DE3227262A1

DE3227262A1 - Verfahren zur herstellung von target-zellen-lysis-faktor und dessen verwendung

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Publication number: DE3227262A1
Application number: DE19823227262
Authority: DE
Inventors: Masakazu Okayama Mitsuhashi; Haruo Funabashi Chiba Ohnishi
Original assignee: Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo KK; Mochida Pharmaceutical Co Ltd; Hayashibara Biochemical Laboratories Co Ltd
Current assignee: Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo KK; Mochida Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1981-07-21
Filing date: 1982-07-21
Publication date: 1983-03-03
Anticipated expiration: 2002-07-22
Also published as: IT8248855A0; ATA283582A; IT1196549B; US4495282A; SE9000532D0; CH664974A5; GB2106117A; SE8204382D0; SE8204382L; SE9000532L; FR2513124B1; DE3227262C3; AU8620082A; AU560793B2; DE3227262C2; GB2106117B; FR2513124A1; AT387980B

Description

CXPl-CHEM DR HANS D. BOETiRS

PATi NTAHWALTF
EUKOF'F.AN PATENT ATTORNEYS

THOMAS-WlMMER-RtNG 14 D-eOOO MÜNCHEN 22

PA. BOETEBS. BAUE« »PARTNER '

THOMAS-WIMMEaFWO 14. DSOOO MÜNCHEN 22 MÜNCHEN

DlPL -»NO. VINCEN2 ν RAFFAY DIPL-CHEM. DR. THOMAS FLECK

Deutsches Patentamt kamburo

TB-EFON (Οββ) 22 76 C7

8000 München 2 telexs24βτβm

TELEQRAMME: PHOvmnOH MÜNCHEN

21. Juli 1982

Anmelder: Kabushiki Kaisha Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyu^o und
Kochida Seiyaku Kabushiki Kaisha, Japan

Verfahren zur Herstellung von Target-Zellen-Lysis-Faktor und dessen Verwendung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Target-Zellen-Lysis-Faktor bzw. Zielzellen-Lysis-Paktcr (nach stehend als "TCL?" beEeichnet) und sie enthaltende therapeutische Mittel gegen maligne Juooren,

TCL? ist in diese= CusannerJiang als ein Paktor definiert, der zvtct."xisch auf eine fifcrcblastartige Zellinie von Mäusen, 1-9291 als Targetzellen bz>·. Zielzellen wirkt und ihre anschliesende Zytolyse bewirkt; bisher sind zwei Arten von TCL? bekannt, näxlich Lynphotoxin und Tuaornejcroee-Faktor (der nachstehend als «^ι?ΤΓ?^η bezeichnet wird).

Vie von Rruichi Acki et al.., Shin-Menekigaku Sosho, Bc. 6, "Lymphokines«', Igaku Shorn Ltd.,. Tokyo, Japan (1979) _t und S. H« rlccz und ?. R. C-laae, "In Vitro Methods in CeIl-Hediated I=T^-^r;ity^w,. Academic Press,. Inc. (1971), beschrieben vurde, bezeichnet z*az. mit de^ AU.sa.ruck ^ffLyEphotoxin" eine prcteinartige Substanz, die Zytotc-xizitat bewirken kann, und die aan intra- und/oder extracellular induzieren kann,

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beispielsweise indem man entweder sensibilisierte T-Zellen einem Antigen aussetzt oder nicht-sensibilisierte T-"ellen einem Lymphotoxinauslöser aussetzt, beispielsweise einem Mitogen, wie z.B. Phytohämagglutinin oder Concanavalin A. Es ist gut belegt, daß Lymphotoxin eine Zytotoxizitüt sowohl auf Tumorzellen als auch auf normale Zellen ausübt.

Wie von E. A. Carswell et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, Bd. 72, Nr. 9, S. 3666 bis 3670 (1975), und E. Pick, »Tumor Necrosis Factor in Lymphokines», Bd. 2, S. 235 bis 272 (1981), Academic Press, Inc., beschrieben wurde, bezeichnet der Ausdruck "TNP" eine proteinartige Substanz, die taan beispielsweise in Macrophagen induzieren kann, indem man parenteral an Kaninchen einen TNF-Auslöser verabreicht, wie z.B. Bacille de Calmette-Guerin (BCG), Corynebacterium parvum oder Endotoxin; und diese proteinartige Substanz kann eine hämorrhagische Nekrose von Meth Α-Sarkom bewirken. Es ist ferner gut belegt, daß TNF praktisch keinerlei Zytolyse von normalen menschlichen Zellen bewirkt, aber eine bemerkenswerte Zytolyse sowohl der Targetzellinie von Mäunen, L-929, als auch von menschlichen Tumorzellen bewirkt.

Die guten Aussichten von TCLF als therapeutisches Mittel gegen maligne Tumoren sind mit einer großen Erwartung aufgrund seiner Zytolysefunktion in Tumorzellen verbunden.

Obwohl TCLF praktisch nicht artspezifisch ist,und daher die Möglichkeit der Verwendung von TCLF nicht menschlichen Ursprungs, z.B. aus Kaninchen oder Ratten, bei der Behandlung von menschlichen Krankheiten naheliegt, ist die Verwundung von TCLF aus lebensfähigen menschlichen Zellen erwünscht und sehr sicher, weil es weniger antigene Eigenschaften und andere Nebenwirkungen hervorbringt, wenn man es in einer derartigen Behandlung verwendet.

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Eb ist Aufgabe der Erfindung, eir. leicht durchführbares Verfahren zur Herstellung von TCLP im technischen Maßstab und dessen mögliche Anwendungen ala therapeutisch.ee Mittel gegen maligne Tumoren vorzusehen.

Erfindungsgemäß wurde festgestellt, daß man eine große Menge an TCLF leicht erhalten kann, indem man menschliche Zellen, die man durch Vermehrung einer menschlichen Zellinie erhalten hat, welche TCLP erzeugen kann, einem TCLF-Auslöser aussetzt, eine gesteigerte TCLF-Erzeugung induziert und das angesammelte bzw. erzeugte TCLF sammelt und reinigt; ferner wurde erfindungsgemäß festgestellt, daß das TCLF ein ausgezeichnetes therapeutisches Mittel gegen maligne Tumoren ist.

Ferner wurde erfindungsgemäß festgestellt, daß das derart erhaltene TCLF mindestens drei Arten von Glycoproteinen mit verschiedenem Molekulargewicht im Bereich von etwa 1 χ 10 bis 1 χ Io Dalton umfaßt, die praktisch keinerlei Zytolyse von normalen menschlichen Zellen bewirken, jedoch eine bemerkenswerte Zytolyse sowohl von menschlichen Tumorzellen als auch der Target-Zellinie von Mäusen, L-929, bewirken.

Die menschliche Zellinie, die man erfindungsgemäß verwenden kann, kann eine Zellinie sein, die man in vitro auf übliche Weise vermehren kann. Um das erfindungsgemäße Verfahren wirkungsvoll durchzuführen, bevorzugt man die Verwendung von menschlichen Zellen, die man vermehrt hat, indem man die menschliche Zellinie auf ein nicht-menschliches warmblütiges Tier transplantierte oder wahlweise dazu die menschliche Zellinie sich in einer Diffusionskammer vom üblichen Typ vermehren ließ, durch welche die nährende Körperflüsaigkeit eines nicht-menschlichen warmblütigen Tieres der Zellinie zugeführt wird: im Gegensatz zu üblichen Methoden, wobei man lebende menschliche Zellen in vitro vermehrt, liefert

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die Methode unter Verwendung der Arbeitsweise in ¹VLvO nicht nur ein TCIiP mit viel höherem Reinheitsgrad, sondern benötigt ferner kein oder viel weniger Nährmedium mit einem Gehalt an teurem Serum und macht dadurch die Erhaltung der Kultur während der Zellvermehrung viel leichter.

Obwohl in der US-PS 4 276 282 (sugimito et al.) eine etwas verbesserte Methode zur Herstellung von humanspezificchem Interferon (nachstehend als "HulPN" bezeichnet) beschrieben ist, das eine Hemmungswiik ung auf Virusinfektionen aufweist, lehrt diese US-PS keinerlei Möglichkeit der Verwendung eines nicht-menschlichen warmblütigen Tieres zur Herstellung von

Insbesondere kann man bei der Methode unter Verwendung eines nicht-menschlichen warmblütigen Tieres als Wirt genial., der Erfindung bestimmte menschliche Zellinien leicht verrohren, während man die nährende Körperflüssigkeit ausnützt, die von dem nicht-menschlichen warmblütigen Tier zugeführt wird, indem man die menschlichen Zellinien auf das nicht-menschliche warmblütige Tier transplantiert oder wahlweise duzu sie in eine übliche Diffusionskammer einsetzt, die derart ausgebildet ist, daß sie die Körperflüssigkeit aufnimmt, und die Kammer in das Tier einsetzt bzw. an dem Tier anbringt; und indem man das Tier auf übliche Weise füttert.

Ferner kann man das erfindungsgemäße Verfahren von den Üblichen Zellvermehrungsmethoden in vitro unter Verwendung von Gewebekulturen dadurch unterscheiden, daß man zusätzliche Merkmale erzielen lcann, nämlich eine viel besser stabilisierte und raschere Zellvermehrung, eine höhere Zellproduktion und eine außerordentlich erhöhte Ausbeute an TCLP pro Zelle.

Die menschlichen Zellinien, die man erfindungsgemäß verwenden kann, sind solche, die man leicht transplant!eren und

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in dem Tier vermehren kann, und die TCLP erzeugen: Beispielsweise Namalva-Zeilen, wie in Journal of Clinical Microbiology, Bd. 1, S. 116 bis 117 (1975) beschrieben ist; BALL-1-, TALE-1- und NAIL-1-Zellen, wie von I. Miyoshi in Nature, Bd. 267, S. 843 bis 844 (1977) beschrieben ist; M-7OO2- und B-7101-Zellen, wie in Journal of Immunology, Bd. 113, S. 1334 bis 1345 (1974) beschrieben ist; JBL-, EBV-Sa-, EBV-Wa-, MOLT-3- und EBV-HO-Zeilen, wie in The Tissue Culture, Bd. 6, Nr. 13, S. 527 bis 546 (1980) beschrieben ist; CCRF-SB-Zellen (ATCC CCL 120); BALM 2-Zellenj DND-41-Zellen; und andere etablierte Zellinien, die man durch Transformieren von normalen Monozyten oder Granulozyten unter Verwendung eines beliebigen karzinogenen Virus, Mittels oder von karzinogener strahlung erhalten hat.

Wenn man anstelle der genannten Zellinien eine menschliche lymphoblastartige Zellinie verwendet, die man viel leichter einer Subkultur unterwerfen kann, und in die man eines oder mehrere menschliche Gene einführen kann, die die TCLF-Erzeugung kodieren, indem man eine Zellfusion unter Verwendung von Polyäthylenglycol oder Sendaivirus oder eine Methode der Genneukombination unter Verwendung von Nuclease, Liga3e und DNA-Polymerase durchführt, erhält man eine außerordentliche Steigerung der Zellvermehrungsrate und/oder der TCLF-Erzeugung pro Zelle.

