Das Patent betrifft die im Anspruch 1 und 2, angegebenen
Verfahren zur Herstellung von Target-Zellen-Lysis-Faktor.
Anspruch 3 nennt den nach Anspruch 1 bzw. Anspruch 2 erhaltenen
Target-Zellen-Lysis-Faktor. Target-Zellen-Lysis-Faktor bzw. Ziel-Zellen-Lysis-Faktor
(nachstehend als "TZLF" bezeichnet) ist in diesem Zusammenhang
als ein Faktor definiert, der
zytotoxisch auf eine fibroblastartige Zellinie von Mäusen,
L-929, als Targetzellen bzw. Zielzellen wirkt und ihre an
schließende Zytolyse bewirkt; bisher sind zwei Arten von
TZLF bekannt, nämlich Lymphotoxin und Tumornekrose-Faktor
(der nachstehend als "TNF" bezeichnet wird).
Die guten Aussichten von TZLF als therapeutisches Mittel
gegen maligne Tumoren sind mit einer großen Erwartung auf
grund seiner Zytolysefunktion in Tumorzellen verbunden.
Obwohl TZLF praktisch nicht artspezifisch ist, und daher die
Möglichkeit der Verwendung von TZLF nicht menschlichen Ur
sprungs, z. B. aus Kaninchen oder Ratten, bei der Behandlung
von menschlichen Krankheiten naheliegt, ist die Verwendung
von TZLF aus lebensfähigen menschlichen Zellen erwünscht und
sehr sicher, weil es weniger antigene Eigenschaften und
andere Nebenwirkungen hervorbringt, wenn man es in einer
derartigen Behandlung verwendet.
Wie von Ryuichi Aoki et al., Shin-Menekigaku Sosho, Bd. 6,
"Lymphokines", Igaku Shoin Ltd., Tokyo, Japan (1979), und
B. R. Bloom und P. R. Glade, "In Vitro Methods in Cell-
Mediated Immunity", Academic Press, Inc. (1971), beschrieben
wurde, bezeichnet man mit dem Ausdruck "Lymphotoxin" eine
proteinartige Substanz, die Zytotoxizität bewirken kann, und
die man intra- und/oder extrazellulär induzieren kann,
beispielsweise indem man entweder sensibilisierte T-Zellen
einem Antigen aussetzt oder nicht-sensibilisierte T-Zellen
einem Lymphotoxinauslöser aussetzt, beispielsweise einem
Mitogen, wie z. B. Phytohämagglutinin oder Concanavalin A.
Es ist gut belegt, daß Lymphotoxin eine Zytotoxizität so
wohl auf Tumorzellen als auch auf normale Zellen ausübt.
Ferner wurde in Cellular Immunology 38, 388-402 (1978) eine
Untersuchung von Lymphotoxin beschrieben, das aus drei Glyco
proteinen mit verschiedenen Molekulargewichten von etwa 1×10⁴
bis 2×10⁴ Dalton, 3,5×10⁴ bis 5×10⁴ Dalton bzw.
7×10⁴ bis 9×10⁴ Dalton bestand, und das man gemäß der
im J. Immunology, Vol 113 (1974), 1334-1345 beschriebenen
Methode durch Einwirkung eines Lymphotoxinauslösers, nämlich
Phytohämagglutinin, auf die etablierten normalen menschlichen
lymphoiden Zellinien M-7002 erhalten hatte. Gemäß
dieser Methode wurde das Lymphotoxin durch Zentrifugieren,
Filtrieren durch Hohlfaser-, Glasfaser- und/oder Membranfil
ter, durch Lyophilisieren, Dialyse, Adsorption und Desorption
an Ionenaustauschern, Gelfiltration, Gelelektrophorese und
Aussalzen unter Verwendung von Ammoniumsulfat abgetrennt,
gereinigt und in drei Gruppen mit verschiedenem Molekular
gewichtsbereich aufgetrennt.
Wie von E. A. Carswell et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
Bd. 72, Nr. 9, S. 3666 bis 3670 (1975), und E. Pick, "Tumor
Necrosis Factor in Lymphokines", Bd. 2, S. 235 bis 272
(1981), Academic Press, Inc., beschrieben wurde, bezeichnet
der Ausdruck "TNF" eine proteinartige Substanz, die man
beispielsweise in Macrophagen induzieren kann, indem man
parenteral an Kaninchen einen TNF-Auslöser verarbreicht, wie
z. B. Bacille de Calmette-Guerin (BCG), Corynebacterium
parvum oder Endotoxin; und diese proteinartige Substanz kann
eine hämorrhagische Nekrose von Meth A-Sarkom bewirken. Es
ist ferner gut belegt, daß TNF praktisch keinerlei Zytolyse
von normalen menschlichen Zellen bewirkt, aber eine bemerkenswerte
Zytolyse sowohl der Targetzellinie von Mäusen,
L-929, als auch von menschlichen Tumorzellen bewirkt.
Ferner ist in der US-PS 4 276 282 (Sugimito et al.) eine
verbesserte Methode zur Herstellung von humanspezifischem
Interferon (nachstehend als "HuIFN" bezeichnet) beschrieben,
das eine Hemmungswirkung auf Virusinfektionen aufweist. Bei
dieser bekannten Methode kann man unter Verwendung eines
nicht-menschlichen warmblütigen Tieres als Wirt bestimmte
menschliche Zellinien leicht vermehren,
während man die nährende Körperflüssigkeit ausnützt, die
von dem nicht-menschlichen warmblütigen Tier zugeführt wird,
indem man die menschlichen Zellinien auf das nicht-menschli
che warmblütige Tier transplantiert oder wahlweise dazu
sie in eine übliche Diffusionskammer einsetzt, die derart
ausgebildet ist, da sie die Körperflüssigkeit aufnimmt,
und die Kammer in das Tier einsetzt bzw. an dem Tier an
bringt; und indem man das Tier auf übliche Weise füttert.
Das nicht-menschliche warmblütige Tier, das man
verwenden kann, ist ein Tier, worin man die Zellinie
vermehren kann: Beispielsweise Geflügel, wie z. B. Huhn oder
Taube; oder Säugetier, wie z. B. Hund, Katze, Affe, Ziege,
Schwein, Pferd, Kuh, Meerschweinchen, Ratte, nackte Ratte,
Hamster, Maus, nackte Maus oder Kaninchen.
Diese US-PS lehrt jedoch keinerlei Möglichkeit der Verwendung
eines nicht-menschlichen warmblütigen Tieres zur Herstellung
von TZLF.
Es ist Aufgabe der Erfindung, ein leicht durchführbares
Verfahren zur Herstellung von TZLF im technischen
Maßstab sowie TZLF vorzusehen.
Die Erfindung betrifft gemäß einer Ausführungsform ein Verfahren
zur Herstellung von Target-Zellen-Lysis-Faktor, bestehend
aus einer Gruppe von Glycoproteinen mit einem Molekulargewicht
von 1×10⁴ bis 2×10⁴ Dalton, 3,5×10⁴ bis 5×10⁴ Dalton
und 7×10⁴ bis 9×10⁴ Dalton, die praktisch keinerlei Zyto
lyse von normalen menschlichen Zellen bewirkt, jedoch eine
bemerkenswerte Zytolyse von menschlichen Tumorzellen, indem
man Zellen einem Target-Zellen-Lysis-Faktor-Auslöser aussetzt,
damit eine Target-Zellen-Lysis-Faktor-Erzeugung induziert und
den Target-Zellen-Lysis-Faktor durch Abtrennungs- und Reini
gungsmethoden unter Verwendung üblicher Maßnahmen sammelt, das
dadurch gekennzeichnet ist, daß man als Zellen Namalva-Zellen,
BALL-1-, TALL-1- oder NALL-1-Zellen, JBL-, EBV-Sa-, EBV-Wa-,
MOLT-3- oder EBV-HO-Zellen oder CCRF-SB-Zellen (=ATCC CCL
120), CCRF-CEM-Zellen oder Balm-2-Zellen,
einsetzt.
