreszenz-Absorptionstechnik beschrieben, bei
welcher Antikörperpaare, die die erforderlichen Chromophoren tragen, veranlasst werden, sich an ein Antigen
zu binden, falls dieses in der zu analysierenden Probe vorhanden ist, und zwar in einer sterischen Anordnung
durch welche das absorbierende Chromophor in der Lage ist, das von Fluoreszenz-Chromophor emittierte Licht
zu absorbieren. Quantitative Bestimmung der Menge des vorhandenen Antigens kann man durchführen, indem man
die Abnahme der maximalen Fluoreszenz misst.
Dieses Verfahren ist sehr gut geeignet zur Bestimmung
- 51 -
der Gegenwart eines Antigens in einer Probe über einen weiten Konzentrationsbereich. Die geringen Abnahmen in
der Fluoreszenz, wie sie bei niedrigen Antigenkonzentrationen
auftreten, kann man jedoch nur sehr schwer nachweisen und genau messen. Im Gegensatz hierzu kann man
geringe Erhöhungen der Fluoreszenz verhältnismässig einfach nachweisen und genau messen. Infolgedessen wird
gemäss einer weiteren Ausführungsform der Erfindung die
Inhibierung der Absorption ausgenutzt und die Erhöhung der Fluoreszenz gemessen.
Um dies in einem Assay für ein spezielles Antigen zu verwirklichen,
werden Mengen an Antigen und monoclonalen Antikörpern zu dem Antigen individuell dem einen oder
dem anderen des Paares der Fluoreszenz-Absorptions-Chromophore markiert. Das Chromophor-markierte Antigen
und die Antikörper werden dann unter Bildung eines Komplexes kombiniert, in welchem das Fluoreszenzchromophor
so positioniert ist, dass das von ihm emittierte Licht von dem Absorptions-Chromophor absorbiert wird. Um dies
zu ermöglichen, kann man das Antigen mit dem Fluoresceirungsmittel markieren und den Antikörper mit dem Absorptionsmittel
oder umgekehrt.
Eine Probe, von der man annimmt, dass sie das zu untersuchende Antigen enthält, v/ird mit dem Chromophor-markierten
Antigen oder Antikörper in Berührung gebra.cht. Nach einer geeigneten Inkubationsperiode wird die Fluoreszenz
gemessen. Wenn in der zu untersuchenden Probe Antigen vorhanden ist', so wird, zumindest zum Teil, die Bildung
eines Komplexes zwischen dem Chromophor-markierten
- 52 -
Antigen und dem Antigen inhibiert, indem es selbst einen Komplex mit dem monoclonalen Antikörper bildet.
In dem Masse wie dies stattfindet, ist der Fluoreszenz-Chromophor nicht langer in Position, so dass das von
ihm emittierte Licht von dem Absorptionschromophor absorbiert wird. Dadurch erhöht sich die Fluoreszenz.
Die Erhöhung der Fluoreszenz kann gemessen werden und in Beziehung zur Konzentration in der analysierten
Probe gebracht werden, indem man mit der Fluoreszenz einer Kontrollprobe, die kein Antigen oder Antigen in
bekannten Mengen enthält, vergleicht.
Aus dem vorhergehenden wird ersichtlich, dass der Chromophor-markierte
Antigen:Antikörper-Komplex löslich sein kann. Gegenwärtig ist es jedoch bevorzugt, Chromophormarkiertes
Antigen und monoclonalen Antikörper zu verwenden, die an einen Latex oder an andere, z.B. die vorher
erwähnten Teilchen einer Grosse, die mit dem gebildeten Komplex Agglomerate bildet, gebunden sind.
Für diesen Zweck sind Teilchen einer Grosse von etwa 0,2 bis etwa 10 um im allgemeinen geeignet. Wird eine unbekannte
Probe, die einen verdächtigen Antigen enthält, mit den agglomeratbildenden Teilchen des Antikörpers
oder Antigens in Berührung gebracht, so findet eine Inhibierung der Agglomeration statt, weil das in der Probe
enthaltene Antigen sich mit dem an den Teilchen gebundenen Antikörper kombiniert. Dadurch ergibt sich eine
Erhöhung der Fluoreszenz, weil keine Adsorption mehr stattfindet, die nachgewiesen und gemessen werden kann,
um dadurch eine Beziehung zwischen der Menge des Antigens in der Probe durch einen Vergleich mit der Fluoreszenz,
- 53 -
die man bei einer Probe beobachtet, die eine bekannte Menge des Antigens enthält, herzustellen.
