DE3418820C2

DE3418820C2 -

Info

Publication number: DE3418820C2
Application number: DE3418820A
Authority: DE
Inventors: Osamu Yano; Takafumi Mobara Chiba Jp Kitano
Original assignee: Mitsui Toatsu Chemicals Inc
Current assignee: Mitsui Toatsu Chemicals Inc
Priority date: 1983-05-30
Filing date: 1984-05-21
Publication date: 1987-12-17
Also published as: GB2140689A; FR2547500B1; GB2140689B; GB8413576D0; US4657896A; CA1222699A; JPH0427964B2; JPS59219235A; DE3418820A1; FR2547500A1

Description

Die Erfindung betrifft die Verwendung von Desoxyribonucleinsäure oder deren Salze zur Behandlung von Verdauungsgeschwüren.

Patienten mit Verdauungsgeschwüren nehmen derzeitig als Folge von verstärktem seelischen Streß, verursacht durch eine Komplizierung des sozialen Lebens, zu. Vieles von Mechanismus und der Pathophysiologie von Verdauungsgeschwüren ist noch unbekannt, und es gibt noch keine entscheidende therapeutische Methode für diese Erkrankung.

Verdauungsgeschwür wird derzeit hauptsächlich durch pharmako-therapeutische Maßnahmen behandelt, wobei Antisäure-, antipeptische Mittel oder anticholinergische Mittel gegen den Verdauungstrakt angreifende Faktoren, verkörpert durch Magensäure und Pepsin, verwendet werden.

Andererseits wird angenommen, daß in einem lebenden Organismus der Beginn eines Verdauungsgeschwürs von der Ausübung eines therapeutischen Antigeschwür-Mechanismus begleitet sein kann, was als eine der mit lebenden Organismen ausgestatteten Schutzmöglichkeiten angesehen wird. Der Gedanke dieses Schutzvermögens lebender Organismen findet nun Interesse, und einige Versuche sind gemacht worden, dieses Vermögen zu stärken, um dadurch die Geschwürtherapie zu beschleunigen. Extrakte aus pflanzlichen oder tierischen Geweben und synthetische Verbindungen haben sich mit diesem Versuch auf einer Linie erwiesen. In den letzten Jahren haben sich Erwartungen insbesondere für Medikamente auf diesem Gebiet verstärkt.

Da Arzneimittel gewöhnlich in Kombination bei der Therapie von Verdauungsgeschwüren verwendet werden, ist die Bereitstellung eines solchen Medikaments erwünscht, das andere Wirkungsmerkmale und physikalische Eigenschaften als herkömmlicherweise verwendete Substanzen hat.

Ferner gibt es das Problem der Nebenwirkungen, wenn Medikamente für längere Zeit verabreicht werden, um das Wiederauftreten von Verdauungsgeschwüren zu verhindern, die eine hohe Wahrscheinlichkeit im Wiederauftreten aufweisen.

Aus Martindale, "The Extra Pharmacopoeia", 26 Ed., S. 2010 und 2038 und aus "Index Noninum" 1975/76, S. 32 ist bereits die therapeutische Verwendung von DNA und RNA für verschiedene Zwecke bekannt.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Schaffung eines Arzneimittels, das man bei der Behandlung der genannten Geschwüre leichter verabreichen und zuverlässig verwenden kann.

Nach der Erfindung wird diese Aufgabe durch die Verwendung gemäß Hauptanspruch gelöst. Eine bevorzugte Verwendungsform ist aus dem Unteranspruch ersichtlich.

Viele pharmakologische Wirkungen von Nucleinsäurederivaten sind unbekannt, und im Hinblick auf ihre medizinische Anwendung ist fast nichts untersucht worden. So entstand das Interesse an der medizinischen Anwendung von Nucleinsäurederivaten; Untersuchungen haben im Ergebnis bestätigt, daß Nucleinsäurederivate, insbesondere DNA, eine bemerkenswerte wirtsvermittelte Antitumowirkung sowie ausgezeichnete Sicherheit zeigen (siehe JA-OS 1 39 096/1982).

Es wurde gefunden, daß DNA die Heilung von Verdauungsgeschwüren bemerkenswert beschleunigt.

