DE3200812C2

DE3200812C2 - D-Phenylalanyl-L-prolyl-L-arginin-aldehyd-sulfat, Verfahren zu seiner Herstellung und diese Verbindung enthaltende Arzneimittel

Info

Publication number: DE3200812C2
Application number: DE3200812A
Authority: DE
Inventors: Dániel Dr. Budapest Bagdy; Sándor Prof.-Dr. Bajusz; Eva Dr. Barabás; geb. Hasenöhrl Erzsébet Széll
Original assignee: Richter Gedeon Vegyeszeti Gyar RT
Current assignee: Teva Hungary Pharmaceutical Marketing PLC
Priority date: 1981-01-13
Filing date: 1982-01-13
Publication date: 1986-09-18
Also published as: PL234696A1; IT1210842B; JPS57181046A; US4399065A; CH649305A5; SU1442078A3; FR2497799A1; SE8200135L; IL64761A0; PL133451B1; MX156383A; PT74268B; GB2091270A; FI820086L; DK151341C; AU7944682A; ATA9782A; DE3200812A1; DK9382A; NO820083L

Abstract

Gegenstand der Erfindung ist D-Phenylalanyl-L-prolyl-L-arginin-aldehyd-sulfat. Gegenstand der Erfindung ist auch ein Verfahren zur Herstellung dieser Verbindung, bei welchem vom Hemisulfat oder N ↑G-Carboxyderivat des an seiner endständigen Aminogruppe eine säureempfindliche Schutzgruppe aufweisenden D-Phenylalanyl-L-prolyl-L-arginin-aldehydes ausgehend die säureempfindliche Schutzgruppe der endständigen Aminogruppe und gegebenenfalls die N ↑G-Carb oxygruppe mit dem 1- bis 12fachen der äquivalenten Menge von wäßriger n bis 12 n Schwefelsäure entfernt und dann das erhaltene freie Tripeptid-aldehyd-sulfat D-Phenylalanyl-L-prolyl-L-arginin-aldehyd-sulfat abgetrennt wird. Ferner sind Gegenstand der Erfindung diese Verbindung enthaltende Arzneimittel mit blutgerinnungshemmender Wirkung.

Description

Die Erfindung betrifft das auch in wäßriger Lösung eine hohe Stabilität aufweisende neue D-Phenylalanyl-L-prolyl-L-arginin-aldehyd-sulfat, ein Verfahren zu seiner Herstellung und diese Verbindung enthaltende Arzneimittel mit biutgcrinnungshernmender Wirkung.

Es ist bekannt, daß bei der Antikoagulanttherapie gegenwärtig Heparin und Polyanionen mit ähnlicher Struktur (Heparinoide) sowie Cumarinderivate eingesetzt werden. Diesen Verbindungen ist gemeinsam, daß sie die zur Blutgerinnung führenden proteolytischen Reaktionen nicht direkt hemmen. Das Heparin beschleunigt als Katalysator die Hemmungsreaktion des einen Plasmainhibitors, des Antithrombins-III, und die der Enzyme des Gerinnungsvorganges, in erster Linie des Thrombins. Die Cumarinderivate hingegen verzögern die Biosynthese der >>-(Carboxy)-gIutaminsäure [GIa] enthaltenden Eiweiße. An der Blutgerinnung nehmen 4 Eiweiße von solchem Typ teil, zum Beispiel das Prothrombin. Die /-(Carboxy)-glutaminsäureteile nicht oder in nicht ausreichender Zahl enthaltenden Blutgerinnungsfaktoren sind inaktiv, sie nehmen am Blutgerinnungsvorgang nicht tail. Es ist zu bemerken, daß die Synthesehemmung allgemein gültig ist, also zum Beispiel einer der natürlichen Inhibitoren des Gerinnungsvorganges, das sogenannte C-Eiweiß (oder XIV-Faktor) auch in inaktiver Form in Gegenwart von Cumarinderivaten synthetisiert wird, was nicht mehr vorteilhaft ist Charakteristisch ist auch, daß das Heparin vor allem für intravenöse Infusionen verwendet wird, dagegen peroral praktisch wirkungslos ist, während die Cumarinderivate nur peroral verabreicht werden können. Die Wirkung des Heparines tritt kurz.

nach der Verabreichung ein, die der Cumarinderivate, da sie Syntheseinhibitoren sind, erst nach 24 bis 36 Stunden.

Weiterhin ist es bekannt, daß einige Tripeptid-aldehyde ebenfalls eine Antikoagulantwirkung haben und vom |1

Obigen abweichend unmittelbar auf das Thrombin wirken, wobei sie dessen proteolytische Reaktionen auch in |;

Abwesenheit von Antithrombin-lII hemmen. Das ist zum Beispiel beim in der HU-PS 1 69 870 beschriebenem §

D-Phenylalanyl-L-prolyl-L-arginin-aldehyd-acetat der Fall. Ein Thrombin-Inhibitor mit ähnlich großer Wirkung ist der in der BE-PS 8 80 844 beschriebene D-Phenylalanyl-L-prolyl-NG-carboxy-L-arginin-aldehyd.

