DE3421731A1

DE3421731A1 - Human tumour necrosis factor

Info

Publication number: DE3421731A1
Application number: DE19843421731
Authority: DE
Inventors: Günther Dr. Adolf; Ingrid Dr. Wien Fogy
Original assignee: Boehringer Ingelheim International GmbH
Current assignee: Boehringer Ingelheim International GmbH
Priority date: 1984-06-12
Filing date: 1984-06-12
Publication date: 1985-12-12

Abstract

The invention relates to a process for the preparation and purification of human tumour necrosis factor and to the factor itself.

Description

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur HerstellungThe invention relates to a method for production

und Reinigung des Humanen-Tumor-Nekrose-Faktors (Hu-TNF) sowie der Faktor selbst.and purification of Human Tumor Necrosis Factor (Hu-TNF) and the Factor itself.

Seit langer Zeit ist bekannt, daß Seren von Tieren, die mit Bacillus Calmette-Guerin sensitiviert und mit bakteriellem Endotoxin behandelt werden, eine Substanz enthalten, die haemorrhagische Nekrosen und/oder Wachstumshemmung bei transplantierbaren Tumoren hervorruft. Diese Substanz, ein Protein, dessen Wirkung erstmals von Corswell et al. (1) aufgezeigt und Tumor-Nekrose-Faktor (TNF) genannt wurde, zeigt zwar auf Tumorzellen sowonl in vivo als auch in vitro cytostatische oder cytotoxische Wirkung, nicht jedoch auf normale Zellen (2-5).It has long been known that sera from animals infected with Bacillus Calmette-Guerin sensitized and treated with bacterial endotoxin, one Substance containing hemorrhagic necrosis and / or growth retardation in transplantable Causes tumors. This substance, a protein, whose effect was first discovered by Corswell et al. (1) and called Tumor Necrosis Factor (TNF) does show Tumor cells both in vivo and in vitro cytostatic or cytotoxic effect, but not on normal cells (2-5).

Menschliche B-lymphoblastoide Zellinien produzieren einen Faktor, der ursprünglich als Lymphotoxin bezeichnet wurde (24,25); es konnte allerdings gezeigt werden, daß es sich um einen Humanen-Tumor-Nekrose-Faktor handelt (5). Auch dieses Protein zeigt bei menschlichen Tumorzellinien in vitro cytostatische und cytotoxische Eigenschaften.Human B-lymphoblastoid cell lines produce a factor originally referred to as lymphotoxin (24.25); it could can be shown to be a human tumor necrosis factor (5). Even this protein shows cytostatic and in vitro in human tumor cell lines cytotoxic properties.

Diese Substanz, der ein Molekulargewicht von etwa 70.000 zugeschrieben wird (5), weist neben der cytostatischen/ cytotoxischen Wirkung in vitro auch eine Potenzierung der Anti-Tumor-Wirkung von humanem Leukozyten-Qi) oder Immun-(/)-Interferon auf (5).This substance is attributed to a molecular weight of about 70,000 is (5), has a cytostatic / cytotoxic effect in vitro as well as a Potentiation of the anti-tumor effect of human leukocyte qi) or immune (/) - interferon on (5).

Diese vielversprechenden P;jnsciiaften lassen das Protein zu einem pole. l wichtigen Faktor bei der Therapie maligner Erkrankungen des Menschen werden. Ausführliche Untersuchungen ließen sich bislang nicht durchführen, da HU-TNF bis vor kurzem nicht bis zur1 für klinische Prüfungen ausreichenden Homogenität gereinigt werden konnte.These promising P; jnsciiaften turn the protein into one pole. l become an important factor in the therapy of malignant diseases in humans. Detailed examinations could not be carried out so far, since HU-TNF up to recently not purified to the homogeneity1 sufficient for clinical trials could be.

Die bei der Reinigung und Konzentrierung tierischer Tumor-Nekrose-Faktoren angewandten Verfahren, wie beispielsweise Ammonsulfat-Fällung, Gel filtration, Gelelektrophorese oder Ionenaustausch-Chromatographie und für die Konzentrierung, Ultrafiltration oder Lyophilisierung (2,4-7) konnten für die erforderlichen Reinigungs- und Homogenitätsqualitäten für den Humanen-Tumor-Nekrose-Faktor nicht befriedigen.Those involved in purifying and concentrating animal tumor necrosis factors applied methods, such as ammonium sulphate precipitation, gel filtration, gel electrophoresis or ion exchange chromatography and, for concentration, ultrafiltration or lyophilization (2,4-7) were able to achieve the required cleaning and homogeneity qualities unsatisfactory for the human tumor necrosis factor.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es daher, Humanen-Tumor-Nekrose-Faktor in Mengen und einer Reinheit bereitzustellen, die ausführliche Untersuchungen der biologischen Eigenschaften sowie klinische Studien möglich machen.The object of the present invention was therefore to find human tumor necrosis factor to be provided in quantities and a purity that allows detailed investigations of the make biological properties as well as clinical studies possible.

Erfindungsgemäß gelöst wurde die Aufgabe durch die Merkmale der Kennzeichen des Anspruchs 1.According to the invention, the object was achieved by the features of the marks of claim 1.

Human-B-lymphoblastoide Zellen wurden in Serum- und Antibiotika-haltigen RPMI 1640-Medium (10) bei 370C angezüchtet. Die herangewachsenen Zellen wurden vom Medium getrennt und in serumfreies Medium überführt.Human B lymphoblastoid cells were serum- and antibiotic-containing RPMI 1640 medium (10) grown at 370C. The grown cells were from Medium separated and transferred to serum-free medium.

Diesem Medium wurden literaturbekannte Tumorpromotoren, beispielsweise Phorbolester oder Mezerein zugesetzt.Tumor promoters known from the literature, for example Phorbol ester or mezerein added.

Nach Abtrennung des Mediums wurde der in den Kulturüberständen, im Medium enthaltene Faktor durch Chromatographie über porenkontrolliertes Glas (CPG) konzentriert und gereinigt. Das erhaltene TNF-Eluat wurde durch Anionenaustauschchromatographie und Affinitätschromatographie über Lectin-Säulen zu mehr als 90 % gereinigt. Die Ausbeute betrug etwa 100 - 200/ug pro Liter Zellkultur-Überstand.After the medium had been separated off, the in the culture supernatants, im Factor contained in the medium by chromatography over pore-controlled glass (CPG) concentrated and purified. The obtained TNF eluate was subjected to anion exchange chromatography and affinity chromatography over lectin columns to more than 90%. the The yield was about 100-200 / ug per liter of cell culture supernatant.

Der auf diese Weise hergestellte Humane-Tumor-Nekrose-Faktor läßt sich wie folgt charakterisieren: Das Molekulargewicht wurde unter nicht denaturierenden Bedingungen zu 70.000 + 10 % bestimmt. Unter denaturierenden Bedingungen wurde eine Größenheterogentität festgestellt. Es zeigten sich drei Spezies mit Molekulargewichten von 21.500, 23.000 und 24.000 mit möglichen Schwankungen von jeweils t 10 %. Diese Heterogenität war unabhängig von der An- oder Abwesenheit reduzierender Agentien. Bei der isoelektrischen Fokussierung konnten im. pH-Bereich von 5.5 - 7.5 mehrere Spezies beobachtet werden.The human tumor necrosis factor produced in this way leaves can be characterized as follows: The molecular weight was among non-denaturing Conditions determined to be 70,000 + 10%. Under denaturing conditions a Size heterogeneity detected. There were three species with molecular weights of 21,500, 23,000 and 24,000 with possible fluctuations of t 10% each. These Heterogeneity was independent of the presence or absence of reducing agents. With isoelectric focusing, im. pH range from 5.5 - 7.5 several Species are observed.

Durch proteolytische Enzyme wurde der Faktor aufgespalten und eine Karte proteolytischer Spaltprodukte erstellt, sowie deren N-terminale Aminosäuresequenzen ermittelt.The factor was broken down by proteolytic enzymes and one Map of proteolytic cleavage products and their N-terminal amino acid sequences determined.

Die N-terminale Aminosäuresequenz des intakten Tumor-Nekrose-Faktors. konnte durch die DABITC/PITC-Doppelkopplungsmethode (16) ermittelt werden. Schließlich wurde die cytostatische und cytotoxische Wirkung auf humane und murine Tumorzellinien in vitro nachgewiesen.The N-terminal amino acid sequence of the intact tumor necrosis factor. could be determined by the DABITC / PITC double coupling method (16). In the end was the cytostatic and cytotoxic effects on human and murine tumor cell lines detected in vitro.

