DE3151962A1 - Verfahren und vorrichtung zur detektion in der saeule bei der fluessigchromatographie - Google Patents

Description

Patentanwälte ■ European Patent Attorneys

7 München

Varian Associates, Inc. Palo Alto, CaI., USA

Vl P546 D

Verfahren und Vorrichtung zur Detektion in der Säule bei der FlUssigchromatographie

Priorität: 8. Januar 1981 -USA- Serial No. 223 445

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Die Erfindung betrifft das Detektieren von Proben auf dem Gebiet der Chromatographie und bezieht sich insbesondere auf ein Verfahren.und eine Vorrichtung zur Detektion in der Säule bei Flüssigchromatographie mit hoher Auflösung.

Auf dem Gebiet der Chromatographie erfolgt die Trennung von Stoffgemengen dadurch, daß eine Probe, die multiple Stoffe enthält, in einem Trägergas oder einer Flüssigkeit durch eine Säule geleitet wird, die eine ruhende phase enthält. Die Stoffe innerhalb der Probe werden auf der Basis ihrer relativen Wanderungsgeschwindigkeit durch die Säule getrennt. Die Stoffe werden nach unterschiedlichen Zeitspannen mit Einrichtungen wie Ioni.sierungsdetektoren, spektrophotometrischen,. spektrofluorometrischen, elektrochemischen Detektoren und dgl. wahrgenommen. Da diese Detektoren am Ende chromatographischer Säulen befestigt sind, ist eine Verbindung zwischen der jeweiligen Säule und dem Detektor nötig. Durch solche Verbindungen werden unweigerlich Mischwirkungen eingeführt und ein totes Volumen verursacht, was · beides zu einem Verlust an Auflösung zwischen Spitzen führt, insbesondere wenn die Spitzen nahe beisammenliegen und besonders dann, wenn der Querschnitt des Verbindungsrohres sehr viel größer ist als der Querschnitt der Säule. Seit die Chromatographie bis zur Verwendung von Mikrοsäulen fortgeschritten ist, deren Innendurchmesser 500 um oder weniger beträgt, ist dies Problem noch verschärft worden. In solchen Fällen ist es nämlich zunehmend schwerer, wenn nicht ganz unmöglich, Verbindungen vorzusehen, die keine wesentlichen Mischwirkungen einführen, denn, obwohl die absoluten Volumen klein sind, können die Querschnittsflächen der Säule, der Verbindung und der Strömungszelle doch sehr unterschiedlich sein. Außerdem ist es schwer, Detektoren-herzustellen und zu befestigen, deren Volumen so klein ist wie innerhalb der Säulen splbst anzutreffen.

In der mikrokapillaren Flüssigchromatographie ist man rasch dazu gelangt, Säulen mit Innendurchmessern im Bereich von 30-60 um zu verwenden, siehe z.B. D. Ishii et al., "Study of Open Tubular Micro-Capillary Liquid Chromatography" , J. High Resolution Chromatography & Chromatography communications, Juni 1979» S. 371. Bei der Verwendung derartiger Säulen kommt es zu ernsthaften Diskontinuitäten zwischen der Säule und dem Detektor. Eine solche Ungleichmäßigkeit der Innendurchmesser kann wie folgt aussehen: Auf eine Säule mit einem Innendurchmesser von 30-60 um können Verbindungselemente folgen, deren Innendurchmesser 130 bzw. 70 um betragen, sowie ein Detektor, der einen Innendurchmesser von 170 um hat (siehe die obengenannte Veröffentlichung von D. Ishii, S. 373), und auf eine Kapillarsäule mit einem Innendurchmesser von 60 um kann eine Verbindung mit einem Innendurchmesser von 150 um und ein Detektor mit einem Innendurchmesser von 300 um folgen (P. Tsuda, "Studies of. Open Tubular Micro-Capillary Liquid Chromatography", J. Chromatogr., Bd. 158, S. 227, 229, 1978). Obwohl die in Frage stehenden Innendurchmesser klein sind, liegt auf der Hand, daß große Unterschiede zwischen den aufeinanderfolgenden Bindegliedern bestehen, so daß an der Grenzstelle starke Mischeffekte sowie Tot-Volumen-Effekte auftreten. Durch solche Effekte

wird die Auflösung zwischen Spitzen notwendigerweise verringert.