Die Erfindung betrifft gemäß einer weiteren Ausführungsform
ein Verfahren zur Herstellung von Target-Zellen-Lysis-Faktor,
das dadurch gekennzeichnet ist, daß man
- (a) eine oder mehrere Zellinien aus der aus BALL-1-,
Namalva-, M-7002-, B-7101-, JBL-, EBV-Sa-, CCRF-SB- (=ATCC CCL
120), EBV-Wa-, TALL-1-, MOLT-3-, Nall-1- und EBV-HO-Zellen,
CCRF-CEM-Zellen und Balm-2-Zellen,
und anderen etablierten Zellinien, die man durch Transfor
mieren von normalen Monozyten oder Granulozyten unter
Verwendung eines beliebigen karzinogenen Virus, Mittels
oder karzinogener Strahlung erhalten hat, bestehenden
Gruppe einem oder mehreren alpha-Interferon- und/oder
gamma-Interferonauslösern aussetzt und dadurch eine Target-
Zellen-Lysis-Faktor-Erzeugung induziert,
- (b) die Kultur bei 4°C und 1000 xg zentrifugiert, die über
stehende Flüssigkeit gegen eine physiologische Kochsalz
lösung mit einem Gehalt von 0,01 M Phosphatpuffer (pH-Wert
7,2) dialysiert, die erhaltene Lösung unter Verwendung
eines Membranfilters filtriert und dann lyophilisiert,
- (c) aus dem so erhaltenen pulvrigen Produkt durch Adsorption
und Desorption an einem Ionenaustauscher, Molekulargewichtsfraktionierung
unter Anwendung der Gelfiltration,
Einengen und Filtrieren unter Verwendung eines Membranfilters,
das Humaninterferon entfernt und
- (d) das humaninterferonfreie Produkt durch Aussalzen unter
Verwendung von Ammoniumsulfat und durch Affinitätschroma
trographie unter Verwendung von Con A-Sepharose reinigt.
Die menschlichen Zellinien, die man erfindungsgemäß verwendet,
sind solche, die man leicht transplantieren und
in dem Tier vermehren kann, und die TZLF erzeugen: Bei
spielsweise Namalva-Zellen, wie in Journal of Clinical
Microbiology, Bd. 1, S. 116 bis 117 (1975) beschrieben ist;
BALL-1, TALL-1- und NALL-1-Zellen, wie von I. Miyoshi in
Nature, Bd. 267, S. 843 bis 844 (1977) beschrieben ist;
M-7002- und B-7101-Zellen, wie in Journal of Immunology,
Bd. 113, S. 1334 bis 1345 (1974) beschrieben ist; JBL-, EBV-
Sa-, EBV-Wa-, MOLT-3- und EBV-HO-Zellen, wie in The Tissue
Culture, Bd. 6, Nr. 13, S. 527 bis 546 (1980) beschrieben
ist; CCRF-CEM-Zellen, CCRF-SB-Zellen (ATCC
CCL 120); BALM-2-Zellen, die in Int. J. Cancer 20, 199-205
(1977) beschrieben sind;
und andere etablierte Zellinien, die man durch
Transformieren von normalen Monozyten oder Granulozyten
unter Verwendung eines beliebigen karzinogenen Virus, Mittels
oder von karzinogener Strahlung erhalten ist.
Wenn man anstelle der genannten Zellinien eine menschliche
lymphoblastartige Zellinie verwendet, die man viel leichter
einer Subkultur unterwerfen kann, und in die man eines oder
mehrere menschliche Gene einführen kann, die die TZLF-Er
zeugung kodieren, indem man eine Zellfusion unter Verwendung
von Polyäthylenglycol oder Sendaivirus oder eine Methode der
Genneukombination unter Verwendung von Nuclease, Ligase und
DNA-Polymerase durchführt, erhält man eine außerordentliche
Steigerung der Zellvermehrungsrate und/oder der TZLF-Erzeu
gung pro Zelle.
Gegebenenfalls kann man eine oder mehrere der beschriebenen
Zellinien frei kombiniert in den Stufen bis zur TZLF-In
duktion verwenden, die nachstehend genauer beschrieben ist.
Menschliche Leukozyten, die TZLF erzeugen können und die man
aus frischem menschlichen Blut gewonnen hat, kann man in
Kombination mit einer oder mehreren der genannten Zellinien
verwenden.
Der TZLF-Auslöser, den man erfindungsgemäß verwenden kann,
kann einer oder mehrere Auslöser sein, der bzw. die die
TZLF-Erzeugung in den menschlichen Zellen induzieren, die
man durch Vermehrung der menschlichen Zellinie unter Ver
wendung der nährenden Körperflüssigkeit erhalten hat,
welche von dem Tier zugeführt wird: Beispielsweise sind
ein üblicher a-Interferonauslöser (IFN-α-Auslöser), wie
z. B. Virus, Nucleinsäure und Nucleotid; gamma-Interferon
auslöser (IFN-gamma-Auslöser), wie z. B. Phytohämagglutinin,
Concanavalin A, Mitogen aus Kermesgewächs (Phytolacca
americana), Lipopolysaccharid, Endotoxin, Polysaccharid
oder Bakterien als TZLF-Auslöser verwendbar: Im allgemeinen
bevorzugt man einen IFN-α-Auslöser, weil man damit
TZLF eines viel höheren Reinheitsgrades induzieren kann.
Bestimmte Antigene wirken als TZLF-Auslöser auf Zellen,
die man mit dem jeweiligen Antigen sensibilisiert hat.
Erfindungsgemäß wurde festgestellt, daß die Kombination
von IFN-α-Auslösern und IFN-gamma-Auslösern als TZLF-Aus
löser vorteilhaft eine bemerkenswerte Steigerung der in
duzierten TZLF-Erzeugung bewirkt.
Ferner wurde festgestellt, daß diese Kombination zur gleichzei
tigen Erzeugung einer beträchtlichen Menge von humanspezifischem
Interferon (HuIFN) zusätzlich zu den biologisch aktiven
Substanzen einschließlich von Lymphotoxin und TNF führt.
Es ist als anzunehmen, daß man durch Verwendung eines
derartigen Auslösers sowohl eine gleichzeitige und billige
Massenherstellung von zwei oder mehr biologisch aktiven
Substanzen ermöglicht, wie z. B. kostbares TZLF und HuIFN,
als auch eine viel wirksamere Verwendung der vermehrten
menschlichen Zellen ermöglicht.
Die menschliche Zellinie, die man erfindungsgemäß verwenden
kann, ist eine Zellinie, die man in vitro auf übliche
Weise vermehren kann. Um das erfindungsgemäße Verfahren wir
kungsvoll durchzuführen, bevorzugt man die Verwendung von
menschlichen Zellen, die man vermehrt hat, indem man die
menschliche Zellinie auf ein nicht-menschliches warmblütiges
Tier transplantiert oder wahlweise dazu die menschliche
Zellinie sich in einer Diffusionskammer vom üblichen Typ
vermehren ließ, durch welche die nährende Körperflüssigkeit
eines nicht-menschlichen warmblütigen Tieres der Zellinie
zugeführt wird: Im Gegensatz zu üblichen Methoden, wobei
man lebende menschliche Zellen in vitro vermehrt, liefert
die Methode unter Verwendung der Arbeitsweise in vivo nicht
nur ein TZLF mit viel höherem Reinheitsgrad, sondern be
nötigt ferner kein oder viel weniger Nährmedium mit einem
Gehalt an teurem Serum und macht dadurch die Erhaltung der
Kultur während der Zellvermehrung viel leichter.
Ferner kann man das erfindungsgemäße Verfahren von den üb
lichen Zellvermehrungsmethoden in vitro unter Verwendung
von Gewebekulturen dadurch unterscheiden, daß man zusätz
liche Merkmale erzielen kann, nämlich eine viel besser sta
bilisierte und raschere Zellvermehrung, eine höhere Zell
produktion und eine außerordentlich erhöhte Ausbeute an
TZLF pro Zelle.
Das nichtmenschliche warmblütige Tier, das man erfindungsgemäß
verwenden kann, ist ein Tier, wie es in der US-PS 4 276 282
beschrieben ist.
Da die Transplantation einer derartigen menschlichen Zell
linie auf das Tier unerwünschte Immunreaktionen bewirkt,
ist es wünschenswert, zu einer möglichst starken Verminderung
der Immunreaktion ein nicht-menschliches warmblütiges
Tier im jüngsten möglichen Zustand zu verwenden, z. B. als
Ei, Embryo oder Fetus oder als Neugeborenes oder jüngstes
Tier.
Vor der Transplantation kann man ein derartiges Tier ferner
mit Röntgenstrahlen oder gamma-Strahlen von etwa 200 bis
600 rem bestrahlen oder ein Antiserum oder Immunsuppressivum
injizieren, um die Immunreaktion auf das niederste mögliche
Niveau herabzudrücken.