Gegebenenfalls kann man eine oder mehrere der beschriebenen Zellinien frei kombiniert in den stufen bis zur TCLF-Induktion verwenden, die nachstehend genauer beschrieben ist. Menschliche Leukozyten, die TCLF erzeugen können und die man aus frischem menschlichen Blut gewonnen hat, kann man in Kombination mit einer oder mehreren der genannten Zellinien verwenden.

Das nicht-menschliche warmblütige.Tier, das man erfindungsgemäß verwenden kann, ist ein Tier, worin man die Zellinie

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vermehren kann: Beispielsweise Geflügel, wie z.B. HuI:η oder Taube; oder Säugetier, wie s.S. Hund, Katze, Affe, Ziege, Schwein, Pferd, Kuh, Meerschweinchen, Ratte, nackte Ratte, Hamster, Maus oder nackte Maus.

Da die Transplantation einer derartigen menschlichen TeIllinie auf das Tier unerwünschte Immunreaktionen bewirbt, ist es wünschenswert, zu einer möglichst starken Verminderung der Immunreaktion ein nicht-menschliches warmblütiges Tier im jüngsten möglichen Zustand zu verwenden, z.B. als Elf Embryo oder Fetus oder als Neugeborenes oder jüngstes Tier.

Vor der Transplantation kann man ein derartiges Tier ferner mit Röntgenstrahlen oder garoma-strahlen von etwa 200 bis 600 rem bestrahlen oder ein Antiserum oder Immunsuppressivum injizieren, um die Immunreaktion auf das niederste mögliche Niveau herabzudrüeken.

Wenn man nackte Mäuse oder nackte Ratten als Wirtstier verwendet, kann man, weil das Tier weniger unerwünschte Immunreaktionen sogar in seinem erwachsenen Zustand zeigt, auf das Tier leicht beliebige der genannten Zellinien ohne eine derartige Vorbehandlung transplantieren, und die Zellinien vermehren eich darin, wobei man weniger befürchten muß, daß unerwünschte Immunreaktionen bewirkt werden.

Man kann sowohl die Stabilisierung der Zellvermehrung als auch die Steigerung der TCLF-Erzeugung durch wiederholte Transplantation unter Verwendung von verschiedenen nichtmenschlichen warmblütigen Tieren erzielen: Beispielsweise kann man diese Vorteile erzielen, indem man zuerst die Zelllinie auf Hamster transplantiert und darin vermehrt und danach die vermehrten menschlichen zellen auf nackte Mäuse neu transplantiert. In diesem Fall kann man die wiederholte

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Transplantation unter Verwendung eines nicht-menschlichen warmblütigen Tieres der gleichen Klasee oder Ordnung sowie der gleichen Art oder der gleichen Gattung durchführen. ·

Was den Körperteil des Tieres betrifft, auf den man die Zellinie transplantieren kann, kann man die Zellinie auf einen beliebigen Körperteil des Tieres transplantieren, sofernaich die Zellinie darin vermehrt: Beispielsweise in die Allantoishöhle oder intravenös, intraperitoneal oder subkutan.

Statt die Zellinie auf das Tier zu transplantieren, kann man beliebige der beschriebenen Zellinlen leicht vermehren, indem man sie in eine übliche Diffusionskammer einbringt, deren Form und Größe verschieden sein kann, und die beispielsweise ein Membranfilter, Ultrafilter oder Hohlfaser—

-7 -5 filter einer nominalen Porengröße von etwa 10 bis 10 m aufweist, das die Verunreinigung der Kammer mit tierischen Zellen verhindert aber "<ie Zellinie mit der nährenden Körperflüssigkeit versorgt; indem man beispielsweise intraperitoneal die Kammer in das Tier einbettet; und die Zelllinie sich darin unter Verwendung der nährenden Körperflüssigkeit vermehren läßt, die vom Tier zugeführt wird.

Ferner kann man die Diffusionskammer beispielsweise auf dem Tier derart vorsehen und anordnen, daß die nährende Körperflüssigkeit und nährende Lösung in der Kammer frei durch die Kammer zirkulieren können. In diesem Fall kann man die Kultur in der Kammer während der Zellvermehrung durch ein oder mehrere transparente Seitenfensterbeobachten, das bzw. die in einer oder mehrerender Kammerwände vorgesehen sind, und/oder man kann die Kammer wiederholt durch eine frische Kammer ersetzen, wodurch man sowohl die Zellvermehrung über den Lebenszeitraum hinaus fortsetzen, ohne das Tier zu töten, als auch die Zellproduktion pro Tier viel stärker steigern kann.

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Da die Verwendung einer derartigen Diffusionskammer eine geringere Auslösung von unerwünschten Immunreaktlorien bewirkt, weil keine direkte Berührung der menschlichen Zellen mit den tierischen Zellen stattfindet, kann man ein beliebiges nicht-menschliches warmblütiges Tier leicht als Wirt ohne Vorbehandlung verwenden, und man kann die vermehrten menschlichen Zellinien leicht daraus gewinnen.

Die Fütterung des Tieres kann man leicht auf übliche Weise durchführen, und es ist keinerlei Spezialbehandlunf: sogar nach der Transplantation erforderlich.

Der Zeitraum, den man benötigt, um eine maximale Zellvermehrung zu erzielen, beträgt im allgemeinen 1 bis 10 Wochen. Die Anzahl der derart erhaltenen menschlicher. Zellen

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kann etwa 10 bis 10 pro Tier oder mehr betragen. Insbesondere vermehren sich erfindungsgemäß die tiansplantier-

2 i 7 ten menschlichen Zellen auf das etwa 10 - bis W -i'ache oder mehr, was eine etwa 10- bis 10 -fache oder noch höhere Ausbeute ist im Vergleich zu jener, die man unter Verwendung der Vermehrungsmethode in vitro unter Verwendung eines Nährmediums erzielt» Demgemäß sind die vermehrten menschlichen Zellen vorzugsweise zur Lösung der Aufgabe der Erfindung geeignet.

Man kann eine beliebige Methode,durch welche in den vermehrten menschlichen Zellen die Erzeugung von TCLF induziert wird, gemäß der Erfindung anwenden: Die vermehrten menschlichen Zellen kann man in dem Tier, das man als Wirt für die Zellvermehrung verwendet, einem TCLF-Auslöser aussetzen. Beispielsweise setzt man menschliche Zellen, die man in suspendiertem Aszites vermehrt hatte, oder Tumorzellen, die man beispielsweise subkutan gebildet hatte, direkt in vivo einem TCLF-Auslöser aus, Induziert die TCLF-Erzeugung, gewinnt das erzeugte bzw. angesammelte TCLF aus

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" f- KH.

Aszites, Serum und/oder Tumor und reinigt danach das TCLP.

Wahlweise dazu kann »andie vermehrten menschlichen Zellen aua dem Tier gewinnen und danach in vitro einem TCIF-Auslöser aussetzen: Beispielsweise suspendiert man die vermehrten menschlichen Zellen, die man durch Gewinnung aue der Aszitessuspension oder durch Extraktion und Zerteilen des aaisiven Tumors bzw. der massiven Tumoren erhalten hat, den bzw. die beispielsweise subkutan gebildet wurden, in einem Nährmedium, das man auf eine Temperatur im Bereich von etwa 20 bis 40 ⁰C vorgewärmt hat, bis zu einer Zelldichte von etwa 10 bis 10 Zellen pro ml, setzt sie in vitro einem TCLF-Auslöser aus und sammelt danach das gebildete TCLF aus der Kultur.

Wenn man die menschliche Zellinie in einer üblichen Diffusionßkammer vermehrt, kann man die vermehrten menschlichen Zellen in der Kammer oder nach der Gewinnung daraus einem TCLF-Auslöser aussetzen.

Die derart erhaltenen menschlichen Zellen kann man ferner in vitro weitere 1 bis 4 d kultivieren und die Portpflanzungszeit vor der TCLP-Induktion einstellen.

Die TCLF-Erzeugung pro Tier kann man ferner steigern, indem man beliebige der nachstehenden Methoden anwendet:

(1) eine Methode, worin man die vermehrten menschlichen Zellen einem TCLF-Auslöser in dem Tier aussetzt, das man als Wirt für die Zellvermehrung verwendet hat, die menschlichen Zellen danach aus einem oder mehreren bestimmten Körperteilen des Tieres oder aus seinem gesamten Korper gewinnt und danach die menschlichen zellen einem TOLF-Auslöser in vitro aussetzt;

(2) eine Methode, worin man menschliche zellen wiederholt in vitro und/oder in vivo einem TCLF-Auslöser auesetzt;

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und/oder

(3) eine Methode, worin man die Diffusionskammer, die man in das Tier eingebettet oder auf dem Tier angebracht hat, wiederholt durch eine frische Kammer ersetzt.

Der TCLF-Auslöser, den man erfindungsgeinäß verwenden kann, kann einer oder mehrere Ausloser sein, der bzw. dio die TCLF-Erzeugung in den menschlichen Zellen induzieron, die man durch Vermehrung der menschlichen Zellinie unter Verwendung der nährenden Körperflüssigkeit erhalten hat, welche von dem Tier zugeführt wird; Beispielsweise sind ein üblicher a-Interferonauslöser (IFN-a-Auslöser), wie z.B. Virus, Nucleinsäure und Nucleotid; gamma-lnterferonauslöser (IFF-gamma-Auslöser), wie z.B. Phytohämap,;lutinin, Concanavalin A, Mitogen aus Kermesgewächs (phytolaoca americana), Lipopolysaccharid, Endotoxin, Polysaccharid odeT Bakterien als TOLF-Auslöser verwendbar: Im allgemeinen bevorzugt man einen IFF-a-Auslöser, weil man damit TCLF eines viel höheren Reinheitsgrades induzieren kann.

Bestimmte Antigene wirken als TCLF-Auslöser auf Zellen, die man mit dem jeweiligen Antigen sensibilisiert hat.

Erfindungsgemäß wurde festgestellt, daß die Kombination von IFN-a-Auslösern und iFN-gamma-Auslösern als TCLF-Auslöser vorteilhaft eine bemerkenswerte Steigerung der induzierten TCLF-Erzeugung bewirkt.

Ferner wurde festgestellt, daß diese Kombination zu einer gleichzeitigen Erzeugung von HuIFN führt.

Es ist also anzunehmen, daß man durch Verwendung eines derartigen Auslösers sowohl eine gleichzeitige und billige Massenherstellung von zwei oder mehr biologisch aktiven Substanzen ermöglicht, wie z.B. kostbares TCLF und HuIFN,

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als auch eine viel wirksamere Verwendung der vermehrten menschlichen Zellen ermöglicht.