Eingeschlossen in die Erfindung ist es, gebundenes Antigen und teilchengebundene monoclonale Antikörper in
einer Untersuchung zu verwenden, bei der direkt die Inhibierung der Agglomeration gemessen wird. Bei dieser
Technik ist weder das Antigen noch der Antikörper markiert. Wird eine antigenhaltige Probe mit den Teilchen
in Berührung gebracht, so findet eine Inhibierung der Agglomeration während der Inkubationsperiode statt. Dadurch
ergibt sich schliesslich eine teilweise Verminderung der Agglomeratbildung. Die Inhibierung wird durch
Nebelmessung oder andere Verfahren für die Messung der Trübung nachgewiesen. Die Abnahme der Trübung kann in
Beziehung gesetzt werden zur Menge des Antigens in der Probe.
Die Beschreibung und die Beispiele haben die Anwendbarkeit der Erfindung auf Assays für IgE gezeigt, aber dies
ist nur ein Beispiel für die zahlreichen Möglichkeiten, die durch die Erfindung genutzt werden können. Für den
Fachmann ist es ersichtlich, dass andere Variationen anwendbar sind.
Claims (47)
- PATENTANSPRÜCHE *iitimunometrisches Assayverfahren zur Bestimmung der Anwesenheit oder der Konzentration von antigenen Substanzen in einer Flüssigkeitsprobe, bei dem man einen ternären Komplex aus der antigenen Substanz, einem ersten Antikörper und einem zweiten, an einer unterschiedlichen Stelle wie der erste Antikörper an das Antigen gebundenen Antikörper bildet, indem man die Probe mit dem ersten und dem zweiten Antikörper in Berührung bringt, dadurch gekennzeichnet, dass man einen monoclonalen Antikörper als ersten und als zweiten Antikörper verwendet.
- 2. Verfahren gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass ein Fluoreszenzchromophor an den ersten Antikörper gebunden ist und ein Chromophor, der in der Lage ist, Licht bei der Wellenlänge, die von dem Fluoreszenzchromophor emittiert wird, zu absorbieren, an den zv/eiten Antikörper gebunden ist, und bei dem man die Probe mit einer die ersten und die zweiten Antikörper enthaltenden Lösung in Berührung bringt und einen ternären Komplex bildet und die Intensität der Fluoreszenz bestimmt und mit der Fluoreszenz einer Standardprobe, die kein Antigen enthält oder die das Antigen in einer bekannten Menge enthält, vergleicht.
- 3. Verfahren gemäss Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet , dass der erste oder der zweite Antikörper an einen festen Träger, der in der Flüssigkeitsprobe unlöslich ist, gebunden ist, und der andere der Antikörper in der Flüssigkeitsprobe löslich ist.
- 4. Verfahren gemäss Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet , dass die Flüssigkeitsprobe gleichzeitig mit dem ersten und dem zweiten Antikörper in Berührung gebracht wird, unter Ausbildung eines unlöslichen ternären Komplexes, und dass die Intensität der Fluoreszenz des ternären Komplexes bestimmt und verglichen wird mit der Fluoreszenz einer Standardprobe, die kein Antigen oder das Antigen in einer bekannten Menge enthält.mmm ο
- 5. Verfahren gemäss Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Probe zuerst mit einem der ersten oder zweiten Antikörper in Berührung gebracht wird, unter Ausbildung eines Antikörper :Antigen-binären Komplexes und dann mit dem anderen des ersten oder zweiten Antikörpers in Berührung gebracht wird, unter Ausbildung eines ternären Komplexes, und dass man die Intensität der Fluoreszenz des Komplexes oder der Flüssigkeit bestimmt und mit einer Standardprobe vergleicht, die kein Antigen oder das Antigen in einer bekannten Menge enthält.