Nachfolgend wird die Erfindung detailliert beschrieben.The invention is described in detail below.

Um den Humanen-Tumor-Nekrose-Faktor nachweisen und die Effektivität der einzelnen Reinigungsschritte überprüfen zu können, wurde ein biologisches Testverfahren durchgeführt, mit dem die cytotoxische Aktivität des Faktors nachgewiesen werden konnte.To prove the human tumor necrosis factor and its effectiveness Being able to check the individual cleaning steps became a biological test procedure carried out, with which the cytotoxic activity of the factor can be detected could.

In der Literatur werden eine Reihe von Methoden zur Bestimmung der Aktivität cytotoxischer Proteine beschrieben, darunter die Bestimmung der Zelldichte von Tumorzellkulturen, die Messung der Freisetzung von radioaktivem Chrom aus vormarkierten Zellen und andere Verfahren (5, 19, 25, 28). Alle diese Methoden können grundsätzlich eingesetzt werden.A number of methods for determining the Activity of cytotoxic proteins described, including the determination of cell density of tumor cell cultures, measuring the release of radioactive chromium from pre-labeled Cells and other procedures (5, 19, 25, 28). All of these methods can in principle can be used.

Im vorliegenden Fall wurde die TNF-Aktivität durch Bestimmung des cytotoxischen Effekts auf transformierte Mauszellen der Zellinie alpha-L 929 gemessen.Diese Zelllinie zeichnet sich durch besondere Sensitivität gegenüber Lymphotoxin aus (23). Der verwendete Test mißt die Freisetzung von radioaktivem Material aus mit Tritium-Thymidin vorbehandelten Zellen und wurde im wesentlichen nach literaturbekannten Verfahren durchgeführt (26). Eine TNF-Konzentration von einer Einheit pro Milliliter führt definitionsgemäß zur Freisetzung von 50 % der gesamten freisetzbaren Radioaktivität.In the present case, the TNF activity was determined by determining the The cytotoxic effect on transformed mouse cells of the alpha-L 929 cell line was measured Cell lines are particularly sensitive to lymphotoxin (23). The test used measures the release of radioactive material from tritiated thymidine pretreated cells and was essentially according to methods known from the literature carried out (26). A TNF concentration of one unit per milliliter results by definition, to release 50% of the total releasable radioactivity.

Die Testzellen (gezüchtet in Eagle's Minimum Essential Medium (12) mit 10 % fötalem Kalbsserum, 100 Einheiten Penicillin/ml und 50 Einheiten Streptomycin/ml) wurden über Nacht mit 2 ,uCi 3H-Thymidin/ml inkubiert, gewaschen und in Plastik-Gewebekulturplatten angesetzt (48 Schalen pro Platte, Durchmesser 11.3 mm, 10.000 Zellen pro Schale in 0.5 ml Medium mit 5 % fötalem Kalbsserum).The test cells (grown in Eagle's Minimum Essential Medium (12) with 10% fetal calf serum, 100 units penicillin / ml and 50 units streptomycin / ml) were incubated overnight with 2 µCi 3H-thymidine / ml, washed and placed in plastic tissue culture plates (48 dishes per plate, diameter 11.3 mm, 10,000 cells per dish in 0.5 ml medium with 5% fetal calf serum).

Vier Stunden später wurden serielle Verdünnungen der zu untersuchenden Proben aufgetragen und drei Tage bei 370 C inkubiert. Anschließend wurden Proben der Kulturüberstände entnommen und ihre Radioaktivität in Flüssigszintillationszähler bestimmt. Als Bezugswert wurden Schalen verwendet, in denen die Zellen durch 0.2 % Natriumdodecylsulfat lysiert wurden. Ein Laborstandardwurde bei allen Tests mitgeführt, um die schwankende Sensitivität der Zellen berücksichtigen zu können.Four hours later, serial dilutions of the samples to be examined were made Samples applied and incubated at 370 ° C. for three days. Then samples were made taken of the culture supernatants and their radioactivity in liquid scintillation counter certainly. Dishes were used as a reference value in which the cells were divided by 0.2 % Sodium dodecyl sulfate was lysed. A laboratory standard was included in all tests, in order to be able to take into account the fluctuating sensitivity of the cells.

Die Zellinie RPMI-1788/EBI, die von der von Moore et al.The RPMI-1788 / EBI cell line derived from the Moore et al.

etablierten Zellinie RPMI 1788 (15) abstammt, und bei der Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, Institut Pasteur, Paris, am 23. Mai 1984 unter der Hinterlegungsnummer I-305 hinterlegt ist,wurde in einem geeigneten Kulturmedium, zum Beispiel RPMIX1640 (10), unter Zusatz von fötalem Kalbsserum in einer Konzentration von 5-10 % und Antibiotika, zum Beispiel Penicillin (100 Einheiten/ml) und Streptomycin (50 Einheiten/ml) bei 37 ob kultiviert. Dreimal wöchentlich wurden die Kulturen mit frischem Medium im Verhältnis 1 : 2 verdünnt. Kleinere Volumina wurden in stationärer Kultur in Plastik-Gewebekulturflaschen,größere Mengen entweder in 1 1 -Erlenmeyerkolben auf einem Rotationsschüttler (80 Umdrehungen pro Minute) oder in Plastik-Rollkulturflaschen kultiviert.established cell line RPMI 1788 (15), and in the collection Nationale de Cultures de Microorganismes, Pasteur Institute, Paris, on May 23, 1984 is deposited under the deposit number I-305, was in a suitable culture medium, for example RPMIX1640 (10), with the addition of fetal calf serum in one concentration of 5-10% and antibiotics, for example penicillin (100 units / ml) and streptomycin (50 units / ml) cultured at 37 ob. The cultures were grown three times a week diluted with fresh medium in a ratio of 1: 2. Smaller volumes were in stationary Culture in plastic tissue culture flasks, larger quantities either in 1 liter Erlenmeyer flasks on a rotary shaker (80 revolutions per minute) or in plastic roll culture flasks cultivated.

Die Kulturen erreicEten dabei Zelldichten bis zu 3 x 10'6 Zellen/ml.The cultures achieved cell densities of up to 3 × 10'6 cells / ml.

Das zu reinigende Material sollte eine möglichst hohe1 spezifische Aktivität aufweisen. Serum, ein für die Proliferation der Zellen notwendiger Bestandteil des Kulturmediums, enthält große Proteinmengen (etwa 50 mg/ml) die die spezifische Aktivität des TNF entsprechend reduzieren.The material to be cleaned should be as specific as possible1 Have activity. Serum, a component necessary for the proliferation of cells of the culture medium, contains large amounts of protein (about 50 mg / ml) which are specific to the Reduce the activity of the TNF accordingly.

Überraschend wurde festgestellt, daß nach anfänglicher Proliferation in serumhaltigem Medium die RPMI-1788/EBI-Zellen auch in serumfreiem Medium relativ hohe Mengen an TNF produzieren. Dazu wurden die Zellen aus einer serumhaltigen Kultur einen Tag nach dem Verdünnen mit frischem Medium durch Zentrifugation geerntet und in einem Zehntel des ursprünglichen Volumens an serumfreiem Medium resuspendiert. Um die TNF-Produktion zu steigern,wurde diesem Medium ein literaturbekannter Tumorpromotor, zum Beispiel TPA (12-0-tetradecanoylphorbol-13-acetat) oder Mezerein zugesetzt.It was surprisingly found that after initial proliferation in serum-containing medium the RPMI-1788 / EBI cells are also relative in serum-free medium produce high levels of TNF. For this purpose, the cells were taken from a culture containing serum harvested by centrifugation one day after dilution with fresh medium and resuspended in one-tenth the original volume of serum-free medium. In order to increase TNF production, a tumor promoter known from the literature was added to this medium, for example TPA (12-0-tetradecanoylphorbol-13-acetate) or mezerein added.

