DE3211309C2 - - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein chromatographisches Verfahren zur Trennung von Gemischen aus Nukleinsäuren unter Ver­ wendung von porenartige Hohlräume enthaltendem Chromato­ graphiematerial aus oberflächenmodifiziertem Silicium­ dioxid, Alumosilikaten, Aluminiumoxid und aus mit diesen Materialien beschichteten Trägersubstanzen.

Der Fortschritt der Biochemie, Mole­ kularbiologie und Polymerforschung und deren Anwendung in Technik, Medizin, Pharmazie und Gentechnologie erfordert die schnelle und systematische Trennung und Isolierung von Makro­ molekülen. Von besonderem Interesse in den Biowissenschaften sind dabei langkettige Oligonukleotide, hochmolekulare Nuklein­ säuren und Proteine. So z. B. tritt in der Gentechnologie häufig das Problem auf, daß aus einem natürlich vorkommenden Gemisch von 100 und mehr verschiedenen hochmolekularen Nukleinsäuren eine einzige molekulare Spezies bis zur Homogenität gereinigt werden muß. Bekanntlich sind die einzelnen Nukleinsäuren durch Molekulargewicht, Größe und Form zu charakterisieren. Für viele Trennprobleme haben sich chromatographische Verfahren als vorteilhaft erwiesen. Die meisten Vorteile in bezug auf Auflösung, geringen Zeitaufwand und Reproduzier­ barkeit bietet dabei die Hochdruckflüssigkeitschromatographie (HPLC). Diese Methode wurde bisher in Form der Gelpermeations­ chromatographie (GPC), der Ionenaustauschchromatographie und der Reversed-Phase Chromatographie (RP-Chromatographie) angewendet. Dabei traten für die hier zu behandelnden Trennpro­ bleme folgende Nachteile auf:
GPC ist nur in der Lage, sehr kleine von sehr großen Molekülen zu trennen.

Die DE-OS 23 13 073 beschreibt ein oberflächenmodifiziertes chromatographisches Material, das durch Umsetzung von anorganischem Festkörper und organischen Molekülen herge­ stellt wird. Der anorganische Festkörper weist OH-Gruppen auf, die mit herkömmlichen Methoden alkyliert werden und in der Alkylgruppe reaktive Heteroatome aufweisen, die durch wünschenswerte funktionelle Gruppen substituiert werden können.

Als anorganische Trägermaterialien werden in den Beispielen Silikagel, poröses Glas, poröses Siliciumdioxid, Alu­ miniumhydroxid, mit Titandioxid belegte Glaskugeln, See­ sand und mit Siliciumdioxid belegte Glasplatten genannt. Diese Materialien werden mit polaren und polar-protischen funktionellen Gruppen belegt. Es können niedermolekulare Stoffe getrennt werden. In Analytical Chemistry, Vol. 47, S. 1329-1337 (1975) werden Chromatographiematerialien beschrieben mit Porengrößen von 160 und 310 Å. Mit diesen Materialien werden niedermolekulare Substanzen, wie Benzol, Naphthalin und Antracin getrennt.

Die GB-PS 14 21 531 beschreibt ein Verfahren zur Herstellung von diskreten porösen Teilchen zur selektiven Reten­ tion von Makromolekülen in Flüssigkeiten. Die selektive Retention führt zur Abtrennung der makromolekularen von niedermolekularen Komponenten sowie zur Trennung der makromolekularen Komponenten in Fraktionen. Die anorganischen Materialien werden mit Stoffen, die verflüchtigt werden können, versetzt. Zum Beispiel kann Hämoglobin in die anorganische Matrix eingebaut werden, welches danach bei hohen Temperaturen verglüht wird, so daß entsprechende Poren entstehen. Diese Materialien sind nicht in ober­ flächenmodifizierter Form eingesetzt worden.