Das derart erhaltene TCLP kann man leicht durch Reinigungsund Abtrennungsmethoden unter Verwendung üblicher Maßnahmen sammeln, wie z.B. Einengen, Aussalzen, Dialyse, Filtrieren, Zentrifugieren und/oder Lyophilisieren. Wenn eine stärker gereinigte TCLF-Zubereitung erwünscht ist, kann man eine Zubereitung höchst möglicher Reinheit mit den genannten Methoden in Kombination mit anderen üblichen Methoden erhalten, z.B. Adsorption und Desorption an Ionenaustauschern, Gelfiltration, Elektrophorese und/oder Fraktionierung am isoelektrischen Punkt.

Wenn man anstelle der genannten Methoden eine Affinitätschromatographie unter Verwendung entweder eines Antikörpers oder eines Mltogens als einem Liganden ■ anwendet, z.B. Con A-Sepharose von Pharmacia Fine Chemicals AB, Uppsala, Schweden, kann man eine raschere und leichtere Herstellung von hochreinem TCLP erzielen.

Erfinduncsgemäß wurde festgestellt, daß das derart erhaltene TCLP im wesentlichen aus drei Glycoproteine^ mit verschiedenen Molekulargewichten von etwa 1 χ 10 bis 2 χ 10 Dalton, etwa 3,5 x 10 bis 5 ac 1(r Daltonbzw. etwa 7 x 10 bis 9 x 10 Dalton besteht, die praktisch keinerlei Zytolyse von normalen menschlichen Zellen bewirken, jedoch eine bemerkenswerte zytolyse von menschlichen Tumorzellon und ferner der Zellinie von Mäusen, L-929 bewirken; Demgemäß kann man TCLF vorteilhaft als prophylaktisches und/oder therapeutisches Mittel gegen Krankheiten verwenden, die auf TCLF ansprechen, wie z.B. maligne Tumore, deren Behandlung bisher als sehr schwierig angesehen wurde.

Den TCXF-Gehalt prüfte man entweder mit der Lymphotoxin-Prüfmethode, die von B. R. Bloom und p. R. Glade, " In Vitro Methods in Cell-Mediated Immunity¹¹, Academic Press, H und M - 3524

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Inc. (1972) berichtet wurde, oder mit der TNF-Prüfmethode, die von E. Pick, "Tumor Necrosis Factor in Lymphokines", Bd. 2, S. 235 bis 272, Academic Press, Inc. (1981) berichtet wurde, wobei man die Zellinie von Mäusen, L-929, in Gegenwart von TCIi¹ für einen bestimmten Zeitraun inkubiert und die überlebenden Zellen zählt.

Den Gehalt an HuIPN. prüfte man mit der üblichen Löcherreduktionsmethode, die in protein, Nucleic Acid and Enzyme, Bd. 20, Nr. 6, S. 616 bis 643 (1975) beschrieben ist, unter Verwendung von PL-Zellen aus menschlichom Anmion.

-Den Hämagglutinierungstiter prüfte man mit der Methode, die in. S. E. SaIk, journal of Immunology, Bd. 49, Γ-. 87 (1944) berichtet wurde, mit einer leichten Modifizierung.

Die Erfindung betrifft alno ein Verfahren zur Herstellung von Target-Zellen-Lysis-Faktor (TCLF) und seine Verwendung.

Insbesondere betrifft die Erfindung ein Verfahren :;ur Herstellung von TCLF, wobei man eine menschliche Zollinie, die TCLF erzeugen kann, einem TCLF-Auslöser aussetzt, eine TCLF-Erzeugung induziert und das erzeugte TCL¹·¹ sammelt und reinigt.

Das TCLF umfaßt Lymphotoxin und Tumornekrosefaktor () und bewirkt praktisch keinerleit Zytotoxizität gegenüber normalen menschlichen Zellen jedoch eine bemerkensv/erte Zytotoxizität gegenüber verschiedenen menschlichen Tumorzellen mit ihrer anschließenden Zytolyse.

Das erfindung3gemäße Verfahren erzeugt gleichzeitig eine beträchtliche Menge an humanspezifischem Interferon (ilulFN) zusätzlich zu den biologisch aktiven substanzen einschließlich von Lymphotoxin und TNF.

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Die menschlichen Zellinien, die man erfindungsgeraäS bevorzugt, sind menschliche Leukozyten und menschliche lymphoblastartige Zellinien, wie z.B. BALL-1-, TAIL-I-, NALI-I-, Namalva-, MOLT-3-, Mono-1-, M-7OO2-, B-7101-, JBL*, EBV-Sa-, EBV-Wa-, EBV-HO-, BALH 2-, CCRP-CEM-, DND-41- und CCRF-SB-Zellen, sowie menschliche Zellinien, die man durch Transformieren von normalen menschlichen Monozyten oder Granulozyten erhalten kann. Alle diese menschlichen Zellinien kann man vermehren, indem man sie auf ein nicht-menschliches warmblütiges Tier tran.^plantiert oder wahlweine dazu sie in einer üblichen Diffusionskammer sich vermehren läßt, durch die man die nährende Körperflüssigkeit eines nicht-menschlichen warmblütigen Tieres ihnen zuführt.

Im Vergleich zu beliebigen üblichen Methoden zur Herstellung von Lymphotoxin oder TIiP liefert die Erfindung eine große Menge von beiden biologisch aktiven Substanzen und ermöglicht eine billige Herstellung von TCLP im tochninchen Maßstab: Dadurch findet die Erfindung vielseitige Anwendung auf dem pharmazeutischen Gebiet.

Die nachstehenden Herstellungsversuche erläutern die Erzeugung von Lymphotoxin, einem Typ von TCLP·

Fähigkeit von in vitro oder in vivo vermehrten menschlichen Zellen,Lymphotoxin zu erzeugen:

Herstellungsversuch 1: ZeilVermehrung in vitro:

Eine menschliche lymphoblastartige Zellinie, BALL-1-Zellen, die aus B-Zellen stammten, transplantierte man in ein RPMI 1640-Medium (pH-Wert 7,2), das man mit 20 Volumen-^ fetalem Kälberserum ergänzt hatte, und kultivierte sie in Suspension bei 37 ⁰C. Die vermehrten menschlichen Zellen wusch man mit serumfreiem RPMI 1640-Medium H und M - 3524

(pH-Wert 7,2), suspendierte sie danach in einem frischen Medium der gleichen Zusammensetzung und erhielt eine Zelldichte von etwa 1 χ 10 Zellen/ml.

Herstellungsversuch 2: Zellvermehrung in vivo:

Nachdem man neugeborenen Hamstern Antieerum, das man aus Kaninchen auf übliche V/eise hergestellt hatte, zur Verminderung der Immunreaktionen injiziert hatte, tranapiantierte man den Tieren subkutan eine menschliche lyrnphoblastartige Zellinie, BALL-1, die aus B-Zellen stammte, und fütterte danach die Hamster auf übliche Weise drei Wochen lang. Die erhaltenen massiven Tumoren, die sich subkutan gebildet hatten, extrahierte man und zerteilte sie durch Suspendieren in einer physiologischen Kochsalzlösung mit einem Gehalt an Trypsin. Danach wusch man die "eilen mit serumfreiem RPM 1640-Medium (pH-Wert 7,2) und suspendierte sie wieder in einem frischen Medium der gleichen Zusammensetzung bis zu einer Zelldichte von etwa 1 χ 10⁶ Zellen/ml.

Herstellungsversuch 3: Herstellung von Lymphotoxln:

Die Induktion von lymphotoxin führte man in jeder ^ellsuspension der vermehrten BALL-1-Zellen, die man in den Versuchen 1 und 2 hergestellt hatte, unter Verwendung von Sendaivirus und/oder phytohämagglutinin durch, zu jeder der Zellsuspensionen gab man Sendaivirus und/oder phytohämagglutinin in einer jeweiligen Menge von etwa 300 Einheiten/ml Hämagglutierungstiter und/oder etwa 50 yug/ml, inkubierte die Mischungen bei 37 ⁰C 2 d und induzierte die TCEP-Erzeugung. Nach der Inkubation vermerkte man eine gleichzeitige starke Erzeugung sowohl von HulNF-oc und HulNF-gamma als auch von lymphotoxin in der Kultur.

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Tabelle I zeigt die Ergebnisse der Lymphotoxinerzeugung. Tabelle I:

Zellvermehrung
Lymphotoxinauslöser ν in vitro in vivo

Sendaivirus 300 (1600) 4000 (7000)

(IPN-a-Aualöser)

phytohämagglutinin 160 (20) 2200 (400) (l"FN-gamma-Auslöser)

Sendaivirus plus 900 (1700) 38000 (26000)

Phytohämagglutinin

Bemerkung: Die Werte zeigen den Lymphotoxintiter /ml; die Werte in Klammer zeigen den HuIFN-Titer /ml.

Aus den Versuchsergebnissen, die in Tabelle I gezeigt sind, ergibt sich, daß Lymphotoxin sowohl in den menschlichen Zellen erzeugt wurde, die in vitro vermehrt wurden, als auch in den menschlichen Zellen erzeugt wurde, dio in vivo vermehrt wurden. Die Kenge an Lymphotoxin, die in den letzteren induziert wurde, ist jedoch außerordentlich höher, d.h. etwa das 10-fache oder mehr, als Jene, die in den ersteren erzeugt wurde. Die Lymphotoxinerzougung unter Verwendung von Cendaivirus ist vergleichbar oder höher als jene, die man unter Verwendung von phytohämagglutinin erzielte. Die Verwendung sowohl von Sendaivirus als auch von phytohämagglutinin steigert synergistiscli die Lymphotoxinerzeugung in den menschlichen Zellen unabhängig von der Vermehrungsmethode im Vergleich zu jener unter Verwendung von Sendaivirus oder phytohämagglutinin. Die synergistische Wirkung ist wesentlich bemerkenswerter in den menschlichen Zellen, die man in vivo vermehrt hatte, als in jenen, die man in vitro vermehrt hatte.

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Daraus ergibt sich, daß die Verwendung von hochaposifischem IFN-Auslöser, insbesondere eine Kombination von IFN-cc- und IFN-gamma-Auslösern für die Induktion von nicht artspezifischem lymphotoxin vorteilhaft ist.

Die nachstehenden Herstellungsbeispiele erläutern die Herstellung von Lymphotoxin und TNP, zwei Arten von (PCLF, gemäß der Erfindung.

Herstellungsbeispiel 1:

Nachdem man Antiserum, das man aus Kaninchen auf übliche Weise gewonnen hatte, in neugeborene Hamster injiziert hatte, um ihre Immunreaktion zu vermindern, transplantierte man den Tieren subkutan eine menschliche lymphoblastartige Zellinie, BALL-1-Zellen, und fütterte sie auf übliche Weise drei Wochen lang.

