DE3200812A1 - D-phenylalanyl-l-prolyl-l-arginin-aldehyd-sulfat, verfahren zu seiner herstellung und diese verbindung enthaltende arzneimittel - Google Patents

D-phenylalanyl-l-prolyl-l-arginin-aldehyd-sulfat, verfahren zu seiner herstellung und diese verbindung enthaltende arzneimittel

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DE3200812A1 DE19823200812 DE3200812A DE3200812A1 DE 3200812 A1 DE3200812 A1 DE 3200812A1 DE 19823200812 DE19823200812 DE 19823200812 DE 3200812 A DE3200812 A DE 3200812A DE 3200812 A1 DE3200812 A1 DE 3200812A1
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Description

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VNR: 101265
MONCHENER STRASSE 8OA ZUGELASSENER VERTRETER
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P 1 519
Patentansprüche und Beschreibung zur Patentanmeldung
RICHTER GEDEON VEGYESZETI GYAR R.T,
Budapest, Ungarn
betreffend
D-Phenylalanyl-L-prolyl-L-arginin- -aldehyd-sulfat, Verfahren zu seiner Herstellung und diese Verbindung enthaltende Arzneimittel
Beschreibung
Die Erfindung betrifft das auch in wäßriger Lösung eine hohe Stabilität aufweisende neue D-Phenylalanyl-L- -prolyl-L-arginin-aldehyd-sulfat, ein Verfahren zu seiner Herstellung und diese Verbindung enthaltende Arzneimittel mit blutgerinnungshemmender Wirkung.
Es ist bekannt, daß bei der Antikoagulanttherapie gegenwärtig Heparin und Polyanione mit ähnlicher Struktur (Heparinoide) sowie Cumarinderivate eingesetzt werden. Diesen Verbindungen ist gemeinsam, daß sie die zur Blutgerinnung führenden eiweißspaltenden beziehungsweise proteolytischen Reaktionen nicht direkt hemmen. Das Heparin beschleunigt als Katalysator die Hemmungsreaktion des einen Plasmainhibitors, des Antithrombines-III, und die der Enzyme des Gerinnungsvorganges, in erster Linie des Thrombines. Die Cumarinderivate hingegen verzögern die Biosynthese der tf-(Carboxy)-glutaminsäure [GIa] enthaltenden Eiweiße. An der Blutgerinnung nehmen 4 Eiweiße von solchem Typ teil, zum Beispiel das Prothrombin. Die tf-(Carboxy)-glutaminsäureteile nicht oder in nicht ausreichender Zahl enthaltenden Blutgerinnungsfaktoren sind inaktiv, sie nehmen am Blutgerinnungsvorgang nicht teil. Es ist zu bemerken, daß die Synthesehemmung allgemein gültig ist, also zum Beispiel einer der natürlichen Inhibitoren des Gerinnungsvorganges, das sogenannte G-Biweiß (oder XIV-Faktor) auch in inaktiver Form in Gegenwart von Cumarinderivaten synthetisiert wird, was nicht mehr vorteilhaft ist. Charakteristisch ist auch, daß das Heparin vor allem für intravenöse Infusionen verwendet wird, dagegen peroral praktisch wirkungslos ist, während die Cumarinderivate nur peroral verabreicht werden können. Die
• - 4- -
Wirkung des Heparines tritt kurz nach der Verabreichung ein, die der Cumarinderivate, da sie Synthese inhibit or en sind, erst nach 24 bis 36 Stunden.
Weiterhin ist es bekannt, daß einige Tripeptid-aldehyde ebenfalls eine Antikoagulantwirkung haben und vom Obigen abweichend unmittelbar auf das Thrombin wirken, wobei sie dessen eiweißspaltende beziehungsweise proteolytische Reaktionen auch in Abwesenheit von Antithrombin-III hemmen. Das ist zum Beispiel beim in der ungarischen Patentschrift 169 870 beschriebenem D-Phenylalanyl-L-prolyl- -L-arginin-aldehyd-acetat der Fall. Ein Thrombin-Inhibitor mit ähnlich großer Wirkung ist der in der belgischen Patentschrift 880 844- beschriebene D-Phenylalanyl-L-prolyl- -N -carboxy-L-arginin-aldehyd.
Nach eigenen Beobachtungen ist die Antithrombin-Aktivität der Salze der obigen synthetischen Arginin-peptid- -aldehyde, besonders der eine freie endständige Aminogruppe aufweisenden Verbindungen, zum Beispiel des beschriebenen D-Fhenylalanyl-L-prolyl-L-arginin-aldehyd -acetates und des D-Phenylalanyl-L-prolyl-L-arginin-aldehyd-hydrochlorides, unterschiedlich und beim Stehen in wäßriger Lösung nimmt sie schnell ab, was die therapeutische Verwendung unmöglich macht. Die N -Carboxyderivate der freien Tripeptid-aldehyde, zum Beispiel der D-Phenylalanyl-L- -prolyl-N -carboxy-L-arginin-aldehyd, bewahren zwar in wäßrigen Pufferlösungen 20 bis 24 Stunden lang ihre Aktivität, aber nach einigen Tagen kann schon eine beträchtliche Aktivitätsabnahme beobachtet werden und nach einigen Monaten läßt seine ursprüngliche Wirksamkeit auch im festen Zustand nach.