Vorzugsweise wurde Mezerein verwendet, das bei gleicher Wirkung auf lymphoide Zellen ein wesentlich schwächerer Tumorpromotor ist (33). Mezerein ist im Handel erhältlich, zum Beispiel von C.C.R., Inc., Chemicals for Cancer Research, 77552 Mitchell Road, Eden Prairie, Minnesota 55344, USA, oder LC Serivices Corporation, 165 Boston Street, Woburn, Massachusetts 01801, USA. Mezerein wurde zu einer Endkonzentration von 5 - 100 ng/ml, bevorzugt 20 ng/ml zugesetzt (Stammlösung 100 ug/ml in Dimethylsulfoxid), und die Zellen wurden in Plastik-Gewebekulturflaschen in stationärer Kultur drei Stunden bei 370C inkubiert. Anschließend wurden die Kulturen zentrifugiert, die Zellen in dem ursprünglichen Volumen an serumfreiem Medium ohne Mezerein resuspendiert und in Plastik-Rollkulturflaschen drei Tage bei 370C inkubiert (0,5 Umdrehungen pro Minute). Danach wurden die Zellen durch Zentrifugation entfernt, der Überstand wurde entweder sofort der weiteren Reinigung zugeführt oder eingefroren und bei -200C gelagert. Die so gewonnenen TNF-Lösungen zeigten hoheTNF-Aktivität (im Durchschnitt etwa 1000 Einheiten/ml) bei gleichzeitig geringen Proteinkonzentrationen (25-50 ,ug/ml).Mezerein was preferably used, which had the same effect lymphoid cells is a much weaker tumor promoter (33). Mezerein is commercially available, for example from C.C.R., Inc., Chemicals for Cancer Research, 77552 Mitchell Road, Eden Prairie, Minnesota 55344, USA, or LC Serivices Corporation, 165 Boston Street, Woburn, Massachusetts 01801, USA. Mezerein became a final concentration from 5 - 100 ng / ml, preferably 20 ng / ml added (stock solution 100 ug / ml in dimethyl sulfoxide), and the cells were grown in stationary culture three in plastic tissue culture flasks Incubated at 370C for hours. The cultures were then centrifuged Cells resuspended in the original volume of serum-free medium without mezerein and incubated in plastic roll culture flasks for three days at 370C (0.5 revolutions per minute). The cells were then removed by centrifugation, the supernatant was either immediately sent for further purification or frozen and with -200C stored. The TNF solutions obtained in this way showed high TNF activity (on average about 1000 units / ml) with low protein concentrations (25-50 , µg / ml).

Im ersten Schritt. des Reinigungsverfahrensmußten große Volumina an Rohlösung verarbeitet werden. Überraschend wurde nun festgestellt, daß Chromatographie über porenkontrolliertes Glas (controlled pore glass, CPG; Fa. SERVA Feinbiochemica, Heidelberg) ein hervorragendes Verfahren zur Konzentrierung und gleichzeitigen Reinigung von TNF darstellt Allgemein ist CPG ein Chromatographie-Trägermaterial mit einer Reihe von Vorteilen.In the first step. of the cleaning process had to take up large volumes Raw solution can be processed. It has now surprisingly been found that chromatography via pore-controlled glass (CPG; SERVA Feinbiochemica, Heidelberg) an excellent method for concentrating and cleaning at the same time of TNF In general, CPG is a chromatography support material with a Number of advantages.

CPG erlaubt auf Grund seiner mechanischen Stabilität und seines geringen Strömungswiderstandes hohe Durchflußraten; es zeigt hohe Beständigkeit gegenüber Chemikalien, kann daher mit starken Säuren regeneriert und oftmals wiederverwendet werden. CPG kann durch Hitze sterilisiert werden und bedarf keiner Vorbehandlung vor der Chromatographie. Darüber hinaus kann durch CPG-Chromatographie eine Verunreinigung durch DNA wirksam entfernt werden (8).CPG allows due to its mechanical stability and its low Flow resistance high flow rates; it shows high resistance to Chemicals, therefore, can be regenerated with strong acids and reused many times will. CPG can be heat sterilized and does not require any pre-treatment before chromatography. In addition, CPG chromatography can cause contamination can be effectively removed by DNA (8).

Die Hu-TNF-haltige Rohlösungwurdezunächst durch ein Papierfilter filtriert und anschließend über Säulen, die porenkontrolliertes Glas enthalten, gepumpt. Ein Großteil des HL. TNF (92 - 98 %) und ein geringer Teil anderer Proteine wurde an das Säulenmaterial gebunden. Anschließend wurde die Säule mit einem geeigneten Puffer gewaschen und damit ein Teil der unerwünschten Proteine entfernt.The crude solution containing Hu-TNF was first filtered through a paper filter and then pumped over columns containing controlled pore glass. A Most of the HL. TNF (92-98%) and a small fraction of other proteins was attached bound the column material. Then the column was filled with a suitable buffer washed and thus some of the unwanted proteins removed.

Schließlichwlqrde der TNF durch ein geeignetes Eluens in einem kleinen Volumen von der Säule gelöst.Überraschenderweise'^nntedurch dieses Verfahren eine mehr als hundertfache Konzentrierung und gleichzeitig eine mehrfache Reinigung erzielt werden. Geeignete Waschpuffer sind zum Beispiel konzentrierte Salzlösungen, wie gepufferte Kochsalz-Lösungen; als Eluentien sind beispielsweise Lösungen von Ethylenglykol, wie 20-50 % Ethylenglykol in einer gepufferten Kochsalz lösung geeignet.Finally, the TNF was removed by a suitable eluent in a small amount Volume detached from the column. Surprisingly, this procedure yielded a More than a hundredfold concentration and at the same time a multiple cleaning achieved will. Suitable washing buffers are, for example, concentrated salt solutions, such as buffered saline solutions; as eluents are, for example, solutions of ethylene glycol, suitable as 20-50% ethylene glycol in a buffered saline solution.

Alternativ kann dieses Verfahren auch im sogenannten "Batch"-Betrieb angewendet werden. Dazu wurde das CPG der TNF-Rohlösung zugesetzt und im Verlauf von mehreren Stunden unter vorsichtiger Agitation der Lösung adsorbiert.Alternatively, this process can also be used in what is known as "batch" mode be applied. For this purpose, the CPG was added to the crude TNF solution and in the course adsorbed for several hours with careful agitation of the solution.

Die Glaskugeln wurden abgetrennt, mit den oben beschriebenen Puffern gewaschen und schließlich der TNF eluiert.The glass spheres were separated with the buffers described above washed and finally the TNF eluted.

CPG-Chromatografie ist als Verfahren zur Konzentrierung und Reinigung von TNF naturgemäß auch dann geeignet, wenn nicht Kulturüberstände von humanen B-lymphoblastoiden Zellinien, sondern ein anderes Ausgangsmaterial verwendet wird, so zum Beispiel Überstände von Kulturen anderer Zellinien oder primärer Zellen, Sera oder Serumfraktionen, oder auch Kulturüberstände oder Lysate von Mikroorganismen, die Gene für TNF enthalten und exprimieren.CPG chromatography is used as a method of concentration and purification of TNF naturally also suitable if not culture supernatants from human B-lymphoblastoids Cell lines, but a different starting material is used, so for example Supernatants from cultures of other cell lines or primary cells, sera or serum fractions, or culture supernatants or lysates of microorganisms that contain genes for TNF and express.

CPG-Chromatographie kann selbstverständlich auch für die weitere Konzentrierung und Reinigung von TNF-Präparaten eingesetzt werden, die bereits mit Hilfe anderer Verfahren partiell gereinigt wurden.CPG chromatography can of course also be used for further concentration and purification of TNF supplements already used with the help of others Processes were partially cleaned.

Die weitere Reinigung des Hu-TNF erfolgte in zwei Stufen; 1) Anionenaustausch-Chromatographie 2) Lectin-Affinitätschromatographie Für die Anionenaustausch-Chromatographie wurde vorzugsweise das FPLC- (Fast Protein Liquid Chromatography) System der Firma Pharmacia (Uppsala,Schweden) eingesetzt, das sehr rasche Trennungen ermöglicht. Alternativ können allerdings auch andere Anionaustauscher verwendet werden.The further purification of the Hu-TNF took place in two stages; 1) Anion Exchange Chromatography 2) Lectin Affinity Chromatography For anion exchange chromatography was preferably the FPLC (Fast Protein Liquid Chromatography) system from Pharmacia (Uppsala, Sweden), which enables very quick separations. Alternatively however, other anion exchangers can also be used.

Das Eluat der CPG-Säulewurdegegen 20 mM Tris.HCl -Puffer pH 7,5 dialysiert. Die Lösung wird über eine im gleichen Puffer äquilibrierte Mono Q-Säule HR5/5 (stark basischer Anionenaustauscher der Firma Pharmacia) gepumpt, wobei ein Großteil der Proteine an die Säule gebunden, TNF jedoch im Durchlauf erhalten wird.The eluate of the CPG column was dialyzed against 20 mM Tris.HCl buffer pH 7.5. The solution is equilibrated in the same buffer Mono Q column HR5 / 5 (strong basic anion exchanger from Pharmacia) pumped, with a large part of the Proteins bound to the column, but TNF is obtained in the flow.