Die erhaltenen massiven Tumoren, die sich subkutan gebildet hatten, von jeweils etwa 15g extrahierte man, zerkleinerte sie und zerteilte sie durch Suspendieren in einer physiologischen Kochsalzlösung mit einem Gehalt an Trypsin.

Die derart erhaltenen menschlichen Zellen wusch man mit serumfreiem RPMI 1640-Medium (pH-Wert 7_f2) und suapendierte sie wieder in einem frischen Medium der güoichen Zusammensetzung bis zu einer Zelldichte von etwa 5 x 10 Zellen/ml. Zu der Zellsuspension gab man sowohl Tendaivirus als auch phytohämagglutinin in einer Menge von 1000 Einheiten/ml Hämagglutinierungstiter bzw. etwa 200 Mg/ml zu, inkubierte die Mischung danach bei 37 ⁰C 2 d und induzierte die Lymphotoxinerzeugung.

Danach zentrifugierte man die Kultur bei 4· C und etwa H und M - 3524

1000 x 980,7 cm/s (lOOO.g) und dialysierte die überstehende Flüssigkeit gegen eine physiologische Kochsalzlösung mit einem Gehalt von 0,01 Mol/l (0,01 M) Phosphatpuffer (pH-Wert 7,2) 31 h lang. Die erhaltene lösung, die eine Lymphotoxinaktivität aufwies, filtrierte man danach unter Verwendung eines Membranfliters, engte das Filtrat ein, lyophilisierte es und erhielt ein pulveriges produkt.

Die lymphotoxinausbeute betrug etwa 5 χ 10 Einheiten

7 pro Hamster. Das Pulver enthielt ferner etwa 3»2 χ 10

Einheiten HuIFN.
Herstellungsbeispiel 2;

Eine menschliche lymphoblastartige Zellinie, BALL-1-Zellen, impfte man in ein Medium mit den minimalen Konzentrationen aller essentiellen Stoffe (pH-Wert 7,4; Eagle's minimal essential medium) ein, das man mit 20 Volumen-^ fetalem Kälberserum ergänzt hatte, und kultivierte sie darin in vitro in einer Suspension bei 37 ⁰C. Nachdem man die vermehrten menschlichen Zellen mit serumfreiem Eagle-Medium mit den minimalen Konzentrationen aller essentiellen Stoffe (pH-Wert 7,4) gewaschen hatte, suspendierte man die Zellen wieder in einem frischen Medium der gleichen Zusammensetzung bis zu einer

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Zelldichte von etwa 1 χ 10 Zellen/ml. Danach gab man zu der Zellsuspension sowohl Sendaivirus als auch Concanavalin A in einer Menge von etwa 1000 Einheiten/ml des Hamagglutinierungstiters bzw. etwa 5 /ug/ml, inkubierte die Mischung bei 38 ⁰C 1 d lang und induzierte die Lymphotoxinerzeugung.

Nachdem man die Kultur bei 4 ⁰C und etwa 1000 x 980,7 cm/s (lOOO.g) zentrifugiert hatte, dialyeierte man die

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überstehende Flüssigkeit gegen eine physiologische Kochsalzlösung mit einem Gehalt an 0,01 Mol/l (0,01 M) Phosphatpuffer (pH-Wert 7,2) 15 h lang. Die erhaltene lösung filtrierte man unter Verwenduni; eines Membranfilters und engte das Filtrat ein, das eine Lymphotoxinaktivität aufwies.

Die Eymphotoxinauabeute betrug etwa 4,5 x 10 Einheiten bezogen auf 1 1 Zellsuspension nach der Induktion. Die HulFN-Ausbeute betrug etwa 1,2 χ 10 Einheiten/1 Zellsuspension.

Herstellungsbeispiel 3:

Erwachsenen nackten Mäusen transplantierte man intraperitoneal eine menschliche lymphoblastartige Zellinie, die von B-Zellen stammte, Namalva, und fütterte die Mäuse auf übliche Weise 5 Wochen lang. Danach injizierte man den Tieren intraperitoneal mit UV-Bestrahlung vorher inaktiviertes iTewcastle-Disease-Virus in einer Iwpflösung mit etwa 3000 Einheiten des Hämagglutinierungstitera pro Tier, tötete sie 24 h nach der Injektion und gewann den Aszites.

Wie im Herstellungsbeispiel 1 reinigte man den Aßzites, engte ihn ein und erhielt ein pulver, das eine Lymphotoxinaktivität aufwies.

Die Lymphotoxinausbeute betrug etwa 9 x 10 Einheiten pro Tier. Das Pulver enthielt ferner etwa 5,2 χ 10 Einheiten von HulFN.

Herstellungsbeispiel 4:

Nachdem man erwachsene Mäuse mit Röntgenstrahlen von

H und M - 3524

etwa 400 rein beotrahlb hatte, um ihre Immunreaktionon zu vermindern, traneplantierte man den Tieren subkutan eine menschliche lymphoplastartige Zellinie, die von B-Zellen stammte, CCRF-SB-Zellen, und fütterte die Mäuse auf übliche Weise 3 Wochen lang.

Die erhaltenen massiven Tumoren, die sich subkutan gebildet hatten, von jeweils etwa 10 g extrahierte man und zerteilte sie wie in Herstellungsbeispiel 1. Die derart erhaltenen menschlichen Zellen suspendierte man in einem frischen Medium der gleichen Zusammensetzung wie in Herstellungsbeispiel 1, gab zu der Zellsuspension Sendaivirus und Concanavalin A in einer Menge von etwa 500 Einheiten/ml Hämagglutinierungstiter bzw. 0,8 ^ig/ml, inkubierte danach 1 d lang die Zellsusp'
Lymphotoxinerzeugung.

1 d lang die Zellsuspension bei 37 ⁰C und induzierte die

Wie in Herstellungsbeispiel 1 reinigte man die Kultur, engte sie ein und erhielt ein pulverartiges Produkt, das eine Lymphotoxinaktivität aufwies.

Die Lymphotoxinauebeute betrug etwa 2,4 x 10 Einheiten

pro Maus. Das Pulver enthielt ferner etwa 1,9 x 10 Einheiten von HuIFN.

Herstellunßsbeispiel 5:

Wie in Herstellungsbeispiel 1 transplantierte man neugeborenen Hamstern eine menschliche lymphoblastartige Zellinie, JBI-Zellen, und fütterte danach die Hamster auf Übliche Welse 4 Wochen lang.

Die erhaltenen massiven Tumoren, die sich subkutan gebildet hatten, jeweils etwa 20 g zerteilte man wie in Herstollungsbeispiel 1 und erhielt eine Zellsuspension mit einer Zelldichte von etwa 3 χ 10 Zellen/ml. Zu der Zellsuspenaion

H und M - 3524

gab man Sendaivirus in einer Menge von etwa 1000 Einheiten/ ml Hämagglutinierungstiter zu, inkubierte danach din Misnhung bei 36 ⁰C 2 d lang und induzierte die lymphotoxlnerzeugung.

Die Kultur reinigte man, engte sie wie in Herstellungsbeispiel 2 ein und erhielt ein Konzentrat, das eine Lyniphot oxinakt ivi t ät aufwi e s.

7 Die Iiymphotoxinausbeute betrug etwa 1,6 χ 10 Einheiten pro Hamster. Das Konzentrat enthielt ferner etwa 7 x 10° Einheiten HuIPN pro Hamster.

Herstellungsbeispiel 6:

Eine menschliche lymphoblastartige Zellinie, EBV-HO-Zellen, die von B-Zellen stammten, suspendierte man in einer physiologischen Kochsalzlösung, setzte die erhaltene Suspension danach in eine zylindrische Diffusionskammer aus Kunststoff mit einem inneren volumen von etwa 10 ml ein, die mit einem Membranfilter einer nominalen Porengröße von etwa 0,5 /um versehen war, und bettete danach intraperitoneal die Kammer in eine erwachsene Ratte ein.

Das Tier fütterte man danach auf übliche Weise 4 Woohen lang und entfernte danach die Kammer.

Die Zelldichte der vermehrten menschlichen lyraphoblastartigen Zellen in der Kammer, die man mit der beschriebenen

Methode erzielt hatte, betrug etwa 6 χ 10 Zellen/ml, was

ρ
das etwa 10 -fache oder mehr jener war, die man durch die In-vitro-Methode mit einem COp^I^vibator unter Verwendung eines Nährmediums erzielt hatte.

Die derart erhaltenen menschlichen Zellen suspendierte man wie in Herstellungsbeispiel 2, gab zu der Zellsuspension

H und M - 3524

ein vorher thermisch inaktiviertes Newcastle-Diaease-Virus und phytohämagglutinin in einer Menge von etwa 500 Rinheiten/ml Hämagglutinierungstiter bzw. etwa 100/ug/ml, inkubierte danach 2 d die Zellsuspei
zierte die Lyraphotoxinerzeugung,

blerte danach 2 d die Zellsuspension bei 37 ⁰C und indu-

Die Kultur reinigte man, engte sie wie in Herstellungsbeispiel 1 ein und erhielt ein pulverartiges Produkt, das eine Lymphotoxinaktivität aufwies.

Die Lymphotoxinausbeute betrug etwa 5,4 x 10 Einheiten pro Ratte. Das pulver enthielt ferner etwa 6,8 χ 10 Einheiten HuIFN.

Herstellungsbeispiel 7:

Eine menschliche lymphoblastartige Zellinie, BALI-1, transplantierte man in die Allantoishöhlen von Eiern mit Embryonen, die man vorher bei 37 C 5 d inkubiert hatte, und inkubierte die Eier bei dieser Temperatur eine weitere Woche lang. Die vermehrten menschlichen Zellen gewann man aus den Eiern, suspendierte sie wie in Herstellungsbeispiel 1 und erhielt eine Zelldichte von 5 x 10 Zellen/ml.

Zu der Zellsuspension gab man Sendaivirus in einer Menge von etwa 1000 Einheiten/ml Hämagglutinierungstiter zu, inkubierte bei 37 ⁰C 1 d lang und induzierte die Lymphotoxlnerzeugung. Danach reinigte man die Kultur, engte sie wie in Herstellungsbeispiel 2 ein und erhielt ein Konzentrat, das eine Lymphotoxinaktivität aufwies.

5 Die Lymphotoxinausbeute betrug etwa 9 x 10 Einheiten pro 10 Eier mit Embryonen. Das Pulverprodukt enthielt ferner

5
etwa 3,5 x 10 Einheiten HulPN pro 10 Eier mit Embryonen.

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Herstellungsbeispiel 8:

Auf gleiche Weise wie in Herstellungsbeispiel 4 beh/indelte man eine menschliche lymphoblastartige Zellinie, und zwar M0LT~3-Zellen anstelle der menschlichen lymphoblastartigen Zellinie, CCEF-SB-Zellen, und erhielt ein pulverartiges Produkt, das eine Lymphotoxinaktivität aufwies.