Vorteilhaft macht das erfindungsgemäß verwendete Arzneimittel, als aktiven Bestandteil DNA oder deren Salze enthaltend, ein Gemisch aus DNA und RNA nutzbar, wie man es mit Hilfe von Mycobacterium bovis BCG (ATCC 19 015) erhält.

Die erfindungsgemäß zu verwendenden Produkte umfassen solche, die aus Kälber-Thymus, Lachshoden, Mikroorganismen oder anderen Naturprodukten hergestellt wurden, worunter solche, die bereits bei Nahrungsmitteln oder Medikamenten angewandt wurden, unter dem Gesichtspunkt der Sicherheit bevorzugt werden. Sogenannte künstlich hergestellte Nucleinsäuren, die nach einer chemischen oder biochemischen Methode erhalten werden, können auch verwendet werden. Sie werden verkörpert durch Desoxyribonucleinsäure, Ribonucleinsäure, deren Gemische, oder sie enthaltende Fraktionen. Es ist ratsam, daß die pharmakologischen und physikochemischen Eigenschaften einer jeden Nucleinsäure mit dem Ziel der Erfindung im Einklang stehen und daß die Menge an Verunreinigungen, die Fieber oder andere Nebenwirkungen hervorrufen können, die in der Nucleinsäure enthalten sind, so klein wie möglich ist. Diese Nucleinsäuren können ferner erwärmt, alkalisch behandelt oder einer anderen physikalisch-chemischen Behandlung oder einer Nuclease-Behandlung oder anderen biochemischen Behandlungen unterworfen werden, um als Material für Arzneimittel geeigneter zu sein. Eine Wärmebehandlung ist besonders vorzuziehen aufgrund der Leichtigkeit dieser Maßnahme. Ziel dieser Behandlungen ist es, die Wirkung der Nucleinsäurederivate des erfindungsgemäßen Arzneimittels zu verbessern, die Herstellung zu erleichtern und weiter die Löslichkeit für die Arzneimittel-Verabreichung zu erhöhen.

Die Erfindung wird nachstehend anhand von Beispielen näher erläutert.

Bezugsbeispiel 1 Herstellung von aus BCG stammendem Nucleinsäureprodukt

Mycobacterium bovis BCG, ATCC 19 015, wurde auf einem Fleischextrakt-Glycerin-Medium bei 37°C 3 Wochen statisch kultiviert und das Kulturmedium zentrifugiert, um feuchte Bazillen zu erhalten. 3,3 kg dieser feuchten Bazillen wurden in einer siebenfachen Menge einer 10 mM Phosphat-Pufferlösung (pH 7,0) suspendiert und unter Eiskühlung mit einer DYNO-Mühle, anschließend mit einer Zentrifuge bei 20 000 g für 20 min aufgebrochen, um 21 l Zellextrakt zu erhalten. Dieser wurde mit 63 g Streptomycinsulfat versetzt, unter ausreichendem Rühren gemischt und über Nacht bei 4°C stehengelassen, und die gebildeten Niederschläge wurden abzentrifugiert und in einem 10 molearen Phosphat-Puffer (pH 7,0), der 0,5 M NaCl enthielt, suspendiert. Diese Suspension wurde gegen den gleichen Puffer und dann gegen destilliertes Wasser dialysiert, um 8 l einer Nucleinsäureprodukt enthaltenden Suspension zu erhalten.

Eine gleiche Menge einer 1,8%igen NaCl-Lösung wurde zu einem Liter der Suspension gegeben, unter Rühren gemischt und 60 min auf 100°C erhitzt. Nach dem Abkühlen der Suspension wurde diese bei 10 000 g 20 min zentrifugiert und die überstehende Flüssigkeit abgetrennt, wozu NaCl gegeben wurde, so daß die Endkonzentration 0,4 M war, und gerührt, Cetyltrimethylammoniumbromid (Tokyo Kasei Kogyo) wurde der Lösung zugesetzt, so daß die Endkonzentration 0,2% (G/V) war, unter ausreichendem Rühren gemischt und 30 min bei Raumtemperatur stehen gelassen. Die gebildeten Niederschläge wurden durch Zentrifugieren gesammelt und in 400 ml einer 1 m NaCl gelöst.