Anstelle der Kapillarsäulen werden heutzutage Quarzglassäulen in der GasChromatographie und Flüssigchromatographie verwendet, siehe F. J. Yang, "Fused Silica Open Tubular Column for Liquid Chromatography", J. High Resolution Chromatography and Chromatography Communications, S. 589, November 1980 sowie die dort genannten Veröffentlichungen. Der Vorteil von Quarzglassäulen besteht darin, daß sie nach dem Erwärmen auf außerordentlich kleine Durchmesser gezogen werden können, und daß aktive Absorptionsmittel, mit deren

Hilfe die chromatographische Trennung hervorgerufen wird, im Innern haftend angebracht werden können. Darüberhinaus haben Quarzglassäulen eine ausgezeichnete· mechanische Festigkeit und sehr gute optische Eigenschaften, und sind, wenn sie auf ausreichend kleine Durchmesser gezogen worden sind, flexibel, wie nachfolgend noch beschrieben wird. Hinsichtlich der Nützlichkeit von Glassäulen mit kleinem Durchmesser wird auf TJS-PS 4 207 188 verwiesen.

Der Fluoreszenznachweis in der Säule ist schon früher gemacht worden. B. F. Lloyd beschreibt in "Nitrogen Heteracycle and Polynuclear Hydrocarbon Fluorescence and Adsorption Effects in the Presence of Silica Gel Applications in High-Pressure Liquid and Microcolumn Chromatography", The Analyst, Bd. 100, S. 529, 531, 1975 eine Mikrosäule mit einem Außendurchmesser von 3,5 mm und einem Innendurchmesser von 1 mm, die an einem Ende durch Erwärmen so eingeengt ist, daß sie einen innendurchmesser von ca. 0,1 mm hat. Die Zeil«»., d.h. der eingeengte Bereich ist mit einem trockenen Absorptionsmittel gefüllt, welches zwischen Baumwoll- oder Glasfaserstopfen gehalten ist. Durch den eingeschnürten Bereich wird eine Probe mit Durchsätzen, bis zu 2 ml/Min, geleitet und die vom Absorptionsmittel ausgehende Fluoreszenz mit einem Mikroskop überwacht. Bei diesem Nachweis in der Säule ist die Säule fest, da ihr innendurchmesser 1000 um beträgt, und sie ist nicht durchsichtig, weil sie Packungsmaterial enthält.

Die Wahrnehmung in der Säule erfolgt mit optischen Einrichtungen unter Verwendung einer flexiblen Quarzglassäule. Die flexible Säule ist im Innern aktiviert und hat einen innendurchmesser von weniger als 500 um und an der Außenseite" einen Schutzüberzug, der in einem Teil in der Nähe des Endes der Säule abgestreift ist. Dieser abgestreifte bzw. vom Überzug befreite Teil wird im Arbeitsweg eines optischen Detektors angeordnet, während man eine Probe durch die Säule fließen läßt, um sie zu analysieren und aufzulösen.

Im folgenden ist die Erfindung mit weiteren vorteilhaften Einzelheiten anhand eines schematisch dargestellten Ausführungsbeispiels näher erläutert. In den Zeichnungen zeigt:

Fig. 1a-1e die Verfahrensschritte zum Herstellen einer Mikrokapillarsäule, die für den Nachweis in der Säule gemäß der Erfindung geeignet ist;

Fig_o 2 eine Anordnung zur Detektion in der Säule mit einer Ultraviolettdetektionsvorrichtung, die gemeinsam mit der erfindungsgemäßen Vorrichtung verwendet wird;

Fig. 3 ein Chromatogramm von Bestandteilen einer Probe, die mit der erfindungsgemäßen Vorrichtung getrennt wurden;

Fig. 4 eine graphische Darstellung des Beitrags zum Verlust an Auflösung, den der erfindungsgemäße Detektor in der Säule im Fall von zwei zurückgehaltenen Bestandteilen mit Trennkonstanten von 1 bzw. 10 leistet;

Fig. 5 ein Chromatogramm von Benzol, wie es mit der erfindungsgemäßen Vorrichtung wahrgenommen wird.