Nach eigenen Beobachtungen ist die Antithrombin-Aktivität der Salze der obigen synthetischen Arginin-pcp- ι

tid-aldehyde, besonders der eine freie endständige Aminogruppe aufweisenden Verbindungen, zum Beispiel des I

beschriebenen D-Phenylalanyi-L-prolyl-L-arginin-aldehyd-acetates und des D-Phenylalanyl-L-prolyl-L-argininaldehyd-hydrochlorides, unterschiedlich und beim Stehen in wäßriger Lösung nimmt sie schnell ab, was die therapeutische Verwendung unmöglich macht. Die N^G-Carboxyderivate der freien Tripeptid-aldehyde, zum Beispiel der D-PhenyIalanyl-L-prolyI-N^G-carboxy-L-arginin-aldehyd, bewahren zwar in wäßrigen Pufferlösungen 20 bis 24 Stunden lang ihre Aktivität, aber nach einigen Tagen kann schon eine beträchtliche Aktivitätsabnahme beobachtet werden und nach einigen Monaten läßt seine ursprüngliche Wirksamkeit aur^u im festen \

Zustand nach. ΐ

Bekannte Verfahren mit dem Versuch der Herstellung eines S'ilfates von D-Phenylalanyl-L-prolyl-L-arginin- \

aldehyd.wie

A) die Acidolyse der tert.-Butyloxycarbonylgruppe mit in Essigsäure gelöster Schwefelsäure (Beyerman und Mitarbeiter: Peptides 1970[Red.: H. Nesvadba], North Holland, Amsterdam, 1973, Seite 138),

B) die direkte Überführung des Carbaminsäurederivates D-PhenylalanyI-L-prolyl-N^G-carboxy-L-arginin-aldehyd gemäß der BE-PS 8 80 844 mit Schwefelsäure in ein freies Tripeptid-aldehyd-sulfat und

C) die Umsetzung von anderen Salzen des freien Tripeptid-aldehydes, zum Beispiel des D-Phenylalanyl-L-prolyl-L-arginin-aldehyd-acetates nach der HU-PS 1 69 870 mit einem Ionensustauscherharz oder Schwefel- \

säure zu einem schwefelsauren Salz. "

hatten keinen Erfolg. Die durch die Verfahren A) bis C) erhaltenen Produkte waren nämlich nach den dünnschichtchromatögraphischen Untersuchungen nicht einheitlich und/oder hatten in wäßriger Lösung keine ausreichende Stabilität.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, unter Behebung der Nachteile des Standes der Technik ein vom

Bisherigen abweichend auch in wäßriger Lösung stabiles neues Salz des D-Phenylalanyl-L-prolyl-L-arginin-al- |

dehydes, ein Verfahren zur Herstellung desselben und diese Verbindung enthaltende Arzneimittel mit blutgerinnungshemmender Wirkung zu schaffen.

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Das Obige wurde überraschenderweise durch die Erfindung erreicht

Es wurde nämlich überraschenderweise festgestellt, daß D-Phenylalanyl-L-prolyl-L-arginin-aldehyd-sulfat auch in wäßriger Lösung eine hohe Stabilität aufweist.

Gegenstand der Erfindung ist daher D-Phenylalanyl-L-prolyl-L-arginin-aldehyd-sulfat

Ferner betrifft die Erfindung ein neues Verfahren zur Herstellung von D-Phenylalanyl-L-prolyl-L-arginin-aldehyd-sulfat, welches darin besteht, daß man vom Hemisulfat oder N^G-Carboxyderivat des an seiüer endständigen Aminogruppe eine tert-Alkoxycarbonylgruppe aufweisenden D-Phenylalanyl-L-prolyl-L-arginin-aldehydes ausgehend die Schutzgruppe der endständigen Aminogruppe und gegebenenfalls die N^G-Carboxygruppe durch Umsetzung mit dem 1 bis 12fachen der äquivalenten Menge von wäßriger η bis 12 η Schwefelsäure bei 40ois 60⁰C abspaltet und das erhaltene freie D-Phenylalanyl-L-prolyl-L-arginin-aldehyd-sulfat abtrennt

Vorzugsweise wird bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens als. Schutzgruppe an der endständigen Aminogruppe des Ausgangsstoffes die tert-Butoxycarbonylgruppe eingesetzt

Das erfindungsgemäße Verfahren kann in der Weise durchgeführt werden, daß von einem an seiner endständigen Aminogruppen geschützten D-Phenylalanyl-L-prolyl-L-arginin-aldehyd-hemisulfat ausgegangen wird, welches in der Weise hergestellt worden ist daß an seiner Guan!dinogruppe durch eine Benzyloxycarbonylgruppe geschütztes L-Arginin-lactam mit tert-Butoxycarbonyl-D-phenylalanyl-L-prolin kondensiert wird, das erhaltene geschützte Tripeptidlactam tert-Butyloxycarbonyl-D-phenyl-alanyl-L-prolyl-N^G-benzyloxycarbonyl-L-argininlactam reduziert wird und die Benzyloxycarbonylgruppe an der Guanidinogruppe des erhaltenen geschümen Tripeptidaldehyds tert-Butyloxycarbonyl-D-phenyialalyl-L-prolyl-NG-benzyloxycarbonyl-L-arginin-aldehyd in Gegenwart eine* äquivalenten Menge Schwefelsäure in 30 bis 40% Wasser enthakendem Ethanol oder Tetrahydrofuran hydriert wird. Dieses an seiner endständigen Aminogruppe gesc.hützte Tripeptid-aldehyd-hemisulfat wird vorzugsweise in 8 bis 12 Äquivalenten, insbesondere 10 Äquivalenten, von 4 in bis 6 n, vorzugsweise 5 n, Schwefelsäure gelöst und 20 bis 40 Minuten, insbesondere 30 Minuten, auf eine Temperatur von 40 bis 60°C, insbesondere 50⁰C gehalten, worauf die Lösung mit Calciumcarbonat neutralisiert und filtriert wird. Sie wird in zweckmäßiger Weise lyophilisiert

Das so hergestellte Produkt kann gegebenenfalls 4 bis 6 Gew.-°/o Calciumsulfat enthalten, was allerdings seine biologische Wirkung beziehungsweise seine pharmazeutische Anwendung nicht bc-einflußt.

