DE3137887C2 - - Google Patents
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Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bildung von
Bakterien mit hoher Nitrilaseaktivität, bei dem man Bakterien mit
der Fähigkeit, Nitrilase zu bilden, inkubiert.
Mit dem Fortschreiten der Verwendung vom immobilisierten
Enzymen und immobilisierten Mikroben, sind zahlreiche
Versuche unternommen worden, Mikroben oder Enzyme
als Katalysatoren für verschiedene Reaktionen zu verwenden.
Nitrilase ist als ein Enzym bekannt, welches Nitrile
unter Bildung der entsprechenden Amide hydratisiert. Als
typisches Beispiel für eine solche Umsetzung, bei der
Bakterien vom Genus Corynebakterium und Genus Nocardia
verwendet werden, findet sich in der US-PS 42 48 968
und Bakterien vom Genus Bacillus und Genus Bacteridium
im Sinne von Prevot, vom Genus Micrococcus und vom
Genus Brevibakterium im Sinne von Bergy werden in US-PS
40 01 081 als solche, die in eine Nitrilaseaktivität aufweisen
und die Acrylnitril unter Bildung von Acrylamid
hydratisieren, erwähnt.
US-PS 37 56 947 beschreibt ein Verfahren zur Behandlung
nitrilhaltiger Abwässer, wobei vorgeschlagen wird, ein
geeignetes Koagulans in Forml von z. B. Eisenverbindungen
zuzugeben, wenn Mikroorganismen bei Zugabe zum
Aktivschlamm keine Koagulierbarkeit zeigen. Ein Hinweis,
daß durch Zugabe einer löslichen Eisenverbindung die
Nitrilaseaktivität bestimmter Bakterien gezielt erhöht
werden kann, ist dieser Schrift, die eine Verbesserung
des Präzipitationszustandes von aktiviertem Schlamm
durch Zugabe eines Koagulationsmittels anspricht, nicht
zu entnehmen.
Gründliche Untersuchungen zum Auffinden eines Verfahrens
zur Bildung von Bakterien mit hoher Nitrilaseaktivität
in hohen Ausbeuten, um diese Enzymquellen
industriell zu erschließen, haben nun dazu geführt,
daß festgestellt wurde, daß die Ausbeute an Nitrilase
erheblich erhöht wird, wenn man die vorerwähnten Bakterien
in einem Kulturmedium inkubiert, welches eine
wasserlösliche Eisenverbindung enthält. Die Erfindung
betrifft somit ein Verfahren zur Herstellung von Bakterien
mit hoher Nitrilaseaktivität und ist dadurch gekennzeichnet,
daß man Bakterien, die in der Lage sind,
Nitrilase zu bilden, in einem eine wasserlösliche Eisenverbindung
enthaltenden Kulturmedium inkubiert, wobei
man ein Kulturmedium, enthaltend eine
wasserlösliche Eisenverbindung in einer Menge von
wenigstens 0,2 mg/l, berechnet als Eisen, verwendet.
Als erfindungsgemäß geeignete Bakterien kommen alle
solche, unabhängig von ihrer taxonomischen Klassifizierung,
in Frage, die die Fähigkeit haben, Acrylnitril unter
Bildung von Acrylamid zu hydratisieren. Bevorzugte
Beispiele sind Corynebakterium Stamm N-771 (Hinterlegungsnummer
FERM 4445), Corynebakterium Stamm N-774
(FERM 4446) und Nocordia Stamm N-775 (FERM 4447), die in
der vorerwähnten US-PS 42 48 968 genannt werden.
Die erfindungsgemäß verwendete wasserlösliche Eisenverbindung
kann ein anorganisches oder organisches
Eisensalz oder eine Organo-Eisen-Komplexverbindung
sein. Beispiele für anorganische Salze sind Sulfate,
Hydrochloride und für organische Salze Acetate und
Fumarate von zweiwertigem Eisen oder dreiwertigem
Eisen, sowie Organo-Eisen-Komplexverbindungen aus Citronensäure,
Bernsteinsäure, Ethylendiamintetraessigsäure
oder Nitrilotriessigsäure und Eisen. Besonders bevorzugt
zur Erhöhung der Enzymaktivität von Bakterien
sind Organo-Eisen-Komplexverbindungen, so daß das
Eisen in dem Kulturmedium als organische Komplexverbindung
vorliegt. Die Menge an diesen Eisenverbindungen,
die dem Kulturmedium zugeführt werden, beträgt
wenigstens 0,2 mg/l, vorzugsweise
0,2 bis 500 mg/l und insbesondere 1 bis 100 mg/l,
berechnet als Eisen.