Bekannte Verfahren mit dem Versuch der Herstellung eines Sulfates von D-Phenylalanyl-L-prolyl-L-arginin-aldehyd, wie
A) die Acidolyse der tert.-Butyloxycarbonylgruppe mit in Essigsäure gelöster Schwefelsäure (Beyerman und Mitarbeiter: Peptides 1970 [Red.: H. Nesvadba], North Holland, Amsterdam, 1973, Seite 138),
B) die direkte Überführung des Carbaminsäurederivates D-Phenylalanyl-L-prolyl-N -carboxy-L-arginin-aldehyd gemäß der belgischen Patentschrift 880 844 mit Schwefel satire in ein freies Tripeptid-aldehyd-sulfat und
C) die Umsetzung von anderen Salzen des freien Tripeptid-aldehydes, zum Beispiel des D-Phenylalanyl-L- -prolyl-L-arginin-aldehyd-acetates nach der ungarischen Patentschrift 169 870 mit einem Ionenaustauscherharz oder Schwefelsäure zu einem schwefelsauren Salz,
hatten keinen Erfolg. Die durch, die Verfahren A) bis C) erhaltenen Produkte waren nämlich nach den dünnschichtchromatographischen Untersuchungen nicht einheitlich und/oder hatten in wäßriger Lösung keine ausreichende Stabilität.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, unter Behebung der Nachteile des Standes der Technik ein vom Bisherigen abweichend auch in wäßriger Lösung stabiles neues Salz des D-Phenylalanyl-L-prolyl-L-arginin-aldehydes, ein Verfahren zur Herstellung desselben und diese Verbindung enthaltende Arzneimittel mit blutgerinnungshemmender Wirkung zu schaffen.
■"■ \j ™"
Das Obige wurde überraschenderweise durch die Erfindung erreicht.
Ea wurde nämlich überraschenderweise festgestellt, daß D-Phenylalanyl-L-prolyl-L-arginin-aldehyd-sulfat auch in wäßriger Lösung eine hohe Stabilität aufweist.
Gegenstand der Erfindung ist daher D-Phenylalanyl-L- -prοIy1-L-arg inin-aldehyd-sulfat.
Ferner wurde nun überraschenderweise festgestellt, daß das D-Phenylalanyl-L-prolyl-L-arginin-aldehyd-sulfat einfach und in entsprechender Reinheit aus entsprechenden an ihrer endständigen Aminogruppe eine säureempfindliche Schutzgruppe, wie tert.-Alkoxycarbonyl- oder Triphenylmethylgruppe, aufweisenden Derivaten, zum Beispiel aus tert.-Butyloxycarbonyl-D-phenylalanyl-L-prolyl-L-arginin- -aldehyd-hemisulfat oder aus tert-.-Butyloxycarbonyl-D- -phenylalanyl-L-prolyl-N -carboxy-arginin-aldehyd mit wäßriger η bis 12 η Schwefelsäure hergestellt werden kann.
Gegenstand der Erfindung ist daher auch ein Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäßen Verbindung, welches
dadurch gekennzeichnet ist, daß vom Hemisulfat oder N -Carboxyderivat des an seiner endständigen Aminogruppe eine säureempfindliche Schutzgruppe aufweisenden D-Phenylalanyl- -L-prolyl-L-arginin-aldehydes ausgehend die säureempfindliche Schutzgruppe der endständigen Aminogruppe und gege-
benenfalls die N -Carboxygruppe mit dem 1- bis 12-fachen der äquivalenten Menge von wäßriger η bis 12 η Schwefelsäure entfernt und dann das erhaltene freie Tripeptid- -aldehyd-sulfat D-Phenylalany 1-L-proIy1-L-arginin-alde-. hyd-sulfat abgetrennt wird.
Vorzugsweise wird als säureempfindliche Schutzgruppe an der endständigen Aminogruppe des Ausgangsstoffes eine tert.-Alkoxycarbony!gruppe, insbesondere die tert.-Butyloxycarbonylgruppe, eingesetzt.
Nach einer vorteilhaften Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird von einem an seiner endständigen Aminogruppe geschützten D-Phenylalanyl-L-prolyl-L- -arginin-aldehyd-hemisulfat, welches in der Weise hergestellt worden ist, daß an seiner Guanidinogruppe durch eine Benzyloxycarbonylgruppe geschütztes L-Arginin-lactam mit tert.-Butyloxycarbonyl-D-phenylalanyl-L-prolin kondensiert wird, das erhaltene geschützte Tripeptidlactam tert.-
c -Butyloxycarbonyl-D-phenylalanyl-L-prolyl-N -benzyloxycarbonyl-L-arginin-lactam reduziert wird und die Benzyloxycarbonylgruppe an der Guanidinogruppe des erhaltenen geschützten Tripeptid-aldehydes tert.-Butyloxycarbonyl-D-phenylalanyl-L-prolyl-N -benzyloxycarbonyl-L-arginin-aldehyd in Gegenwart einer äquivalenten Menge Schwefelsäure in 30 bis 40% Wasser enthaltendem Äthanol" oder Tetrahydrofuran hydriert wird, ausgegangen. Dieses an seiner endständigen Aminogruppe geschützte Tripeptid-aldehyd-hemisulfat wird nach dieser vorteilhaften Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens in 8 bis 12 Äquivalenten, insbesondere 10 Äquivalenten, von 4 η bis 6 n, vorzugsweise 5 Q1 Schwefelsäure gelöst und 20 bis 40 Minuten, insbesondere 30 Minuten, auf einer Temperatur von 40 bis 60 C, insbesondere 50°C, gehalten und dann wird die Lösung mit Calciumcarbonat neutralisiert und filtriert. Sie wird zweckmäßig lyophilisiert.
Das so hergestellte Produkt kann gegebenenfalls 4 bis 6 Gew.-% Calciumsulfat enthalten, was allerdings seine biologische Wirkung beziehungsweise seine pharmazeu-
tische Anwendung nicht beeinflußt.
Das erfindungsgemäße D-Phenylalanyl-L-prolyl-L-arginin- -aldehyd-sulfat kann auch in an sich bekannter Weise hergestellt werden, wie durch Hydrieren von Benzyloxycarbonyl- -D-phenylalanyl-L-proIyI-N -benzyloxy-carbonyl-L-arginin- -aldehyd [Z-D-Phe-Pro-Arg[Z]-H] in Gegenwart einer äquivalenten Menge Schwefelsäure.