- 6. Verfahren gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der erste Antikörper an in der Flüssigkeitsprobe unlöslichen Teilchen gebunden ist und dass die Probe mit einer Suspension der Teilchen eine ausreichende Zeit in Berührung gebracht wird, unter Ausbildung eines ternären Komplexes, wodurch eine Agglomeration der an den ersten und zweiten Antikörper gebundenen Teilchen stattfindet.
- 7. Verfahren gemäss Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet , dass die Grosse der Teilchen im Bereich von etwa 0,2m bis etwa 10 um liegt.
- 8. Verfahren gemäss Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet , dass die Teilchen ausgewählt sind aus Latex, Siliziumdioxid, Glas, Zellen, Polyacrylamid, Polymethylmethacrylat und Agarose.
- 9. Verfahren gemäss einem der Ansprüche 6,7 oder 8, dadurch gekennzeichnet , dass die an den ersten Antikörper gebundenen Teilchen eine unterschiedliche Farbe von denen haben, die an den zweiten Antikörper gebunden sind.
- 10. Verfahren gemäss einem der Ansprüche 6, 7, 8 oder9, dadurch gekennzeichnet , dass die Teilchen eine Grosse im Bereich von etwa 1,0 bis 10 um haben.
- 11. Verfahren gemäss einem der Ansprüche 6, 7, 8 oder10, dadurch gekennzeichnet , dass man die Trübung der Probe nach der Bildung des ternären Komplexes bestimmt und in Beziehung bringt zu einer Kontrollprobe, von der bekannt ist, dass sie kein Antigen oder Antigen in einer bekannten Menge enthält.
- 12. Verfahren gemäss einem der Ansprüche 6, 7, 8 oder 10, dadurch gekennzeichnet , dass ein Fluoreszenzchromophor an den ersten Antikörper und ein Chromophor, der in der Lage ist, das Licht der von dem Fluoreszenzchromophor emittierten Wellenlänge zu absorbieren, an den zweiten Antikörper gebunden ist, und dass man nach dem Kontaktieren die Intensität der Fluoreszenz bestimmt und mit der Fluoreszenz einer Standardprobe vergleicht, die frei von dem Antigen ist oder das Antigen in einer bekannten Menge enthält.— 5 —
- 13. Verfahren gemäss einem der Ansprüche 2, 3, 4, 5 oder 12, dadurch gekennzeichnet , dass der Fluoreszenzchromophor Fluorescein und der Chromophor, der in der Lage ist, das emittierte Licht zu absorbieren, Rhodamin ist.
- 14. Verfahren gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , dass ein Enzym an den ersten Antikörper und eine Substanz an den zweiten Antikörper gebunden wird und dadurch das Enzym mit der Substanz reagiert und den Nachweis des Antikörper: Antigen: Antikörper-Komplexes ermöglicht.
- 15. Verfahren gemäss Anspruch 14, dadurch g e k e η η zeichnet , dass die an den zweiten Antikörper gebundene Substanz ein Enzym ist.
- 16. Verfahren gemäss Anspruch 15, dadurch g e k e η η zeichnet , dass das erste Antikörper-gebundene Enzym eine Reaktion katalysiert, bei welcher ein Produkt gebildet wird, welches bei einer Reaktion benötigt wird, die von dem zweiten Antikörpergebundenen Enzym katalysiert wird.
- 17. Verfahren gemäss Anspruch 16, dadurch g e k e η η zeichnet , dass das Produkt der von dem ersten gebundenen Enzym katalysierten Reaktion bei der Reaktion, die von dem zweiten gebundenen Enzym katalysiert wird, verbraucht wird.
- 18. Verfahren gemäss Anspruch 16, dadurch g e k e η η zeichnet , dass das Produkt der von demersten gebundenen Enzym katalysierten Reaktion allosterisch mit dem zweiten gebundenen Enzym reagiert.
- 19. Verfahren gemäss Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass das Produkt der von dem ersten gebundenen Enzym katalysierten Reaktion allosterisch das zweite gebundene Enzym aktiviert oder allosterisch inhibiert.