Wenn man nackte Mäuse oder nackte Ratten als Wirtstier ver
wendet, kann man, weil das Tier weniger unerwünschte Immun
reaktionen sogar in seinem erwachsenen Zustand zeigt, auf
das Tier leicht beliebige der genannten Zellinien ohne eine
derartige Vorbehandlung transplantieren, und die Zellinien
vermehren sich darin, wobei man weniger befürchten muß, daß
unerwünschte Immunreaktionen bewirkt werden.
Man kann sowohl die Stabilisierung der Zellvermehrung als
auch die Steigerung der TZLF-Erzeugung durch wiederholte
Transplantation unter Verwendung von verschiedenen nicht
menschlichen warmblütigen Tieren erzielen: Beispielsweise
kann man diese Vorteile erzielen, indem man zuerst die Zell
linie auf Hamster transplantiert und darin vermehrt und
danach die vermehrten menschlichen Zellen auf nackte Mäuse
neu transplantiert. In diesem Fall kann man die wiederholte
Transplantation unter Verwendung eines nicht-menschlichen
warmblütigen Tieres der gleichen Klasse oder Ordnung sowie
der gleichen Art oder der gleichen Gattung durchführen.
Was den Körperteil des Tieres betrifft, auf den man die
Zellinie transplantieren kann, kann man die Zellinie auf
einen beliebigen Körperteil des Tieres transplantieren,
sofern sich die Zellinie darin vermehrt: Beispielsweise
in die Allantoishöhle oder intravenös, intraperitoneal
oder subkutan.
Statt die Zellinie auf das Tier zu transplantieren, kann
man beliebige der beschriebenen Zellinien leicht vermehren,
indem man sie in eine übliche Diffusionskammer einbringt,
deren Form und Größe verschieden sein kann, und die bei
spielsweise ein Membranfilter, Ultrafilter oder Hohlfaser
filter einer nominalen Porengröße von etwa 10-7 bis 10-5 m
aufweist, das die Verunreinigung der Kammer mit tierischen
Zellen verhindert aber die Zellinie mit der nährenden Kör
perflüssigkeit versorgt; indem man beispielsweise intra
peritoneal die Kammer in das Tier einbettet; und die Zell
linie sich darin unter Verwendung der nährenden Körperflüssigkeit
vermehren läßt, die vom Tier zugeführt wird.
Ferner kann man die Diffusionskammer beispielsweise auf
dem Tier derart vorsehen und anordnen, daß die nährende
Körperflüssigkeit und nährende Lösung in der Kammer frei
durch die Kammer zirkulieren können. In diesem Fall kann
man die Kultur in der Kammer während der Zellvermehrung
durch ein oder mehrere transparente Seitenfenster beobachten,
das bzw. die in einer oder mehreren der Kammerwände vorgesehen
sind, und/oder man kann die Kammer wiederholt durch eine
frische Kammer ersetzen, wodurch man sowohl die Zellver
mehrung über den Lebenszeitraum hinaus fortsetzen, ohne das
Tier zu töten, als auch die Zellproduktion pro Tier
viel stärker steigern kann.
Da die Verwendung einer derartigen Diffusionskammer eine
geringere Auslösung von unerwünschten Immunreaktionen be
wirkt, weil keine direkte Berührung der menschlichen Zel
len mit den tierischen Zellen stattfindet, kann man ein
beliebiges nicht-menschliches warmblütiges Tier leicht
als Wirt ohne Vorbehandlung verwenden, und man kann die
vermehrten menschlichen Zellinien leicht daraus gewinnen.
Die Fütterung des Tieres kann man leicht auf übliche Weise
durchführen, und es ist keinerlei Spezialbehandlung sogar
nach der Transplantation erforderlich.
Der Zeitraum, den man benötigt, um eine maximale Zellver
mehrung zu erzielen, beträgt im allgemeinen 1 bis 10 Wo
chen. Die Anzahl der derart erhaltenen menschlichen Zellen
kann etwa 10⁷ bis 10¹² pro Tier oder mehr betragen. Ins
besondere vermehren sich die transplantierten
menschlichen Zellen auf das etwa 10²- bis 10⁷-fache oder
mehr, was eine etwa 10- bis 10⁶-fache oder noch höhere
Ausbeute ist im Vergleich zu jener, die man unter Verwen
dung der Vermehrungsmethode in vitro unter Verwendung
eines Nährmediums erzielt: Demgemäß sind die vermehrten
menschlichen Zellen vorzugsweise zur Lösung der Aufgabe
der Erfindung geeignet.
Man kann eine beliebige Methode, durch welche in den ver
mehrten menschlichen Zellen die Erzeugung von TZLF indu
ziert wird, gemäß der Erfindung anwenden: Die vermehrten
menschlichen Zellen kann man in dem Tier, das man als
Wirt für die Zellvermehrung verwendet, einem TZLF-Auslöser
aussetzen. Beispielsweise setzt man menschliche Zellen, die
man in suspendiertem Aszites vermehrt hatte, oder Tumor
zellen, die man beispielsweise subkutan gebildet hatte,
direkt in vivo einem TZLF-Auslöser aus, induziert die TZLF-
Erzeugung, gewinnt das erzeugte bzw. angesammelte TZLF aus
Aszites, Serum und/oder Tumor und reinigt danach das TZLF.
Wahlweise dazu kann man die vermehrten menschlichen Zellen
aus dem Tier gewinnen und danach in vitro einem TZLF-Aus
löser aussetzen: Beispielsweise suspendiert man die ver
mehrten menschlichen Zellen, die man durch Gewinnung aus
der Aszitessuspension oder durch Extraktion und Zerteilen
des massiven Tumors bzw. der massiven Tumoren erhalten hat, den bzw.
die beispielsweise subkutan gebildet wurden, in einem
Nährmedium, das man auf eine Temperatur im Bereich von
etwa 20 bis 40°C vorgewärmt hat, bis zu einer Zelldichte
von etwa 10 ⁵ bis 10⁸ Zellen pro ml, setzt sie in vitro
einem TZLF-Auslöser aus und sammelt danach das gebildete
TZLF aus der Kultur.
Wenn man die menschliche Zellinie in einer üblichen Diffu
sionskammer vermehrt, kann man die vermehrten menschlichen
Zellen in der Kammer oder nach der Gewinnung daraus einem
TZLF-Auslöser aussetzen.
Die derart erhaltenen menschlichen Zellen kann man ferner
in vitro weitere 1 bis 4 d kultivieren und die Fortpflan
zungszeit vor der TZLF-Induktion einstellen.
Die TZLF-Erzeugung pro Tier kann man ferner steigern, indem
man beliebige der nachstehenden Methoden anwendet:
(1) eine Methode, worin man die vermehrten menschlichen
Zellen einem TZLF-Auslöser in dem Tier aussetzt, das man
als Wirt für die Zellvermehrung verwendet hat, die mensch
lichen Zellen danach aus einem oder mehreren bestimmten
Körperteilen des Tieres oder aus seinem gesamten Körper
gewinnt und danach die menschlichen Zellen einem TZLF-
Auslöser in vitro aussetzt;
(2) eine Methode, worin man menschliche Zellen wiederholt
in vitro und/oder in vivo einem TZLF-Auslöser aussetzt;
und/oder
(3) eine Methode, worin man die Diffusionskammer, die man
in das Tier eingebettet oder auf dem Tier angebracht hat,
wiederholt durch eine frische Kammer ersetzt.
Das derart erhaltene TZLF kann man leicht durch Reinigungs-
und Abtrennungsmethoden unter Verwendung üblicher Maßnahmen
sammeln, wie z. B. Einengen, Aussalzen, Dialyse, Filtrieren,
Zentrifugieren und/oder Lyophilisieren. Wenn eine
stärker gereinigte TZLF-Zubereitung erwünscht ist, kann
man eine Zubereitung höchst möglicher Reinheit mit den
genannten Methoden in Kombination mit anderen üblichen
Methoden erhalten, z. B. Adsorption und Desorption an
Ionenaustauschern, Gelfiltration, Elektrophorese und/oder
Fraktionierung am isoelektrischen Punkt.
Wenn man anstelle der genannten Methoden eine Affinitäts
chromatographie unter Verwendung entweder eines Antikörpers
oder eines Mitogens als einem Liganden anwendet, z. B.
Con A-Sepharose kann man eine raschere und leichtere Herstellung
von hochreinem TZLF erzielen.