Herkömmlicherweise _gi_{ng man} davon aus, daß es nicht

möglich ist, die Trennung von Bestandteilen innerhalb einer Probe festzustellen, während diese noch am Ende einer chromatographischen Säule fließt. Dies wurde insbesondere für den optischen Nachweis im Sichtbaren nicht für möglich gehalten, weil die herkömmlichen Säulenmaterialien keine akzeptablen optischen Eigenschaften hatten. Eine Ausnahme bildet der Fluoreszenznachweis, der in der oben genannten Veröffentlichung von Lloyd beschrieben ist. Für den optischen Nachweis im Sichtbaren hat jedoch Kronglas (Natron-Kalk-Glas) . und Borosilikatglas . eine unannehmbar hohe optische Absorption, und Metallsäulen sind undurchsichtig. Außerdem kann man mit gewöhnlichen Glassäulen nicht mit einem· Druck

bis zu 750 bar arbeiten, was für Flüssigchromatographie mit hoher Auflösung nötig ist. Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren wird jedoch Quarzglas sowohl für eine kontinuierliche chromatographische Säule als auch für eine integrale Detektorströmungszelle benutzt. Wegen der inneren Bindung ist Quarzglas viel stärker als andere Glase. Infolgedessen sind zum Ziehen Temperaturen von 1800°-2000°C im Vergleich zu 400⁰C für Kronglas und 700⁰C für Pyrex-Glas nötig. Quarzglassäulen, die bis zu Innendurchmessern von weniger als 500 um gezogen wurden, sind flexibel und können gewendelt so daß große Längen in kleine Räume passen. Dieses Quarzglas steht jetzt zur Verwendung in Gaschromatographiesäulen mit Innendurchmessern von weniger als 300 um im Handel zur Verfügung, siehe z.B. R. Dandeneau et al., "Flexible Fused' Silica Columns", American Laboratory, Juni 1979; Alltech Associates, Product Bulletin Nr. 37, S. 1_f 1980. Die gemäß der Erfindung vorgesehene Verwendung des Endes einer Quarzglassäule als Strömungszelle für den Nachweis erhöht die Empfindlichkeit und bewahrt die chromatographische Auflösung, weil die Konzentration hoch ist und scharfe Spitzen zu sehen sind.

Es sind bereits verschiedene Detektoren mit geringem totem Volumen entwickelt worden, wozu auf folgendes hingewiesen wird: 1.) Laserfluorimetrie,. G. J. Diebold und R.N. Zare, "Laser Fluorimetry: Subpicogram Detection of Alfatoxins Using High-Pressure Liquid Chromatography", Science 196, 1439-1441, 1977; 2.) Miniaturisierte UV-Detektoren, D. Ishii et al. "A Study of Micro-High-Performance Liquid Chromatography to Development of Technique for Miniaturization of High-Performance Liquid Chromatography", J. Chromatogr. 144, 157-168, 1977; 3.) Y. Hirata et al., "Packed Microcapillary Columns With Different Selectivities for Liquid Chromatography", Anal. ehem. 51, 1807-1809, 1979; 4.) Miniaturisierte elektrochemische Detektoren, Y. Hirata et al., "Small-Volume Electrochemical Detector for Micro-