Eine gleiche Menge eines Chloroform/Isoamylalkohol (24 : 1)-Gemischs wurde zu der Lösung gegeben, geschüttelt und zentrifugiert, um die wäßrige Phase abzutrennen. Nach zweimaliger Wiederholung dieses Vorgangs wurde eine dreifache Menge 99,5%igen Ethanols zu der erhaltenen wäßrigen Phase gegeben, unter Rühren gemischt und über Nacht bei 4°C stehen gelassen. Die gebildeten Niederschläge wurden durch Zentrifugieren gesammelt, in destilliertem Wasser gelöst, gegen destilliertes Wasser dialysiert und gefriergetrocknet, um 1,04 g aus BCG stammenden Nucleinsäureprodukt zu erhalten. Dieses Produkt wies 70% Desoxyribonucleinsäure, 28% Ribonucleinsäure und Spurenmengen anderer Bestandteile auf. Nachdem die Desoxyribonucleinsäure und die Ribonucleinsäure fraktioniert worden waren (siehe Schneider, W. C. (1946), J. Biol. Chem. 164, 747), wurden die Nucleinsäuren quantitativ bestimmt. Desoxyribonucleinsäure wurde nach der Diphenylamin-Methode bestimmt (siehe Burton, K. (1956), Biochm. J. 62, 3, 5) mit Kälberthymus-Desoxyribonucleinsäure als Standard, und Ribonucleinsäure wurde nach der Orcin-Methode (siehe Mejbaum, W. (1939) Hoppe-Seyler's Z. Physiol. Chem. 258, 117) mit Hefe-Ribonucleinsäure als Standard bestimmt (die Bestimmungen erfolgten in den folgenden Beispielen in der gleichen Weise).

Bezugsbeispiel 2

Bacillus subtilis, ATCC 6633, wurde unter Schütteln auf einem Pepton-Medium 6 h bei 37°C kultiviert, und das Kulturmedium wurde zentrifugiert, um feuchte Bazillen zu erhalten. 98 g der erhaltenen feuchten Bazillen wurden in 100 ml eines Phosphat-Puffers (pH 7,0) suspendiert, und eine Lösung von aus Bazillen stammendem Nucleinsäureprodukt wurde in der gleichen Weise, wie im Bezugsbeispiel 1, hergestellt. Die erhaltene Lösung wurde mit 1 n NaOH neutralisiert und gefriergetrocknet, um 158 mg einer getrockneten Probe zu erhalten. 90 mg davon wurden in 10 ml eines 0,05 m Acetat-Puffers (pH 4,5) gelöst, wozu 200 E Ribonuclease T2 (Sankyo), gelöst in 2 ml des Puffers, gegeben und 22 h bei 37°C inkubiert wurden.

Eine gleiche Menge Chloroform-Isoamylalkohol (24 : 1)-Gemisch wurde zur Reaktionsflüssigkeit gegeben, geschüttelt und zentrifugiert, um die wäßrige Schicht zu trennen. Nach Wiederholung dieses Vorgangs wurde die Gesamtmenge der wäßrigen Schicht auf eine Säule (2,5 × 90 cm) mit Sephadex G-100 (Pharmacia Fine Chemicals, Inc.) gebracht, zuvor mit 0,5 m Ammoniumbicarbonat ins Gleichgewicht gebracht und mit der Lösung eluiert. Die Desoxyribonucleinsäure enthaltende Fraktion, die zuerst eluiert worden war, wurde aufgefangen und gegen destilliertes Wasser dialysiert. Das Dialysat wurde mit 1 n NaOH neutralisiert und gefriergetrocknet, um 72 mg eines Natriumsalzes von aus Bazillen stammenden Nucleinsäureprodukt zu erhalten.

Das so erhaltene Nucleinsäureprodukt umfaßte im wesentlichen Desoxyribonucleinsäure.

Bezugsbeispiel 3

Das im Bezugsbeispiel 1 erhaltene, aus BCG stammende Nucleinsäureprodukt wurde mit Ribonuclease (der Sigma Corp.) und weiter mit Pronase abgebaut und mit Chloroform zwecks Entproteinierung geschüttelt. Die wäßrige Phase dieses entproteinierten Nucleinsäureprodukts wurde an einer Säule mit Sepharose CL 6B (der Pharmacia Fine Chemicals, Inc.), die in den Tests eingesetzt werden sollten, fraktionsgereinigt. Der Desoxyribonucleinsäure-Gehalt der erhaltenen Nucleinsäureprodukte lag nicht unter 98%.