Die Erfindung betrifft ferner das entsprechend dem erfindungs
gemäßen Verfahren herstellbare TZLF, das Lymphotoxin und
Tumornekrosefaktor (TNF) umfaßt und praktisch keinerlei Zyto
toxizität gegenüber normalen menschlichen Zellen, jedoch
eine bemerkenswerte Zytotoxizität gegenüber verschiedenen
menschlichen Tumorzellen mit ihrer anschließenden Zytolyse
bewirkt. Demgemäß kann man das gemäß den beiden Ausführungs
formen des erfindungsgemäßen Verfahrens herstellbare TZLF
vorteilhaft als prophylaktisches und/oder therapeutisches
Mittel gegen Krankheiten verwenden, die auf TZLF ansprechen,
wie z. B. maligne Tumore, deren Behandlung bisher als sehr
schwierig angesehen wurde (vgl. Anspruch 3).
Den TZLF-Gehalt prüfte man entweder mit der Lymphotoxin-
Prüfmethode, die von B. R. Bloom und P. R. Glade, "In
Vitro Methods in Cell-Mediated Immunity", Academic Press,
Inc. (1972) berichtet wurde, oder mit der TNF-Prüfmethode,
die von E. Pick "Tumor Necrosis Factor in Lymphokines",
Bd. 2, S. 235 bis 272, Academic Press, Inc. (1981) be
richtet wurde, wobei man die Zellinie von Mäusen, L-929,
in Gegenwart von TZLF für einen bestimmten Zeitraum in
kubiert und die überlebenden Zellen zählt.
Den Gehalt an HuIFN prüfte man mit der üblichen Löcher
reduktionsmethode, die in Protein, Nucleic Acid and
Enzyme, Bd. 20, Nr. 6, S. 616 bis 643 (1975) beschrieben
ist, unter Verwendung von FL-Zellen aus menschlichem
Amnion.
Den Hämagglutinierungstiter prüfte man mit der Methode,
die in J. E. Salk, Journal of Immunology, Bd. 49, S. 87
(1944) berichtet wurde, mit einer leichten Modifizierung.
Nachstehend wird die Erfindung durch Versuche, Beispiele
und Untersuchungen näher erläutert.
Die nachstehenden Herstellungsversuche erläutern die Er
zeugung von Lymphotoxin, einem Typ von TZLF.
Fähigkeit von in vitro oder in vivo vermehrten menschlichen
Zellen, Lymphotoxin zu erzeugen:
Herstellungsversuch 1: Zellvermehrung in vitro
Eine menschliche lymphoblastartige Zellinie, BALL-1-
Zellen, die aus B-Zellen stammten, transplantierte man
in ein RPMI 1640-Medium (pH-Wert 7,2), das man mit 20 Volumen-%
fetalem Kälberserum ergänzt hatte, und kultivierte
sie in Suspension bei 37°C. Die vermehrten menschlichen
Zellen wusch man mit serumfreiem RPMI 1640-Medium
(pH-Wert 7,2), suspendierte sie danach in einem frischen
Medium der gleichen Zusammensetzung und erhielt eine Zell
dichte von etwa 1×10⁶ Zellen/ml.
Herstellungsversuch 2: Zellvermehrung in vivo
Nachdem man neugeborenen Hamstern Antiserum, das man aus
Kaninchen auf übliche Weise hergestellt hatte, zur Vermin
derung der Immunreaktion injiziert hatte, transplantierte
man den Tieren subkutan eine menschliche lympho
blastartige Zellinie, BALL-1, die aus B-Zellen stammte,
und fütterte danach die Hamster auf übliche Weise drei Wochen
lang. Die erhaltenen massiven Tumoren, die sich subkutan
gebildet hatten, extrahierte man und zerteilte sie
durch Suspendieren in einer physiologischen Kochsalzlösung
mit einem Gehalt an Trypsin. Danach wusch man die Zellen
mit serumfreiem RPMI 1640-Medium (pH-Wert 7,2) und sus
pendierte sie wieder in einem frischen Medium der gleichen
Zusammensetzung bis zu einer Zelldichte von etwa
1×10⁶ Zellen/ml.
Herstellungsversuch 3: Herstellung von Lymphotoxin
Die Induktion von Lymphotoxin führte man in jeder Zell
suspension der vermehrten BALL-1-Zellen, die man in den
Versuchen 1 und 2 hergestellt hatte, unter Verwendung
von Sendaivirus und/oder Phytohämagglutinin durch. Zu
jeder der Zellsuspensionen gab man Sendaivirus und/oder
Phytohämagglutinin in einer jeweiligen Menge von etwa
300 Einheiten/ml Hämagglutierungstiter und/oder etwa 50 µg/ml,
inkubierte die Mischungen bei 37°C 2 d und indu
zierte die TZLF-Erzeugung. Nach der Inkubation vermerkte
man eine gleichzeitige starke Erzeugung sowohl von
HuINF-α und HuINF-gamma als auch von Lymphotoxin in der
Kultur.
Tabelle I zeigt die Ergebnisse der Lymphotoxinerzeugung.
Aus den Versuchsergebnissen, die in Tabelle I gezeigt sind,
ergibt sich, daß Lymphotoxin sowohl in den menschlichen
Zellen erzeugt wurde, die in vitro vermehrt wurden, als
auch in den menschlichen Zellen erzeugt wurde, die in vivo
vermehrt wurden. Die Menge an Lymphotoxin, die in den
letzteren induziert wurde, ist jedoch außerordentlich
höher, d. h. etwa das 10fache oder mehr, als jene, die
in den ersten erzeugt wurde. Die Lymphotoxinerzeugung
unter Verwendung von Sendaivirus ist vergleichbar oder
höher als jene, die man unter Verwendung von Phytohämagglutinin
erzielte. Die Verwendung sowohl von Sendaivirus als
auch von Phytohämagglutinin steigert synergistisch die
Lymphotoxinerzeugung in den menschlichen Zellen unabhängig
von der Vermehrungsmethode im Vergleich zu jener
unter Verwendung von Sendaivirus oder Phytohämagglutinin.
Die synergistische Wirkung ist wesentlich bemerkenswerter
in den menschlichen Zellen, die man in vivo vermehrt
hatte, als in jenen, die man in vitro vermehrt hatte.
Daraus ergibt sich, daß die Verwendung von hochspezifischem
IFN-Auslöser, insbesondere eine Kombination von
IFN-α- und IFN-gamma-Auslösern für die Induktion von
nicht artspezifischem Lymphotoxin vorteilhaft ist.
Die nachstehenden Herstellungsbeispiele erläutern die
Herstellung von Lymphotoxin und TNF, zwei Arten von
TZLF, gemäß der Erfindung.
Herstellungsbeispiel 1
Nachdem man Antiserum, daß man aus Kaninchen auf übliche
Weise gewonnen hatte, in neugeborene Hamster injiziert
hatte, um ihre Immunreaktion zu vermindern, transplantierte
man den Tieren subkutan eine menschliche lympho
blastartige Zellinie, BALL-1-Zellen, und fütterte sie
auf übliche Weise drei Wochen lang.
Die erhaltenen massiven Tumoren, die sich subkutan gebildet
hatten, von jeweils etwa 15 g extrahierte man, zerkleinerte
sie und zerteilte sie durch Suspendieren in
einer physiologischen Kochsalzlösung mit einem Gehalt
an Trypsin.
Die derart erhaltenen menschlichen Zellen wusch man mit
serumfreiem RPMI 1640-Medium (pH-Wert 7,2) und suspendierte
sie wieder in einem frischen Medium der gleichen
Zusammensetzung bis zu einer Zelldichte von etwa 5×10⁶
Zellen/ml. Zu der Zellsuspension gab man sowohl Sendai
virus als auch Phytomhämagglutinin in einer Menge von
1000 Einheiten/ml Hämagglutinierungstiter bzw. etwa
200 µg/ml zu, inkubierte die Mischung danach bei 37°C
2 d und induzierte die Lymphotoxinerzeugung.
Danach zentrifugierte man die Kultur bei 4°C und etwa
1000×980,7 cm/s² (1000 g) und dialysierte die über
stehende Flüssigkeit gegen eine physiologische Koch
salzlösung mit einem Gehalt von 0,01 Mol/l (0,01 M)
Phosphatpuffer (pH-Wert 7,2) 31 h lang. Die erhaltene
Lösung, die eine Lymphotoxinaktivität aufwies, filtrierte
man danach unter Verwendung eines Membranfilters,
engte das Filtrat ein, lyophilisierte es und erhielt
ein pulveriges Produkt.
Die Lymphotoxinausbeute betrug etwa 5×10⁷ Einheiten
pro Hamster. Das Pulver enthielt ferner etwa 3,2×10⁷
Einheiten HuIFN.