Alternativ kann das Eluat der CPG-Säule gegen 20 mM Tris.HCl-Puffer pH 9.0 dialysiert und über die Ionenaustauschsäule gepumpt werden; unter diesen Bedingungen wurde TNF adsorbiert und konnteanschließend in einem NaCl-Gradienten eluiert werden; bei einer Konzentration von 60-150 mM NaClwurde ein Eluat mit TNF-Aktivität aufgefangen. Die Ionenaustauschchromatographie erlaubte in beiden Varianten eine vier- bis fünffache Reinigung sowie im Fall der Verwendung von pH 9.0 eine weitere Konzentrierung des TNF bei Ausbeuten von 70-100 %.Alternatively, the eluate of the CPG column can be used against 20 mM Tris.HCl buffer pH 9.0 dialyzed and pumped through the ion exchange column; Under these Conditions TNF was adsorbed and could then in a NaCl gradient to be eluted; at a concentration of 60-150 mM NaCl, an eluate with TNF activity became caught. Ion exchange chromatography allowed one in both variants four to five times cleaning and, if pH 9.0 is used, another one Concentration of the TNF with yields of 70-100%.

Die TNF-haltigen Fraktionen der Ionenaustausch-Chromatographie wurden vereinigt und direkt über eine Lectin-Säule, zum Beispiel Concanavalin A-Sepharose 4B oder Linsen-Lectin-Sepharose 4B (Pharmacia) gepumpt. TNFwurde an die Säule gebunden und durch Zusatz von 100 mM alpha-Methyl-D-mannosid eluiert. Dieser Schritt resultierle in einer weiteren Konzentrierung sowie einer mehrfachen Reinigung des TNF.The TNF-containing fractions by ion exchange chromatography were combined and directly through a lectin column, for example Concanavalin A-Sepharose 4B or Lentil Lectin Sepharose 4B (Pharmacia). TNF became bound to the column and eluted by adding 100 mM alpha-methyl-D-mannoside. This step results in a further concentration as well as a multiple purification of the TNF.

Die Chromatographie-Schritte können mit gleichem Erfolg auch in umgekehrter Reihenfolge durchgeführt werden.The chromatography steps can also be reversed with the same success Sequence to be carried out.

Dazuwurdedas Eluat der CPG-Säule gegen 20 mM Tris.HCl pH 7.5 oder pH 9.0 dialysiert, über eine Lectin-Säule gereinigt und erst anschließend der Ionenaustausch-Chromatographie unterworfen.For this, the eluate of the CPG column against 20 mM Tris.HCl pH 7.5 or Dialyzed pH 9.0, purified on a lectin column and only then the ion exchange chromatography subject.

Die so erhaltenen Fraktionen zeigten eine spezifische Aktivität von etwa 106 E/mg Protein. Aus 1 1 Zellkulturüberstand konnten 0.1 - 0.2 mg gereinigtes Protein gewonnen werden, was einer Ausbeute von 10 % - 20 % entspricht.The fractions thus obtained showed a specific activity of about 106 U / mg protein. From 1 liter of cell culture supernatant 0.1-0.2 mg of purified Protein can be obtained, which corresponds to a yield of 10% - 20%.

Der erfindungsgemäß hergestellte Humane-Tumor-Nekrose-Faktor wurde sowohl proteinchemisch als auch biologisch charakterisiert. Die Gelfiltrations-HPLC, die Moleküle nach Molekülgröße und Molekülgestalt auftrennt, wies für den erfindungsgemäß hergestellten Hu-TNF einen Hauptpeak auf, der Hu-TNF repräsentierte und mindestens 90 % des Gesamtproteins enthielt sowie ein oder mehrere Nebenmaxima, die in Summe höchstens 10 % des Gesamtproteins enthielten. Das Molekulargewicht des Hu-TNF unter nichtdenaturierenden Bedingungen wurde mit 70.000 (+ 10 %) ermittelt.The human tumor necrosis factor produced according to the invention was characterized both in terms of protein chemistry and biology. Gel Filtration HPLC, separating the molecules according to their molecular size and shape, pointed to the invention Hu-TNF produced a major peak representing Hu-TNF and at least 90% of the total protein as well as one or more secondary maxima, which in sum contained no more than 10% of the total protein. The molecular weight of the Hu-TNF below non-denaturing conditions were found to be 70,000 (+ 10%).

Bei der Reverse Phase - HPLC, die Proteine nach ihrer Hydrophobizität auf trennt, wurde ein Hauptpeak, der Hu-TNF repräsentiert und mindestens 90 % des Gesamtproteins darstellte sowie mehrere Nebenpeaks, die in Summe weniger als 10 % des Gesamtproteins entnielten, nachgewiesen. Als Trennsäule wurde eine Bakerbond C18-Säule der Firma J.T. Baker Chemicals (Deventer, Holland) verwendet (4,6 x 250 mm, Teilchengröße 5 um) und als mobile Phase ein Gemisch aus 0,1 % Trifluoressigsäure in Wasser und 0,1 % Trifluoressigsäure in Acetonitril.Hu-TNF, in wässrigem Puffer gelöst, wurde in einem linearen Gradienten von 20 - 68 % Acetonitril bei einer Acetonitril-Konzentration von 55-60 % eluiert.In the reverse phase - HPLC, the proteins according to their hydrophobicity on separates became a major peak representing Hu-TNF and at least 90% of the Total protein as well as several side peaks, which in total are less than 10 % of total protein removed, detected. A Bakerbond was used as the separation column C18 column from J.T. Baker Chemicals (Deventer, Holland) used (4.6 x 250 mm, particle size 5 µm) and a mixture of 0.1% trifluoroacetic acid as the mobile phase in water and 0.1% trifluoroacetic acid in acetonitrile.Hu-TNF, in aqueous buffer was dissolved in a linear gradient of 20-68% acetonitrile at an acetonitrile concentration eluted by 55-60%.

Die Auftrennung durch diskontinuierliche SDS-Gelektrophorese in Acrylamidgelen nach Laemmli (21) erbrachte drei Hauptbanden, die mindestens 90 % des nachweisbaren Gesamtproteins enthaelten.Die Molekulargewichte der diesen Banden zuzurechnenden Proteine wurden mit 21 500, 23 000 und 24 000 (jeweils + 10 %) ermittelt. Die Intensität der Banden und ihre Wanderungsweite im Gel wurde durch die An- oder Abwesenheit von Reduktionsmitteln wie zum Beispiel 2-Mercaptoethanol nicht beeinflußt.The separation by discontinuous SDS gel electrophoresis in acrylamide gels according to Laemmli (21) produced three main bands, which are at least 90% of the detectable The molecular weights of the bands attributable to these bands Proteins were found to be 21,500, 23,000 and 24,000 (each + 10%). The intensity the bands and their migration distance in the gel was determined by the presence or absence not influenced by reducing agents such as 2-mercaptoethanol.

Die isoelektrische Fokussierung in Polyacrylamidgelen, die Proteine mit isoelektrischen Punkten von 3.5 bis 9.5 auftrennen können, ergab mehrere Banden im pH-Bereich von 5.5 bis 7.5 Die Fraktion, die bei der oben beschriebenen Reverse Phase HPLC 90 % des Gesamtproteins ausmachte und als hochreines Material zur Verfügung stand, wurde durch proteolytische Enzyme in Peptide gespalten. Reverse Phase HPLC dieses Spaltproduktgemisches ergab ein für TNF charakteristisches Elutionsmuster.Isoelectric focusing in polyacrylamide gels, the proteins can separate with isoelectric points from 3.5 to 9.5, resulted in several bands in the pH range from 5.5 to 7.5 the fraction obtained in the reverse described above Phase HPLC made up 90% of the total protein and was available as high-purity material was cleaved into peptides by proteolytic enzymes. Reverse phase HPLC this mixture of cleavage products gave an elution pattern characteristic of TNF.

Verwendet wurde eine Micro-Bondapak Trennsäule der Firma Waters (Milford, MA. 01757, USA) und als mobile Phase ein Gemisch aus 0,1 % Trifluoressigsäure in Wasser und 0,1 % Trifluoressigsäure in Acetonitril. Die Peptide wurden durch einen linearen Gradienten von 0-55 % Acetonitril eluiert.A Micro-Bondapak separation column from Waters (Milford, MA. 01757, USA) and a mixture of 0.1% trifluoroacetic acid in Water and 0.1% trifluoroacetic acid in acetonitrile. The peptides were by a linear gradient of 0-55% acetonitrile eluted.