Bezugsbeispiel 4

Das im Bezugsbeispiel 1 erhaltene Nucleinsäureprodukt wurde mit Desoxyribonuclease 1 (der Worthington Corp.) abgebaut und mit Chloroform zwecks Entproteinierung geschüttelt. Die wäßrige Phase der entproteinierten Produkte wurde bei den Tests eingesetzt, nachdem sie der Fraktionsreinigung an einer Sephadex G-50-Säule unterworfen worden war. Der Ribonucleinsäure-Gehalt der erhaltenen Produkte lag nicht unter 98%.

Hauptsächlich bringt DNA die Heilungswirkung. Jedoch erhält man bei der Verabreichung einer geeigneten Menge RNA zusammen mit DNA noch eine etwas größere Wirkung.

Nach der Erfindung erhält man einen bemerkenswerten Effekt bei der Heilung des Essigsäuregeschwürs bei Ratten, das als morphologisch ähnliches Modell für Geschwüre beim Menschen angesehen wird. Ferner zeigt sich, daß die wirksame Dosis des Mittels einen breiten Bereich hat.

Das erfindungsgemäß verwendete Arzneimittel hat eine extrem niedrige akute Toxizität und ist sicher in seiner Antigenizität. Als Ergebnis der Tests wurde bestätigt, daß Fiebererzeugung, Schmerz, entzündungsfördernde Eigenschaften oder andere Störungen so gering sind, daß sie bei der gewöhnlichen Anwendung als Medikament zu vernachlässigen sind.

Da das erfindungsgemäß verwendete Arzneimittel auch tumorzid wirkt, eignet es sich für die Heilung von Verdauungsgeschür, z. B. Magengeschwür, das zu einer Krebsvorstufe oder weiter zu Magenkrebs fortschreitet.

Das erfindungsgemäß verwendete Arzneimittel kann als solches oder in Kobination mit üblicherweise verwendeten Zusätzen oder Bindemittel eingesetzt werden. Dosis, Methode und Verabreichungsweg werden je nach dem Fall gewählt. Im allgemeinen ist es ratsam, 0,001 bis 100 mg in einer Dosis in 1- bis 7tägigen Abständen zu verabreichen.

Der Verabreichungsweg kann intradermal, hypoderm intramuskulär, intravenös, oral oder als direkte Verabreichung am Ort der Erkrankung gewählt werden.

Es folgen weiterhin einige Beispiele mit zugehörigen Tests.

Beispiel 1 Flüssigpräparate

100 mg des im Bezugsbeispiel 1 erhaltenen, aus BCG stammenden Nucleinsäureprodukts wurden in 100 ml phosphatgepufferter Salzlösung (der Nissui Seiyaku Co.) gelöst und unter sterilen Bedingungen unter Verwendung eines Nuclepore-Filters (0,2 µm, Nuclepore Corp.) filtriert. 1,5 ml-Portionen des erhaltenen Filtrats wurden unter sterilen Bedingungen in Ampullen gegossen (Flüssigpräparat).

Beispiel 2 Lyophilisierte Präparate

100 mg des aus BCG stammenden Nucleinsäureprodukts wurden in 100 ml destilliertem Wasser zur Injektion gelöst, wozu 5 g Mannit gegeben und gelöst wurden, und filtriert wurde unter sterilen Bedingungen mit einem Nuclepore-Filter (0,2 µm). Nachdem 1 ml-Portionen des erhaltenen Filtrats unter sterilen Bedingungen in Ampullen gegossen worden waren, wurde die Lösung gefriergetrocknet, um ein erfindungsgemäßes lyophilisiertes Präparat zu erhalten.

Test 1 Einfluß auf Essigsäure-Geschwür

Essigsäure-Geschwür, das chronische Ratten-Geschwürmodell, wurde in den Mägen männlicher Wistar-Ratten nach der Methode von Okabe et al. (Okabe, S., et al., Amer. J. Dig. Dis. Bd. 16, 277 (1971)) hervorgerufen, um den Einfluß einer Reihe von Nucleinsäuren zu prüfen. Die in einer physiologischen Salzlösung gelösten Nucleinsäuren wurden hypodermal in die Rücken von Ratten sechsmal jeden zweiten Tag mit dem Tag nach der Operation verabreicht. Die Mägen wurden am Tag nach der letzten Verabreichung (dem 12. Tag nach der Operation) herausgelöst und mit Formalin leicht fixiert, und die größten und kleinsten Durchmesser des ulcerösen Bereichs wurden gemessen. Der Geschwürindex und das Heilverhältnis wurden nach den folgenden Formeln errechnet:

Geschwürindex (mm²) = großer Durchmesser (mm) × kleiner Durchmesser (mm)

Die Ergebnisse sind in Tabelle I zusammengefaßt.