Abtrennung des HuIFN-Bestandteils und Reinigung des
Lymphotoxins in an sich bekannter Weise:
Den HuIFN-Bestandteil in dem erhaltenen pulverartigen
Produkt entfernte
man durch Adsorption und Desorption an einem Ionenaustauscher,
Molekulargewichtsfraktionierung unter Anwendung der Gelfil
tration, Einengen und Filtrieren unter Verwendung eines
Membranfilters gemäß der Methode, die in G. Bodo, "Sympo
sium on Preparation, Standardization and Clinical Uses of
Interferon" 11-th International Immunobiological Symposium,
8 and 9 June 1977, Zagrev, Yugoslavia, beschrieben ist,
engte das erhaltene HuIFN-freie Produkt ein und reinigte
es durch Aussalzen unter Verwendung von Ammoniumsulfat.
Das erhaltene Produkt führte man danach einer Affinitäts
chromatographie unter Verwendung von Phytohämagglutinin-
Sepharose in einem 0,01 M Phosphatpuffer zu (0,01 Mol/l,
pH-Wert 7,4) und eludierte den adsorbierten Teil, indem man
eine frische Zubereitung des gleichen Puffers aufgab, der
ferner 0,1 Mol/l (0,1 M) N-Acetyl-D-galactosamin enthielt.
Die eluierten Fraktionen, die eine Lymphotoxinaktivität
aufwiesen, dialysierte man gegen eine frische Zubereitung
des gleichen Puffers jedoch ohne N-Acetyl-D-galactosamin,
engte ein, lyophilisierte und erhielt ein pulverartiges
Produkt.
Die spezifische Aktivität des derart erhaltenen Lympho
toxins betrug etwa 30 000 Einheiten/mg Protein.
Eine Gelfiltration des pulverartigen Produktes bezüglich
des Molekulargewichtes brachte die nachstehenden Ergebnisse:
Das Produkt wurde in drei Bestandteile mit verschiedenen
Molekulargewichten von etwa 7×10⁴ bis 9×10⁴ Dalton,
etwa 3,5×10⁴ bis 5×10⁴ Dalton und etwa 1×10⁴ bis
2×10⁴ Dalton mit einem Aktivitätsverhältnis von etwa
1 : 1 : 2 aufgetrennt, das jeweils den beschriebenen α, β- und
gamma-Lymphotoxinen hinsichtlich ihrer Molekulargewichte
und anderen verfügbaren physikalisch chemischen Informationen
entsprach. Alle Bestandteile waren Glycoproteine,
und ihr Saccharidgehalt fiel in den Bereich von etwa 5 bis
45%, in Abhängigkeit von ihrem Molekulargewicht.
Herstellungsbeispiel 2
Eine menschliche lymphoblastartige Zellinie, BALL-1-
Zellen, impfte man in ein Medium mit den minimalen Kon
zentrationen aller essentiellen Stoffe (pH-Wert 7,4;
Eagle′s minimal essential medium) ein, das man mit 20 Volumen-%
fetalem Kälberserum ergänzt hatte, und kultivierte
sie darin in vitro in einer Suspension bei 37°C.
Nachdem man die vermehrten menschlichen Zellen mit
serumfreiem Eagle-Medium mit den minimalen Konzentrationen
aller essentiellen Stoffe (pH-Wert 7,4) gewaschen
hatte, suspendierte man die Zellen wieder in einem frischen
Medium der gleichen Zusammensetzung bis zu einer
Zelldichte von etwa 1×10⁷ Zellen/ml. Danach gab man
zu der Zellsuspension sowohl Sendaivirus als auch
Concanavalin A in einer Menge von etwa 1000 Einheiten/ml
des Hämagglutinierungstiters bzw. etwa 5 µg/ml, inku
bierte die Mischung bei 38°C 1 d lang und induzierte
die Lymphotoxinerzeugung.
Nachdem man die Kultur bei 4°C und etwa 1000×980,7 cm/s²
(1000 g) zentrifugiert hatte, dialysierte man die
überstehende Flüssigkeit gegen eine physiologische
Kochsalzlösung mit einem Gehalt an 0,01 Mol/l (0,01 M)
Phosphatpuffer (pH-Wert 7,2) 15 h lang. Die erhaltene
Lösung filtrierte man unter Verwendung eines Membran
filters und engte das Filtrat ein, das eine Lymphotoxin
aktivität aufwies.
Die Lymphotoxinausbeute betrug etwa 4,5×10⁶ Einheiten
bezogen auf 1 l Zellsuspension nach der Induktion. Die
HuIFN-Ausbeute betrug etwa 1,2×10⁷ Einheiten/l Zell
suspension.
Herstellungsbeispiel 3
Erwachsenen nackten Mäusen transplantierte man intra
peritoneal eine menschliche lymphoblastartige Zellinie,
die von B-Zellen stammte, Namalva, und fütterte die
Mäuse auf übliche Weise 5 Wochen lang. Danach injizierte
man den Tieren intraperitoneal mit UV-Bestrahlung vorher
inaktiviertes Newcastle-Disease-Virus in einer Impflösung
mit etwa 3000 Einheiten des Hämagglutinierungstiters
pro Tier, tötete sie 24 h nach der Injektion und gewann
den Aszites.
Wie im Herstellungsbeispiel 1 reinigte man den Aszites,
engte ihn ein und erhielt ein Pulver, das eine Lympho
toxinaktivität aufwies.
Die Lymphotoxinausbeute betrug etwa 9×10⁶ Einheiten pro
Tier. As Pulver enthielt ferner etwa 5,2×10⁶ Einheiten
von HuIFN.
Herstellungsbeispiel 4
Nachdem man erwachsene Mäuse mit Röntgenstrahlen von
etwa 400 rem bestrahlt hatte, um ihre Immunreaktion zu
vermindern, transplantierte man den Tieren subkutan eine
menschliche lymphoblastartige Zellinie, die von B-Zellen
stammte, CCRF-SB-Zellen, und fütterte die Mäuse auf übliche
Weise 3 Wochen lang.
Die erhaltenen massiven Tumoren, die sich subkutan gebil
det hatte, von jeweils etwa 10 g extrahierte man und zer
teilt sie wie in Herstellungsbeispiel 1. Die derart erhal
tenen menschlichen Zellen suspendierte man in einem frischen
Medium der gleichen Zusammensetzung wie in Her
stellungsbeispiel 1, gab zu der Zellsuspension Sendaivirus
und Concanavalin A in einer Menge von etwa 500 Einheiten/ml
Hämagglutinierungstiter bzw. 0,8 µg/ml, inkubierte danach
1 d lang die Zellsuspension bei 37°C und induzierte die
Lymphotoxinerzeugung.
Wie in Herstellungsbeispiel 1 reinigte man die Kultur, engte
sie ein und erhielt ein pulverartiges Produkt, das eine
Lymphotoxinaktivität aufwies.
Die Lymphotoxinausbeute betrug etwa 2,4×10⁷ Einheiten
pro Maus. Das Pulver enthielt ferner etwa 1,9×10⁷ Einheiten
von HuIFN.
Herstellungsbeispiel 5
Wie in Herstellungsbeispiel 1 transplantierte man neugeborenen
Hamstern eine menschliche lymphoblastartige Zellinie,
JBL-Zellen, und fütterte danach die Hamster auf übliche Weise
4 Wochen lang.
Die erhaltenen massiven Tumoren, die sich subkutan gebildet
hatten, jeweils etwa 20 g zerteilte man wie in Herstellungs
beispiel 1 und erhielt eine Zellsuspension mit einer Zell
dichte von etwa 3×10⁶ Zellen/ml. Zu der Zellsuspension
gab man Sendaivirus in einer Menge von etwa 1000 Einheiten/ml
Hämaggultinierungstiter zu, inkubierte danach die Mi
schung bei 36°C 2 d lang und induzierte die Lymphotoxin
erzeugung.
Die Kultur reinigte man, engte sie wie in Herstellungsbei
spiel 2 ein und erhielt ein Konzentrat, das eine Lympho
toxinaktivität aufwies.
Die Lymphotoxinausbeute betrug etwa 1,6×10⁷ Einheiten pro
Hamster. Das Konzentrat enthielt ferner etwa 7×10⁶ Ein
heiten HuIFN pro Hamster.
Herstellungsbeispiel 6
Eine menschliche lymphoblastartige Zellinie, EBV-HO-Zellen,
die von B-Zellen stammten, suspendierte man in einer
physiologischen Kochsalzlösung, setzte die erhaltene Sus
pension danach in eine zylindrische Diffusionskammer aus
Kunststoff mit einem inneren Volumen von etwa 10 ml ein,
die mit einem Membranfilter einer nominalen Porengröße von
etwa 0,5 µm versehen war, und bettete danach intraperito
neal die Kammer in eine erwachsene Ratte ein.