7 Die lymphotoxinausbeute betrug etwa 3,3 x 10 Einheiten

pro Maus. Das pulverartige Produkt enthielt ferner etwa 1,4 x 10⁷ Einheiten HuIPN.

Herstellungsbeispiel 9:

Den HulFN-Bestandteil in einem pulverartigen produkt, das man wie in Herstellungsbeispiel 1 erhalten hatte, entfernte man durch Adsorption und Desorption an einem Ionenaustauscher, Molekulargewichtsfraktionierung unter Anwendung der Gelfil-—₇tration, Einengen und Filtrieren unter Verwendung pines Membranfilters gemäß der Methode, die in G. Bodo, "Symposium on Preparation, Standardization and Clinical Uses of

Interferon" 11-th International Immunological Symposium, 8 and 9 June 1977, Zagrev, Yugoslavia, beschrieben ist, engte das· erhaltene HulFN-freie Produkt ein und reinigte es durch Aussalzen unter "Verwendung von Ammoniumeulfat. Das erhaltene produkt führte man danach einer Affinitütschromatographie unter Verwendung von phytohämaggluiinin-Sepharose in einem 0,01 M Phosphatpuffer zu (0,01 κο1/1, pH-Wert 7,4) und eluierte den adsorbierten Teil, indem man eine frische Zubereitung des gleichen Puffers aufgab, der ferner 0,1 Mol/l (0,1 M) N-Acetyl-D-galactosamin enthielt. Die eluierten Fraktionen, die eine Lymphotoxinaktivität aufwiesen, dialysierte man gegen eine frische Zubereitung des gleichen Puffers jedoch ohne N-Acetyl-D-galactosamin, engte ein, lyophilisierte und erhielt ein pulverartiges Produkt.

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1 OS-

Die spezifische Aktivität des derart erhaltenen Lyniphotoxins betrug etwa 30 000 Einheiten/mg Protein.

Eine Gelfiltration des pulverartigen Produktes bezüglich des Molekulargewichtes brachte die nachstehenden Ergebnisse: Das Produkt wurde in drei Bestandteile mit verschiedenen Molekulargewichten von etwa 7x10 bis 9x10 Dalton, etwa 3»5 x 10 bis 5 χ 10 Dalton und etwa 1 χ 10 bis 2 χ 10 Dalton mit einem Aktivitätsverhältnis von etwa 1:1:2 aufgetrennt, das jeweils den beschriebeneno(-, ß- und gamma-Lymphotoxinen hinsichtlich ihrer Molekulargewichte und anderen verfügbaren physikalisch chemischen Informationen entsprach. Alle Bestandteile waren Glycoproteine, und ihr Saccharidgehalt fiel in den Bereich von etwa 5 bis 45 ft, in Abhängigkeit von ihrem Molekulargewicht.

Herstellungsbeispiel 10:

Neugeborenen Hamstern injizierte man Antiserum, das man aus Kaninchen auf übliche Weise hergestellt hatte, verminderte ihre Immunreaktion soweit wie möglich, transplantierte ihnen danach subkutan eine menschliche Zellinie monosytischen Ursprungs, die man unter Verwendung von SV-40-Virus transformiert hatte, und fütterte die Hamster danach eine Woche lang auf übliche Weiee. Danach injizierte man den Tieren intraperitoneal lebende BCG-Zellen in einer Impflösung von 10 Zellen pro
weitere zwei Wochen lang.

7
lösung von 10 Zellen pro Tier, und fütterte die Tiere

Danach extrahierte man die erhaltenen massiven Tumoren, die sich subkutan gebildet hatten, von jeweils etwa 15 g» zerkleinerte sie und zerteilte sie durch Suspendieren in einer physiologischen Kochsalzlösung mit einem Gehalt an Trypsin. Nachdem man die menschlichen Zellen mit Eagle's Medium mit den minimalen Konzentrationen aller essentiellen stoffe (pH-Wert 7,2) gewaschen hatte, welches man

H und M - 3524

mit 5 Volumen-^* menschlichem Serum ergänzt hatte, suspendierte man die Zellen in einem frischen Medium der fleichen Zusammensetzung bis zu einer Zelldichte von etwa 5 x 10 Zellen/ml. Danach gab man zu der Zellauspen:;ion E. coli-Endotoxin in einer Menge von etwa 1o /ug/ml, inkubierte bei 37 ⁰C 16 h und induzierte die TNP-Erζeugung.

Danach zentrifugierte man die Kultur bei 4 ⁰C und etwa 1000 x 980,7 cm/s (1000-g), entfernte den Niederschlag und dialysierte die zurückbleibende überstehende Flüssigkeit gegen eine physiologische Kochsalzlösung mit einem Gehalt von 0,01 Mol/l (0,01 M) Phosphatpuffer (pn-V/crt 7,2) 21 h lang. Die erhaltene Lösung filtrierte man danach unter Verwendung eines Membranfilters, lyophilisierte das Filtrat, das eine TNF-Aktivität aufwies, und erhielt ein pulverartiges Produkt.

Den HuIPN-Bestandteil in dein pulverartif:en produkt nntfernte man durch Adsorption und Desorption mit einem Ionenaustauscher, Molekulargewichtsfraktionierimf; unter Anwendung der Gelfiltration, Einengen und Filtrieren unter Verwendung eines Membranfilters gemäß der Methode, die j_r in G. Bodo, "Symposium on Preparation, Standardization \'z}. and Clinical Use of Interferon", 11-th International Immuno- {Γ-"T logical Symposium,8 and 9 June 1977, Sagrev, Yugoslavia, i^j reinigte das erhaltene HuIFH-freie produkt durch Aussalzen f unter Verwendung von Ammoniumsulfat und durch AffinLtäts- ' Chromatographie unter Verwendung von Con A-Sepharosο von Pharmacia Fine Chemicals AB, Uppsala, Schweden, und erhielt etwa 1 χ 10 Einheiten eines hochreinen TlTP, das eine Zytolyse von Meth Α-Sarkom bewirken konnte, und das praktisch keinerlei Zytolyse von menschlichen normalen Zellen jedoch eine bemerkenswerte Zytolyse von menschlichen Tumorzellen bewirkte.

Das so erhaltene TNF enthielt keinen TNF-Auslöser, und H Vnd M - 3524

3227762

seine spezifische Aktivität betrug etwa 350 000 Einheiten/ mg Protein.

Herstellungsbeispiel 11_:

Nachdem man Antiserum, das man aus Kaninchen auf übliche Weise hergestellt hatte, neugeborenen Hamstern injiziert hatte, um ihre Immunreaktion zu vermindern, transplantiertθ man den Tieren subkutan eine menschliche lymphoblastartige Zellinie, BALL-I, und fütterte die Tiere auf übliche Weise drei Wochen lang.

Nach dem Extrahieren und Zerkleinern der erhaltenen massiven Tumoren, die sich subkutan gebildet hatten, von jeweils etwa 15g zerteilte man die erhaltenen Tumore durch suspendieren in einer physiologischen Kochsalzlösung mit einem Gehalt an Trypsin. Nachdem man die menschlichen Zellen mit serumfreien RPMI 1640-Medium (pH-Wert 7,2) gewaschen hatte, suspendierte man die menschlichen Zellen wieder in einem frischen Medium der gleichen zusammensetzung bis zu einer

Zelldichte von etwa 1 χ 10 Zellen/ml.

Zu der Zellsuspension gab man Sendaivirus und E. coli-Endotoxin in einer Menge von etwa 1000 Einheiten/ml Hämagglutinieruncstiter bzw. etwa 20 fig/ml und inkubierte danach 2 d di<
TNP-Erzeugung.

danach 2 d die Zellsuspension bei 37 ⁰C und induzierte die

Danach zentrifugierte man die Kultur bei 4 ⁰C und etwa

ρ
1000 x 980,7 cm/s (1000-g) entfernte den Niederschlag, dialysierte die erhaltene überstehende Flüssigkeit gegen eine physiologische Kochsalzlösung mit einem Gehalt an 0,01 Mol/l (0,01 M) Phosphatpuffer (pH 7,2) 21 h lang und filtrierte danach die erhaltene Lösung unter Verwendung eines Membranfilters. Danach konzentrierte man das Piltrat, das eine TNF-Aktivität aufwies, lyophilislerte es und

H und M - 3524

erhielt ein pulverartiges Produkt.

7 Die TNF-Ausbeute betrug etwa 8,3 x 10 Einheiten pro Ham-

ster. Das Produkt enthielt ferner etwa 4»1 x 10 Einheiten HuIPN.

Herstellungsbeispiel 12:

Erwachsenen nackten Mäusen transplantierte man intraperitoneal eine menschliche lymphoblastartige Zellinie, TALL-I> und fütterte die Tiere auf übliche Weise 5 Wochen lanp:. Danach injizierte man den Tieren intraperitonoal ein durch UV-Bestrahlung vorher inaktiviertes Newcastle-Disease-Virus in einer Impflösung von etwa 3000 Einheiten Hämagglutinieruni.;stiter pro Tier, tötete die Tiere 24 h nach der Injektion und gewann danach den Asiites.

Den Aszites reinigte man, engte ihn ein und trocknete ihn wie in Herstellungsbeispiel 11 und erhielt ein pulverartiges Produkt, das eine TNP-Aktivität aufwies.

Die TNF-Ausbeute betrug etwa 6,2 χ 10 Einheiten pro nackte Maus. DaB Produkt enthielt ferner etwa 4_t5 x 10 Einheiten HuIPN.

Herstellungsbeispiel 13:

Nachdem man erwachsene Mäuse mit Röntgenstrahlen von etwa 400 rem bestrahlt hatte, um ihre Immunreaktionen zu vermindern, transplantierte man den Tieren subkutan eine menschliche Zellinie, Mono-1-Zellen, und fütterte die Tiere auf übliche Weise 3 Wochen lang.

Danach extrahierte man die erhaltenen massiven Tumox-en, die sich subkutan gebildet hatten, von jeweils etwa 10 g, zerkleinerte sie und zerteilte sie wie in Herstellungs-

H und M - 3524

beiepiel 10.

Danach suspendierte man die menschlichen Zellen wieder in einem frischen Medium der gleichen zusammensetzung wie in Beispiel 10 bis zur gleichen zelldichte. Zu der Zeillsuspension gab man Concanavalin A und Sendaivirus in einer Menge von 0,8 fig/ml bzw. etwa 500 Einheiten/ml Hämagglutinierungstiter zu, inkubierte danach 1 d die erhaltene Mischung bei 37 ⁰C und induzierte die TNF-Erζeugung.

Die erhaltene Kultur reinigte man danach, engte sie ein und trocknete sie wie in Herstellungsbeispiel 11 ur:d erhielt ein pulverartiges Produkt, das eine TNT-Aktivität aufwies.