column Liquid Chromatography", J. Chromatogr. 181, 287-294, 1980$ 5.) Ein fluorometrischer Detektor mit Hüllfluß bzw. Mantelströmung, L.W. Hersliberger et al., "Sub-Mieroliter Flow-Through Cuvette for Fluorescence Monitoring of High Performance Liquid Chromatographie Effluents», Anal. Chem. 51, H44-H46, 1979 und 6.) Der fluorometrische Detektor mit freifallendem Tropfen, F. Martin et al., "The Free-Falling Drop Detector - A Novel Fluorescence Detector for High Performance Liquid Chromatography" , Clin. Ghem. 22, I434-I437, 1979. Die am wenigsten störanfälligen und am häufigsten verwendeten unter diesen Detektoren sind der UV- und der spektrofluorometrisehe Detektor. Die Tatsache daß. solche TJV- und spektroflüorometrisehen Detektoren mit geringem totem Volumen zur Verfügung stehen, ist ein wichtiger Faktor, der es ermöglicht, daß Flüssigchromatographie mit einer Säule mit kleiner Bohrung eine wichtige Trenntechnik für routinemäßige Anwendungsfälle werden kann. Jedoch besteht eine Einschränkung hinsichtlich dieser Detektoren mit kleinem totem Volumen insofern, als Strömungszellenvolumen zwischen 0,1 und 0,3 ^l von dem für die Flüssigchromatographie in Säulen mit kleiner Bohrung erwünschten Optimum weit entfernt sind. So ist für die Flüssigchromatographie in Säulen mit kleiner Bohrung theoretisch abgeleitet worden, daß Detektorströmungszellenvolumen von 1 -10.nl nötig sind, um weniger als 1$ Verlust an Spitzenauflösung bei einer offenen rohrförmigen Säule mit einem Durchmesser von 10-50 um für eine beibehaltene Spitze bei einem Trennverhältnis k = 10 und einer Verweilzeit von einer Stunde zu erhalten, siehe J. Knox et al., "Kinetic Optimization of Straight Open Tubular Liquid chromatography", J. Chromatogr., Bd. 186¹, S. 405-418, 1979. Darüberhinaus wird die Leistung bedeutend beeinflußt von der zusätzlichen Bandverbreiterung, die die Verbindungen von Säule zu Detektor und Schnittstellenrohre hervorrufen. Mit dem Verfahren und der Vorrichtung gemäß der Erfindung sollen die Effekte der Verbindung

zwischen Säule und Detektor sowie des toten Volumens des Detektors aufgrund von Vermischung vermieden werden.

Das Verfahren gemäß der Erfindung ist anhand der Zeichnungen, insbesondere Pig. 1a-1f erläutert. Eine in Pig. 1a im Querschnitt gezeigte Quarzglassäule 10 hat eine Wanddicke 11 im Größenordnungsbereich von 24 mm und einen Innendurchmesser ID von weniger als 20 mm. Diese Quarzglassäule 10 wird unter Wärmebehandlung in einer Ziehmaschine für Faseroptik bei einer Temperatur im Größenordnungsbereich von 2000°0 gezogen. Die Ziehgeschwindigkeit (Verhältnis von Auszugs- zu Eingabegeschwindigkeit) kann von größer als 1 bis zu 1000 variieren. In dem Maß, in dem diese Geschwindigkeit zunimmt, "nimmt sowohl der Innendurchmesser als auch die, Wanddicke ab. Der reduzierte Innendurchmesser beträgt typischerweise weniger als 500 um, und die reduzierte Wanddicke 11· liegt zwischen 20 und 150 um . Solche Säulen sind handelsüblich und stehen für die GasChromatographie zur Verfügung, wie oben schon erwähnt. Säulen mit größerem Durchmesser sind typischerweise nicht flexibel und deshalb nicht in den Bereich des erfindungsgemäßen Verfahrens eingeschlossen. Die fertig gezogene Säule 10· ist flexibel aber zerbrechlich. Zum Schutz wird auf die Außenseite ein Polymerisatüberzug'12, z.B. Polyimid oder ein Metallüberzug aufgebracht; typischerweise hat dieser äußere Überzug eine Dicke zwischen 10 und 150 um.