Das Tier fütterte man danach auf übliche Weise 4 Wochen lang
und entfernte danach die Kammer.
Die Zelldichte der vermehrten menschlichen lymphoblastartigen
Zellen in der Kammer, die man mit der beschriebenen
Methode erzielt hatte, betrug etwa 6×10⁸ Zellen/ml, was
das etwa 10²-fache oder mehr jener war, die man durch die
In-vitro-Methode mit einem CO₂-Inkubator unter Verwendung
eines Nährmediums erzielt hatte.
Die derart erhaltenen menschlichen Zellen suspendierte man
wie in Herstellungbeispiel 2, gab zu der Zellsuspension
ein vorher thermisch inaktiviertes Newcastle-Disease-Virus
und Phytohämagglutinin in einer Menge von etwa 500 Einheiten/ml
Hämaglutinierungstiter bzw. etwa 100 µg/ml, inkubierte
danach 2 d die Zellsuspension bei 37°C und induzierte
die Lymphotoxinerzeugung.
Die Kultur reinigte man, engte sie wie in Herstellungsbei
spiel 1 ein und erhielt ein pulverartiges Produkt, das
eine Lymphotoxinaktivität aufwies.
Die Lymphotoxinausbeute betrug etwa 5,4×10⁶ Einheiten
pro Ratte. Das Pulver enthielt ferner etwa 6,8×10⁶ Einheiten
HuIFN.
Herstellungsbeispiel 7
Eine menschliche lymphoblastartige Zellinie, BALL-1, trans
plantierte man in die Allantoishöhlen von Eiern mit Embryonen,
die man vorher bei 37°C 5 d inkubiert hatte, und inkubierte
die Eier bei dieser Temperatur eine weitere
Woche lang. Die vermehrten menschlichen Zellen gewann man
aus den Eiern, suspendierte sie wie in Herstellungsbeispiel 1
und erhielt eine Zelldichte von 5×10⁶ Zellen/ml.
Zu der Zellsuspension gab man Sendaivirus in einer Menge
von etwa 1000 Einheiten/ml Hämagglutinierungstiter zu, in
kubierte bei 37°C 1 d lang und induzierte die Lymphotoxin
erzeugung. Danach reinigte man die Kultur, engte sie wie
in Herstellungsbeispiel 2 ein und erhielt ein Konzentrat,
das eine Lymphotoxinaktivität aufwies.
Die Lymphotoxinausbeute betrug etwa 9×10⁵ Einheiten pro
10 Eier mit Embryonen. Das Pulverprodukt enthielt ferner
etwa 3,5×10⁵ Einheiten HuIFN pro 10 Eier mit Embryonen.
Herstellungsbeispiel 8
Auf gleiche Weise wie in Herstellungsbeispiel 4 behandelte
man eine menschliche lymphoblastartige Zellinie, und zwar
MOLT-3-Zellen anstelle der menschlichen lymphoblastartigen
Zellinie, CCRF-SB-Zellen, und erhielt ein pulverartiges
Produkt, das eine Lymphotoxinaktivität aufwies.
Die Lymphotoxinausbeute betrug etwa 3,3×10⁷ Einheiten
pro Maus. Das pulverartige Produkt enthielt ferner etwa
1,4×10⁷ Einheiten HuIFN.
Herstellungsbeispiel 9
Neugeborenen Hamstern injizierte man Antiserum, das man
aus Kaninchen auf übliche Weise hergestellt hatte, verminderte
ihre Immunreaktion soweit wie möglich, transplantierte
ihnen danach subkutan eine menschliche Zellinie monzytischen
Ursprungs, die man unter Verwendung von SV-40-Virus
transformiert hatte, und fütterte die Hamster danach eine
Woche lang auf übliche Weise. Danach injizierte man den
Tieren intraperitoneal lebende BCG-Zellen in einer Impf
lösung von 10⁷ Zellen pro Tier, unf fütterte die Tiere
weitere zwei Woche lang.
Danach extrahierte man die erhaltenen massiven Tumoren,
die sich subkutan gebildet hatten, von jeweils etwa 15 g,
zerkleinerte sie und zerteilte sie durch Suspendieren in
einer physiologischen Kochsalzlösung mit einem Gehalt an
Trypsin. Nachdem man die menschlichen Zellen mit Eagle′s
Medium mit den minimalen Konzentrationen aller essentiellen
Stoffe (pH-Wert 7,2) gewaschen hatte, welches man
mit 5 Volumen-% menschlichem Serum ergänzt hatte, suspendierte
man die Zellen in einem frischen Medium der gleichen
Zusammensetzung bis zu einer Zelldichte von etwa
5×10⁶ Zellen/ml. Danach gab man zu der Zellsuspension
E. coli-Endotoxin in einer Menge von etwa 10 µg/ml, in
kubierte bei 37°C 16 h und induzierte die TNF-Erzeugung.
Danach zentrifugierte man die Kultur bei 4°C und etwa
1000×980,7 cm/s² (1000 g), entfernte den Niederschlag
und dialysierte die zurückbleibende überstehende Flüssig
keit gegen eine physiologische Kochsalzlösung mit einem
Gehalt von 0,01 Mol/l (0,01 M) Phosphatpuffer (pH-Wert 7,2)
21 h lang. Die erhaltene Lösung filtrierte man danach
unter Verwendung eines Membranfilters, lyophilisierte das
Filtrat, das eine TNF-Aktivität aufwies, und erhielt ein
pulverartiges Produkt.
Den HuIFN-Bestandteil in dem pulverartigen Produkt ent
fernte man durch Adsorption und Desorption mit einem Ionen
austauscher, Molekulargewichtsfraktionierung unter Anwen
dung der Gelfiltration, Einengen und Filtrieren unter
Verwendung eines Membranfilters gemäß der Methode, die
in G. Bodo, "Symposium on Preparation, Standardization
and Clinical Use of Interferon", 11th International Immunobio
logical Symposium, 8 and 9 June 1977, Zagrev, Yugoslavia, beschrieben
ist. Man reinigte das erhaltene HuIFN-freie Produkt durch Aussalzen
unter Verwendung von Ammoniumsulfat und durch Affinitäts
chromatographie unter Verwendung von Con A-Sepharose
und erhielt
etwa 1×10⁶ Einheiten eines hochreinen TNF, das eine
Zytolyse von Meth A-Sarkom bewirken konnte, und das prak
tisch keinerlei Zytolyse von menschlichen normalen Zellen
jedoch eine bemerkenswerte Zytolyse von menschlichen Tumor
zellen bewirkte.
Das so erhaltene TNF enthielt keinen TNF-Auslöser, und
seine spezifische Aktivität betrug etwa 350 000 Einheiten/mg
Protein.
Herstellungsbeispiel 10
Nachdem man Antiserum, das man aus Kaninchen auf übliche
Weise hergestellt hatte, neugeborenen Hamstern injiziert
hatte, um ihre Immunreaktion zu vermindern, transplantierte
man den Tieren subkutan eine menschliche lymphoblastartige
Zellinie, BALL-1, und fütterte die Tiere auf übliche Weise
drei Wochen lang.
Nach dem Extrahieren und Zerkleinern der erhaltenen massiven
Tumoren, die sich subkutan gebildet hatten, von jeweils
etwa 15 g zerteilte man die erhaltenen Tumore durch Suspendieren
in einer physiologischen Kochsalzlösung mit einem
Gehalt an Trypsin. Nachdem man die menschlichen Zellen mit
serumfreien RPMI 1640-Medium (pH-Wert 7,2) gewaschen hatte,
suspendierte man die menschlichen Zellen wieder in einem
frischen Medium der gleichen Zusammensetzung bis zu einer
Zelldichte von etwa 1×10⁷ Zellen/ml.
Zu der Zellsuspension gab man Sendaivirus und E. coli-
Endotoxin in einer Menge von etwa 1000 Einheiten/ml
Hämagglutinierungstiter bzw. etwa 20 µg/ml und inkubierte
danach 2 d die Zellsuspension bei 37°C und induzierte die
TNF-Erzeugung.