- 20. Verfahren gemäss einem der Ansprüche 16 bis 19, dadurch gekennzeichnet , dass bei der Reaktion die von dem zweiten Antikörper-gebundenen Enzym katalysiert wird, ein nachweisbares Produkt gebildet wird.
- 21. Verfahren gemäss einem der Ansprüche 16 bis .19, dadurch gekennzeichnet , dass bei der von dem zweiten Antikörper-gebundenen Enzym katalysierten Reaktion eine nachweisbare Substanz verbraucht wird.
- 22. Verfahren gemäss Anspruch 20 oder 21, dadurch gekennzeichnet , dass die Bildung oder der Verbrauch der nachweisbaren Substanz colorimetrisch, fluorimetrisch, durch Lumineszenz oder durch Spektrofotometrie nachgewiesen wird.
- 23. Verfahren gemäss Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass die Substanz auf dem zweiten Antikörper eine Reaktion, die von dem ersten Antikörper-gebundenen Enzym katalysiert wird, eingeht.
- 24. Verfahren gemäss Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet , dass die Reaktion eine Substanz erzeugt, die colorimetrisch, fluorimetrisch, durch Lumineszenz oder durch Spektrofotometrie nachgewiesen werden kann.
- 25. Verfahren zur Bestimmung der Gegenwart oder der Konzentration von antigenen Substanzen in einer Flüssigkeitsprobe, gekennze ichnet durch die Stufen:(a) Kontaktieren einer Probe der Flüssigkeit mit einer bekannten Menge einer zugegebenen antigenen Substanz und eines monoclonalen Antikörpers zu der antigenen Substanz, und(b) Messen der Inhibierung der Bildung eines Komplexes zwischen dem Antikörper und der zugegebenen antigenen Substanz durch Kombination des monoclonalen Antikörpers und der antigenen Substanz in der Flüssigkeit unter Ausbildung eines zweiten Komplexes.
- 26. Verfahren gemäss Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet , dass ein Fluoreszenzchromophor an die zugegebene antigene Substanz gebunden wird und ein Chromophor, der in der Lage ist, Licht einer Wellenlänge, wie sie von dem Fluoreszenzchromophor emittiert wird, zu absorbieren, an den monoclonalen Antikörper gebunden ist und wobei man nach dem Inberührungbringen die Intensität der Fluoreszenz bestimmt und mit der Fluoreszenz einer Standardprobevergleicht, die keine antigene Substanz oder die antigene Substanz in einer bekannten Menge enthält.
- 27. Verfahren gemäss Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet , dass ein Fluoreszenzchromophor an den monoclonalen Antikörper gebunden ist und ein Chromophor, das in der Lage ist, Licht der Wellenlänge, die von dem Fluoreszenzchromophor emittiert wird, zu absorbieren, an die zugegebene antigene Substanz gebunden ist, und dass man nach dem Kontaktieren die Intensität der Fluoreszenz bestimmt und mit der Fluoreszenz einer Standardprobe vergleicht, die frei von der antigenen Substanz ist oder die die antigene Substanz in einer bekannten Menge enthält.
- 28. Verfahren gemäss Ansprüchen 26 oder 27, dadurch gekennzeichnet , dass der Fluoreszenzchromophor Fluorescein und der Chromophor, der in der Lage ist, emittierendes Licht zu absorbieren, Rhodamin ist.
- 29. Verfahren gemäss einem der Ansprüche 26 oder 27, dadurch gekennzeichnet , dass der monoclonale Antikörper und die zugegebene antigene Substanz an Teilchen gebunden sind, und dass der erste Komplex aus einem Agglomerat der den monoclonalen Antikörper bindenden Teilchen und der die antigene Substanz bindenen Teilchen besteht.
- 30. Verfahren geraäss Anspruch 29, dadurch gekennzeichnet , dass die Teilchen ausgewählt sind aus Latex, Siliziumdioxid, Glas, Zellen, Polyacrylamid, Polymethylmethacrylat und Agarose.
- 31. Verfahren gemäss Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet , dass der monoclonale Antikörper und die zugegebene antigene Substanz an Teilchen gebunden sind, und dass der erste Komplex aus einem Agglomerat von Teilchen besteht, welche die zugegebene antigene Substanz binden, worauf man, nach dem Kontaktieren, die Trübung der Probe bestimmt und mit der Trübung einer Standardprobe, die keine antigene Substanz oder die antigene Substanz in einer bekannten Menge enthält, vergleicht.