Die Erfindung kann durchgeführt werden, indem man
einen Stamm der vorerwähnten Bakterien inkubiert und
dabei ein Kulturmedium verwendet, das Kohlenstoffquellen,
wie Glukose, Maltose und Saccharose
und Stickstoffquellen, wie Ammoniak, Ammoniumsulfat,
Ammoniumchlorid, Ammoniumnitrat und Harnstoff, organische
Nährmittel, wie Hefeextrakt, Fleischextrakt,
Malzextrakt, Caseinhydrolysat und Pepton und dergleichen,
und das anorganische Nährstoffe, wie Phosphorsäuresalze,
Kaliumsalze, Magnesiumsalze und andere
Metallsalze als in geringfügigen Mengen erforderliche
Nährstoffe enthält. Zu diesen gibt man dann die wasserlösliche
Eisenverbindung der vorerwähnten Art, um die Nitrilaseaktivität
der Bakterien dadurch zu erhöhen. Die
Kultivierung wird im allgemeinen bei einer Temperatur
von 25 bis 30°C, einem pH-Wert zwischen 5 und 8 unter
aeroben Bedingungen während 30 bis 100 Stunden durchgeführt.
Die Erfindung wird nachfolgend ausführlich in den
Beispielen erläutert.
Zum Messen der Nitrilaseenzymaktivität zum Hydratisieren
von Acrylnitril wurde folgende Methode angewendet:
Bakterien wurden aus dem Kulturmedium mit 0,05 M
Phosphat abgetrennt und mit einer 0,05 M Phosphatpufferlösung
(pH 7,5) gewaschen, wobei man gewaschene
Bakterienzellen erhielt. Diese wurden als Enzymquelle
verwendet und eine geeignete Menge einer Enzymlösung
(gewaschene Zellen: 1 bis 5 mg) wurde zu 5 ml einer
0,05 M Phosphatpufferlösung (pH 7,5), enthaltend 2,5%
Acrylnitril, gegeben. Nachdem die vorerwähnte Phosphatpufferlösung
bis zu einer Gesamtmenge von 10 ml zugegeben
worden war, wurde 10 Minuten bei 10°C umgesetzt.
Das bei dieser Umsetzung gebildete Acrylamid wurde
quantitativ mittels Gaschromatografie gemessen und das
Gewicht in mg an Bakterien, die 1 µmol/min an Acrylamid
unter den vorerwähnten Bedingungen bildeten, wurde
als eine Einheit bewertet.
Die Prozentangaben in den Beispielen sind auf das Gewicht
bezogen.
Ein Grundmedium (pH 7,5) aus 1% Glukose, 0,5%
(NH₄)₂SO₄, 0,1% KH₂PO₄, 0,1%MgSO₄ · 7H₂O, 0,01%
NaCl, 0,01% CaCl₂ · 2H₂O, 0,000004% CuSO₄ · 5H₂O, 0,00001%
KJ, 0,00002% FeCl₃ · 6H₂O, 0,00004% MnSO₄ · 4H₂O, 0,00002%
Na₂MoO₄ · 2H₂O, 0,00004% ZnSO₄ · 6H₂O, 1% Casaminosäure und
0,0002% Thiaminhydrochlorid wurde in mittelgroße
Reagenzgläser in einer Menge von jeweils 10 ml eingefüllt.
Dazu wurde Ferrosulfat oder Ferrisulfat in einer
Menge zwischen 0 und 500 mg/l, als lösliches Eisen berechnet,
in den in Tabelle 1 angegebenen Mengen gegeben
und diese hergestellten Proben wurden 15 Minuten bei
120°C sterilisiert. Nach dem Abkühlen wurde sterilisiertes
CaCO₃ in einer Menge von 2% zur Einstellung des
pH-Wertes zugegeben. Dazu wurden 0,05 ml eines Kulturmediums
von Corynebakterium Stamm N-774 (FERM Nr. 4446),
das zuvor mit dem vorerwähnten Kulturmedium (enthaltend
0,001% Ferrosulfat) inkubiert worden war, gegeben und
die Kultivierung wurde unter Schütteln während 3 Tagen
bei 30°C durchgeführt. Nach Beendigung der Kultivierung
wurden die Bakterien mittels einer Zentrifuge abgetrennt
und mit einer 0,05 M Phosphatpufferlösung (pH
7,5) gewaschen. Mit den gewaschenen Bakterienzellen wurde
dann die Nitrilaseenzymaktivität zum Hydratisieren
von Acrylnitril gemessen und die Ergebnisse werden
in Tabelle 1 gezeigt. Aus Tabelle 1 geht hervor, daß
in dem Fall, daß eine wasserlösliche Eisenverbindung
nicht zu dem Grundkulturmedium gegeben worden war, eine
Enzymbildung kaum stattfand, obwohl das Bakterienwachstum
gut war. Es ist auch ersichtlich, daß die Enzymaktivität
der Bakterien erheblich in Gegenwart einer
wasserlöslichen Eisenverbindung, wodurch
eine große Menge an Enzym im Inneren
der Bakterien gebildet wurde, ansteigt.