Ferner sind Gegenstand der Erfindung Arzneimittel mit blutgerinnungshemmender Wirkung, weiche die erfindungsgemäße Verbindung als Wirkstoff, zweckmäßig zusammen mit einem oder mehreren pharmazeutisch üblichen Konfektionierungsmittel(n), enthalten.

Das erfindunj, gemäße D-Phenylalanyl-L-prolyl-L-arginin-aldehyd-suIfat hat nämlich eine überlegene blutgerinnungshemmende Wirkung.

Daß die Stabilität der verschiedenen Salze des D-Phenyl-alanyl-L-prolyl-L-arginin-aldehydes in wäßriger Lösung, zum Beispiel in physiologischer Kochsalzlösung, sehr unterschiedlich ist, wurde durch Versuche nachgewiesen. Bei eigenen Untersuchungen wurden die Peptide in einer Konzentration von 10 mg/cm³ gelöst, und die Änderung der Antithrombin-Aktivkät der gelösten Stoffe 180 Tage lang beobachtet. Die Lösungen wurden bei einer Temperatur von 5°C gelagert. Die Aktivitätswerte wurden in einem System, das aus folgenden Bestandteilen bestand, festgestellt:

0,2 cm³ 0,5%-iges Rinderfibrinogen in einer 0,9%-igen Kochsalzlösung,

0,1 cm³ Tris-fhydroxymethylJ-aminomethanhydrochlorid/Salzsäure-Puffer (pH-Wert = 7,2), v/eicher die Peptidlösung enthielt, und

0,1 cm¹ menschliches Thrombin [US Standard Human Thrombin (NIH, Bethesda, Maryland, USA)], 10 Einheiten/cm³ Lösung.

Die in einem »Schnither-Gross Coagulometer« bestimmte Gerinnungszeit des Systems betrug ohne Peptid 15 s. Die Aktivität des Tripeptid-aldehyd-salzes wurde mit 100 bewertet, wenn bei einer 3.5 χ 10- ⁷ m Reaktionsgemischendkonzentration (bei 0,175 μg Tripeptid-aldehyd-sulfat/cm³ Reaktionsgemisch) eine 5fache relative Gerinnungszeit erreicht wurde.

Die Ergebnisse der Untersuchungen sind in der folgenden Tabelle 1 zusammengesi eilt.

Tabelle I

Änderung der Antithrombin-Aktivität von Tripeptid-aldehyd-derivaten in physiologischer Kochsalzlösung

Pcptid-aldchyd-derivat·¹)

Relative Aktivität¹³) nach

0 5 10 15 20 40 90

Tag Tagen Tagen Tagen Tagen Tagen Tagen

D-Phenylalanyl-L-prolyl-L-arginin-aldehyd-sulfat |D-Phe-Pro-Arg-H · H₂SO₄)C)

[erfindungsgemäße Verbindung]
D-Phenylalanyl-L-proIyl-L-arginin-aldehyd-diacetat (D-Phe-Pro-Arg-H · 2CH₃COOH)O

[Vergleichssübstanz]

100 100 100 100 100 100

100

70	60	40	40	40	35	30
bis	bis	bis	bis	bis	bis	bis
50	40	30	30	30	25	20

90	90	80	70	60	50	40
bis	bis	bis	bis	bis	bis	bis
60	60	50	40	40	30	30

Tabelle I (Fortsetzung)

Peptid-aldehyd-derivat^a) Relative Aktivität¹¹) nach

0 5 10 15 20 40 90

Tag Tagen Tagen Tagen Tagen Tagen Tagen

D-Phenylalanyl-L-proIyl-L-arginin-aldehyd-dihydrochiorid

{D-Phe-Pro-Arg-H 2 HCI|") io [ Vergleichssubstanz]

D-Phenylalanyi-L-prolyI-N^G-carboxy-L-arginin-aldehyd 100 80 60 50 30 25 20

{D-Phe-Pro-Arg[COOH]-H}0 [Vergleichssubstanz]

]5 ^a) Die Abkürzungen (auch an anderen Stellen) entsprechen dem Fachschrifttum (zum Beispiel J. Biol. Chem, 247, [1972], 977) sowie Z steht für einen Benzyloxycarbonylrest, Arg[COOH] bedeutet einen Ns-Carboxy-L-argininrest und Arg[Z] stellt einen N^G-BenzyIoxycarbonyl-L-argininrest dar.

^b) Die Antithrombin-Aktivität ist 100, wenn der Peptid-aldehyd in einer 3,5 χ 10~' m Reaktionsgemischenilkonzenlration eine 5fache relative Gerinnungszeit hervorruft.

^c) Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestelltes Produkt.

^d) Ein durch Hydrieren von Benzyloxycarbonyl-D-phenylalanyl-L-proIyl-W^-benzyloxycarbonyl-L-r^nin-aldehyd JZ-D-Phe-Pro-Arg[Z]-Hf in Gegenwart einer äquivalenten Saizsäuremenge hergestelltes Produkt.

^e) Nach der HU-PS 1 69 870 hergestelltes Vrodukt. Ähnlich wie beim Acetat ändert sich die Antithrombin-Aklivilät des entsprechenden Citrates, Tartrates und p-Tcluolsulfonates [Tosylates).