Ferner sind Gegenstand der Erfindung Arzneimittel mit blutgerinnungshemmender Wirkung, welche die erfindungsgemäße Verbindung als Wirkstoff, zweckmäßig zusammen mit 1 oder mehr pharmazeutisch üblichen Konfektionierungsmittel(n), enthalten.
Das erfindungsgemäße D-Phenylalanyl-L-prolyl-L-arginin- -aldehyd-sulfat hat nämlich eine überlegene blutgerinnungshemmende Wirkung.
Daß die Stabilität der verschiedenen Salze des D-Phenylalanyl-L-prolyl-L-arginin-aldehydes in wäßriger Lösung, zum Beispiel in physiologischer Kochsalzlösung, sehr unterschiedlich ist, wurde durch Versuche nachgewiesen. Bei eigenen Untersuchungen wurden die Peptide in einer Konzentration von 10 mg/cm^ gelöst und die Änderung der Antithrombin-Aktivität der gelösten Stoffe 180 Tage lang beobachtet. Die Losungen wurden bei einer Temperatur von 5°C gelagert. Die Aktivitätswerte wurden in einem System, das aus folgenden Bestandteilen bestand, festgestellt:
0,2 cnr 0,5%-iges Rinderfibrinogen in einer 0,9%-igen Kochsalzlösung,
0,1 cnr Tris-(hydroxymet;h7"l)-aminomethanhydrochlo-
rid/Salzsäure-Puffer (pH-Wert = 7,2), welcher die Peptidlösung enthielt, und
0,1 cnr menschliches Thrombin [US Standard Human Thrombin (NIH, Bethesda, Maryland, USA)], 10 Einheiten/ cnr Lösung.
Die in einem "Schnither-Gross Coagulometer" bestimmte Gerinnungszeit des Systemes betrug ohne Peptid 15 s. Die Aktivität des Tripeptid-aldehyd-salzes wurde mit 100 bewer-
tet, wenn bei einer 3>5 x 10 ' m Reaktionsgemischendkonzentration (bei 0,175 zug- Tripeptid-aldehyd-sulfat/cm^ Reaktionsgemisch) eine 5-fache relative Gerinnungszeit erreicht wurde.
Die Ergebnisse der Untersuchungen sind in der folgenden Tabelle I zusammengestellt.
- 10 -
- 10 Tabelle I
Änderung der Antithrombin-Aktivität von Tripeptid-aldehyd-derivaten
in physiologischer Kochsalzlösung
i D-Phenylalanyl-L-prolyl-L-arginin-aldehyd-sulfat 0 Relative Aktivität b nach 10 15 20 40 90
Peptid-aldehyd-derivat a ^D-Phe-Pro-Arg-H . H2SO4]0 Tag Tagen Tagen Tagen Tagen Tagen
[erfindungsgemäße Verbindung] 5
j D-Phenylalanyl-L-proIyI-L-arginin-aldehyd-diacetat 100 Tagen 100 100 100 100 100
{D-Phe-Pro-Arg-H . 2 CH5COOH}de
j [Vergleichssubstanz] 70 100 40 40 40 35 30
D-Phe ny IaI any 1-L-pr 0 Iy 1- L- ar g inin-aldehy d-dihydioclilaEk bis bis bis bis bis bis
i [ü-Phe-Pro-Arg-H . 2 HCl]d 50 60 30 30 30 25 20
[Vergleichssubstanz] . 90 bis. 80 70 60 50 40
I Λ
• D-PhenyIaIany 1-L-pr0IyI-N -carbo^-L-ergiriii -aldehyd		 bis 40 bis bis bis bis bis
^D-Phe-Pro-Arg[GOOH]-HJf 60 90 50 40 40 30 30
[Vergleichssubstanz] bis
100 60 60 50 30 25 20
80
- 11 -
Die Abkürzungen (auchen anderen Stellen) entsprechen dem Fachschrifttum (zum Beispiel J. Biol. Chem., 2fj£, [1972], 977) sowie Z steht für einen Benzyloxycarbonylrest, Arg[COOH] bedeutet einen N -Carboxy-L-argininrest und Arg[Z] stellt einen
N -Benzyloxycarbonyl-L-argininrest dar.
Die Antithrombin-Aktivität ist 100, wenn der Peptid-aldehyd in einer 3»5 x 10 ' m Reaktionsgemischendkonzentration eine 5-fache relative Gerinnungszeit hervorruft.
Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestelltes Produkt.
Ein durch Hydrieren von Benzyloxyearbonyl-D- -phenylalanyl-L-prolyl-N -benzyloxycarbonyl-L- -arginin-aldehyd {Z-D-Phe-Pro-Arg[Z]-H} in Gegenwart einer äquivalenten Säuremenge hergestelltes Produkt.
β Ähnlich wie beim Acetat ändert sich die Antithrombin-Aktivität des entsprechenden Citrates, Tartcates und p-Toluolsulfonates [Tosylates].
Wie in der belgischen Patentschrift 880 844 beschrieben hergestelltes Produkt.
Aus der obigen Tabelle I geht hervor, daß, während die anfängliche Aktivität des D-Phenylalanyl-L-prolyl-L-arginin-aldehyd-dihydrochlorides in physiologischer Kochsalzlösung nach 5 Tagen und die Aktivität von D-Phenylalanyl-L-prolyl-L-arginin-aldehyd-diacetat und des entsprechenden Citrates, Tartrates und p-Toluolsulfonates schon
- 12 -
nach, einigen Tagen abzunehmen begann (ähnliche Eigenschaften weist auch das N -Carboxyderivat D-Phenylalanyl-L- -prolyl-N -carboxy-L-arginin-aldehyd auf) , das erfindungsgemäße D-Phenylalanyl-L-prolyl-L-arginin-aldehyd-sulfat auch noch nach 90 Tagen seine Antithrombin-Aktivität bewahrte. In verlängerten Stabilitätsuntersuchungen erwies sich das D-Phenylalanyl-L-prolyl-L-arginin-aldehyd-sulfat selbst nach. 180 Tagen in wäßriger Lösung noch als stabil und auch in festem Zustand verlor es über 6 Monate hinweg nichts von seiner Aktivität.