Unter diesen Bedingungenkonntendie durch Staphylococcus aureus V8 Protease generierten Peptide in 7 Peaks, die durch Trypsin generierten Peptide in mehr als 20 Peaks aufgetrennt werden. Das Muster der tryptischen Peptide wurde durch Reduktion mittels Dithiothreit nicht verändert.Under these conditions the Staphylococcus aureus V8 Protease generated peptides in 7 peaks, the trypsin generated peptides in more than 20 peaks can be separated. The pattern of tryptic peptides was made by Reduction by means of dithiothreitol not changed.

Die durch proteolytische Spaltung mittels Staphylococcus aureus V8 Protease erhaltenen Spaltprodukte wurden durch diskontinuierliche SDS-Gelektrophorese nach Cleveland et al. (22) aufgetrennt und charakterisiert. Jedes der drei oben beschriebenen Proteine mit den Molekulargewichten 21.500, 23.000 und 24.000 zerfiel dabei in zwei Peptide, wovon eines mit einem Molekulargewicht von etwa 6000 allen drei Proteinen gemeinsam war, während das jeweils andere Peptid ein gegenüber dem intakten Protein um etwa 6000 verringertes Molekulargewicht aufwies.The proteolytic cleavage by means of Staphylococcus aureus V8 Protease obtained cleavage products were determined by discontinuous SDS gel electrophoresis according to Cleveland et al. (22) separated and characterized. Any of the three above described proteins with molecular weights 21,500, 23,000 and 24,000 disintegrated thereby in two peptides, one of which with a molecular weight of about 6000 all three proteins was common while the other peptide had a molecular weight reduced by about 6000 compared to the intact protein.

Eine Reihe von proteolytischen Abbauprodukten von TNF wurde durch Ermittlung ihrer N-terminalen Aminosäuresequenzen charakterisiert. Dazu wurden sequentielle Abbaureaktionen entweder mit Hilfe eines automatischen Aminosäuresequenators, Modell 470 A, der Firma Applied Biosystems (Foster City, Kalifornien,USA; Ref. 18) oder durch manuelle Degradation mit Hilfe der DABITC/PITC-Doppelkopplungsmethode (16) durchgeführt, wobei die Aminosäurederivate durch Dünnschichtchromatographie (16) uf durch Reverse Phase HPLC identifiziert wurden.A number of proteolytic degradation products of TNF has been carried out by Determination of their N-terminal amino acid sequences characterized. These were sequential Degradation reactions either with the help of an automatic amino acid sequenator, model 470 A, from Applied Biosystems (Foster City, California, USA; Ref. 18) or through manual degradation using the DABITC / PITC double coupling method (16) carried out, the amino acid derivatives by thin layer chromatography (16) identified by reverse phase HPLC.

Folgendes HPLC-System wurde dazu verwendet: Trennsäule Ultrasphere-ODS der Firma Beckman Instruments (Irvine, Kalifornien, USA; 4,6 x 250 mm, Teilchengröße 5 um); Flußrate, 1 ml/min; Laufmittel A: 50 mM Natriumacetat, 2 % Triethylamin, 100 mM NaCl, pH 5,0; Laufmittel B: Acetonitril Gradient: 0-10 min 20-40 % B, 10-20 min 40-70 %, B, 20-25 min 70 % B, 25-30 min 80 % B.The following HPLC system was used for this: Ultrasphere-ODS separation column from Beckman Instruments (Irvine, California, USA; 4.6 x 250 mm, particle size 5 µm); Flow rate, 1 ml / min; Mobile phase A: 50 mM sodium acetate, 2% triethylamine, 100 mM NaCl, pH 5.0; Mobile phase B: acetonitrile gradient: 0-10 min 20-40% B, 10-20 min 40-70%, B, 20-25 min 70% B, 25-30 min 80% B.

Die Kennzeichnung der Fragmente erfolgte in der Reihenfolge ihrer Elution von der Reverse Phase Säule.The fragments were labeled in their order Elution from the reverse phase column.

Durch Staphylococcus aureus V 8 Protease generierte Fragmente: 2) NH2-LEU-PRO-GLY-VAL-GLY 4) NH2-MET-GLN-ILE-GLN-VAL LEU Durch Trypsin generierte Fragemente: 1) NH2-GLN-HIS-PRO-LYS 2) NH2-ALA-TYR-X-8 + 9) NH2-MET-ASP-LEU-ALA 10) NH2-GLN-ASN-X- ILE-ILE-X - ARG LEU LEU 17) NH2-ALA-THR-SER-GLY-PRO-LEU-TYR-LEU-ALA-HIS- X--VAL-GLN-LEU-PHE-SER-SER-GLN-TYR-PRO-PHE - X -VAL-X-18) NH2-MET-VAL-TYR-PRO-GLY-ILE-LEU 19) NH2-NET-VAL-TYR-PRO-MET-ILE PHE LEU GLY GLY Mehrfache Angaben bedeuten, daß das entsprechende Aminosäurederivat nicht eindeutig einer der angegebenen Aminosäuren zugeordnet werden konnte; X bedeutet, daß die entsprechende Aminosäure nicht identifiziert werden konnte.Fragments generated by Staphylococcus aureus V 8 protease: 2) NH2-LEU-PRO-GLY-VAL-GLY 4) NH2-MET-GLN-ILE-GLN-VAL LEU By trypsin generated fragments: 1) NH2-GLN-HIS-PRO-LYS 2) NH2-ALA-TYR-X-8 + 9) NH2-MET-ASP-LEU-ALA 10) NH2-GLN-ASN-X- ILE-ILE-X - ARG LEU LEU 17) NH2-ALA-THR-SER-GLY-PRO-LEU-TYR-LEU-ALA-HIS- X - VAL-GLN-LEU-PHE-SER-SER-GLN-TYR-PRO-PHE - X -VAL-X-18) NH2-MET-VAL-TYR-PRO-GLY-ILE-LEU 19) NH2-NET-VAL-TYR-PRO-MET-ILE PHE LEU GLY GLY Multiple entries mean that the corresponding amino acid derivative is not clearly one of the specified amino acids could be assigned; X means that the corresponding amino acid has not been identified could be.

Die N-terminale Aminosäuresequenz des nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten und durch Reverse Phase HPLC gereinigten Hu-TNF selbst wurde mit Hilfe des oben erwähnten Aminosäuresequenators ermittelt. Die Aminosäurederivate wurden nach der Methode von Lottspeich und Eisenbeiß /17) identifiziert. Dabei wurde in allen Abbauschritten jeweils nur ein einziges Aminosäurederivat erhalten Die ermittelte Sequenz lautet wie folgt 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 NH2LEU-PRO-GLY-VAL-GLY-LEU- X PRO-SER-ALA 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 -ALA-GLN- X -ALA-ARG-GLN-HIS-PRO-LYS-MET-TYR VAL 21 22 23 -ASP-LEU - ALA Derivate der Aminosäuren ILE und LEU lassen sich mit Hilfe dieser Methode unzulänglich trennen, so daß beide Aminosäuren den N-terminus des Proteins bilden könnten.The N-terminal amino acid sequence of the process according to the invention Hu-TNF prepared and purified by reverse phase HPLC was itself obtained using of the amino acid sequenator mentioned above. The amino acid derivatives were identified using the method of Lottspeich and Eisenbeiß / 17). In In each of the degradation steps, only a single amino acid derivative was obtained Sequence is as follows 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 NH2LEU-PRO-GLY-VAL-GLY-LEU- X PRO-SER-ALA 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 -ALA-GLN- X -ALA-ARG-GLN-HIS-PRO-LYS-MET-TYR VAL 21 22 23 -ASP-LEU - ALA Let derivatives of the amino acids ILE and LEU separate inadequately with the help of this method, so that both amino acids the Could form the N-terminus of the protein.

Der nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellte und gereinigte Hu-TNF wurde biologisch charakterisiert, indem seine cytostatische und/oder cytotoxische Wirkung gegenüber humanen Tumorzellen untersucht wurde. Hu-TNF hemmte in vitro die Proliferation von humanen Cervix-Carcinom-Linien (Zellinie HeLA) und humanen Lungenkarzinom-Zellen (Zellinie A 549). In ähnlicher Weise wurde die Proliferation von transformierten Mauszellen der Linie L929 oder von Maus-Melanom-Zellen der Linie B16 gehemmt.The one produced and purified by the process according to the invention Hu-TNF has been characterized biologically by its cytostatic and / or cytotoxic Effect on human tumor cells was investigated. Hu-TNF inhibited the in vitro Proliferation of human cervical carcinoma lines (HeLA cell line) and human lung carcinoma cells (Cell line A 549). Similarly, the proliferation of transformed Mouse cells of line L929 or mouse melanoma cells of line B16 were inhibited.