^f) Wie in der BE-PS 8 80 844 beschrieben hergestelltes Produkt
25

Aus der obigen Tabelle 1 geht hervor, daß während die anfängliche Aktivität des D-Phenylalanyl-L-prolyl-L-arginin-aldehyd-dihydrochlorides in physiologischer Kochsalzlösung nach 5 Tagen und die Aktivität von D-Phenyl-alanyl-L-prolyl-L-arginin-aldehyd-diacetat und des entsprechenden Citrates, Tartrates und p-ToIuolsuIfonates schon nach einigen Tagen abzunehmen begann (ähnliche Eigenschaften weist auch das N^G-£arboxyderivat D-Phenylalanyl-L-prolyl-N^carboxy-L-arginin-aldehyd auf), das erfindungsgemäße D-Phenylalanyl-L-prolyl-L-arginin-aldehyd-suIfat auch noch nach 90 Tagen seine Antithrombin-Aktivität bewahrte. In verlängerten Stabiliiätsuntersuchungen erwies sich das D-Phenylalanyl-L-prolyl-L-arginin-aldehyd-sultat selbst nach 180 Tagen in wäßriger Lösung noch als stabil und auch in festem Zustand verlor es über 6 Monate hinweg nichts von seiner Aktivität.

Die Antithrombin-Aktivität der obigen Tripeptid-aldehyd-salze sowie des Carbaminsäurederivates D-Phenyla!any!-L-pro!y!-N^G-carbQxy-L-arginiri-aldehyd und von Heparin wurde auch an menschlichem Plasma, welches den biologischen Bedingungen besser entspricht, im folgenden System untersucht:

0.2 cm³ Humancitratplasma.
0,1 cm⁵ iris-ihydroxymethylJ-aminomethanhydrochlorid/Salzsäure-Puffer (pH-Wert = 7,2), welcher auch die

Peptidlösung enthielt, und

0,1 cm³ menschliches Thrombin [US Standard Human Thrombin (NIH, Bethesda, Maryland, USA)], 10 Einhciten/cm³ Lösung.

Die Gerinnungszeit des Systemes wurde ohne Peptid in einem 15 s »Schnither-Gross Coagulomcter« bestimmt.

Tabelle II
Antithrombin-Aktivität von Tripeptid-aldehyd-derivaten bei Humanplasma

Peptid-aidehyd-derivat Zur doppelten Verlängerung der Relative

Gerinnungszeit notwendige Peptid- Aktivität menge in einer Reaktionsgemisch-Konzentration von μg/cm⁾

unmittelbar nach dem Lösen

des Peptides

D-Phenylalanyl-L-prolyl-L-arginin-aldehyd-sulfat 0,020 100

eo JD-Phe-Pro-Arg-H · H₂SO₄)

[erfindungsgemäße Verbindung]
D-Phenylalanyl-L-prolyl-N°-carboxv-L-arginin-aldehyd 0,042 48

{D-Phe-Pro-Arg[COOH]-H} [Vergleichssubstanz]

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Tabelle II (Fortsetzung) Pcptid-aklchyd-derival

Zur doppelten Verlängerung der Relative
Gerinnungszeit notwendige Peptid- Aktivität
menge in einer Reaktionsgemisch-Konzeniraiion von jig/cm¹
unmittelbar nach dem Lösen
des Peptides

D-Phenylalanyl-L-prolyl-L-arginin-aldehyd-diacetat 0,065 bis 0,140

(D-Phc-Pro-Arg-H ■ 2CH₃COOHl

[Vergleichssubstanz]
D-Phenylalanyl-L-prolyl-L-arginin-aldehyd-dihydrochlorid 0,060 bis 0,130

{D-Phe-Pro-Arg-H · 2 HC1}
[Vcrglcichssubstanz]
Heparin«) 0,105

[Vcrgleichssubstanz]

31 bis 14 ίο 33 bis 15
19

im ί lande! crhä!i!ichcs{!32,2 E-'mg, US.Ph.XVH.) Hep_a!

mn

Aus der obigen Tabelle II geht hervor, daß die zur doppelten Verlängerung der Blindversuchs- beziehungsweise Kontrollgerinnungszeit notwendige Peptidmenge bei D-Phenylalanyl-L-prolyl-L-arginin-aldehyd-diacetat und D-Phenylalanyl-L-prolyl-L-arginin-aldehyd-dihydrochlorid von den Chargen abhängt und dabei das Mehrfache und auch bei D-Phenylalanyl-L-prolyl-W^-carboxy-L-arginin-aldehyd noch das Doppelte der dazu erforderlichen Menge von D-Phenylalanyl-L-prolyl-L-arginin-aldehyd-sulfat beträgt sowie die zur doppelten Verlängerung der Blindversuchs- beziehungsweise Kontrollgerinnungszeit erforderliche Menge von Heparin mehr als das 5fache der dazu erforderlichen Menge von D-Phenylalanyl-L-prolyl-L-arginin-aldehyd-sulfat ist.

Die Ergebnisse der Untersuchung der bereits oben untersuchten Trip^ptid-aldehyd-derivate und von Heparin in vivo sind in der folgenden Tabelle III zusammengestellt.

Tabelle III

Untersuchung in vivo

Zur Erzielung einer therapeutischen Wirkung¹¹) notwendige Dosis

Pcplid-aldchyd-derival

Intravenöse Infusion
in mg/kg/Stunde
Kaninchen Hund

Perorale Verabreichung
in mg/kg

Kaninchen riünu

wirkungslos wirkungslos

D-Phenylalanyl-L-prolyl-L-arginin-aldehyd-sulfat 1,0 0,5 25 25

{D-Phe-Pro-Arg-H - H₂SO₄I

[erfindtingsgemäße Verbindung]
D-Phenylalanyl-L-prolyl-L-arginin-aldehyd-diacetat — — 100 100

{D-Phe-Pro-Arg-H - 2 CH₃COOHj

[Vergleichssubstanz]
D-Phenylalanyl-L-prolyl-L-arginin-aldehyd-dihydrochlorid — — — IQO

{D-Phe-Pro-Arg-H -2HC1(

[Vergleichssubstanz]
D-PhenylaIanyl-L-prolyl-N^G-carboxy-L-arginin-aIdehyd — 3,0 50 50

{D-Phe-Pro-Arg[COOH]-H}

[Vergleichssubstai.z]
Heparin 0.5 0,5

[Vergleichssubstanz]

^h) Eine therapeutische Wirkung ist durch die 1,5- bis 2pfache Verlängerung der ganzen Blutgerinnungszeit gekennzeichnet (Fachschrifttum: Nies, A. S. [1978] in Clinical Pharmacology {Melmon. K,I_ and Morelli. F.F. eds.}. 2. ^D:) Ausgabe. Seiten 303 bis 305, Macmillan Publ. Co. Ine, New York; Verstraete. M. Verwiighen. R. [1980] in Drug Treatment. Principles and Practice of Clinical Pharmacology and Therapeutics. 2. Ausgabe. Avery. G. S. ed. [1980]. Seilen 889 bis 952, Edinburgh and London).