Die Antithrombin-Aktivität der obigen Tripeptid-aldehyd-salze sowie des Carbaminsäurederivates D-Phenylalanyl- -L-prolyl-N -carboxy-L-arginin-aldehyd und von Heparin wurde auch an menschlichem Plasma, welches den biologischen Bedingungen besser entspricht, im folgenden System untersucht :
0,2 cnr Humaneitratplasma,
0,1 cnr Tris-(hydroxymethyl)-aminomethanhydro-
chlorid/Salzsäure-Puffer (pH-Wert = 7,2), welcher auch die Peptidlösung enthielt^
und
0,1 cnr menschliches Thrombin [US Standard Human Thrombin (NIH, Bethesda, Maryland, USA)], 10 Einheiten/cnr Lösung.
Die Gerinnungszeit des Systemes wurde ohne Peptid in einem 15 s "Schnither-Gross Coagulometer" bestimmt.
— 13 —
Tabelle II
Antithrombin-Aktivität von Tripeptid-aldehyd-derivaten bei
Humanplasma
Peptid-aldenyd-derivat Zur doppelben Verläagerung der Ge-
rinnuigszeit notgrecdige Peptiämen-
ge in einer ReaTriionsgemiscb-iKon-
zentration
von
yug/cm'
uanLttelbar nach, dem Lösen des
Peptides		 Relative
Aktivität
D-Phenylalanyl-L-prolyl-L-arginin-aldehyd-sulfat
{D-Phe-Pro-Arg-H . H3SO^]
[erfindungsgemäße Verbindung]		 0,020 100
ρ
D-PhenyIaIanyl^L-prοIy 1-N -carboxy-L-arginin-aldefcßrd
{D-Phe-Pro-Arg[COOH]-H}
[Vergleicnssubstanz]		 0,042 48
D-Phenylalanyl-Ir-prolyl-L-arginin-al(3eh5d.-diacetat
^D-Piie-Pro-Arg-H . 2 GH,COOH}
[Vergleiclis sub stanz]		 0,065 bis 0,140 31
bis
14
- 14 -
O CD OO
Fortsetzung der Tabelle II
Pept id-aldehyd-derivat
beziehungsweise
Heparin		 Zur doppelten Verlagerung der Ge-
rinnmgsz eit notwendige Peptldmen-
ge in einer ReaWionseeinißch-Kon-
zentration
von
yug/cm*
■uanLttelbec nacli dem Lösen des
Peptides		 Relative
Aktivität
D-Phenylalanyl-I^prolyl-L-ai^^iin-atöe^
{,D-Phe-Pro-Arg-H . 2 HCl}
[Vergleichssubstanz]		 0,060 bis 0,130 33
bis
15
Heparin g
[Vergleichssubstanz]		 0,105 19
%■ t € C
Im Handel erhältliches (132,2 E/mg, IT.S.Ph.XVII.) Heparin
- 15 -
σ ο oo
Aus der obigen Tabelle II geht hervor, daß die zur doppelten Verlängerung der BlindVersuchs- beziehungsweise Kontrollgerinnungszeit notwendige Peptidmenge bei D-Phenylalanyl-L-prolyl-L-arginin-aldehyd-diacetat und D-Phenylalanyl-L-prolyl-Ir-arginin-aldehyd-dihydrochlorid von den Chargen abhängt und dabei das Mehrfache und auch bei D-Phenylalanyl-L-prolyl-N -carboxy-L-arginin-aldehyd noch das Doppelte der dazu erforderlichen Menge von D-Phenylalanyl-L-proly 1-L-arginin-aldehyd-sulfat be trägt sowie die zur doppelten Verlängerung der Blindversuchs- beziehungsweise Kontrollgerinnungszeit erforderliche Menge von Heparin mehr als das 5-fache der dazu erforderlichen Menge von D-Phenylalanyl-L-prolyl-L-arginin-aldehyd- -sulfat ist.
Die Ergebnisse der Untersuchung der bereits oben untersuchten Tripeptid-aldehyd-derivate und von Heparin in vivo sind in der folgenden Tabelle III zusammengestellt.
16 -
- 16 Tabelle III
Untersuchung in vivo
Zur Erzielung einer therapeutischen Wirkung notwendige Dosis
Peptid-aldehyd-derivat
Intravenöse Infusion
in
mg/kg/Stunde
Kaninchen Hund
Perorale Verabreichung
in
mg/kg
Kaninchen Hund
D-Phenylalanyl-L-prolyl-L-erginin-aldehyd-sulfat {D-Phe-Pro-Arg-E . H2SO4) ( ' '
[erfindungsgemäße Verbindung] 1,0
0,5
D-Phenylalanyl-L-prolyl-L-ai^inin-^ldehyd-diacetat JD-Phe-Pro-Arg.-H . 2 CH5COOH] [Vergleichssub stanz] 100
100
J-Phenylalanyl-I^prolyl-L-argflnin-aldehy (D-Phe-Pro-Arg-H . 2 HCl]
[Vergleichssubstanz] 100
- 17 -
- 17 Portsetzung der Tabelle III
Pept id-aldehyd-derivat Entravenöse Infusion
in		 Hund Perorale Verabreichung
in		 Hund
"beziehungsweise mg/kg/Stunde mg/kg
Heparin Kaninchen 3,0 Kaninchen 50 ■
ρ
D-Phenylalanyl-L-prolyl-N -carboxy-L-arginin-		 wirkungs
-aldehyd
^D-Phe-Pro-Arg[COOH]-H]
[Vergleichssubstanz]		 0,5 . 50 los
Heparin wirkungs
; [Vergleichssubstanz] 0,6 los
Eine therapeutische Wirkung ist durch die 1,5-"bis 2,5-fache Verlängerung der ganzen Blutgerinnungszeit gekennzeichnet (Fachschrifttum: Nies, A. S. [1978] in Clinical Pharmacology [Melmon, K. L. and Morelli, F. Ϊ. eds}, 2. Ausgabe, Seiten 305 bis 306, Macmillan Publ. Co. Inc., New York; Verstraete, M. Verwilghen, R. [1980] in Drug Treatment, Principles and Practice of Clinical Pharmacology and Therapeutics, 2. Ausgabe, Avery, G. S. ed. [1980], Seiten 889 his 952, Edinburgh and London).