7 Die TNF-Ausbeute betrug etwa 6,8 χ 10 Einheiten pro Maus.

7 Das pulverartige Produkt enthielt ferner etwa 1,3 x 10

Einheiten von HuIFN.
Herstellungsbeispiel 14:

Neugeborenen Hamstern transplantierte man wie in Herstel-Iun£sbex3piel 10 eine menschliche lymphoblastartigo Zelllinie, Naraalva, und fütterte danach die Tiere auf übliche Weise 4 Wochen lang.

Wie in ilerstellungsbeispiel 11 extrahierte man die erhaltenen massiven Tumoren, die sich subkutan gebildet hatten, von jeweils etwa 20 g, zerkleinerte sie und zerteilte sie wie im gleichen Beispiel und erhielt eine Zellsuspension mit einer Zelldichte von etwa 3 x 10 Zellen/ml. Danach gab man zu der Zellauspension Sendaivirus in einer Menge von etwa 1000 Einheiten/ml Hämagglutierungstiter, inkubierte danach bei 36 ⁰C 2 d und induzierte die TNF-Erzeugung. Danach reinigte man die Kultur und engte sie ein wie in Herstellungsbeispiel 11 und erhielt ein Konzentrat

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- ψ- JV

das eine TNF-Aktivität aufwies.

Die TNF-Ausbeute betrug etwa 4_f3 x 10 Einheiten pro Hamster. Das Produkt enthielt ferner etwa 8,2 χ 10 Einheiten HuIFN.

Herstellungsbeispiel 15:

Nachdem man eine menschliche lymphoblastartige ZellLnie, NALL-1-Zellen, in einer physiologischen Kochsalzlösung suspendiert hatte, setzte man die Zellsuspension in eine zylindrische Diffusionskammer aus Kunststoff mit einem inneren Volumen von etwa 10 ml ein, welche mit einem Membranfilter einer nominalen Porengröße von etwa 0,5 /um versehen war, und bettete die Kammer intraperitoneal in eine erwachsene Ratte ein.

Das Tier fütterte man danach auf übliche Weise 4 Wochen lang und entfernte danach die Kammer.

Die Zelldichte in der Kammer, die man erzielte, betrug etwa 5 χ 10 Zellen/ml, was das etwa 10 -fache oder mehr jener war-, die man mit einer Gewebekulturmethode in vitro mit einem COp-lnkubator unter Verwendung eines Nährmediums erzielte.

Die vermehrten menschlichen Zellen suspendierte man wieder in einem frischen Medium der gleichen Zusammensetzung wie in Herstellungsbeispiel 10 bis zur gleichen Zelldichte, gab zu der erhaltenen Zellsuspension ein durch UV-p.estrahlung vorher inaktiviertes Newcastle-Disease-Virus und phytohämagglutinin in einer Menge von etwa 500 Einheiten/ ml Hämagglutinierungstiter bzw. etwa 100 jug/ml, Inkubierte danach 2 d die Zellsuspension bei 37 ⁰C und induzierte die TNF-Erzeugung.

H und M - 3524

si

Danach reinigte man die Kultur, konzentrierte sie und trocknete sie wie in Herstellungsbeispiel 11 und erhielt ein pulverartiges Produkt, das eine TNF-Aktlvität aufwies.

Die TNF-Ausbeute betrug etwa 2,6 χ 10 Einheiten pro Ratte. Das pulverartige Produkt enthielt ferner etwa 9_f4 x 10 Einheiten HuIPN.

Herstellungsbeispiel 16:

Eine menschliche lymphoblastartige Zellinie, JBL-Zellen, transplantierte man in die Allantoishöhlen von Eiern mit Embryonen, die man bei 37 ⁰C 5 d lang inkubiert hatte, und inkubierte die Eier weiter bei dieser Temperatur eine zusätzliche Woche lang.

Danach suspendierte man die vermehrten menschlichen Zellen in einem frischen Medium der gleichen Zusammensetzung wie in Herateilungsbeispiel 10 bis zu einer Zelldichte von 5 x 10 Zellen/ml. Zu der Zellsuspension gab man danach Sendaivirus in einer Menge von etwa 1000 Einheiten/ml Hämagglutinierungstiter, inkubierte bei 37 ⁰C 1 d lang und induzierte die TlTP-Erzeugung. Die Kultur reinigte man danach, konzentrierte sie wie in Herstellungsbeispiel 11 und erhielt ein Konzentrat, das eine TNF-Aktivität aufwies.

Die TNF-Ausbeute betrug etwa 1,5 x 10 Einheiten pro 10 Eier mit Embryonen und die verfügbaren physikalisch chemischen Eigenschaften stimmten gut mit jenen überein, die von carswell et al. berichtet wurden. Das Konzentrat ent-

5
hielt ferner etwa 4,0 x 10 Einheiten HuIFN pro 10 Eier mit Embryonen.

Das erfindungsgemäße TCLF» das man in den beschriebenen Ausführungsformen der Erfindung erhalten hat, ist vorteilhaft als prophylaktisches und/oder therapeutisches Mittel

H ujid M - 3524

gegen Krankheiten einaetzbar, die auf TCL? anaprechon, z.B· als Injektionslösung, Mittel zur internen oder externen Verabreichung, Kollyrium (Augenmittel) oder Collunariura, allein oder in Kombination mit

einem oder mehreren Mitteln.

Der Ausdruck "Krankheit, die auf TCLF anspricht" umfaßt in diesem Zusammenhang alle menschlichen Krankheiten, die man unter Verwendung von TCLP verhüten und/oder behandeln kann: Beispielsweise maligne Tumoren, wie z.B. Brustkrebs, Lungenkrebs, Gebärmutterkrebs, Blasenkrebs, Dickdarmkrebs, Magenkrebs, Leukämie, Lymphom und Hautkrebs.

Die nachstehenden Untersuchungen und Versuche erläutern die Wirksamkeit, Toxizität, die Anwendungsvorschriften und Dosierung des erfindungsgemäßen TCLP.

Untersuchung der Wirksamkeit und Toxizität von TlTF: Untersuchung 1·

Nackten BALB/C-Mäusen transplantierte man subkutan in den Rückenbereich kleine Bruchstücke eines menschlichen Brustkrebsgewebe s.

Nachdem die erhaltenen massiven Tumoren auf etwa 2(X) mm angewachsen waren, injizierte man gleiche Mengen der TFF-Zubereitung von Herstellungsbeispiel 10 intravenös jeden Tag in einer Dosierung von entweder 100 Einheiten/kr;/d oder 1000 Einheiten/kg/d. 15 d nach der ersten Injektion tötete man die Tiere und wog die erhaltenen massiven Tumoren. Die Ergebnisse sind in Tabelle II gezeigt. Eine TFF-freie physiologische Kochsalzlösung injizierte man intravenös als Vergleich.

H «nd M - 3524

3227262	Dosierung/d	Naßgewicht	des massi-
Tabelle II:		ven Tumors	(g)
Behandlung		11,0 + 1	,4
	100 Einheiten/kg	7,5 ± 0	,8
Vergleich	1000 Einheiten/kg	7,1 + 0	,4*
TNF
TNF

Bemerkung: * Der Wert ist statistisch signifikant bezogen auf den Vergleich mit einer Signifikanz von 5 $>,

Untersuchung 2:

Gruppen von je 10 männlichen BDF^-Mäusen pro Gruppe mit einem Gewicht von etwa 25 g pro Maus transplantierte man subkutan in den Rückenbereich Gewebestückchen von Lewis ¹B-Lungenkrebs von 2 mm im Quadrat. Nach einem Zeitraum von 8 d nach der Transplantation injizierte man den Tieren jeden Tag das TNF von Herstellungsbeispiel 10 in einer Dosierung von entweder 100 Einheiten/kg/d oder 1000 Einheiten/kg/d. 21 d nach der ersten Injektion tötete man die Tiere und wog die erhaltenen massiven Tumoren. Die firgebnisse sind in Tabelle III gezeigt. Eine TNF-freie physiologische Kochsalzlösung injizierte man intravenös ale Vergleich.

Tabelle III:

Behandlung ' Dosis/d Naßgewicht den __________ _«_-____». massiven Tumors (g)

Vergleich 7,5 + 0,5

TITF 100 Einheiten/kg 6,7 + 0,8

TNF 1000 Einheiten/kg 4,5 + 0,4 *

Bermerlcung: * Der Wert ist statistisch signifikant bezogen auf den Vergleich mit einer Signifikanz von 5 56· H and M 3524

32272S2

Untersuchung 3:

Eine Prüfung der akuten Toxizität der TU⁷F-ZUbQreitung von Herstellungsbeispiel 10 unter Verwendung von _2o-d-alten Mäusen bestätigte _f daß die Toxizität der T!T?-3ubereitung außerordentlich gering ist, d.h. einen LDt_n-V*ert vcn 200 000 Einheiten/kg oder mehr nach intraperitonealer Injektion aufweist.

Die nachstehenden Versuche erläutern die Wirksamkeit, Toxizität, Anwendungsvorschriften und Dosierung von Lyr.photoxin, einem Typ von TCLF.

Versuch 1:

Nackten BALB/C-Mäusen transplantierte man subkutan in den Rückenbereich kleine Bruchstücke eines menschlicher Brustkrebsgewebes.

Nachdem die erhaltenen massiven Tumoren auf etwa 2Γ0 mm herangewachsen waren, injizierte man gleiche Mender einer Lymphotoxiniaischung, die Lymphotoxinproben mit eines Molekulargewicht von 7 x 10 bis 9 x 10 Dalton, 3,^ς x 1O^4- bis 5 x 10⁴ Dalton bzw. 1 χ 10^ bis 2 χ 1O^4- Daaton enthielten, und die man wie in Herstellungsbeispiel 9 erhalten hatte, intravenös zweimal pro Tag in einer Dosierung von entweder 4· Einheiten/kg/d oder 40 Einheit c-n/kg/d. 15 d nach der ersten Injektion tötete man die Tiere und wog die erhaltenen massiven Tumoren. Die Ergebnisse sind in Tabelle IV gezeigt. Eine lymphotoxinfreie physiologische Kochsalzlösung injizierte man intravenös als Vergleich.

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-if

Tabelle IY:

Behandlung Dosis/d Naßgewicht des

massiven Tumors

Vergleich 10,8 + 1,2

Lymphotoxinmischung 4 Einheiten/kg 7,9 + 0,7 Lymphotoxinmischung 40 Einheiten/kg 7,4 + 0,5*

Bemerkung: * Der Wert ist statistisch signifikant bezogen auf den Vergleich mit einer Signifikanz von 5 #.