Wie aus den Pig. 1d und 1e hervorgeht, ist die Quarzglassäule entweder dadurch aktiviert, daß die Innenseite mit einer ruhenden Phase 13 beschichtet oder daß eine ruhende Phase 13 an der Innenfläche der Säule chemisch haftend angebrachtist, oder die Säulen sind mit aktivierten Mikroteilchen H gefüllt. Bei den Säulen mit den kleinsten Innendurchmessern (bei denen die Durchmesser denen der Mikroteilchen angenähert sind), können Beläge praktischer sein als Füllkörper, obwohl auch Packungstechniken beispielsweise,-gemäB '

TIS-PS 4 059 523 angewandt werden können. Die Technik des Beschichtens oder Packens ist "bekannt, und es können die meisten herkömmlichen Verfahren angewandt werden, siehe L. R. Snyder et al., Introduction to Modern Liquid Chromatography, §9.2, "Column packings" S. 287 und folgende. Wie Fig. 1f zeigt, wird als nächstes der äußere Schutzuberzug längs eines kurzen Segmentes der mit Belag versehenen oder gepackten Mikrokapillarsäule aus Quarzglas entfernt. Die Entfernung erfolgt durch Abkratzen, Auflösen oder thermisches Zersetzen des Überzugs. Das genannte Segment hat eine Abmessung von 1 cm oder weniger, was ausreicht für den Zugang eines optischen Detektors für sichtbares Licht durch die Säule. Tatsächlich wird eine Strömungszelle geschaffen, ohne daß dazu getrennte Teile miteinander verbunden werden müssen. Das Volumen dieser Zelle braucht nur 0,24 jjl zu betragen, wenn der Innendurchmesser der Säule 10 um beträgt. Das freigelegte Segment 15 der Quarzglassäule wird dann im Lichtweg eines UV-Lichtdetektors, beispielsweise eines Jasco UVIDEC III oder eines Variehrome TJV-50 angeordnet, wie Pig. 2 zeigt. Bei einem alternativen Ausführungsbeispiel ist auch der aktivierende Belag 13 längs des Endes der Quarzglassäule bis zu einschließlich des kurzen Segmentes entfernt, um jegliche Absorption von sichtbarem Licht durch den dünnen Film auszuschließen. Diese Entfernung erfolgt entweder durch Aufbringen äußerer Wärme oder durch Eintauchen des Endes der Säule in ein geeignetes Lösungsmittel. Im Fall von gepackten Säulen

werden die aktivierten Mikroteilchen 14 aus der Strömungszelle durch eine stromaufwärts angeordnete Fritte herausgehalten.

Eine Vorrichtung zum Nachweis in der Säule gemäß der Erfindung ist in Fig. 2 und 3 gezeigt. Gemäß Fig. 2 wird ein UV-Detektor, z.B. ein Jasco UVIDEC III verwendet. Der UV-Detektor weist eine Lichtquelle 20, Fokussieroptik 21, einen Monochromator 2.2 mit einem Austrittsspalt 25 sowie einen

Photodetektor 24 auf. Statt einer Strömungszelle ist ein Kanal für die Quarzglassäule 10^f vorgesehen. Das bloßgelegte Segment 15 ist so quer zum Lichtweg angeordnet, daß der Photodetektor 24 Licht empfängt, welches durch den vollen Durchmesser der Säule hindurchgetreten ist, durch die eine probe fließt. Der Durchsatz ist kein Begrenzungsfaktor und kann bis zu 10 ml/Min, betragen. In einem anderen Ausführungsbeispiel kann ein Mehrfachwellenlängen-UV-Detektor, z.B. ein Varian Varichrome UV-50 vorgesehen sein. Die Anordnung bleibt dabei dieselbe, und die Wellenlängen sind so gewählt, daß mehrere Substanzen gleichzeitig festgestellt werden können.