Aus der obigen Tabelle III geht hervor, daß die Antithrombin-Wirkung des erfindungsgemäßen D-Phenylalanyl-L- -prolyl-L-arginin-aldehyd-sulfates auch in vivo sehr groß ist. Bei intravenöser Verabreichung reicht sie an die Wirkung des in der Therapie allgemein verwendeten Heparines heran. Das D-Phenylalanyl-L-prolyl-L-arginin-aldehyd-sulfat zeigt aber im Vergleich zum Heparin eine Mehrwirkung, denn, während das Heparin peroral wirkungslos ist, kann mit dem D-Phenylalanyl-L-prolyl-L-arginin-aldehyd-sulfat in einer peroralen Dosis von 25 mg/kg eine therapeutische Wirkung erzielt werden, und dieses ist auch den bekannten Verbindungen D-Phenylalanyl-L-prolyl-L-arginin-aldehyd- -diacetat und D-Phenylalanyl-L-prolyl-L-arginin-aldehyd- -dihydrochlorid sowie D-Phenylalanyl-L-prolyl-N -carboxy- -L-arginin-aldehyd überlegen, indem mit D-Phenylalanyl-L- -prolyl-L-arginin-aldehyd-diacetat und D-Phenylalanyl-L- -prolyl-L-arginin-aldehyd-dihydrochlorid nur in einer Do-
sis von 100 mg/kg und mit D-Phenylalanyl-L-prolyl-N -carboxy-L-arginin-aldehyd nur in einer Dosis von 50 mg/kg eine therapeutische Wirkung erzielt werden kann.
In der folgenden Tabelle IV sind die akuten Toxizitätswerte (LD,-Q-Werte) von oben untersuchten Tripeptid-aldehyd-derivaten und von Heparin bei Mäusen zusammengestellt.
- 19 -
- 19 Tabelle IY
Akute Toxizitätswerte bei Mäusen
Paptid-aldehyd-derivat
beziehungsweise
Heparin		 Intcavenöaer
Bolus		 LD50-
ir
mg/1
intrape-
ritoneal		 ■Wert
1
sub- j per-
I
kutan ; oral		 960 keine Schrifttumsangaben
D-Phenylalanyl-L-prolyl-L-arginin-aldehyd-sulfat
[D-Phe-Pro-Arg-H . HgSO^}
[erfindungsgemäße Verbindung]		 230 i
1 800 |>2 000
I		 1 200
D-Phenylalanyl-L-prolyl-L-arginin-aldehyd-diacetat
i_D-Phe-Pro-Arg-H . 2 CH3COOH)
. · [Vergleichssubstanz]		 9 38
D-Phenylalanyl-Ir-prolyl-N -carbo^-L-arginln-e.ldehyd
D-Phe-Pro-Arg[COOH]-H]i
[Vergleichssubstanz]		 - - -
Heparin
[Vergleichssubstanz]
- 20 -
O CD OO
Wegen Löslichkeitsprobleme können die ToxAzität tätsangaben für andere Verabreichungsformen nicht mit entsprechender Sicherheit gegeben werden.
Bei einer 1-stündigen intravenösen Infusion ergab sich bei Kaninchen ein LDc-.-Wert von 58 mg/kg.
Aus der obigen Tabelle IV geht hervor, daß das erfindungsgemäße D-Phenylalanyl-L-prolyl-L-arginin-aldehyd- -sulfat auch hinsichtlich der Toxizität günstiger als das D-Phenylalanyl-L-prolyl-L-arginin-aldehyd-diacetat und
das D-Phenylalanyl-L-prolyl-N-carboxy-L-arginin-aldehyd ist, wobei das erstere einen höheren LD1-Q-Wert als 2 g/kg hat.
Im Hinblick auf die niedrige Toxizität und hohe Wirksamkeit des D-Phenylalanyl-L-prolyl-L-arginin-aldehyd- -sulfates ist der beide Paktoren berücksichtigende therapeutische Index, der bezüglich der pharmazeutischen Verwendung einer Verbindung eine der wichtigsten Angaben ist, viel vorteilhafter als der der übrigen Tripeptid-aldehyd- -derivate.
Auf Grund von intravenösen Infusionsuntersuchungen an Hunden betragt die intravenöse Humaninfusionsdosis 1 bis 2 mg/kg/Stunde.
Die Erfindung wird an Hand der folgenden Beispiele näher erläutert.