Ein Grundkulturmedium wie in Beispiel 1 wurde in vier
mittelgroße Reagenzgläser in Mengen von jeweils 10 ml
eingefüllt. Dazu wurde Nichts, Ferrosulfat, Ferrizitrat
und Natriumethylendiamintetraessigsäure-Eisenkomplex jeweils
gegeben und dann wurde 15 Minuten bei 120°C sterilisiert.
Nach dem Abkühlen wurde sterilisiertes CaCO₃
in einer Menge von 2% zugegeben, um den pH einzustellen
und dann wurden 0,05 ml eines Kulturmediums von
Corynebakterium Stamm N-774 (FERM Nr. 4446), wie in Beispiel
1 angewendet, zugegeben. Die Kultivierung wurde
unter Schütteln während 3 Tagen bei 30°C durchgeführt.
Nach Beendigung der Kultivierung wurden die Bakterien wie
in Beispiel 1 abgetrennt und die Enzymaktivität wurde
ebenso wie in Beispiel 1 gemessen. Die Ergebnisse werden
in Tabelle 2 gezeigt.
Aus Tabelle 2 geht hervor, daß die Ausbeute an Enzym
in Gegenwart von den in einem Kulturmedium, dem eine
wasserlösliche Eisenverbindung zugegeben worden war,
inkubierten Bakterien erheblich ansteigt, im Vergleich
zu dem Fall, daß die Bakterien in einem Kulturmedium
ohne Zugabe inkubiert worden waren. Daraus geht hervor,
daß die Gegenwart des Eisenions in Form einer
organischen Komplexverbindung besonders wirksam ist.
Ein Kulturmedium (pH 7,5), enthaltend 1,0% Glukose, 0,5%
Pepton, 0,3% Hefeextrakt und 0,3% Malzextrakt, wurde
in sechs Reagenzgläser in Mengen von jeweils 10 ml eingefüllt.
Ferrosulfat wurde zu drei der Gläser in einer
Menge von 2 mg/l als lösliches Eisen gegeben und dann
wurde 15 Minuten bei 120°C sterilisiert. Nach dem Kühlen
wurden 0,05 ml eines Kulturmediums von Corynebakterium
Stamm N-774 (FERM Nr. 4446), Nocardiastamm N-775 (FERM
Nr. 4447) oder Brevibakterium imperial IAM 1654, die
durch vorherige Inkubierung erhalten worden waren (unter
Verwendung des vorerwähnten Kulturmediums, zu dem eine
wasserlösliche Eisenverbindung nicht zugegeben worden
war) zu den Reagenzgläsern gegeben und die Kultivierung
wurde unter Schütteln während 48 Stunden bei 30°C durchgeführt.
Nach Beendigung der Kultivierung wurden die
Bakterien abgetrennt und die Enzymaktivität wurde wie in
Beispiel 1 gemessen. Die Ergebnisse werden in Tabelle
3 gezeigt.
Aus Tabelle 3 geht hervor, daß die in einem Kulturmedium,
dem eine wasserlösliche Eisenverbindung zugegeben
worden war, inkubierten Bakterien eine erhöhte
Enzymaktivität im Vergleich zu solchen Bakterien aufwiesen,
die im gleichen Kulturmedium aber ohne Zugabe einer
wasserlöslichen Eisenverbindung inkubiert worden waren
und daß sich eine große Menge an Enzym im
Inneren der Bakterien bildete.
Claims (3)
1. Verfahren zum Produzieren von Bakterien mit hoher Nitrilaseaktivität,
bei dem man Bakterien mit der Fähigkeit,
Nitrilase zu bilden, inkubiert, dadurch gekennzeichnet,
daß man ein Kulturmedium, enthaltend
eine wasserlösliche Eisenverbindung in einer Menge
von wenigstens 0,2 mg/l, berechnet als Eisen, verwendet.
2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,
daß die wasserlösliche Eisenverbindung
in dem Kulturmedium in einer Menge von 0,2 bis 500 mg/l,
berechnet als Eisen, vorhanden ist.
3. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,
daß die wasserlösliche Eisenverbindung
in dem Kulturmedium einer Menge von 1 bis 100 mg/l,
berechnet als Eisen, vorliegt.
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