Da es im Detektor in der Säule nach der Erfindung zu vernachlässigbarer Mischung kommt, kann der Beitrag der Bandverbreiterung außerhalb der Säule zu dem prozentualen Verlust an Auflösung, $>dR, wie folgt ausgedrückt werden:

• v^R -\

^4R - . 100$ = (1 - Cl + hl J * ) -. IOO96 (1)

R₀ HL

worin R ,R = Auflösung, gemessen für die Säule bzw. die Kombination aus Säule und Detektor,

h,H = Höhenäquivalent zu einer theoretischen Platte für die Strömungszelle bzw. die Säule,

1,L = Eintritts/Austrittsspaltlänge für die Strömungszelle bzw. die Säulenlänge.

Im Falle einer Säule mit kreisförmigem Querschnitt kann z.B. h und H durch eine Gleichung (2) bzw. (3) ausgedrückt werden.

^2Dm +

U 2

/J

2D 2 2 2

H= —- + (1 + 6k' + 11k· ). r_U + 2k' df U (3)

U 24(1 + k·)² D_m 3(1 + k')2 D₁

worin r = Säulenradius,

U = durchschnittliche lineare Strömungsgeschwindigkeit der bewegten phase,

D u. D- = Diffusionsvermögen der gelösten Moleküle in der bewegten bzw. ruhenden phase,

d.p = Filmdicke der ruhenden Phase-,

k' - Trennverhältnis der gelösten Moleküle = wahre Verweilzeit/Säulenleerzeit.

Auf der Basis dieser Gleichungen ergibt sich der in Fig. gezeigte Beitrag des Detektors gemäß der Erfindung in der Säule zu dem Wert #AR für zwei zurückgehaltene Bestandteile mit Trennverhältnissen k' von 1 bzw. 10 in einer Säule mit einer Länge bis zu 15 Meter. Als Durchsatz und D_m werden Werte von 1^1 /Min. bzw. 1 χ 10"^ cm /s angenommen. Die Länge des Detektors ist 0,3 cm, der Säulendurchmesser wird mit 150 um angenommen. Bei Verwendung herkömmlicher optischer Detektoren können die zugehörigen Strömungszellen einen signifikanten Beitrag zum Verlust an Auflösung leisten, z.B. im G-rößenordnungsbereich von einigen zehn Prozent. Selbst bei einem Trennverhältnis, welches 1 angenähert ist (untere Grenze für eine chromatographische Säule, die gut trennt) trägt die dem Nachweis dienende "Zelle" in der Säule, wie Fig. 4 zeigt, zum Verlust an Auflösung im Größenordnungsbereich von Hundertsteln eines Prozent bei. Erwartungsgemäß ist, je höher das Trennverhältnis ist, der Beitrag zum prozentualen Verlust an Auflösung umso geringer. Der prozentuale Verlust an Spitzenauflösung aufgrund des Detektors in der Säule errechnet sich tatsächlich als ein Wert von weniger als 0,02$ für zurückgehaltene Bestandteile mit T.rennkonstanten zwischen. 1 und 10 in Säulen, die langer sind als 1 Meter. Dies ist zwar schon vernachlässigbar, wird aber noch geringer, wenn der Durchmesser

der Säule weniger als 150 um beträgt. Ein Beispiel für gut aufgelöste Bestandteile geht aus Figo 3 hervor. Die bewegte Phase bestand zu 70$ aus Acetonitril und 30$ aus Wasser. Die Säule hatte eine Länge von 60 cm, einen Innendurchmesser von 200 ^m und bestand aus Quarzglas. Sie war mit 5 pm Teilchen gepackt, an denen Octadecylsiloxan haftete. Der "Durchsatz betrug 5,4 jjm/Min., der Einlaßdruck war 350 Atmosphären. Das Volumen der Strömungszelle betrug 0,09jLim Die saubere Trennung der Bestandteile a-f geht aus der unten folgenden Tabelle I hervor.