Aus der obigen Tabelle III geht hervor, daß die Antithrombin-Wirkung des erfindungsgemäßen D-Phenylalanyl-L-prolyl-L-arginin-aldehyd-sulfates auch in vivo sehr groß ist. Bei intravenöser Verabreichung reicht sie an die Wirkung des in der Therapie allgemein verwendeten Heparines heran. Das D-Phenylalanyl-L-proIyl-L-arginin-aldehyd-sulfat zeigt aber im Vergleich zum Heparin eine Mehrwirkung, denn, während das Heparin peroral wirkungslos ist, kann mit dem D-Phenylalanyl-L-proIyl-L-arginin-aldehyd-suIfat in einer peroralen Dosis von 25 mg/kg eine therapeutische Wirkung erzielt werden, und dieses ist auch den bekannten Verbindungen D-Phenylalanyl-L-proIyl-L-arginin-aldehyd-diacetat und D-Phenylalanyl-L-prolyl-L-arginin-aldehyd-dihydrochlorid sowie D-PhenylaIanyl-L-proIyl-N^G-carboxy-L-arginin-aldehyd überlegen, indem mit D-Phenylalanyl-L-prolyl-L-arginin-aldehyd-diacetat und D-Phenylalanyl-L-proIyl-L-arginin-aldehyd-dihydrochlorid nur in einer Dosis

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von 100 mg/kg und mit D-Phenylalanyl-L-prolyl-NC'-carboxy-L-arginin-aldehyd nur in einer Dosis von 50 mg/kg eine therapeutische Wirkung erzielt werden kann.

In der folgenden Tabelle IV sind die akuten Toxizitätswerte (LD₅₀-Werte) von oben untersuchten Tripcplid* aldehyd-derivatsn und von Heparin bei Mäusen zusammengestellt.

Tabelle IV

Akut» Toxizitätswerte bei Mäusen

Paptid-aldehyd-derival beziehungsweise Heparin LDso-Wert in mg/kg

Intravenöser intrape- subkutan peroral

Bolus ritoneal

D-Phenylalanyi-L-prolyl-L-arginin-aldehyd-sulfat 45^k) 230 1800 >2000

(D-Phe-Pro-Arg-H · H₂SO₄)

[erfindungsgemäße Verbindung]
D-Phenylalanyl-L-prolyl-L-arginin-aldehyd-diacetat 9 38 — 960

(D-Phe-Pro-Arg-H · 2CH₃COOH)

[Vergleichssubstanz]
D-Phenylalanyl-L-prolyl-N^ü-carboxy-L-arginin-aldehyd — — — 1200

(D-Phe-Pro-Arg[COOH]-H)')

[Vergleichssubstanz]
Heparin keine Schrifttumsangaben

[Vergleichssubstanz]

') Wegen Löslichkeitsprobleme können die Toxizitätsangaben für andere Verabreichungsformen nicht mil entsprechender Sicherheil gegeben werden.
^k) Bei einer !siündigen intravenösen Infusion ergab sich bei Kaninchen ein LDso-Wert von 58 mg/kg.

Aus der obigen Tabelle IV geht hervor, daß das erfindungsgemäße D-Phenylalanyl-L-prolyl-L-arginin-aldchyd-sulfat auch hinsichtlich der Toxizität günstiger als das D-Phenylalanyl-L-prolyl-L-arginin-aldehyd-diacctat und das D-Phenylalanyl-L-prolyl-N^G-carboxy-L-arginin-aldehyd ist, wobei das erstere einen höheren LDso-Wert als 2 g/kg hat. |

Im Hinblick auf die niedrige Toxizität und hohe Wirksamkeit des D-Phenylalanyl-L-prolyl-L-arginin-aldehydsulfates ist der beide Faktoren berücksichtigende therapeutische Index, der bezüglich der pharmazeutischen Verwendung einer Verbindung eine der wichtigsten Angaben ist, viel vorteilhafter als der der übrigen Tripeptidaldehyd-derivate.

Auf Grund von intravenösen Infusionsuntersuchungen an Hunden beträgt die intravenösen Humaninfusionsdosis 1 bis 2 mg/kg/Stunde.

Die Erfindung wird an Hand der folgenden Beispiele näher erläutert.