Die in den Beispielen angegebenen R«-Werte wurden durch Schichtchromatographie an Silicagel (Kieselgel G, Reanal, Budapest) in folgenden Lösungsmittelgemischen
bestimmt:
- 21 -
Lösungsmittelgemisch- Volttmverliältnis
bestandteile der Bestandteile
1 Äthylacetat/Fyridin/Essigsäure/Wasser 480 : 20 : 6 :
2 Äthylacetat/Pyridin/Essigsäure/Wasser 60 : 20 : 6 :
3 Ithylacetat/Pyridin/Essigsäure/Wasser 30 : 20 : 6 :
Beispiel 1
D-Phenylalanyl-L-prolyl-L-arginin-aldehyd- -sulfat
Es wurden 2,74 g (5 Millimol) tert.-Butyloxycarbonyl- -D-phenylalanyl-L-prolyl-L-arginin-aldehyd-hemisulfat in 5 cnr Wasser gelöst, unter-Rühren beziehungsweise Schütteln wurden 5 cm* einer 10 η Schwefelsäure zugesetzt und es wurde auf 50°C erwärmt. Die Lösung wurde 15 Minuten lang bei 50 C gerührt beziehungsweise geschüttelt, dann mit 25 car Eiswasser verdünnt und während des Kühlens mit Eiswasser wurde der pH-Wert mit festem Calciumcarbonat (etwa 2,25 6 waren notwendig) auf 6,5 eingestellt. Das ausgeschiedene Calciumsulfat wurde abfiltriert und 2-mal mit 5 cnr V/asser gewaschen. Das mit den Waschwässern vereinigte Filtrat wurde 2-mal mit ;Je 10 cur n-Butanol ausgeschüttelt, dann unter vermindertem Druck auf etwa 30 cur eingeengt sowie gegebenenfalls filtriert und schließlich lyophilisiert. So wurden 2,25 g (79% <ler Theorie) D-Phenylalanyl- -L-prolyl-L-arginin-aldehyd-sulfat mit einem Gehalt an 4,8 Gew.-% Calciumsulfat erhalten.
n|-Wert =0,35 bis 0,40.
[o<]^O-Wert = -117 ί 1° (c = 1, in V/asser).
- 22 -
Elementaranalyse:
Für C2OH3O°3N6 * H2S04 * 5 H2° · °»2 CaSO4 (Molekulargewicht
- 565,85)
berechnet: C = 42,45%, H = 6,77%, N = 14,85%,
SO4 - 20,37%, Ca « 1,41%, H2O » 9,55%i
gefunden: G - 42,2%, H - 6,9%, N - 14,85%,
SO4 = 19,8%, Ca = 1,3%, H2O = 9,75%.
Der Ausgangsstoff tert.-Butyloxycarbonyl-D-phenylalanyl-L-prolyl-L-arginin-aldehyd-hemisulfat ist wie folgt' beschrieben hergestellt worden:
1. Stufe
tert.-Butyloxycarbonyl-D-phenylalanyl- -N -benzylo> nin-lactam
-L-prolyl-N -benzyloxycarbonyl-L-argi-
Es wurden 8,6 g (22 Millimol) tert.-Butyloxycarbonyl- -N -benzyloxycarbonyl-L-arginin-lactam (belgische Patentschrift Nr. 880 844) in 20 Om^ Äthylacetat suspendiert und bei einer Temperatur von 5°C wurden unter Rühren beziehungsweise Schütteln 40 cm* einer 4 m Lösung von Chlorwasserstoff in Äthylacetat zugesetzt. Das Beaktionsgemisch wurde unter Kühlen mit Eiswasser 30 Minuten lang gerührt beziehungsweise geschüttelt und dann mit 100 cur gekühltem Äthylacetat verdünnt und der abgeschiedene Niederschlag wurde abfiltriert, mit Äthylacetat gewaschen und in einem Vakuumexsikkator über Kaiiumhydroxyd getrocknet. Das so erhaltene N -Benzyloxycarbonyl-L-arginin-lactam-hydrochlorid wurde in 20 cm Dimethylformamid gelöst und nach dem
- 23 -
Kühlen auf -1O0C wurden 6,2 cm^ (44 Millimol) Triethylamin zugesetzt. Die erhaltene Suspension wurde dem wie folgt beschrieben erhaltenen Anhydrid zugesetzt.
7,25 g (20 Millimol) tert.-Butyloxycarbonyl-D-phenylalanyl-L-prolin (TJ. Ludescher und H. Schwyzer: HeIv. Chim·. Acta J£ [1972], 2 052 und 2,22 cm5 (20 Millimol) N-Methylmorpholin wurden in 20 cur Dimethylformamid gelöst. Die Lösung wurde auf -15°C gekühlt und unter Rühren beziehungsweise Schütteln wurden 2,64 cnr (20 Millimol) Chlorkohlensäureisobutylester und dann nach 5 Minuten die gemäß dem vorherigen Absatz erhaltene Dirnethylformamidlösung zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde noch 1 Stunde bei ~15°C und 1 Stunde lang bei O0C gerührt beziehungsweise geschüttelt. Dann wurde es mit 30 cnr Benzol verdünnt und die abgeschiedenen Salze wurden abfiltriert und 2-mal mit je ΊΟ ·;ί(ΐ Hnf.ar,] goflc.tqr.htn* D1.§ JipnAMJ. aiifciif-il l;ö!"?e ÜhnekUjlformamidlösung wurde mit 50 cnr Wasser verdünnt und die Phasen wurden voneinander getrennt. Die wäßrige Phase wurde 2-mal mit Je 10 cnr Benzol ausgeschüttelt, dann wurden die vereinigten benzolhaltigen Lösungen nacheinander 3-mal mit je 30 cm* einer 10%-igen Natriumcarbonatlösung, mit 30 cnr Wasser, 3-mal mit je 30 car einer 0,5 Q Schwefelsäure und 2-mal mit je 30 cnr Wasser gewaschen und schließlich nach dem Trocknen über wasserfreiem Natriumsulfat unter vermindertem Druck eingedampft. Der Eindampfrückstand wurde mit Petroläther verrieben, filtriert, mit Petroläther gewaschen und an der Luft getrocknet. Es wurden 9j65 g (76% der Theorie) tert.-Butyloxycarbonyl-D-phenylalanyl-L-prolyl-N -benzyloxycarbonyl-L-arginin-lactam erhalten .
IlJ-Wert - 0,81 bis 0,89.