Bestandteil Elutionszeit (Min.)

a Benzol " 10

b Toluol 10,7 .

c Naphtalin 12

d Pluoren 17,8

e Phenathacen 20,5

f Pyren 29

Pig« 5 zeigt die Nachweisgrenze für eine 6 nl Strömungszelle in der Säule, die am Ende.einer 213 cm Säule ausgebildet war. Die Nachweisgrenze betrug 0,24 Nanogramm Benzol, was sich zu einer nachweisbaren Mindestkonzentration von 1,5 Uanogramm/Mikroliter umrechnen läß.t. Der Durchsatz betrug 1,06 μΙ/Min. Die Spitzenhöhe lag im Bereich von 1000 fachen des Rauschens. ■ ■

ιί

Leerseite

Claims (10)

1. Ansprüche

   /> Verfahren zur Detektion in der Säule mit hoher Auflösung bei der Flüssigchromatographie mit hoher Auflösung, dadurch ge kennzeichne t, daß eine Mikrokapillarsäule aus Quarzglas mit einem Innendurchmesser von weniger als 500 um geschaffen wird, daß das Innere der Säule mit einem chromatographisch aktiven Material aktiviert wird, daß ein Schutzüberzug auf die Außenseite der Säule aufgebracht wird, daß ein Segment des Schutzüberzuges entfernt wird, um das darunterliegende Segment der Quarzglassäule freizulegen, daß ein optischer chromatographischer Detektor vorgesehen wird, daß das freigelegte Segment der Säule im Lichtweg des Detektors angeordnet wird, daß eine Probe, die zu identifizierende Stoffe enthält, durch die Säule geleitet wird, und daß getrennte Stoffe, während sie durch das freigelegte Segment der Säule fließen, nachgewiesen werden.
2. 2. Verfahren nach Anspruch 1,

   dadurch gekennz eichne t, daß das Innere der Säule durch Packen der Säule mit einem chromatographisch aktiven Material aktiviert wird, und daß die Packung innerhalb des Volumens des freigelegten Segmentes entfernt wird.
3. 3. Verfahren nach Anspruch 1,

   dadurch gekennzeichnet, daß das Innere der Säule durch Beschichtender Innenwand der Säule mit einem chromatographisch aktiven Material aktiviert wird.
4. 4. Verfahren nach Anspruch 3»

   dadurch gekennzeichnet, daß das chromatographisch aktive Material längs des freigelegten Segmentes entfernt wird.
5. 5 ο Verfahren nach Anspruch 1,

   dadurch gekennzeichne t, daß als chromatographischer Detektor ein Detektor für das UTbraviolettabsorptionsvermögen vorgesehen wird.
6. 6. Vorrichtung zur Detektion in der Säule bei der Flüssigchromatographie mit hoher Auflösung, gekennze ichne t durch eine flexible Quarzglassäule mit einem Innendurchmesser von weniger als 500 um, die chromatographisch aktiviert ist und einen äußeren Schutzüberzug hat, der ein Segment aufweist, welches längs des Endes seiner Länge freiliegt, und einen optischen chromatographischen Detektor, der so ausgelegt ist, daß er die Säule so aufnimmt, daß das freiliegende Segment im Lichtnachweisweg des Detektors liegt.
7. 7. Vorrichtung nach Anspruch 6, "

   dadurch gekennz eich net, daß das freiliegende Segment eine Länge von weniger als 1 cm hat.
8. 8. Vorrichtung nach Anspruch 6, .

   dadurch gekennze ichne t, daß der optische chromatographische Detektor ein Ultraviolett-Detektor ist.
9. 9. Vorrichtung nach Anspruch 7, .

   dadurch gekennze ichnet, daß die Säule mit einem chromatographisch aktiven Material gepackt ist.
10. 10. Vorrichtung nach Anspruch 7,

    dadurch gekennzeichnet, daß die Innenfläche der Säule mit einem chromatographisch aktiven Material beschichtet .ist.