Versuch 2:

Gruppen von je 10 männlichen BDF^-Mäusen pro Gruppe mit einem Gewicht von etwa 25 g pro Maus transplantierto man subkutan in den Rückenbereich Gewebestücke von Lewis«s-Lungenkreba von 2 mm im Quadrat. Nach einem Zeitraum von 8 d nach der Transplantation injizierte man den Tieren intravenös zweimal jeden Tag entweder eine Lymphotoxinmischung oder eine gamina-Lymphotoxinzubereitung mit einem

4. 4. Molekulargewicht von 1 χ 10 bis 2 χ 10 Dalton, die man beide in Herstellungsbeispiel 9 erhalten hatte, in einer Dosis von entweder 4 Einheiten/kg/d oder 40 Einheiten/kg/d. 21 d nach der ersten Injektion tötete man die Tiere und wog die erhaltenen massiven Tumoren. Die Ergebnisse sind in Tabelle V gezeigt. Eine lymphotoxinfreie physiologische Kochsalzlösung injizierte man intra venös als Vergleich.

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Tabelle V:

Behandlung

Dosis/d

Naßgewicht dos massiven Tumors (g)

Vergleich	4	Einheiten/kg	7,3 + 0,3
lymphotoxinmischung	40	Einheiten/kg	6,6 + 0,7
Lymphotoxinmischung	4	Einheiten/kg	4,7 + 0,<5 *
gamma-Lymphotoxin A λ			6,1 + Ο,ίί
(1x10V bis 2x10^
DaIton)	40	Einheiten/kg
gamma-lymphot oxin		4,2 + 0,4 *

(1x1O⁴ bis 2x1O⁴
DaIton)

Bemerkung: * Der Wert ist statistisch signifikant bezogen auf den Vergleich mit einer Signifikanz von 5 $.

Versuch 3:

Gruppen von 20 männlichen BDP^-Mäusen pro Gruppe mit einem Gewicht von etwa 25 g pro Haus transplantierte man nubkutan eine Leukämiezellinie von Mäusen, L-1210, in den Rückenbereich. Ab dem folgenden Tag nach der Transplantation injizierte man den Tieren intravenös einmal oder zwoimal jeden Tag eine Dosis von entweder 30 Einheiten/kg/d oder 300 Einheiten/kg/d und bestimmte den Zeitraum, den man für eine 50 #-ige Überlebensrate benötigte.

Entweder eine lymphotoxinfreie physiologische Kochsalzlösung oder Mitomycin C in einer Dosierung von 0,5 mg/kg/d injizierte man intravenös als Vergleich. Die Ergebnisse sind in Tabelle VI gezeigt.

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3227262	Behandlung	■"	zweimal/d
	Kochsalzlösung Mitomycin C , (0,5 mg/kg/d) ' 30 Einheiten/		9 d 9 d 15 d
Tabelle VI:	300 Einheiten/ .. kff/d		16 d
	einmal/d
Vergleich	9 d 9 d 9 d
Iymphotoxin- - mischung	12 d

Die Versuchsergebnisse von Tabelle VI bestätigen, daß man trotz der relativ kleinen Dosis der lymphotoxinmischung eine viel wirksamere Behandlung durch Steigerung der Frequenz der täglichen Dosis von 1 auf 2 erwarten kann.

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Versuch 4t

Gruppen von 20 männlichen BDF--Mäusen pro Gruppe mit einem Gewicht von etwa 25 g pro Maus transplantierte man eine Zelllinie, P 388, die aus Mäuseleukämie stammte. Ab dem folgenden Tag nach der Transplantation Injizierte man den Tieren jeden Tag die Lymphotoxinmischung 30 d lang und bestimmte das Verhältnis zwischen der Dosis und den Überlebenstagen oder das Überlebensverhältnis (%).

Tabelle VII

Vergleich

Lymphotoxinmischung

Behandlung

Kochsalzlösung

Uberlebenstage

1 6 15 30 80 100% 0% 0% 0% 0%

Mitomycin C (0,5 mg/kg/d)

0%

0% 0%

100% 35%

300 Einheiten/kg/d 100% 40% 0%

1000 Einheiten/kg/d 100% 45% 45% 30% 30%

3000 Einheiten/kg/d 100% 70% 65% 65% 65%

L 10000 Einheiten/kg/d 100% 100% 85% 85% 85%

H und M-3524

-37-

Entweder eine lymphotoxinfreie physiologische Kochsalzlösung oder Mitomycin C in einer Dosis von 0,5 mg/kg/d injizierte man intravenös als Vergleich.

Die Ergebnisse sind in Tabelle VZI gezeigt.

Wie sich aus den Versuchsergebnissen in Tabelle VII ergibt, ist die Verabreichung in einer großen Dosis, d.h. 1000 Einheiten/kg/d oder mehr viel wirksamer, wenn man die Lymphotoxinmischung als prophylaktisches oder therapeutisches Mittel verwendet.

Versuch 5: Akute Toxizitätj

Eine Prüfung auf akute Toxizität, wobei man einer Gruppe von 20-d-alten Mäusen eine Lymphotoxinmischung von Herstellungsbeispiel 9 verabreichte, bestätigte, daß die Toxizität der Lymphotoxlnmischung extrem gering ist, d.h. einen LD_5Q-Wert von 10000 Einheiten/kg oder mehr nach intraperitonealer Injektion aufweist.

Dio Konzentration der Lymphotoxinmischung, die man für eine 50 %ige Hemmung der ZeilVermehrung in vitro benötigt, bestimmte man unter Verwendung entweder von normalen menschlichen Zellen oder menschlichen Tumorzellen auf übliche Weise und erhielt die nachstehenden Ergebnisse: Bei den normalen menschlichen Zellen, z.B. menschlichen Darmzellen (407-Linie)menschlichen Chang-Leberzellen und Girardi-Herzzellen war die Konzentration extrem hoch, d.h. 20000 Einheiten/ml oder mehr,während bei menschlichen Tumorzellen, z.B. KB-Zollen aus dem Nasen-Rachen-Raum, HEp-2-Zellen aus dem menschlichen Kehlkopf, HEL-Zellen aus Lungenkrebs, -war--

dio Konzentration außerordentlich gering, d.h. 18 Einheiten/ml, 24 Einheiten/ml bzw. 33 Einheiten/ml.

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Vie sich aus dem beschriebenen Versuch ergibt, ist das erfindungsgemäße TCLF sehr sicher und wirksam aus der Sicht, daß eine hohe Dosis normale Zellen praktisch nicht angreift, während eine geringe Dosis bemerkenswert Tumorzellen angreift: Demgemäß ist es zur Behandlung von veschiedenen Krrnkheiten vorteilhaft verwendbar, die auf TCLF ansprechen.

Vor der Verabreichung des TCLFs an einen Patienten, der an einem malignen Tumor leidet, kann man es ggf. in vitro mit einem Bruchstück des Tumorgewebes behandeln, das man dem Patienten entnommen hat, um die Eigenschaft dos ¹KLRj zu erhöhen, als Immunogen zu wirken, und es dem Patienten verabreichen, um eine weitere wirksame Behandlung des malignen Tumors durchzuführen.

Dio Dosis des erfindungsgemäßen TCLFs liegt im allgemeinen im Bereich von 5 bis 50 000 000 Einheiten/d für einen Erwachsenen: insbesondere bei lokaler Verabreichung, z.B. in Form von Kollyrium oder lokaler Injektion 5 bis 1 000 000 Einheiten/d; bei Verabreichung durch die Haut oder durch die Schleimhaut (perkutan oder permukos), z.B. in Form von Salbe oder Suppositorium, 10 bis 5 000 000 Einheiten/d; bei systemischer bzw. innertherapeutischer Verabreichung, z.B. intravenöser oder intramuskulärer Injektion, 50 bis 10 000 000 Einheiten/d; und bei oraler Verabreichung, 500 bis 50 000 000 Einheiten/d; die Dosis ist jedoch in Abhängigkeit von ihren Anwendungsvorschriften und den Symptomen des Patienten frei variierbar.

Obwohl man das TCLF ggf. in ein Medikament auf übliche Weise nach dem Vermischen mit einem üblichen Trägerstoff, Grundstoff und/oder Arzneimittelträger einarbeiten kann, sollte der TCLF-Gehalt des Medikamentes mindestens 5 Einheiten/g vom Gesichtspunkt seiner Toxizität, wirksamen Dosis und Stabilität her betragen.

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Die Gestalt und Form des Medikamentes gegen malignen Tumor kann man beliebig auswählen, sofern es für den gewünschten Zweck geeignet ist: · Beispielsweise kann man es zur oralen Verabreichung zu bestimmten Zubereitungen für Anwendungen durch den Darm formen, z.B. zu Kapseln, Tabletten oder Pulver; für die rektale Verabreichung zu Suppositorien; für die Injektion kann man es beispielsweise zu einer lyophilisierten Injektionslösung verarbeiten, die man vor der Anwendung zu einer Injektionslösung mit destilliertem Walser löst; ferner kann es die Form von Collunarium, Kollyrium oder Salbe aufweisen.

Die nachstehenden Zubereitungsbeispiele erläutern die Mittel, die TCLF enthalten.

Zubereitungsbeispiel 1: Injektionslösung:

Eine Lymphotoxinlösung, die man durch Auflösen von 20 000 Einheiten einer Lymphotoxinmischung von Herstellungsbeispiel 9 in 200 ml physiologischer Kochsalzlösung hergestellt hatte, filtrierte man unter sterilen Bedingungen unter Verwendung eines Membranfilters. Gleiche Teile des Filtrates von 2 ml verteilte man in sterilisierte Glasampullen, lyophilisierte sie, verpackte sie darin und erhielt die Injektionslösung.

Dio Injektionslösung ist zur Behandlung von Brustkrebs, Lungenkrebs, Leberkrebs und Leukämie vorteilhaft verwendbar.

Zubereitungsbeispiel 2: Salbe:

Eine Lymphotoxinmischung von Herstellungsbeispiel 3 vermischte man mit einer minimalen Menge an flüssigem Paraffin, vermischte die Mischung ferner auf übliche Weise mit Vaselin und erhielt eine Salbe mit einem Lymphotoxingehalt von H und Μ-352Ί -40-

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50 Einheiten/g.

Die Salbe ist zur Behandlung von Hautkrebs, Brustkrebs oder Lymphom vorteilhaft verwendbar.

Zubereitungsbeispiel 3: Kollyrium:

Zu einer Mischung mit einem Gehalt an 800 ml destilliertem Wasser, 5 ml ß-Phenylethylalkohol und 40 000 Einheiten einer Lymphotoxinmischung von Ilerstellungsbeispiel 6 mischte mnn Natriumchlorid in einer zusätzlichen Menge an dostllliertem Wanser zu und erhielt 1000 ml einer isotonischen Lösung.

Die erhaltene Lösung ist als Kollyrium zur Behandlung von Retinoblastom vorteilhaft verwendbar.

Zubereitungsbeispiel 4: Überzogene Darmtablette:

Eine überzogene Darmtablette stellte man auf übliche Weise her, indem man eine Mischung tablettierte, die aus Stärke, Maltose und einer Lymphotoxinzubereitung mit einem Molekulargewicht von 1 χ 10" bis 2 χ 10 Dalton von Herstellungsbeispiel 9 bestand, einen Lymphotoxingehalt von 2000 Einheiten/Tablette (100 mg) erzielte, danach die Tablette mit dem Phthalsäureester von Methylcellulose überzog und eine überzogene Darmtablette erhielt.