.«P Mit Hilfe der vorliegenden Erfindung ist es also erstmals möglich, Hu-TNF in überraschend hoher Ausbeute herzustellen und mit einem rationellen Verfahren eine hervorragende Konzentrierung und Reinigung zu erzielen, wodurch sowohl umfangreiche Untersuchungen der biologischen Aktivität als auch eine teilweise Charakterisierung des Proteins ermöglicht wurde. . «P With the help of the present invention it is therefore possible for the first time To produce Hu-TNF in a surprisingly high yield and with a rational process to achieve excellent concentration and purification, thereby both extensive Investigations of the biological activity as well as a partial characterization of the protein was made possible.

Das erfindungsgemäß hergestellte TNF stellt auf Grund dieser Ergebnisse ein aus zwei oder mehr Untereinheiten zusammengesetztes Protein dar, wobei die Bindung der Untereinheiten nicht durch Disulfidbrücken erfolgt. Die Untereinheiten weisen eine einheitliche N-terminale Aminosäuresequenz auf; ihre Ladungs- und Größenheterogenität kann am einfachsten durch die Annahme unterschiedlicher Glykosylierung erklärt werden.The TNF produced according to the invention is based on these results a protein composed of two or more subunits, whereby the bond of the subunits does not take place through disulfide bridges. The subunits show has a uniform N-terminal amino acid sequence; their charge and size heterogeneity can most easily be explained by assuming different glycosylation.

Das kürzlich von Aggarwal et al. (19,20) beschriebene Verfahren zur Produktion und Reinigung eines cytotoxischen Proteins aus der humanen lymphoblastoiden Zellinie PRMI 1788 läßt sich mit den erfindungsgemäßen Verfahren nicht vergleichen, da es zwar von ähnlichen, aber nicht identischen Proteinen ausgeht, die zudem auch noch in wesentlich geringerer Konzentration im Zellkulturüberstand vorlagen.The recently published by Aggarwal et al. (19,20) for the Production and purification of a cytotoxic protein from the human lymphoblastoid Cell line PRMI 1788 cannot be compared with the method according to the invention, because it is based on similar but not identical proteins, and so do those were still present in the cell culture supernatant in a significantly lower concentration.

Im folgenden wird beispielshaft die Herstellung, Reinigung und Charakterisierung des Humanen-Tumor-Nekrose-Faktors erläutert, ohne dadurch die Erfindung in irgendeiner Weise einzugrenzen: 1. Herstellung von Hu-TNF RPMI-1788/EBI-Zellen wurden in RPMI-1640 Medium mit 10 % fötalem Kalbsserum, Penicillin (100 E/ml) und Streptomycin (50 E/ml) bei 370C in Kunststoff-Rollkulturflaschen gezüchtet (Höhe 14 cm, Durchmesser 11 cm, Rollgeschwindigkeit 0,5 Umdrehungen pro Minute; 500 ml/Flasche) und dreimal wöchentlich im Verhältnis 1: 2 mit frischem Medium verdünnt.The following is an example of the production, cleaning and characterization of Human Tumor Necrosis Factor, without thereby affecting the invention in any way Narrow down ways: 1. Production of Hu-TNF RPMI-1788 / EBI cells were made in RPMI-1640 Medium with 10% fetal calf serum, penicillin (100 U / ml) and streptomycin (50 U / ml) Grown at 370C in plastic roll culture flasks (height 14 cm, diameter 11 cm, rolling speed 0.5 revolutions per minute; 500 ml / bottle) and three times diluted weekly in a ratio of 1: 2 with fresh medium.

Einen Tag nach dem letzten Verdünnen wurden die Zellen aus mehreren Flaschen durch Zentrifugation gewonnen und in einem Zehntel des ursprünglichen Volumens serumfreiem Kulturmedium suspendiert. Mezerein wurde aus einer Stammlösung von 0,1 mg/ml (aufbewahrt bei -200C) in Dimethylsulfoxid zu einer Endkonzentration von 20 ng/ml zugegeben und die Suspension in 750 ml - Plastik-Gewebekulturflaschen bei 370 C drei Stunden inkubiert. Anschließend wurde die Kultur zentrifugiert, die Zellen im ursprünglichen Volumen an serumfreiem Medium ohne Mezerein resuspendiert und in Rollkulturflaschen weitere drei Tage inkubiert (Bedingungen wie oben). Danach wurden die Zellen durch Zentrifugation abgetrennt, der Überstand durch ein Papierfilter filtriert und bei -200C eingefroren. One day after the final dilution, the cells were made from several Bottles obtained by centrifugation and converted to one-tenth of the original volume suspended in serum-free culture medium. Mezerein was made from a stock solution of 0.1 mg / ml (stored at -200C) in dimethyl sulfoxide to a final concentration of 20 ng / ml are added and the suspension is placed in 750 ml plastic tissue culture flasks Incubated at 370 C for three hours. The culture was then centrifuged, the cells resuspended in the original volume of serum-free medium without mezerein and incubated for a further three days in roll culture flasks (conditions as above). Thereafter the cells were separated off by centrifugation, the supernatant through a paper filter filtered and frozen at -200C.

Tabelle 1 gibt beispielhaft die Ergebnisse von zwölf aufeinanderfolgenden Produktionsansätzen wieder. Table 1 gives the results of twelve successive examples Production approaches again.

Tabelle 1. Table 1.

Experiment Volumen Hu-TNF-Aktivitaet im Zellueberstand ml E.ml Summe E x 10 ^- 6 1 6 000 1 050 6,3 2 3 000 180 0,5 3 2 800 1 140 3,2 4 2 700 1 140 2,8 5 2 300 390 0,9 6 5 000 880 4,4 7 5 500 900 4,9 8 6 000 1 020 6,1 9 5 000 1 470 7,4 10 5 000 3 700 18,5 11 5 400 2 850 15,4 12 5 300 930 4,9 Geometrischer Mittelwert : 1 001 E/ml 2. Konzentrierung und Reinigung durch Chromatographie über porenkontrolliertes Glas Lösungen von Hu-TNF, hergestellt wie unter 1. beschrieben, wurden über Säulen aus porenkontrolliertem Glas gepumpt (CPG-10, 120-200 mesh, Porendurchmesser 35 nm; für Volumina bis 3000 ml: Säulendurchmesser 8 mm, Säulenvolumen 10 ml, Flußgeschwindigkeit 120 ml/h; für Volumina bis 8000 ml: Säulendurchmesser 2 cm, Säulenvolumen 25 ml, Flußgeschwindigkeit 300 ml/h). Experiment Volume of Hu-TNF activity in the cell supernatant ml E.ml total E x 10 ^ - 6 1 6,000 1 050 6.3 2 3,000 180 0.5 3 2 800 1 140 3.2 4 2 700 1 140 2.8 5 2 300 390 0.9 6 5 000 880 4.4 7 5 500 900 4.9 8 6 000 1 020 6.1 9 5 000 1 470 7.4 10 5 000 3 700 18.5 11 5 400 2 850 15.4 12 5 300 930 4.9 Geometric mean : 1 001 U / ml 2. Concentration and purification by chromatography over pore-controlled Glass solutions of Hu-TNF, prepared as described under 1., were over columns pumped from pore-controlled glass (CPG-10, 120-200 mesh, pore diameter 35 nm; for volumes up to 3000 ml: column diameter 8 mm, column volume 10 ml, flow rate 120 ml / h; for volumes up to 8000 ml: column diameter 2 cm, column volume 25 ml, Flow rate 300 ml / h).

Anschließend wurde mit phosphat-gepufferter NaCL-Lösung (2,7 mM KC1; 1,5 mM KH2PO4, 10 mM NaHPO4; 1,5 M NaCl) gewaschen, bis das Eluat proteinfrei war, und schließlich im gleichen Puffer mit 50 % Ethylenglykol eluiert (Pumpgeschwindigkeit 40 ml/Stunde). Tabelle 2 zeigt die Hu-TNF-Aktivität und den Porteingehalt der verschiedenen Fraktionen bei einem beispielhaften Lauf; Tabelle 3 zeigt eine Übersicht über elf aufeinanderfolgende Produktionsläufe. Phosphate-buffered NaCl solution (2.7 mM KC1; 1.5mM KH2PO4, 10mM NaHPO4; 1.5 M NaCl) washed until the eluate was protein-free, and finally eluted in the same buffer with 50% ethylene glycol (Pumping speed 40 ml / hour). Table 2 shows the Hu-TNF activity and the Port content of the various fractions in an exemplary run; Tabel 3 shows an overview of eleven successive production runs.