Bisher bekannte Ionenaustauscher und Reversed-Phase Träger­ materialien konnten mit hoher Auflösung nur für kleine Makro­ moleküle wie Oligonukleotide, Peptide und Proteinbruchstücke eingesetzt werden. Bei der Trennung von hochmolekularen Makro­ molekülen wie beispielsweise messenger-Ribonukleinsäuren, Viren, Viroiden, Deoxyribonukleinsäure-Fragmenten und großen Proteinen konnte die erforderte Auflösung nicht erreicht werden. Das hydrophob-ionische-RPC-5 Chromatographiematerial wie beispielsweise von Larson, J. E. et al. (The Journal of Biological Chemistry (1979) 254, 5535-5541) beschrieben wurde zwar er­ folgreich bei der Trennung von Deoxyribonukleinsäure-Fragmenten eingesetzt, kann jedoch nicht auf die HPLC adaptiert werden, da das Trägermaterial nicht druckstabil ist. Man muß als Nach­ teile die niedrigen Flußraten, das heißt sehr lange Chromato­ graphiezeiten und eine geringe chromatographische Stabilität des Chromatographiematerials in Kauf nehmen. Aufgrund der chemischen Eigenschaften des RPC-5 Materials war es nicht möglich, komplexe Ribonukleinsäuregemische und Proteingemische aufzutrennen.

Mit den bisher bekannten Chromatographieverfahren war es nicht möglich, komplexe makromolekulare Gemische mit hoher Auflösung und hoher Geschwindigkeit in die einzelnen Molekülspezies zu trennen und zu isolieren oder diese Gemische zu analysieren.

Die Erfindung macht es sich zur Aufgabe, ein Verfahren bereitzustellen, mit den die o. a. Nachteile vermieden werden. Insbesondere soll es möglich sein, Nukleinsäure­ gemische der verschiedensten Art, die Komponenten mit sehr unter­ schiedlichen Abmessungen, beispielsweise im Bereich von 30 Å bis 1000 Å enthalten, in einem einzigen Durchlauf mit sehr hoher Auflösung und bei hoher Durchsatzgeschwindigkeit in ihre Kompo­ nenten aufzutrennen. Weiterhin sollten die verwendeten Materialien bei hohem Druck, weiten Temperaturbereichen und mit langer Lebensdauer einsetzbar sein. Wünschenswert ist eine hohe Be­ ladbarkeit mit den zu trennenden makromolekularen Gemischen. Diese Aufgabe wurde gemäß der in den Patentansprüchen beschriebenen Erfindung gelöst. Entgegen der bisherigen Meinung in der Fachliteratur wurde somit ein chromatographisches Verfahren entwickelt und die dazu notwendigen Trägermaterialien synthetisiert, mit denen es möglich ist, komplexe Nuklein­ säuregemische mit einem sehr weitem Molekülgrößenspektrum mit sehr hohem Auflösungsvermögen aufzutrennen. Dieses Ver­ fahren ist aufgrund seiner Einfachheit und der preiswerten und stabilen Materialien neben der wissenschaftlichen Anwendung vor allem für den industriellen Einsatz geeignet.

Entgegen den bisher bekannten Verfahren, die ausschließlich auf chemischen Eigenschaften der Trägermaterialien beruhten, geht die vorliegende Erfindung von der Erkenntnis aus, daß die Größe und/oder Form der Hohlräume der Trägermaterialien von ganz wesentlicher Bedeutung für die Trennung ist, und in bestimmter Relation zur Größe der zu isolierenden Makromolekül­ spezies stehen muß. Es hat sich gezeigt, daß die Größe der Hohlräume das 1-20fache der zu isolierenden Komponente betragen muß. Sollten die Abmessungen der einzelnen zu trennenden Komponenten mehr als den Faktor 20 voneinander verschieden sein, ist es selbstverständlich möglich, die Trennung in mehreren Schritten durchzuführen.