Die in den Beispielen angegebenen Rr-Werte wurden durch Dünnschichtchromatographie an Silicagel (Kicselgel G, Reanal, Budapest) in folgenden Lösungsmittelgemischen bestimmt:

Lösungsmittelgemischbestandteile Volumenverhältnis

der Bestandteile

1 Äthylacetat/Pyridin/Essigsäure/Wasser 480 :20 :6 :11

2 Äthyiacetat/Pyridin/Essigsäure/Wasser 60 :20 :6 :11

3 Äthylacetat/Pyridin/Essigsäure/Wasser 30:20:6:11

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Beispiel 1
D-Phenylalanyl-L-proiyl-L-arginin-aldehyd-sulfat

Es wurden 2,74 g (5 mMol) terL-Butyloxycarbonyl-D-phenylalanyl-L-prolyl-L-arginin-aldehyd-hemisuIfat in 5 cm³ Wasser gelöst, unter Rühren beziehungsweise Schütteln wurden 5 cm³ einer 10 η Schwefelsäure zugesetzt und es wurde auf 50°C erwärmt Die Lösung wurde 15 Minuten lang bei 50⁰C gerührt beziehungsweise geschüttelt, dann mit 25 cm³ Eiswasser verdünnt und während des Kühlens mit Eiswasser wurde der pH-Wert mit festem Calciumcarbonat (etwa 2,25 g waren notwendig) auf 64 eingestellt. Das ausgeschiedene Calciumsulfat wurde abfiltriert und 2mal mit 5 cm³ Wasser gewaschen. Das mit den Waschwässern vereinigte Filtrat wurde 2mal mit je 10 cm³ n-ButanoI ausgeschüttelt, dann unter vermindertem Druck auf etwa 30 cm³ eingeengt sowie gegebenenfalls filtriert und schließlich lyophilisiert So wurden 2,25 g (79% der Theorie) D-Phenylalanyl-L-prolyl-L-arginin-aldehyd-sulfat mit einem Gehalt an 4,8 Gew.-% Calciumsulfat erhalten.

Rr³-Wert = 035 bis 0.40.

[λ]?-Wert = -117 ± 1° (c = 1, in Wasser).

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Elemcnlaranalyse:

FUrC₂₀H₃₀O₃N₆ ■ H₂SO₄ · 3 H₂O · 0,2 CaSO₄ (Molekulargewicht = 565,85)

berechnet: C = 42,45%, H = 6,77%, N = 14,85%, SO₄ = 20,37%, Ca = 1,41%,. H₂O = 9,55%;

gefunden: C = 42,2%, H = 6,9%, N = 14,85%, SO₄ = 19,8%, Ca = 1,3%. H₂O = 9,75%.

Der Ausgangsstoff tert.-Butyloxycarbonyl-D-phenylalanyl-L-prolyl-L-argihin-aideliyd-hemisulfat ist wie folgt beschrieben hergestellt worden:

I.Stufe

tert.-Butyloxycarbonyl-D-phenylalanyl-L-prolyl-NG-benzyloxycarbonyl-L-argiriin-lactam

Es wurden 8,6 g (22 mMol) tert.-Butyloxycarbonyl-N^G-benzyloxycarbonyl-L-arginin-lactam (BE-PS 8 80 844) in 20 cm³ Äthylacetat suspendiert und bei einer Temperatur von 5°C wurden unter Rühren beziehungsweise Schütteln 40 cm³ einer 4 m Lösung von Chlorwasserstoff in Äthylacetat zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde unter Kühlen mit Eiswasser 30 Minuten lang gerührt beziehungsweise geschüttelt und dann mit 100 cm gekühltem Äthylacetat verdünnt und der abgeschiedene Niederschlag wurde abfiltriert, mit Athylacetat gewaschen und in einem Vakuumexsikkator über Kaliumhydroxyd getrocknet. Das so erhaltene N°-Benzyloxycarbonyl-L-arginin-lactam-hydrochlond wurde in 20 cm³ Dimethylformamid gelösi und nach dem Kühlen auf — !0⁰C wurden 6,2 cm³ (44 mMol) Triäthylamin zugesetzt. Die erhaltene Suspension wurde dem wie folgt beschrieben erhaltenen Anhydrid zugesetzt.

7,25 g (20 mMol) tert.-Butyloxycarbonyl-D-phenyl-alanyl-L-prolin (U. Ludescher und R. Schwyzer: HeIv. Chi'm. A.cta 55 [1972], 2052 und 2,22 cm³ (20 mMol) N-Methylmorpholin wurden in 20 cm³ Dimethylformamid gelöst. Die Lösung wurde auf- 15°C gekühlt und unter Rühren beziehungsweise Schütteln wurden 2,64 cm³ (20 mMol) Chlorkohlensäureisobutylester und dann nach 5 Minuten die gemäß dem vorherigen Absatz erhaltene Dimethylformamidiösung zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde noch 1 Stunde bei - 15°C und 1 Stunde lang bei 0⁰C gerührt beziehungsweise geschüttelt. Dann wurde es mit 30 cm³ Benzol verdünnt und die abgeschiedenen Salze wurden abfiltriert und 2mal mit je 10 cm³ Benzo! gewaschen. Die Benzol enthaltende Dimethylformamidiösung wurde mit 50 cm³ Wasser verdünnt und die Phasen wurden voneinander getrennt. Die wäßrige Phase wurde 2mal mit je 10 cm³ Benzol ausgeschüttelt, dann wurden die vereinigten benzolhaltigen Lösungen nacheinander 3mal mit je 30 cm³ einer 10%igen Natriumcarbonatlösung, mit 30 cm³ Wasser, 3mal mit je 30 cm einer 0,5 η Schwefelsäure und 2mal mit je 30 cm³ Wasser gewaschen und schließlich nach dem Trocknen über wasserfreiem Natriumsulfat unter vermindertem Druck eingedampft. Der Eindampfrückstand wurde mit Petroläther verrieben, filtriert, mit Petroläther gewaschen und an der Luft getrocknet. Es wurden 9,65 g (76% der Theorie) tert.-Butyloxycarbonyl-D-phenyl-alanyl-L-prolyl-NG-benzyloxycarbonyl-L-arginin-lactam erhalten.

Rf^!-Wert = 0,81 bis 0,89.