Der Proteingehalt der Lösungen wurde nach der Methode von Bradford (23) mit Hilfe des Testkits der Firma Biorad, Richmond, California 94804, USA, bestimmt.The protein content of the solutions was determined by the Bradford method (23) using the test kit from Biorad, Richmond, California 94804, USA.

Tabelle 2.Table 2.

Fraktion Volume Protein Hu - TNF Spez. Reinigungs Konzentr. Ausbeute Aktivitaet Aktivitaet faktor faktor % ml mg/ml E/ml E/mg Kulturmedium 1 600 55 243 4 418 1 1 100 Dwrchflusz 1 600 - <17 - - - -Waschloesung 5 - 67 - - - -Eluat 12 400 23 000 57 700 13 133 71 Tabelle 3.Fraction Volume Protein Hu - TNF Spec. Cleaning Concentr. yield Activity activity factor factor% ml mg / ml U / ml U / mg culture medium 1 600 55 243 4 418 1 1 100 flow rate 1 600 - <17 - - - -Wash solution 5 - 67 - - - -Eluat 12 400 23 000 57 700 13 133 71 Table 3.

Experiment Volumen (ml) Hu-TNF-Aktivitaet (E/ml) Ausbeute Roholesung Eluat Rchloesung Eluat % 1 6 000 43 1 050 66 000 44 2 3 000 27 180 8 500 42 3 2 800 22 1 140 57 000 40 4 2 700 17 1 040 160 500 96 5 5 000 21 870 137 000 67 6 5 500 18 900 285 000 104 7 5 000 20 1 470 136 000 53 8 5 400 30 3 700 379 000 63 9 5 400 29 2 850 354 000 67 11 1 600 12 240 23 000 71 12 3 000 15 2 170 138 000 32 Im Mittel wurde eine 167-fache Konzentration bei einer Ausbeute von 62 % erzielt.Experiment Volume (ml) Hu-TNF activity (U / ml) Yield raw reading Eluate solution Eluate% 1 6,000 43 1 050 66,000 44 2 3,000 27 180 8 500 42 3 2 800 22 1 140 57 000 40 4 2 700 17 1 040 160 500 96 5 5 000 21 870 137 000 67 6 5 500 18 900 285 000 104 7 5 000 20 1 470 136 000 53 8 5 400 30 3 700 379 000 63 9 5 400 29 2 850 354 000 67 11 1 600 12 240 23 000 71 12 3 000 15 2 170 138 000 32 in the Medium, a 167-fold concentration was achieved with a yield of 62%.

3. Reinigung durch Anionenaustausch-Chromatographie Eluate von mehreren CPG-Säulen (siehe 2) wurden vereinigt und über Nacht gegen 20 mM Tris-HCl Puffer pH 9,0 dialysiert. 25 ml dieser Lösung mit einer Hu-TNF-Aktivität von 36 400 E/ml und einem Proteingehalt von 1 mg/ml wurde unter Verwendung eines FPLC-Systems der Firma Pharmacia, Uppsala, Schweden, über eine Mono Q HR5/5 Säule (Pharmacia) gepumpt (Flußgeschwindigkeit 1 ml/Minute) ; anschließend wurde mit einem linearen NaCl-Gradienten (0-350 mM im gleichen Puffer) eluiert. 2 ml - Fraktionen wurden gesammelt und ihre Aktivität bestimmt. Die Hu-TNF-Ausbeute in den aktiven Fraktionen betrug 110 %, der Reinigungsfaktor 5 (Abbildung 1).3. Purification by anion exchange chromatography. Several eluates CPG columns (see Figure 2) were pooled and overnight against 20 mM Tris-HCl buffer dialyzed pH 9.0. 25 ml of this solution with a Hu-TNF activity of 36 400 U / ml and a protein content of 1 mg / ml was determined using an FPLC system of Pharmacia, Uppsala, Sweden, pumped through a Mono Q HR5 / 5 column (Pharmacia) (Flow rate 1 ml / minute); then a linear NaCl gradient was used (0-350 mM in the same buffer) eluted. 2 ml fractions were collected and theirs Activity determined. The Hu-TNF yield in the active fractions was 110%, the cleaning factor 5 (Figure 1).

4. Reinigung durch Concanavalin A-Affinitätschromatographie 4.1 Die Eluate mehrer CPG-Säulen (siehe 2) wurden vereinigt und gegen 20 mM Tris.HCl-Puffer pH 7,5 dialysiert.4. Purification by Concanavalin A Affinity Chromatography 4.1 Die Eluates from several CPG columns (see FIG. 2) were combined and against 20 mM Tris.HCl buffer Dialyzed pH 7.5.

Die Lösung wurde über eine Concanavalin A-Sepharose 4B-Säule (Firma Pharmacia) gepumpt (Säulenvolumen 4 ml, Säulendurchmesser 8 mm, Flußgeschwindigkeit 40 ml/h). The solution was passed through a Concanavalin A-Sepharose 4B column (company Pharmacia) (column volume 4 ml, column diameter 8 mm, flow rate 40 ml / h).

Anschließend wurde die Säule mit dem gleichen Puffer gewaschen, bis kein Protein mehr im Durchlauf nachzuweisen war, und schließlich mit 100 mM alpha-methyl-D-mannosid im gleichen Puffer eluiert. 70 % des Hu-TNF wurden an die Säule gebunden, davon konnten 71 % eluiert werden (Tabelle 4). Der Reinigungsfaktor betrug 10,2. The column was then washed with the same buffer until no more protein could be detected in the run, and finally with 100 mM alpha-methyl-D-mannoside eluted in the same buffer. 70% of the Hu-TNF was bound to the column, of which 71% could be eluted (Table 4). The cleaning factor was 10.2.

Tabelle 4 Fraktion Volumen Hu-TNF Proteingehalt Spezifische Ausbeute Aktivität Aktivität ml E/ml µg/ml E/mg % Probe 120 26 800 1 400 19 000 100 Durchlauf 120 8 400 - - 30 Eluat 15 107 500 550 195 000 50 Tabelle 5 Fraktion Volumen Hu-TNF Proteingehalt Spezifische Ausbeute Aktivität Aktivität E/ml µg/ml E/mg % Probe 100 25 400 190 136 000 100 Durchlauf 100 500 - - 2 Eluat 5,5 217 500 240 906 000 47 4.2 Die Hu-TNF-enthaltenden Fraktionen einer Ionenaustausch-Chromatographie (siehe 3) wurden vereinigt und über eine Säule mit Concanavalin A-Sepharose 4B gepumpt (Säulenvolumen 2 ml, Säurendurchmesser 8 mm, Flußgeschwindigkeit 20 ml/h). Anschließend wurde die Säule mit20 mM Tris.HCl pH 7,5 gewaschen, bis kein Protein mehr im Eluat nachzuweisen war und im gleichen Puffer mit lOOmM alpha-methyl-D-mannosid eluiert. Die Chromatographie verlief mit einer Ausbeute von 47 % und ergab eine 6,7-fache Reinigung des Hu-TNF (Tabelle 5).Table 4 Fraction Volume Hu-TNF Protein Content Specific Yield Activity Activity ml U / ml µg / ml U / mg% sample 120 26 800 1 400 19 000 100 run 120 8 400 - - 30 eluate 15 107 500 550 195 000 50 Table 5 Fraction volume Hu-TNF Protein content Specific yield Activity Activity U / ml µg / ml U / mg% sample 100 25 400 190 136 000 100 pass 100 500 - - 2 eluate 5.5 217 500 240 906 000 47 4.2 The fractions containing Hu-TNF from ion exchange chromatography (see FIG. 3) were combined and pumped through a column with Concanavalin A-Sepharose 4B (column volume 2 ml, acid diameter 8 mm, flow rate 20 ml / h). Then the Column washed with 20 mM Tris.HCl pH 7.5 until no more protein can be detected in the eluate and eluted in the same buffer with 100 mM alpha-methyl-D-mannoside. The chromatography proceeded in 47% yield and gave a 6.7-fold purification of the Hu-TNF (Table 5).