Tabelle I

Test 2A Einfluß von aus BCG-stammenden Nucleinsäureprodukten auf Essigsäure-Geschwür (Teil 1)

Der Einfluß von im Bezugsbeispiel 1 erhaltenen, aus BCG stammenden Nucleinsäureprodukten wurde in der gleichen Weise wie im Test 1 untersucht. Die Ergebnisse sind in Tabelle II zusammengefaßt.

Tabelle II

Test 2B Einfluß von aus BCG stammenden Nucleinsäureprodukten auf Essigsäure-Geschwür (Teil 2)

Der Einfluß von im Bezugsbeispiel 1 erhaltenen, aus BCG stammenden Nucleinsäureprodukten und der Desoxyribonucleinsäure und Ribonucleinsäure, aus der BCG-Nucleinsäure abgetrennt, wurde in der gleichen Weise wie beim Test 1 getestet. Die Ergebnisse sind in Tabelle III zusammengefaßt.

Tabelle III

Test 3A Akuter Toxizitätstest von BCG-Nucleinsäureprodukten

Das im Bezugsbeispiel 1 erhaltene BCG-Nucleinsäureprodukt, in einer physiologischen Salzlösung gelöst, wurde mit einer Dosis von 1 g/kg Körpergewicht männlichen ddY-Mäusen im Alter von 5 Wochen, die in Gruppen von jeweils 10 Tieren unterteilt waren (durchschnittlich 23 g Gewicht), intravenös verabreicht. Während der Beobachtungsdauer von 1 Woche nach Verabreichung wurde weder eine Behinderung der Gewichtszunahme noch ein Todesfall beobachtet. Daraus ergibt sich, daß die DL₅₀ dieser Substanz bei intravenöser Verabreichung nicht kleiner als 1g/kg ist.

Test 3B Akuter Toxizitätstest von BCG-Desoxyribonucleinsäure

Die akute Toxizität der im Test 2B verwendeten BCG-Desoxyribonucleinsäure wurde in der gleichen Weise wie im Test 3A geprüft. Aus dem Testergebnis ergibt sich, daß die DL₅₀ dieser Substanz bei intravenöser Verabreichung nicht kleiner als 1 kg/kg ist.

Test 4A Antigenizitätstest von BCG-Nucleinsäure

Das im Bezugsbeispiel 1 erhaltene BCG-Nucleinsäureprodukt, gelöst in einer physiologischen Salzlösung, wurde in einer Dosis von 1 mg pro Tier männlichen Hartley-Meerschweinchen, die in Gruppen von jeweils 6 Tieren unterteilt worden waren (durchschnittlich 350 g Gewicht), sechsmal (dreimal pro Woche) zwecks Sensibilisierung intradermal verabreicht. Zwei Wochen nach der letzten Sensibilisierung wurde das gleiche BCG-Nucleinsäureprodukt, in einer physiologischen Salzlösung gelöst, in einer Dosis von 10 mg oder 2 mg/kg Körpergewicht intravenös verabreicht. Aus dem Ergebnis der Prüfung auf Antigenizität dieser Substanz durch Beobachten des Verhaltens der Meerschweinchen zu dieser Belastung ergibt sich, daß bei der obigen Dosis keinerlei anaphylaktischer Schock induziert wurde.

Test 4B Antigenizitätstest von BCG-Desoxyribonucleinsäure

Die Antigenizität der im Test 2B verwendeten BCG-Desoxyribonucleinsäure wurde in der gleichen Weise wie beim Test 4A getestet. Als Ergebnis wurde gefunden, daß diese Substanz keinen anaphylaktischen Schock induzierte.

Claims

1. Verwendung von Desoxyribonucleinsäure oder deren Salzen zur Behandlung von Geschwüren des Verdauungstraktes.

2. Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß ein Gemisch von Desoxyribonucleinsäure und Ribonucleinsäure, hauptsächlich die Desoxyribonucleinsäure aufweisend, vorliegt.