2. Stufe

40 tert.-Butyloxycarbonyl-D-phenylalanyl-L-prolyl-NG-benzyloxycarbonyl-L-arginin-aldehyd

Es wurden 9,52 g (15 mMol) des in der 1. Stufe erhaltenen geschützten Tripeptid-lactames tert.-Butyloxycarbonyl-D-phenylalanyl-L-prolyl-NG-benzyloxycarbonyl-L-arginin-Iactam in 45 cm³ Tetrahydrofuran gelöst und bei einer Temperatur von - 20° C unter starkem Rühren beziehungsweise Schütteln eine 11,25 mMol Lithiumaluminiumhydrid (LiAlH₄) enthaltende Lösung von Lithiumaluminiumhydrid in Tetrahydrofuran (etwa 28 cm³ einer 04 m Lösung) zugesetzt. Der Erfolg der Reduktion wurde durch Schichtchromatographie kontrolliert (der Rr¹-Wert des Lactames tert-Butyloxycarbonyl-D-phenylalanyl-L-prolyl-NG-benzyloxycarbonyl-L-argimn-laclam beträgt 0,71 bis 0,77 und der des Aldehydes tert-Butyloxycarbonyl-D-phenylalanyl-L-prolyl-NG-benzyloxycarbonyl-L-arginin-aldehyd 0,31 bis 0,39) und erforderlichenfalls konnte weitere Lithiumaluminiumhydridlösung zugesetzt werden. Am Ende der Reaktion wurde die Tetrahydrofuranlösung vorsichtig mit einer 0,5 η Schwefelsäure auf einen pH-Wert von 3 angesäuert und dann mit Wasser (etwa 100 cm³) so verdünnt, daß die Substanz nicht ausgeschieden wurde. Dann wurde sie 2-mal mit je 30 cm³ η-Hexan ausgeschüttelt. Die wäßrige tetrahydrofuranhaltige Lösung wurde 3-mal mit je 75 cm³ Methylenchlorid ausgeschüttelt und dann wurden die vereinigten Methylenchloridlösungen 3-mal mit je 10 cm³ einer 10%igen N atriumcarbonatlösung und 2-mal mit je 10 cm³ Wasser gewaschen. Danach wurde die methylenchloridhaltige Lösung über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und unter vermindertem Druck eingedampft. Der Eindampfrückstand wurde in 50 cm³ Benzol gelöst und die Lösung wurde erneut unter vermindertem Druck eingedampft Das Lösen im Benzol und das Eindampfen wurden noch 1 mal wiederholt Der so erhaltene Eindampfrückstand wurde mit Diäthyläther verrieben, filtriert, mit Diäthyläther gewaschen und an der Luft getrocknet. Es wurden 6,9 g (72% der Theorie) tert-Butyloxycarbonyl-D-phenylalanyl-L-prolyl-NG-benzyloxycarbonyl-L-arginin-aldehyd erhalten.

Rr'-Wert = 0.3 bis 0.4.

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3. Stufe
tert.-Butyloxycarbonyl-D-phenylalanyl-L-prolyl-L-arginin-aldehyd-hemisulfat

Es wurden 6,4 g (10 mMol) des in der 2. Sture erhaltenen geschützten Tripeptid-aldehydes terl.-Butyloxycarbonyl-D-phenylaianyl-L-prolyl-NG-benzyloxycarbonyi-L-arginin-aldehyd in einem Gemisch von 50 cm³ Wasser, 50 cm³ Tetrahydrofuran und 10 cm³ einer η Schwefelsäure gelöst und dann in Gegenwart voij 1 g eines 10%igön Palladium/Aktivkohle-Katalysators hydriert. Das Fortschreiten der Reaktion wurde mittels Schichtchromatographie verfolg« (der Rr² Wert des an seiner Guanidinogruppe geschützten Tripeptidaldehydes tert.-Butyloxy-

carbonyl-D-phenylalanyl-L-prolyl-N'^-benzyloxycarbonyl-L-arginin-aldehyd beträgt 0,95 bis 1,0 und der Rr²-Wert des freien Tripeptidaldehyd-hemisulfates tert.-Butyloxycarbonyl-D-phenylalanyl-L-prolyl-L-argininaldehyd-hemisulfat 0,45 bis 0,54). Am Ende der Reaktion wurde der Katalysator abfiltriert und mit 30 cm³ 50%igem wäßrigen Tetrahydrofuran gewaschen und dann wurde das Filtrat unter vermindertem Druck auf etwa 60 cm³ eingeengt. Der Rückstand wurde 4-mal mit je 40 cm³ n-Butanol ausgeschüttelt. Wenn die wäßrige

Phase das tert.-Butyloxycarbonyl-D-phenylalanyl-L-prolyl-L-arginin-aldehyd-hemisuIfat (Rr²-Wert = 0,45 bis 0,54) enthielt, wurden 5 cm³ Tetrahydrofuran zugesetzt und es wurde 2- bis 3-mal mit je 40 cm³ n-Butan'ol ausgeschüttelt. Die n-Butanolphasen wurden vereinigt und unter vermindertem Druck zur Trocknung eingedampft. Der Eindampfrückstand wurde mit einem Gemisch von Diäthyläther und Diisopropyläther im Volumverhältnis von 1 :1 verrieben, filtriert und mit dem vorstehender. Gemisch gewaschen und dann in einem Vakuumexsikkator getrocknet. Es wurden 4,4 g (80% der Theorie) tert.-Butyloxycarbonyl-D-phenyl-alanyl-L-prolyl-L-üi-ginin-aldehyd-hemisulfat erhalten.

Rr²-Wert = 0,45 bis 0,54.

[«]?-Wert = -65 ± 1° (c = 1, in Wasser).

Analyse:

FOrC₂₅H₃₈O₅N₆ ■ 0,5 H₂SO₄ (Molekulargewicht = 551,64)

berechnet: C = 54,43%, H = 7,13%, N = 15,23%. SO₄ = 8,71%;

gefunden: C = 54,5%, H = 7,3%, N = 15,2%, SO₄ = 8,7%.