- 24 -
2. Stufe
tert.-Butyloxycarbonyl-D-phenylalanyl-L-yloxycart
-aldehyd
-prolyl-N -benzyloxycarbonyl-L-arginin-
Es wurden 9,52 g (15 Millimol) des in der 1. Stufe erhaltenen geschützten Tripeptid-lactames tert.-Butylosycarbonyl -D-phenylalanyl-L-proIyI-N -benzyloxycarbonyl-L-arginin-lac tam in 45 cm* Tetrahydrofuran gelöst und bei einer Temperatur von -20°C wurde unter starkem Rühren beziehungsweise Schütteln eine 11,25 Millimol Lithiumaluminiumhydrid (LiAlH7.) enthaltende Lösung von Lithiumaluminiumhydrid in Tetrahydrofuran (etwa 28 cnr einer 0,4m Lösung) zugesetzt. Der Erfolg der Reduktion wurde durch SchichtChromatographie kontrolliert (der R'-Wert des Lactames tert.-Butyloxycarbonyl-D-phenylalanyl-L-prolyl-N -benzyloxycarbonyi-L-arginin- -lactam beträgt 0,71 bis 0,77 und der des Aldehydes tert.- -Butyloxycarbonyl-D-phenylalanyl-L-proIyI-N -benzyloxycarbonyl-L-arginin-aldehyd 0,31 bis 0,39) und erforderlichenfalls konnte weitere Lithiumaluminiumhydridlösung zugesetzt werden. Am Ende der Reaktion wurde die Tetrahydrofuranlösung vorsichtig mit einer 0,5 η Schwefelsäure auf einen pH-Wert von 3 angesäuert und dann mit Wasser (etwa 100 cnr ) so verdünnt, daß die Substanz nicht ausgeschieden wurde. Dann wurde sie 2-mal mit Je 30 cm* η-Hexan ausgeschüttelt. Die wäßrige tetrahydrofuranhaltige.Lösung wurde 3-mal mit je 75 cm^ Methylenchlorid ausgeschüttelt und dann wurden die vereinigten Methylenchloridlösungen 3-mal mit je 10 cnr einer 10%-igen Natriumcarbonatlösung und 2-mal mit je 10 cnr Wasser gewaschen. Danach wurde die methylenchloridhaltige Lösung über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und unter vermindertem Druck eingedampft. Der Eindampfrückstand wurde in 50 cm* Benzol gelöst und die Lösung
- 25 -
wurde erneut unter vermindertem Druck eingedampft. Das Lösen in Benzol und das Eindampfen wurden noch 1-mal wiederholt. Der so erhaltene Eindampfrückstand wurde mit Diäthyläther verrieben, filtriert, mit Diäthyläther gewaschen und an der Luft getrocknet. Es wurden 6,9 g (72% der Theorie) tert.-Butyloxycarbonyl-D-phenylalanyl-L-prolyl-N -benzyloxycarbonyl-L-arginin-aldehyd erhalten.
R^-Wert = 0,3 bis 0,4.
3, Stufe
t ert. -Butyloxycarbonyl-D-pheny lalanyl-L-prolyl- -L-arg inin-aldehyd-hemisulf at
Es wurden 6,4 g (10 Millimol) des in der 2. Stufe erhaltenen geschützten Tripeptid-aldehydes tert.-Butyloxycarborjyl-D-phenylalanyl-L-prolyl-lN -benzyloxycarbonyl-L- -arginin-aldehyd in einem Gemisch von 50 cnr Wasser, 50 cnr Tetrahydrofuran und 10 cm7 einer η Schwefelsäure gelöst und dann in Gegenwart von 1 g eines 10%-igen Palladium/Aktivkohle-Katalysators hydriert. Das Fortschreiten der Reaktion wurde mittels Schichtchromatographie verfolgt (der R^-Wert des an seiner Guanidinogruppe geschützten Tripeptidaldehydes tert.-Butyloxycarbonyl-D- -phenylalanyl-L-prolyl-N -benzyloxycarbonyl-L-arginin-al-
dehyd beträgt 0,95 t>is 1,0 und der R|-Y/ert des freien Tripeptidaldehyd-hemisulfates tert.-Butyloxycarbony1-D- -phenylalanyl-L-prolyl-L-arginin-aldehyd-hemisulfat 0,4-5 bis 0,54). Am Ende der Reaktion wurde der Katalysator abfiltriert und mit 30 cm* 50%-igem wäßrigem Tetrahydrofuran gewaschen und dann wurde das Filtrat unter vermindertem Druck auf etwa 60 cm* eingeengt. Der Rückstand wurde 4-mal mit je 40 cnr n-Butanol ausgeschüttelt. Wenn die
- 26 -
wäßrige Phase das tert.-Butyloxycarbonyl-D-phenylalanyl- -L-prolyl-L-arginin-aldehyd-hemisulfat (R|-Wert ». 0,45 bis 0,54) enthielt, wurden 5 cm Tetrahydrofuran zugesetzt und es wurde 2- bis 3-mal mit je 40 cnr n-Butanol ausgeschüttelt. Die n-Butanolphasen wurden vereinigt und unter vermindertem Druck zur Trockne eingedampft. Der Eindampfrückstand wurde mit einem Gemisch von Diäthyläther und Diisopropyläther im Volumverhältnis von 1:1 verrieben, filtriert und mit dem vorstehenden Gemisch gewaschen und dann in einem Vakuumexsikkator getrocknet. Es wurden 4,4 g (80% der Theorie) tert.-Butyloxycarbonyl-D-pheny1-alanyl-L-prolyl-L-arginin-aldehyd-hemisulfat erhalten.
R^-Wert = 0,45 bis 0,54.
[oC]^°-Wert = -65 ± 1° (c = 1, in Wasser).
Analyse:
Für G2cH,q0cN6 .0,5 H2SO4 (Molekulargewicht = 551,64)
berechnet: 0 = 54,45%, H = 7,13%, N = 15,23%, SO4 = 8,71%;
gefunden: C = 54,5%, H =» 7,3%, N= 15,2%, SO4 = 8,7%.