Danach zentrifugierte man die Kultur bei 4°C und etwa
1000×980,7 cm/s² (1000 g) entfernte den Niederschlag,
dialysierte die erhaltene überstehende Flüssigkeit gegen
eine physiologische Kochsalzlösung mit einem Gehalt an
0,01 Mol/l (0,01 M) Phosphatpuffer (pH 7,2) 21 h lang und
filtrierte danach die erhaltene Lösung unter Verwendung
eines Membranfilters. Danach konzentrierte man das Filtrat,
das eine TNF-Aktivität aufwies, lyophilisierte es und
erhielt ein pulverartiges Produkt.
Die TNF-Ausbeute betrug etwa 8,3×10⁷ Einheiten pro Hamster.
Das Produkt enthielt ferner etwa 4,1×10⁷ Einheiten
HuIFN.
Herstellungsbeispiel 11
Erwachsenen nackten Mäusen transplantierte man intraperi
toneal eine menschliche lymphoblastartige Zellinie, TALL-1,
und fütterte die Tiere auf übliche Weise 5 Wochen lang. Danach
injizierte man den Tieren intraperitoneal ein durch UV-Bestrahlung
vorher inaktiviertes Newcastle-Disease-Virus in einer
Impflösung von etwa 3000 Einheiten Hämagglutinierungstiter
pro Tier, tötete die Tiere 24 h nach der Injektion und
gewann danach den Aszites.
Den Aszites reinigte man, engte ihn ein und trocknete ihn
wie in Herstellungsbeispiel 10 und erhielt ein pulverartiges
Produkt, das eine TNF-Aktivität aufwies.
Die TNF-Ausbeute betrug etwa 6,2×10⁶ Einheiten pro
nackte Maus. Das Produkt enthielt ferner etwa 4,5×10⁶
Einheiten HuIFN.
Herstellungsbeispiel 12
Neugeborenen Hamstern transplantierte man wie in Herstel
lungsbeispiel 9 eine menschliche lymphoblastartige Zell
linie, Namalva, und fütterte danach die Tiere auf übliche
Weise 4 Wochen lang.
Wie in Herstellungsbeispiel 10 extrahierte man die erhaltenen
masiven Tumoren, die sich subkutan gebildet hatten,
von jeweils etwa 20 g, zerkleinerte sie und zerteilte sie
wie im gleichen Beispiel und erhielt eine Zellsuspension
mit einer Zelldichte von etwa 3×10⁶ Zellen/ml. Danach
gab man zu der Zellsuspension Sendaivirus in einer Menge
von etwa 1000 Einheiten/ml Hämagglutinierungstiter, inku
bierte danach bei 36°C 2 d und induzierte die TNF-Erzeu
gung. Danach reinigte man die Kultur und engte sie ein
wie in Herstellungsbeispiel 10 und erhielt ein Konzentrat
das eine TNF-Aktivität aufwies.
Die TNF-Ausbeute betrug etwa 4,3×10⁷ Einheiten pro Hamster.
Das Produkt enthielt ferner etwa 8,2×10⁶ Einheiten
HuIFN.
Herstellungsbeispiel 13
Nachdem man eine menschliche lymphoblastartige Zellinie,
NALL-1-Zellen, in einer physiologischen Kochsalzlösung
suspendiert hatte, setzte man die Zellsuspension in eine
zylindrische Diffusionskammer aus Kunststoff mit einem
inneren Volumen von etwa 10 ml ein, welche mit einem Mem
branfilter einer nominalen Porengröße von etwa 0,5 µm
versehen war, und bettete die Kammer intraperitoneal in
eine erwachsene Ratte ein.
Das Tier fütterte man danach auf übliche Weise 4 Wochen
lang und entfernte danach die Kammer.
Die Zelldichte in der Kammer, die man erzielte, betrug
etwa 5×10⁸ Zellen/ml, was das etwa 10²-fache oder mehr
jener war, die man mit einer Gewebekulturmethode in vitro
mit einem CO₂-Inkubator unter Verwendung eines Nährmediums
erzielte.
Die vermehrten menschlichen Zellen suspendierte man wieder
in einem frischen Medium der gleichen Zusammensetzung wie
in Herstellungsbeispiel 9 bis zur gleichen Zelldichte,
gab zu der erhaltenen Zellsuspension ein durch UV-Bestrahlung
vorher inaktiviertes Newcastle-Disease-Virus und
Phytohämagglutinin in einer Menge von etwa 500 Einheiten/ml
Hämagglutinierungstiter bzw. etwa 100 µg/ml, inkubierte
danach 2 d die Zellsuspension bei 37°C und induzierte die
TNF-Erzeugung.
Danach reinigte man die Kultur, konzentrierte sie und
trocknete sie wie in Herstellungsbeispiel 10 und erhielt
ein pulverartiges Produkt, das eine TNF-Aktivität aufwies.
Die TNF-Ausbeute betrug etwa 2,6×10⁷ Einheiten pro Ratte.
Das pulverartige Produkt enthielt ferner etwa 9,4×10⁶
Einheiten HuIFN.
Herstellungsbeispiel 14
Eine menschliche lymphoblastartige Zellinie, JBL-Zellen,
transplantierte man in die Allantoishöhlen von Eiern mit
Embryonen, die man bei 37°C 5 d lang inkubiert hatte,
und inkubierte die Eier weiter bei dieser Temperatur eine
zusätzliche Woche lang.
Danach suspendierte man die vermehrten menschlichen Zellen
in einem frischem Medium der gleichen Zusammensetzung wie
in Herstellungsbeispiel 9 bis zu einer Zelldichte von
5×10⁶ Zellen/ml. Zu der Zellsuspension gab man danach
Sendaivirus in einer Menge von etwa 1000 Einheiten/ml
Hämagglutinierungstiter, inkubierte bei 37°C 1 d lang
und induzierte die TNF-Erzeugung. Die Kultur reinigte man
danach, konzentrierte sie wie in Herstellungsbeispiel 10
und erhielt ein Konzentrat, das eine TNF-Aktivität aufwies.
Die TNF-Ausbeute betrug etwa 1,5×10⁶ Einheiten pro 10 Eier
mit Embryonen und die verfügbaren physikalisch chemischen
Eigenschaften stimmten gut mit jenen überein, die
von Carswell et al. berichtet wurden. Das Konzentrat ent
hielt ferner etwa 4,0×10⁵ Einheiten HuIFN pro 10 Eier
mit Embryonen.
Das erfindungsgemäße TZLF, das man in den beschriebenen
Ausführungsformen der Erfindung erhalten hat, ist vorteil
haft als prophylaktisches und/oder therapeutisches Mittel
gegen Krankheiten einsetzbar, die auf TZLF ansprechen.
Der Ausdruck "Krankheit, die auf TZLF anspricht" umfaßt
in diesem Zusammenhang alle menschlichen Krankheiten, die
man unter Verwendung von TZLF verhüten und/oder behandeln
kann: Beispielsweise maligne Tumoren, wie z. B. Brustkrebs,
Lungenkrebs, Gebärmutterkrebs, Blasenkrebs, Dickdarmkrebs,
Magenkrebs, Leukämie, Lymphom und Hautkrebs.
Die nachstehenden Untersuchungen und Versuche erläutern
die Wirksamkeit, Toxizität, die Anwendungsvorschriften und
Dosierung des erfindungsgemäßen TZLF.
Untersuchung der Wirksamkeit und Toxizität von TNF:
Untersuchung 1
Nackten BALB/C-Mäusen transplantierte man subkutan in den
Rückenbereich kleine Bruchstücke eines menschlichen Brust
krebsgewebes.
Nachdem die erhaltenen massiven Tumoren auf etwa 200 mm³
angewachsen waren, injizierte man gleiche Mengen der TNF-
Zubereitung von Herstellungsbeispiel 9 intravenös jeden
Tag in einer Dosierung von entweder 100 Einheiten/kg/d oder
1000 Einheiten/kg/d. 15 d nach der ersten Injektion tötete
man die Tiere und wog die erhaltenen massiven Tumoren. Die
Ergebnisse sind in Tabelle II gezeigt. Eine TNF-freie
physiologische Kochsalzlösung injizierte man intravenös
als Vergleich.
Untersuchung 2
Gruppen von je 10 männlichen BDF₁-Mäusen pro Gruppe mit
einem Gewicht von etwa 25 g pro Maus transplantierte man
subkutan in den Rückenbereich Gewebestückchen von Lewis′s-
Lungenkrebs von 2 mm im Quadrat. Nach einem Zeitraum von
8 d nach der Transplantation injizierte man den Tieren
jeden Tag das TNF von Herstellungsbeispiel 9 in einer
Dosierung von entweder 100 Einheiten/kg/d oder 1000 Einhei
ten/kg/d. 21 g nach der ersten Injektion tötete man die
Tiere und wog die erhaltenen massiven Tumoren. Die Ergeb
nisse sind in Tabelle III gezeigt. Eine TNF-freie physio
logische Kochsalzlösung injizierte man intravenös als Ver
gleich.