Beispiel 2
D-Phenyialanyl-L-prolyl-L-arginin-aldehyd-sulfat

Es wurden 2,85 g (5 mMol) tert.-Butyloxycarbonyl-D-phenylalanyl-L-prolyl-NC-carboxy-L-arginin-aldehyd in 5 cm³ Wasser gelöst und unter Rühren beziehungsweise Schütteln wurden 5 cm³ einer 1On Schwefelsäure zugesetzt. Die Lösung wurde auf 50° C erwärmt, 15 Minuten lang auf dieser Temperatur von 50° C gehalten und dann mit 25 cm³ Eiswasser verdünnt und unter Kühlen mit Eiswasser mit festem Calciumhydroxyd (etwa 1,6 g waren erforderlich) wurde der pH-Wert auf 6,5 eingestellt. Das ausgeschiedene Calciumsulfat wurde abfiltriert und 2-mal mit je 5 cm³ Wasser gewaschen. Das mit den Waschwässern vereinigte Filtrat wurde 2-mal mit je 10 cm³ n-Butanol ausgeschüttelt, dann unter vermindertem Druck auf etwa 30 cm³ eingeengt, erforderlichenfalls filtriert und schließlich lyophilisiert. So wurden 2,3 g (81% der Theorie) D-Phenylalanyl-L-prolyl-L-arginin-aldehyd-sulfat mit einem Gehalt an 4,9 Gew.-% Calciumsulfat erhalten.

Rr³- Wert = 0,35 bis 0.40.

|>]i?-Wert = -117 ± Γ (c = 1, in Wasser).

Der Ausgangsstoff tert.-Butyloxycarbonyl-D-phenyl-alanyl-L-prolyl-NG-carboxy-L-arginin-aldehyd ist wie folgt beschrieben hergestellt worden.

Es wurden 6,4 g (10 mMol) wie bei der Herstellung des Ausgangsstoffes des Beispieles 1,2. Stufe beschrieben hergestellter geschützter Tripeptid-aldehyd tert.-Butyloxycarbonyl-D-phenylalanyl-L-prolyl-NC-benzyloxycarbonyl-L-arginin-aldehyd in 100 cm³ 75%igem wäßrigem Äthanol in Gegenwart von 1 g 10%igem Palladium/Aktivkohle-Katalysator hydriert. Der Verlauf der Reaktion wurde mittels Dünnschichtchromatographie verfolgt (der Rf²-Wert des geschützten Tripeptid-aldehydes tert.-Butyloxycarbonyl-D-phenylaIanyl-L-prolyI-N^G-benzyloxycarbonyl-L-arginin-aldehyd beträgt 0,90 bis 0,95 und der des N^G-Carboxyderivates tert-Butyloxycarbonyl-D-phenylalanyl-L-prolyI-N^G-carboxy-L-arginin-aldehyd 0,45 bis 0,55). Am Ende der Reaktion wurde der Katalysator abfiltriert und mit 30 cm³ Wasser gewaschen und dann wurde das Filtrat unter vermindertem Druck auf 30 bis 40 cm³ eingeengt Der Rückstand wurde mit 100 cm³ Wasser verdünnt, 2-mal mit je 20 cm³ Methylenchlorid ausgeschüttelt und lyophilisiert. Es wurden 5,1 g (85% der Theorie) tert-Butyloxycarbonyl-D-phenylalanyl-L-prolyl-N^G-carboxy-L-arginin-aldehyd erhalten.

Rr²-Wert = 0,45 bis 0,55.

Aminosäureanalyse: Phenylalanin = 0,96; Prolin = 1 (Bezugsgrundlage).

Molekulargewicht auf Grund der Aminosäureanalyse = 570.

OO 812

B eispiel 3
Arzneimittelpräparat

Ein Zweiampullenarzneimittelpräparat, das für 6- beziehungsweise 12-stündige Infusion geeignet war, wurde
wie folgt hergestellt:

Es wurden 420 bis 840 mg D-Phenylalanyl-L-prolyl-L-arginin-aldehyd-sulfat als Wirkstoff und 40 bis 80 mg
Humanalbumin zusammen lyophilisiert. Der Inhalt der so Iyophilisierten AmpuHe wurde vor der Anwendung in
bis 200 cm³ steriler, von Fiebererregern freier (pyrogenfreier) isotonischer Kochsalzlösung gelöst.

Claims

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Patentansprüche:

l.D-Phenylalanyl-L-prolyl-L-arginin-aldehyd-suIfat
2. Verfahren zur Herstellung der Verbindung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man vom Hemisulfat oder N^G-Carboxyderivat des an seiner endständigen Aminogruppe eine tert-Alkoxycarbonylgruppe aufweisenden D-Phenylalanyl-L-prolyl-L-arginin-aldehydes ausgehend die Schutzgruppe der endständigen Aminogruppe und gegebenenfalls die N^G-Carboxygruppe durch Umsetzung mit dem 1 bis I2fachen der äquivalenten Menge von wäßriger η bis 12 η Schwefelsäure bei 40 bis 60⁰C abspaltet und das erhaltene freie D-Phenylalanyl-L-prolyl-L-arginin-aldehyd-sulfat abtrennt.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man als Schutzgruppe an der endständigen Aminogruppe des Ausgangsstoffes die tert-Butoxycarbonylgruppe einsetzt
4. Arzneimittel mit blutgerinnungshemmender Wirkung, enthaltend die Verbindung nach Anspruch 1 als Wirkstoff, zweckmäßig zusammen mit einem oder mehreren pharmazeutisch üblichen Konfektionierungsmittel(n).