Die Tablette ist zur Behandlung von Dickdarmkrebs und Leberkrebs vorteilhaft verwendbar.

Zubereitungsbeispiel 5: Injektionslösung:

Eine TNF-Lösung, die man durch Auflösen von 500 000 Einheiten einer TNF-Zubereitung von Herstellungsbeispiel 10 in 200 ml physiologischer Kochsalzlösung hergestellt hatte, filtrierte man unter sterilen Bedingungen unter Verwendung H und M-3524 -41-

eines Membranfilters. Gleiche Teile des Filtrates von je 2 ml verteilte man in sterilisierte Glasampullen, lyophili sicrte sie und verpackte sie darin und erhielt die Injektionslösung.

Die Injektionslösung 1st zur Behandlung von Brustkrebs, Lungenkrebs, Leberkrebs und Leukämie vorteilhaft verwendbar.

Zubereitungsbeispiel 6: Salbe:

Zu einer TNF-Zubereitung von Herstellungsbeispiel 11 mischte man eine minimale Menge an flüssigem Paraffin zu, mischte zu der Mischung ferner Vaselin zu und erhielt eine Salbe mit einem TNF-Gehalt von 20 000 Einheiten/g auf übliche Weise.

Salbe ist zur Behandlung von Hautkrebs, Brustkrebs und Lyniphom war teilhaft verwendbar.

Zubereitungsbeispiel 7: Kollyrium:

Zu einer Mischung aus 800 ml destillfe rtem Wasser, 5 ml ß-Phenylethylalkohol und 20 000 000 Einheiten einer TNF-Zubereitung von Herstellungsbeispiel 14 mischte man eine zusätzliche Menge von destilliertem Wasser mit Natriumchlorid zu und erhielt 1000 ml einor isotonischen Lösung.

Dio Lösung ist als Kollyrium zur Behandlung von Retinoblastom vorteilhaft verwendbar.

Zubereitungsbeispiel 8: Überzogene Darmtablette:

Eine überzogene Darmtablette stellte man auf übliche Weise her, indem man eine Mischung tablettierte, die aus Stärke, H und M-3524 -42-

Maltose und einer TNF-Zubereitung von Herstellungsbeispiel 12 bestand, erzielte einen TNF-Gehalt von 200 000 Einheiten/ Tablette (100 mg), überzog die Tablette mit dem Phthalsäureester von Methylcellulose und erhielt eine überzogene Darmtablette.

Die Tablette ist zur Behandlung von Dickdarmkrebs und Leberkrebs vorteilhaft verwendbar.

Die Offenbarung umfaßt auch den korrespondierenden englischen Text.

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Claims

Patentansprüche

1. Verfahren zur Herstellung von Target-Zellen-Lysie-Faktor (TCLF), das dadurch gekennzeichnet ist, daß man

a) eine menschliche Zellinie, die TCLF erzeugen kann, einem TCLF-Auslöser aussetzt und eine TCLF-Erzeugung induziert; und

b) das erzeugte TCLF sammelt und reinigt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , daß man

a) eine menschliche Zellinie vermehrt, die TCLF erzeugen kann, indem man die Zellinie auf ein nichtmenschliches warmblütiges Tier transplantiert oder wahlweise dazu die Zellinie sich mit einer Vorrichtung vermehren läßt, durch die man die nährende Körperflüssigkeit eines nichtmenschlichen warmblütigen Tieres der Zellinie zuführt;

b) die menschlichen Zellen, die man mit einer der genannten Vermehrungsmethoden vermehrt hat, einem TCLF-Auslöser aussetzt und eine TCLF-Erzeugung induziert; und

c) das erzeugte TCLF sammelt und reinigt.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet , daß man eine oder mehrere Zellinien aus der aus BALL-I-, Namalva-, CCRF-SB-, EBV-, TALL-I-, MOLT-3-, NALL-I-, Mono-1-, JBL-, EBV-HO-Zellen und etablierten Zellinien moneytischen Ursprungs bestehenden Gruppe als menschliche Zellinie verwendet.

4· Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet , daß man einen oder mehrere IFN-d - und/oder IFN-}f-Auslöser als TCLF-Auslöser verwendet.

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5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Virus als IFN-ed -Auslöser und Phytohämagglutinin oder Concanavalin A als IFN- f-Auslöser verwendet.

6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet , daß man TCLF und HuIFN gleichzeitig erzeugt.

7. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet , daß man ein TCIF er« zeugt, das aus einem oder mehreren Glycoproteinen mit

4 einem Molekulargewicht im Bereich von 1 χ 10 bis 1 χ 10 Dalton und einem Saccharidgehalt im Bereich von 5 bis 45 % besteht.

8. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet , daß man ein TCLF erzeugt, das mindestens eine Gruppe von Glycoproteinen mit

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einem Molekulargewicht von etwa 1 χ 10 bis 2 χ 10

Dalton, 3,5 χ 10 bis 5 χ 10 Dalton und/oder 10 χ 10 bis 9 χ 10⁴ Dalton enthält.

9. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet , daß man ein TCLF herstellt, das Lymphotoxin und/oder TNF enthält.

10. Therapeutisches Mittel gegen maligne Tumoren, gekennzeichnet durch einen Gehalt an TCLF neben üblichen Hilfs- und Trägerstoffen.

11. Therapeutisches Mittel nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet , daß das TCLF aus einem oder mehreren Glykoproteinen mit einem Molekulargewicht im Bereich von 1 χ 10 bis 1 χ 10 Dalton und einem Saccharidgehalt im Bereich von 5 bis 45 % besteht.

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12. Therapeutisches Mittel nach Anspruch 10, dadurch g β kennze i chnet , daß das TCLF mindestens eine Gruppe von Glycoproteinen mit einem Molekulargewicht von etwa 1 χ 10⁴ bis 2 χ ΙΟ⁴ Dalton, etwa 3,5 χ ΙΟ⁴ Dalton bis 5 χ 10 Dalton und/oder etwa 7 χ 10⁴ bis 9 χ ΙΟ⁴ Dalton enthält.

13. Therapeutisches Mittel nach einem der vorhergehenden Ansprüche, gekennzeichnet durch einen TCLF-Gehalt von mindestens 5 Einheiten/g.

14. Therapeutisches Mittel nach einem der vorhergehenden Ansprüche , gekennzeichnet durch einen Gehalt an TCLF und ferner HuIFN.

15. Therapeutisches Mittel nach einem der vorhergehenden Ansprüche, gekennzeichnet durch ein TCLF, das in einer menschlichen Zellinie hergestellt wurde.

16. Therapeutisches Mittel nach einem der vorhergehenden Ansprüche, gekennzeichnet durch ein TCLF, das erhältlich ist, indem man --

a) eine menschliche Zellinie vermehrt, die TCLF erzeugen kann, indem man die Zellinie auf ein nichtmenschliches warmblütiges Tier transplantiert oder wahlweise dazu eine menschliche Zellinie sich in einer Vorrichtung vermehren läßt, durch die man die nährende Körperflüssigkeit eines nichtmenschlichen warmblütigen Tieres der Zellinie zuführt;

b) die menschlichen Zellen, die man mit einer der beschriebenen Vermehrungsmethoden vermehrt hat, einem TCLF-Auslöser aussetzt und die TCLF-Erzeugung induziert; und

c) das erzeugte TCLF sammelt und reinigt.

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17. Mittel . nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet , daß das TCLF Lymphotoxin und/oder TNF enthält.

18. Verfahren zur Herstellung eines therapeutischen Mittels gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche gegen maligne Tumoren, dadurch gekennzeichnet , daß man das Mittel mit oder unter Zugabe von TCLF mit einem

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Molekulargewicht im Bereich von 1 χ 10 bis 1 χ 10 Dalton und einem Saccharidgehalt im Bereich von 5 bis 45 % herstellt.

19. Verfahren nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet , daß man das Mittel mit oder unter Zugabe von TCLF bis zu einem TCLF-Gehalt von mindestens 5 Einheiten/g herstellt.

20. Verfahren nach Anspruch 18 oder 19, dadurch gekennzeichnet , daß man ein TCLF verwendet, das man erhält, indem man eine menschliche Zellinie einem TCLF-Auslöser aussetzt, eine TCLF-Erzeugung induziert und , das erzeugte TCLF sammelt und reinigt.

21. Mittel zur Behandlung von Krankheiten, die auf TCLF ansprechen, gekennzeic hnet durch eine wirksame Dosis von TCLF gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche neben üblichen Hilfs- und Trägerstoffen.

22. Mittel nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, daß das TCLF aus einem oder mehreren Glycoproteinen mit einem Molakulargewicht im Bereich von etwa

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1 x 10 bis 1 χ 10 Dalton und einem Saccharidgehalt im Bereich von etwa 5 bis 45 % besteht.

23. Mittel nach Anspruch 21 oder 22, dadurch g β k β η η H und M-3524 -5-

zeichnet , daß das TCLF mindestens eine Gruppe von Glycoproteinen mit einem Molekulargewicht von

1 χ 10⁴ bis 2 χ 10⁴ Dalton, etwa 3,5 χ 10⁴ bis 5 χ 10⁴DaIton

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und /oder etwa 7 χ 10 bis 9 χ 10 Dalton bestehenden Gruppe enthält.

24. Mittel nach einem der Ansprüche 21 bis 23, dadurch gekennzeichnet , daß das TCLF Lymphotoxin und/oder TNF enthält.

25. Mittel nach einem der Ansprüche 21 bis 24, dadurch gekennzeichnet , daß die Krankheit, die auf TCLF anspricht, ein maligner Tumor ist.

26. Mittel nach einem der Ansprüche 21 bis 25, dadurch g β kennzeichnet, daß es ein Mittel zur Verabreichung von TCLF durch

lokale, intravenöse oder intramuskuläre Injektion, oral, perkutan, permukos und/oder in Form von Kollyrium, Collunarium oder Salbe ist.

27. Mittel nach einem der Ansprüche 21 bis 26, dadurch gekennzeichnet , daß die wirksame Dosis des TCLFs im Bereich von 5 bis 50 000 000 Einheiten/d liegt.

28. Mittel nach einem der Ansprüche 21 bis 27, dadurch gekennzeichnet , daß die Wirksame Dosis des TCLFs bei lokaler Verabreichung 5 bis 1 000 000 Einheiten, bei perkutaner oder permukoser Verabreichung 10 bis 5 000 000 Einheiten, bei intravenöser oder intramuskulärer Verabreichung 50 bis 10 000 000 Einheiten, bei oraler Verabreichung 500 bis 50 000 000 Einheiten und bei Verabreichung in Form von Kollyrium 5 bis 1 000 Einheiten beträgt.

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