- 32. Verfahren gemäss Anspruch 31, dadurch gekennzeichnet , dass die Teilchen ausgewählt sind aus Latex, Siliziumdioxid, Glas, Zellen, Polyacrylamid, Polymethylmethacrylat und Agarose.
- 33. Verfahren gemäss einem der Ansprüche 29, 30, 31oder 32, dadurch gekennzeichnet , dass die Teilchen eine Grosse im Bereich von etwa 0,2 bis etwa 10 um haben.
- 34. Verfahren gemäss Anspruch 1, zur Bestimmung der Anwesenheit oder der Konzentration einer antigenen Substanz in einer Flüssigkeitsprobe, gekennzeichnet durch folgende Stufen:- 10 -- ίο -(a) Kontaktieren einer Probe der Flüssigkeit mit einem löslichen ersten monoclonalen Antikörper zu der antigenen Substanz , unter Ausbildung eines löslichen Komplexes des Antikörpers und der in der Probe enthaltenen antigenen Substanz, wobei der erste monoclonale Antikörper markiert ist,(b) Kontaktieren des löslichen Komplexes mit einem zweiten monoclonalen Antikörper, der an einen festen, in der Flüssigkeit unlöslichen Träger gebunden ist, unter Ausbildung eines unlöslichen Komplexes des ersten monoclonalen Antikörpers, der antigenen Substanz und dem zweiten monoclonalen Antikörper, gebunden an den festen Träger,(c) Abtrennen des festen Trägers von der Flüssigkeitsprobe und von nichtreagiertem markierten Antikörper,(d) Messen entweder der Menge des auf dem festen Träger enthaltenen markierten Antikörpers oder der Menge an nichtreagiertem markierten Antikörper, und(e) dass man die Menge an gemessenem markierten Antikörper mit der Menge des gemessenen markierten Antikörpers für eine Kontrollprobe, die nach den Stufen (a) bis (d) hergestellt wurde, vergleicht, wobei bekannt ist, dass die Kontrollprobe frei von der antigenen Substanz ist, um die Gegenwart der antigenen Substanz in der Flüssigkeitsprobe zu- 11 -bestimmen, oder dass man die gemessene Menge des markierten Antikörpers mit der gemessenen Menge eines markierten Antikörpers einer bekannte Mengen an antigenen Substanzen enthaltenden Probe, die gemäss den Stufen (a) bis (d) hergestellt worden ist, in Beziehung setzt, um die Konzentration der in der Flüssigkeitsprobe enthaltenen antigenen Substanz zu bestimmen.
- 35. Verfahren gemäss Anspruch 1, zur Bestimmung der Gegenwart einer antigenen Substanz in einer Flüssigkeitsprobe, gekennzeichnet durch die Stufen(a) gleichzeitiges Inberührungbringen einer Probe der Flüssigkeit mit ersten und zweiten monoclonalen Antikörpern zu der antigenen Substanz, wobei der erste monoclonale Antikörper markiert ist und der zweite monoclonale 7mtikörper an einen festen Träger, der in der Flüssigkeit unlöslich ist, gebunden ist, unter Ausbildung eines unlöslichen Komplexes aus dem ersten monoclonalen Antikörper, der antigenen Substanz und dem zweiten monoclonalen Antikörper,(b) dass man den festen Träger von der Flüssigkeitsprobe und von nichtumgesetztem markierten Antikörper abtrennt,(c) dass man die Menge an markiertem Antikörper auf dem festen Träger oder die Menge an nichtreagiertem markierten Antikörper misst, und- 12 -(d) dass man die Menge an gemessenem markierten Antikörper mit der Menge an markiertem Antikörper, die bei einer Kontrollprobe, die gemäss den Stufen (a) bis (c) hergestellt worden ist und von der bekannt ist, dass sie die antigene Substanz nicht enthält, vergleicht, um dadurch die Anwesenheit der antigenen Substanz in der Flüssigkeitsprobe festzustellen, oder dass man die Menge an gemessenem markierten Antikörper mit der Menge an gemessenem markierten Antikörper einer Probe, die eine bekannte Menge der antigenen Substanz enthält und nach den Stufen (a)-(c) hergestellt worden, ist, vergleicht, um die Konzentration an antigener Substanz in der Flüssigkeitsprobe festzustellen·
- 36. Immunometrisches Assay gemäss Anspruch 1, zur Bestimmung der Gegenwart oder der Konzentration einer antigenen Substanz in einer Flüssigkeitsprobe, wobei ein ternärer Komplex aus einem ersten markierten Antikörper, der antigenen Substanz und einem zweiten Antikörper, der an einen festen Träger, in der Flüssigkeit unlöslichen Träger gebunden ist, gebildet wird, dadurch gekennzeichnet , dass man einen monoclonalen Antikörper für sowohl den markierten Antikörper als auch für den an einen festen Träger gebundenen Antikörper verwendet.