Eine geeignete Modifizierung der Oberfläche ist vorteilhaft. Es hat sich dabei als sehr vorteilhaft erwiesen, daß die für die Wechsel­ wirkung mit den zu trennenden Substanzen verantwortlichen Gruppen über flexible Kettenmoleküle auf der Oberfläche ver­ ankert sind. Diese Wirkung wird beispielsweise durch Verwendung von γ-Glycidyloxypropyltrimethoxysilan und N,N-Dimethylamino­ ethanol erreicht. Als wechselwirkende Gruppen kommen stark und schwach basische Anionenaustauscher, stark und schwach saure Kationenaustauscher, Gruppen mit hydrophoben Wechselwirkungen, Gruppen mit Polarisationswechselwirkungen und Gruppen, die mehrere der bekannten Eigenschaften kombinieren, in Frage.

Da es sich gezeigt hat, daß bei vielen Anwendungen zweiwertige Metallionen zu erheblichen Störungen Anlaß geben können, wird weiterhin vorgeschlagen, daß alle mit den Lösungsmitteln in Berührung kommenden Teile aus Edelmetall, Kunststoff oder Glas bestehen, bzw. entsprechende Beschich­ tungen aufweisen.

Die Erfindung ist anhand der Figuren näher erläutert. Es zeigt

Fig. 1 Eine an sich bekannte Vorrichtung zur Durchführung eines chromatographischen Verfahrens.

Fig. 2 Ausschnitte von Querschnitten durch Trägermaterialien mit verschiedenen Hohlraumgrößen.

Fig. 3, 4, 5 Graphische Darstellung verschiedener Elutions­ profile für verschiedene Hohlraumgrößen und Molekülgroßen. Die in Fig. 1 dargestellte Vorrichtung besteht aus einem druckfesten Zylinder (2), der mit einem Zuführungsstutzen (1) und einem Auslaufstutzen (3) versehen ist. Im unteren Teil des Zylinders (2) ist ein sehr feinmaschiges, chemisch inertes Sieb (4) angeordnet. Über dem Sieb (4) befindet sich der aus diskreten makroporösen Silicagelteilchen (5) bestehende chromatographische Träger. Die zu trennenden Substanzen werden in einer Lösung über den Zuführungsstutzen (1) eingefüllt und in den Hohlräumen des Trägers (5) adsorbiert. Bei dem anschließenden Elutionsschritt werden die zu trennenden Sub­ stanzen und Moleküle durch ein Lösungsmittel kontinuierlich variierender Zusammensetzung eluiert. Aufgrund der zeitlichen Änderung des Lösungsmittels treten im Ausfluß (3) die getrennten Komponenten zeitlich nacheinander aus.

Anhand von Fig. 2 wird der Einfluß der Hohlraumgröße des Trägermaterials auf die Wechselwirkung mit dem Makromolekül erläutert. Ein Makromolekül (6) kann in einen zu kleinen Hohlraum (7) des Trägermaterials (5) nicht genügend ein­ dringen, um eine optimale Wechselwirkung einzugehen. Der von seinen Abmessungen günstigere Hohlraum (8) erlaubt dagegen sehr intensive Wechselwirkungen. Um die Wechselwirkung zu erhöhen, sind die wechselwirkenden Gruppen über flexible Ketten­ moleküle (9) auf die Hohlraumoberfläche verankert. Ist dagegen der Hohlraum (10) zu groß, so ist wieder mit einer Abnahme der Wechselwirkung zu rechnen. Die Kettenmoleküle haben in diesem Beispiel folgende chemische Struktur:

Die flexible Kette γ-Glycidyloxypropyltrimethoxysilan ist an der einen Seite am Träger-Silicagel (P) verankert und trägt am anderen Ende die Anionenaustauschergruppe N,N-Dimethylamino.