Untersuchung 3
Eine Prüfung der akuten Toxizität der TNF-Zubereitung von
Herstellungsbeispiel 9 unter Verwendung von 20-d-alten
Mäusen bestätigte, daß die Toxizität der TNF-Zubereitung
außerordentlich gering ist, d. h. einen LD₅₀-Wert von
200 000 Einheiten/kg oder mehr nach intraperitonealer In
jektion aufweist.
Die nachstehenden Versuche erläutern die Wirksamkeit, Toxizität,
Anwendungsvorschriften und Dosierung von Lymphotoxin,
einem Typ von TZLF.
Versuch 1
Nackten BALB/C-Mäusen transplantierte man subkutan in den
Rückenbereich kleine Bruchstücke eines menschlichen Brust
krebsgewebes.
Nachdem die erhaltenen massiven Tumoren auf etwa 200 mm³
herangewachsen waren, injizierte man gleiche Mengen einer
Lymphotoxinmischung, die Lymphotoxinproben mit einem
Molekulargewicht von 7×10⁴ bis 9×10⁴ Dalton, 3,5×10⁴
bis 5×10₄ Dalton bzw. 1×10⁴ bis 2×10⁴ Dalton
enthielten, und die man wie in Herstellungsbeispiel 1 nach der Abtrennung
des HuIFN und Reinigung erhalten hatte, intravenös zweimal pro Tag in einer Dosierung
von entweder 4 Einheiten/kg/d oder 40 Einheiten/kg/d.
15 d nach der ersten Injektion tötete man die Tiere und
wog die erhaltenen massiven Tumoren. Die Ergebnisse sind
in Tabelle IV gezeigt. Eine lymphotoxinfreie physiologische
Kochsalzlösung injizierte man intravenös als Ver
gleich.
Versuch 2
Gruppen von je 10 männlichen BDF₁-Mäusen pro Gruppe mit
einem Gewicht von etwa 25 g pro Maus transplantierte man
subkutan in den Rückenbereich Gewebestücke von Lewis′s-
Lungenkrebs von 2 mm im Quadrat. Nach einem Zeitraum von
8 d nach der Transplantation injizierte man den Tieren
intravenös zweimal jeden Tag entweder eine Lymphotoxin
mischung oder eine gamma Lymphotoxinzubereitung mit einem
Molekulargewicht von 1×10⁴ bis 2×10⁴ Dalton, die man
beide in Herstellungsbeispiel 1 nach Abtrennung des HuIFN und Reinigung erhalten hatte, in
einer Dosis von entweder 4 Einheiten/kg/d oder 40 Einhei
ten/kg/d. 21 g nach der ersten Injektion tötete man die
Tiere und wog die erhaltenen massiven Tumoren. Die Ergeb
nisse sind in Tabelle V gezeigt. Eine lymphotoxin
freie physiologische Kochsalzlösung injizierte man intra
venös als Vergleich.
Versuch 3
Gruppen von 20 männlichen BDF₁-Mäusen pro Gruppe mit
einem Gewicht von etwa 25 g pro Maus transplantierte man
subkutan eine Leukämiezellinie von Mäusen, L-1210, in den Rücken
bereich. Ab dem folgenden Tag nach der Transplantation
injizierte man den Tieren intravenös einmal oder zweimal
jeden Tag eine Dosis von entweder 30 Einheiten/kg/d oder
300 Einheiten/kg/d und bestimmte den Zeitraum, den man
für eine 50%ige Überlebensrate benötigte.
Enweder eine lymphotoxinfreie physiologische Kochsalzlösung
oder Mitomycin C in einer Dosierung von 0,5 mg/kg/d inji
zierte man intravenös als Vergleich. Die Ergebnisse sind
in Tabelle VI gezeigt.
Die Versuchsergebnisse von Tabelle VI bestätigen, daß man
trotz der relativ kleinen Dosis der Lymphotoxinmischung
eine viel wirksamere Behandlung durch Steigerung der Fre
quenz der täglichen Dosis von 1 auf 2 erwarten kann.
Versuch 4
Gruppen von 20 männlichen BDF₁-Mäusen pro Gruppe mit einem
Gewicht von etwa 25 g pro Maus transplantierte man eine
Zellinie, P 388, die aus Mäuseleukämie stammte. Ab dem
folgenden Tag nach der Transplantation injizierte man den
Tieren jeden Tag die Lymphotoxinmischung 30 d lang und be
stimmte das Verhältnis zwischen der Dosis und den Überle
benstagen oder das Überlebensverhältnis (%).
Entweder eine lymphotoxinfreie physiologische Kochsalzlösung
oder Mitomycin C in einer Dosis von 0,5 mg/kg/d injizierte
man intravenös als Vergleich.
Die Ergebnisse sind in Tabelle VII gezeigt.
Wie sich aus den Versuchsergebnissen in Tabelle VII ergibt,
ist die Verabreichung in einer großen Dosis, d. h. 1000 Ein
heiten/kg/d oder mehr viel wirksamer, wenn man die Lympho
toxinmischung als prophylaktisches oder therapeutisches
Mittel verwendet.
Versuch 5 Akute Toxizität
Eine Prüfung auf akute Toxizität, wobei man einer Gruppe von
20-d-alten Mäusen eine Lymphotoxinmischung von Herstellungs
beispiel 1 (erhalten nach der Abtrennung des HuIFN und Reinigung), verarbreichte, bestätigte, daß die Toxizität der
Lymphotoxinmischung extrem gering ist, d. h. einen LD₅₀-Wert
von 10 000 Einheiten/kg oder mehr nach intraperitonealer
Injektion aufweist.
Die Konzentration der Lymphotoxinmischung, die man für eine
50%ige Hemmung der Zellvermehrung in vitro benötigt, be
stimmte man unter Verwendung entweder von normalen mensch
lichen Zellen oder menschlichen Tumorzellen auf übliche
Weise und erhielt die nachstehenden Ergebnisse: Bei den
normalen menschlichen Zellen, z. B. menschlichen Darmzellen
(407-Linie) menschliche Chang-Leberzellen und Girardi-Herz
zellen war die Konzentration extrem hoch, d. h. 20 000 Einhei
ten/ml oder mehr, während bei menschlichen Tumorzellen,
z. B. KB-Zellen aus dem Nasen-Rachen-Raum, HEp-2-Zellen aus
dem menschlichen Kehlkopf, HEL-Zellen aus Lungenkrebs,
die Konzentration außerordentlich gering war, d. h. 18 Einhei
ten/ml, 24 Einheiten/ml bzw. 33 Einheiten/ml.
Wie sich aus dem beschriebenen Versuch ergibt, ist das er
findungsgemäße TZLF sehr sicher und wirksam aus der Sicht,
daß eine hohe Dosis normale Zellen praktisch nicht an
greift, während eine geringe Dosis bemerkenswert Tumorzellen
angreift: Demgemäß ist es zur Behandlung von verschiedenen
Krankheiten vorteilhaft verwendbar, die auf TZLF ansprechen.
Vor der Verabreichung des TZLFs an einen Patienten, der an
einem malignen Tumor leidet, kann man es ggf. in vitro mit
einem Bruchstück des Tumorgewebes behandeln, das man dem
Patienten entnommen hat, um die Eigenschaft des TZLFs zu erhöhen,
als Immunogen zu wirken, und es dem Patienten verabreichen,
um eine weitere wirksame Behandlung des malignen Tumors
durchzuführen.
Die Dosis des erfindungsgemäßen TZLFs liegt im allgemeinen
im Bereich von 5 bis 50 000 000 Einheiten/d für einen Er
wachsenen: insbesondere bei lokaler Verabreichung, z. B. in
Form von Kollyrium oder lokaler Injektion 5 bis 1 000 000
Einheiten/d; bei Verabreichung durch die Haut oder durch die
Schleimhaut (perkutan oder permukos), z. B. in Form von
Salbe oder Suppositorium, 10 bis 5 000 000 Einheiten/d; bei
systemischer bzw. innertherapeutischer Verabreichung, z. B.
intravenöser oder intramuskulärer Injektion, 50 bis
10 000 000 Einheiten/d; und bei oraler Verabreichung,
500 bis 50 000 000 Einheiten/d; die Dosis ist jedoch in
Abhängigkeit von ihren Anwendungsvorschriften und den Sympto
men des Patienten frei variierbar.