- 37. Verfahren gemäss Anspruch 36, dadurch gekennzeichnet , dass man die Flüssigkeitsprobe zuerst mit dem zweiten Antikörper unter Ausbildung eines binären Komplexes der antigenen Substanz und- 13 -dem zweiten Antikörper, der in der Flüssigkeitsprobe unlöslich ist, kontaktiert und dann mit dem ersten markierten Antikörper kontaktiert, unter Ausbildung des ternären Komplexes.
- 38. Verfahren gemäss Anspruch 36, dadurch gekennzeichnet , dass die Flüssigkeitsprobe zuerst mit dem zweiten Antikörper kontaktiert wird, unter Ausbildung eines binären Komplexes der antigenen Substanz und des zweiten Antikörpers, der in der Flüssigkeit unlöslich ist, und dass man die von dem festen Träger abgetrennte Probe und den festen Träger mit einer Lösung des ersten markierten Antikörpers in Berührung bringt und dadurch den ternären Komplex bildet.
- 39. Verfahren gemäss einem der Ansprüche 34 bis 38, dadurch gekennzeichnet , dass der erste monoclonale Antikörper das Produkt einer von dem zweiten monoclonalen Antikörper unterschiedlichen Zellinie ist.
- 40. Verfahren gemäss einem der Ansprüche 34 bis 38, dadurch gekennzeichnet , dass das Antigen wenigstens zwei identische Bindungsstellen hat und dass die ersten und zweiten monoclonalen Antikörper das Produkt der gleichen Zellinie sind.
- 41. Verfahren gemäss einem der Ansprüche 34 bis 40, dadurch gekennzeichnet , dass die ersten und die zweiten Antikörper so ausgewählt sind, dass sie eine Affinität für das Antigen vonwenigstens etwa 10 1/mol haben.- 14 -
- 42. Verfahren geraäss Anspruch 41, dadurch gekennzeichnet, dass die Affinität wenigstens etwa 10 1/mol beträgt.
- 43. Verfahren gemäss einem der Ansprüche 34 bis 40, dadurch gekennzeichnet , dass der feste Träger gewaschen wird, um die Flüssigkeitsprobe von dem Träger abzutrennen.
- 44. Verfahren gemäss Anspruch 43, dadurch gekennzeichnet, dass der feste Träger mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung gewaschen wird.
- 45. Verfahren gemäss einem der Ansprüche 34 bis 40, dadurch gekennzeichnet , dass das Antigen ausgewählt ist aus der Gruppe IgE, Häpatitis A, Hepatitis B, Häpatitis-Nicht-A, Häpatitis-Nicht-B, Alphafötoprotein, carcinoembryonisch.es Antigen, Insulin und humane thyroidstimulierenden Hormon.
- 46. Verfahren gemäss einem der Ansprüche 34 bis 40, dadurch gekennzeichnet, dass der markierte Antikörper mit einem radioaktiven Isotop, einem Enzym oder einem fluorogenen Material markiert ist und dass man die Untersuchung radiometrisch, fluorometrisch oder enzymatisch vornimmt.
- 47. Verfahren gemäss Anspruch 46, dadurch gekennzeichnet, dass die Markierung radioaktives1 25 Isotop J ist.- 15 -
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