Beispiel 2
D-Phenylalanyl-L-prolyl-L-arginin-aldehyd-
-sulfat
Es wurden 2,85 g (5 Millimol) tert.-Butyloxycarbonyl- -D-phenylalanyl-L-prolyl-N-carboxy-L-arginin-aldehyd in
- 27 -
5 cnr Wasser gelöst und unter Rühren beziehungsweise Schütteln wurden 5 ei* einer 10 η Schwefelsäure zugesetzt. Die Lösung wurde auf 50°C erwärmt, 15 Minuten lang auf dieser Temperatur von 5O0G gehalten und dann mit 25 cnr Eiswasser verdünnt und unter Kühlen mit Eiswasser mit festem Calciumhydroxyd (etwa 1,6g waren erforderlich) wurde der pH-Wert auf 6,5 eingestellt. Das ausgeschiedene Calciumsulfat wurde
■χ
abfiltriert und 2-mal mit je 5 cnr Wasser gewaschen. Das mit den Waschwässern vereinigte Filtrat wurde 2-mal mit je
10 cnr n-Butanol ausgeschüttelt, dann unter vermindertem Druck auf etwa 30 cm* eingeengt, erforderlichenfalls filtriert und schließlich lyophilisiert. So wurden 2,3 g (81% der Theorie) D-Phenylalanyl-L-prolyl-L-arginin-aldehyd-sulfat mit einem Gehalt an 4,9 Gew.-% Calciumsulfat erhalten.
R^-Wert » 0,35 bis 0,40.
[<*]2°-7/ert = -117 ί 1° (c = 1, in Wasser).
Der Ausgangsstoff tert.-Butyloxycarbonyl-D-phenyl-
-alanyl-L-prolyl-N -carboxy-L-arglnin-aldehyd ist wie folgt beschrieben hergestellt worden.
Es wurden 6,4 g (10 Millimol) wie bei der Herstellung des Ausgangsstoffes des Beispieles 1, 2. Stufe beschrieben hergestellter geschützter Tripeptid-aldehyd tert.-Butyl-
oxycarbonyl-D-phenylalanyl-L-prolyl-N -benzyloxycarbonyl- -L-arginin-aldehyd in 100 cnr 75%-igem wäßrigem Äthanol in Gegenwart von 1 g 10%-igem Palladium/Aktivkohle-Katalysator, hydriert. Der Verlauf der Reaktion wurde mittels Schichtchromatographie verfolgt (der R^-Wert des geschützten Tripeptid-aldehydes tert.-Butyloxycarbonyl-D-
-phenylalanyl-L-prolyl-N -benzyloxycarbonyl-L-arginin- -aldehyd beträgt 0,90 bis 0,95 und der des
- 28 -
N -Carboxyderivates tert.-Butyloxycarbonyl-D-phenylalanyl- -L-prolyl-N^carboxy-L-arginin-aldehyd 0,45 bis 0,55)· Am Ende der Reaktion wurde der Katalysator abfiltriert und mit 30 cnr Wasser gewaschen und dann wurde das Filtrat unter vermindertem Druck auf 30 bis 4-0 cnr eingeengt. Der Rückstand wurde mit 100 cnr Wasser verdünnt, 2-mal mit je 20 cnr Methylenchlorid ausgeschüttelt und lyophilisiert. Es wurden 5»1 S (85% der Theorie) tert.-Butyloxycarbonyl- -D-phenylalanyl-L-prolyl-N -carboxy-L-arginin-aldehyd erhalten.
R^-Wert = 0,45 bis 0,55·
Aminosäureanalyse: Phenylalanin = 0,96; Prolin = Λ
(Bezugsgrundlage).
. Molekulargewicht auf Grund der Aminosäureanalyse = 570.
Beispiel 3 Arzneimittelpräparat
Ein Zweiampullenarzneimittelpräparat, das für 6- beziehungsweise 12-stündige Infusionen geeignet war, wurde wie folgt hergestellt:
Es wurden 420 bis 840 mg D-Phenylalanyl-L-prolyl-L- -arginin-aldehyd-sulfat als Wirkstoff und 40 bis 80 mg Humanalbumin zusammen lyophilisiert. Der Inhalt der so lyophilisierten Ampulle wurde vor der Anwendung in 100 bis 200 cnr steriler von Fiebererregern freier (pyrogenfreier) isotonischer Kochsalzlösung gelöst.
Zusammenfassung

Claims (1)

  1. Patentansprüche
    D-Phehylalanyl-L-prolyl-L-arginin-aldehyd-sulfat.
    Verfahren zur Herstellung der Verbindung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man vom Hemisulfat oder N -Carboxyderivat des an seiner endständigen Aminogruppe eine säureempfindliche Schutzgruppe aufweisenden D-Phenylalanyl-L-prolyl-L-arginin-aldehydes ausgehend die säureempfindliche Schutz gruppe der endständigen Aminogruppe und gegebenenfalls die N -Carboxygruppe mit dem 1 - bis 12-fachen der äquivalenten Menge von wäßriger η bis 12 η Schwefelsäure entfernt und dann das erhaltene freie D-Phenylalanyl-L-prolyl-Ii-arginin-aldehyd-sulfat abtrennt .
    3«) Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man als säureempfindliche Schutzgruppe an der endständigen Aminogruppe des Ausgangsstoffes eine tert.-Alkoxycarbonylgruppe, insbesondere die tert.- -Butyloxycarbonylgruppe, einsetzt.
    4-.) Arzneimittel mit blutgerinnungshemmender Wirkung, gekennzeichnet durch einen Gehalt an der Verbindung nach Anspruch 1 als Wirkstoff, zweckmäßig zusammen mit 1 oder mehr pharmazeutisch üblichen Konfektionierungsmittel(n).
    Beschreibung
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