Die beschriebene chemische Modifikation wurde auf sphärische Silicagele mit 10 µm Korngröße und Hohlraumgrößen von 100 Å, 500 Å und 4000 Å angewendet. Dazu werden 50 g Silicagelteilchen in einem 1000 ml Dreihalskolben bei einem Druck von <1 mbar 24 h bei einer Temperatur von 240°C aktiviert. Nach dem Abkühlen wurde mit trockenem Stickstoff belüftet und mit 500 ml trockenem γ-Glycidyloxypropyltrimethoxysilan versetzt. Die Umsetzung erfolgte 8 h bei 220°C unter Stickstoffatmosphäre und unter ständigem Rühren. Nach der Umsetzung wurde das überschüssige γ-Glycidyloxypropyltrimethoxysilan abgesaugt und das Produkt Epoxy-Silica mehrmals mit trockenem Dioxan gewaschen. Das Epoxy-Silica wurde in einem Vierhalskolben mit Innenthermometer, Rückflußkühler, Rührer und Stickstoffeinleitungsrohr mit 500 ml trockenem, N,N-Dimethylaminoethanol versetzt. Die Reak­ tion wurde durch 1 ml BF₃/Ether katalysiert und 24 h unter Rückfluß gekocht. Nach der Reaktion wurde das Dimethylamino- Silicagel abgesaugt und mehrmals mit Dioxan, Methanol und Ether gewaschen und bei 50°C getrocknet. Die Ausbeute betrug 51,5 g.

In Fig. 3-5 sind Trennbeispiele von kurzkettigen Nuklein­ säuren (Fig. 3) und langkettigen Nukleinsäuren (Fig. 4, 5) dargestellt. Die Durchmesser der Hohlräume sind - wie in der Zeichnung angegeben - 100 Å, 500 Å und 4000 Å. Die Konzen­ tration der eluierten Komponenten wird durch die UV-Absorption bei 260 nm gemessen und gegen die Zeit aufgetragen.

Daraus lassen sich folgende Ergebnisse ablesen. Kurzkettige Nukleinsäuren mit einer Länge von 20 Å bis 30 Å werden opti­ mal auf einer Hohlraumgröße von 100 Å getrennt (Fig. 3). Als ein Beispiel für die Trennung langkettiger Nukleinsäuren wurde ein natürliches Gemisch von transfer RNA (80 Å Größe), ribosomaler 5SRNA (110 Å Größe), 9S messenger RNA (300 Å Größe), und Viroid-RNA (450 Å Größe, eine pflanzenpathogene infektiöse RNA) gewählt. Es ist in Fig. 4 deutlich zu sehen, daß die größte gewählte Porengröße die beste Trennung ergibt, wobei nicht ausgeschlossen ist, daß mit einer Hohlraumgröße, die zwischen 500 Å und 4000 Å liegt, eine noch bessere Trennung zu erzielen wäre. In Fig. 5 ist das Beispiel aus Fig. 4 durch langsamere Elution weiter optimiert worden. Es wird eine voll­ ständige Trennung aller Komponenten erreicht.

Die in den angegebenen Beispielen verwendeten Dimethylamino- Silicagele hatten die Beladbarkeit von 4,8 mg Nukleinsäurege­ misch/g (100 Å), 17,2 mg Nukleinsäuregemisch/g (500 Å) und 5,6 mg Nukleinsäuregemisch/g (4000 Å).

Das erfindungsgemäß beschriebene Verfahren ist das erste chromatographische Verfahren, das folgende Eigenschaften hat:

• 1) Allgemeine Anwendbarkeit zur Trennung von Gemischen aus Nukleinsäuren.
• 2) Kurze Chromatographiezeiten und hohe Reproduzierbarkeit der Elutionsprofile durch die Verwendung von druckstabilen Trägern in HPLC Apparaturen.
• 3) Hohe Beladbarkeit.
• 4) Chromatographiematerialien mit Langzeitstabilität (kein "Ausbluten" der Chromatographiesäulen).

Claims (1)

1. Chromatographisches Verfahren zur Trennung von Gemischen aus Nukleinsäuren unter Verwendung von porenartige Hohl­ räume enthaltendem Chromatographiematerial aus ober­ flächenmodifiziertem Siliciumdioxid, Alumosilikaten, Alumi­ niumoxid und aus mit diesen Materialien beschichteten Trägersubstanzen, dadurch gekennzeichnet, daß ein Chromatographiematerial verwendet wird, bei dem der Durch­ messer der Hohlräume das 1- bis 20fache der Abmessungen der zu trennenden Makromoleküle ist und die Oberfläche des Chromatographiematerials stark und schwach saure Kationen- oder stark und schwach basische Anionenaus­ tauscher aufweist.