Charakterisierung des erfindungsgemäß hergestellten TNF 5. Gelpermeations-HPLC Gelpermeations-HPLC wurde mit Hilfe einer Anlage der Firma Waters (Milford, Massachusetts 01757, USA). Characterization of the TNF 5 prepared according to the invention. Gel permeation HPLC Gel permeation HPLC was carried out using a system from Waters (Milford, Massachusetts 01757, USA).

durchgeführt. Verwendet wurde eine Pumpe der Type M 45, ein Proben-Injektor Typ U6k, eine UV-Detektor-Einheit Typ 441 (Detektion bei 214 nm), sowie zwei hintereinander geschaltete Trennsäulen der Type I-125 (7,8 x 300 mm, Teilchengröße 101um). carried out. A type M 45 pump, a sample injector, was used Type U6k, a UV detector unit type 441 (detection at 214 nm), as well as two in a row Switched separation columns of the type I-125 (7.8 x 300 mm, particle size 101 µm).

Als Laufmittel wurde 20 mM Phosphat-Puffer pH 7,0; 0,5 M Na2S04; 0.04 % Tween 20; 25 % (v/v) 1,2 Propylenglykol verwendet, die Flußgeschwindigkeit betrug 0,5 ml pro Minute. 20 mM phosphate buffer pH 7.0; 0.5 M Na 2 SO 4; 0.04% Tween 20; 25% (v / v) 1.2 propylene glycol used, the flow rate was 0.5 ml per minute.

Als Eichproteine zur Bestimmung des Molekulargewichts wurden Serumalbumin, Trypsinogen, Ovalbumin und Lysozym verwendet. Der Proteingehalt wurde durch Messung der Absorption bei einer Wellenlänge von 214 nm bestimmt. 10 pl einer Lösung von Hu-TNF (240zug Protein/ml)wurden injiziert. Serum albumin, Trypsinogen, ovalbumin and lysozyme used. The protein content was determined by measurement the absorption determined at a wavelength of 214 nm. 10 pl of a solution of Hu-TNF (240 pw protein / ml) was injected.

Der Hauptpeak mit einer Retentionszeit entsprechend einem Molekulargewicht von 70 000 + enthielt mehr als 90 % der gesamten Proteinmenge (Abbildung 2). The main peak with a retention time corresponding to a molecular weight out of 70,000+ contained more than 90% of the total amount of protein (Figure 2).

6. Reverse-Phase-HPLC Reverse-Phase-HPLC wurde mit einer Anlage der Firma Waters, ausgestattet mit zwei Pumpen der Type 510, einem Gradienten-Programmiergerät Typ 680, einem Probeninjektor Typ U6K, einer UV-Detektoreinheit Typ 440 mit Extended Wavelength Module und einer Trennsäule Typ Bakerbond C 18 (Firma J.T. Baker; siehe 4.2) durchgeführt.6. Reverse-phase HPLC Reverse-phase HPLC was carried out using a system from Waters company, equipped with two type 510 pumps, a gradient programming device Type 680, a sample injector type U6K, a UV detector unit type 440 with Extended Wavelength Module and a separating column type Bakerbond C 18 (J.T. Baker; see 4.2) carried out.

25 /ul einer Hu-TNF-Lösung mit 240 sog Protein/ml wurden auf die Säule,äquilibriert in 0,1 % Trifluoressigsäure mit 20 % Acetonitril, aufgetragen und in einem linearen Acetonitril-Gradienten eluiert. Die Konzentration von Protein im Eluat wurde durch Messung der UV-Absorption bei 214 nm gemessen (Abbildung 3). 25 / μl of a Hu-TNF solution with 240 suction protein / ml were added to the Column equilibrated in 0.1% trifluoroacetic acid with 20% acetonitrile, applied and eluted in a linear acetonitrile gradient. The concentration of protein in the eluate was measured by measuring the UV absorption at 214 nm (Figure 3).

Folgendes Programm wurde verwendet: Laufmittel A: 0,1 % Trifluoressigsäure in Wasser Laufmittel B: 0,1 % Trifluoressigsäure in Acetonitril O - 2 min: 20 % - 68 % Laufmittel b 26 - 36 min: 68 % Laufmittel B Ein einziger Hauptpeak enthielt mehr als 90 % des gesamten eluierten Proteins; die Proteinausbeute betrug 108 %. The following program was used: Mobile phase A: 0.1% trifluoroacetic acid in water mobile phase B: 0.1% trifluoroacetic acid in acetonitrile O - 2 min: 20% 68% mobile phase b 26-36 min: 68% mobile phase B Contained a single main peak greater than 90% of the total eluted protein; the protein yield was 108%.

7. Diskontinuierliche Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelectrophorese Diskontinuierliche Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophoresewurde nach der Methode von Laemmli (21) durchgeführt. Gele mit 15 % Acrylamid und einer Dicke von 0,75 mm wurden verwendet.7. Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide discontinuous gel electrophoresis Discontinuous sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis was used after the method of Laemmli (21). Gels with 15% acrylamide and a thickness of 0.75 mm were used.

25/kl einer Lösung von gereinigtem Hu-TNF (290 pg Protein/ml) wurden mit 25/um doppelt konzentriertem Probenpuffer gemischt und 3 Minuten auf 950C erhitzt. Anschließend wurde die Probe auf das Gel aufgetragen und bei einer Feldstärke von etwa 13 V/cm auf getrennt. Nach Anfärbung des Gels in einer Lösung von Coomassie-Blau R 250 (0,1 % in H20:CH30H: CHrOOOH 5 : 5 : 1) und Entfärbung im gleichen Gemisch konnte die Molekulargewichtsbestimmung durch die als Standard auf demselben Gel aufgetrennte Mischung aus Ovalbumin, beta-Lactoglobulin, Lysozym, Cytochrom c, boviner Trypsin-Inhibitor und Insulin vorgenommen werden.25 / kl of a solution of purified Hu-TNF (290 pg protein / ml) were mixed with 25 μm double concentrated sample buffer and heated to 950C for 3 minutes. The sample was then applied to the gel and applied at a field strength of about 13 V / cm on separately. After staining the gel in a solution of Coomassie blue R 250 (0.1% in H20: CH30H: CHrOOOH 5: 5: 1) and decolorization in the same mixture was able to determine the molecular weight by using the standard on the same gel separated mixture of ovalbumin, beta-lactoglobulin, lysozyme, cytochrome c, bovine Trypsin inhibitor and insulin can be made.

(Abbildung 4 zeigt das gefärbte Gel).(Figure 4 shows the colored gel).

Drei Banden mit dem Molekulargewicht 21-500, 23. 000 und 24.000 enthielten mehr als 90 % des gesamten sichtbaren Proteins. Dasselbe Bild ergab sich auch, wenn dem Probenpuffer kein 2-Mercaptoethanol zugesetzt wurde.Contained three bands of molecular weight 21-500, 23,000 and 24,000 more than 90% of all visible protein. The same picture emerged when no 2-mercaptoethanol was added to the sample buffer.

Die gefärbten Banden wurden aus dem Gel ausgeschnitten und in 1 ml Zellkulturmedium mit 5 % fötalem Kalbsserum 18 Stunden bei Raumtemperatur geschüttelt, um die Proteine zu eluieren; die Eluate zeigten allerdings im Test keine Hu-TNF-Aktivität. Die Versuchsdurchführung wurde daher wie folgt geändert: Die Probe wurde nach dem Mischen mit Probenpuffer 15 min bei 37 0C inkubiert und auf das Gel aufgetragen. Nach der Auftrennung (siehe oben) wurden zwei die Proben enthaltenden Bahnen ausgeschnitten, senkrecht zur Laufrichtung in Streifen geschnitten und wie oben beschrieben eluiert. Hu-TNF-Aktivität wurde in all jenen Proben gefunden, die den oben genannten Banden entsprachen, nicht jedoch in den anderen Fraktionen (Abbildung 5).The colored bands were cut out of the gel and placed in 1 ml Cell culture medium with 5% fetal calf serum shaken for 18 hours at room temperature, to elute the proteins; however, the eluates showed no Hu-TNF activity in the test. The test procedure was therefore changed as follows: The sample was after Mixing with sample buffer, incubated for 15 min at 37 ° C. and applied to the gel. After the separation (see above), two tracks containing the samples were cut out, Cut into strips perpendicular to the running direction and eluted as described above. Hu-TNF activity was found in all those samples showing the above bands but not in the other groups (Figure 5).

Die Ausbeute betrug etwa 10 %.The yield was about 10%.

8. Isoelektrische Fokussierung Verwendet wurde eine Anlage der Firma Pharmacia, bestehend aus einem Flachbett-Gerät der Type FBE 3000 und einem Netzgerät der Type ECPS 3000/150, sowie LKB Ampholine-PAG Plates pH 3,5-9,5 der Firma LKB, Bromma, Schweden.8. Isoelectric focusing A system from the company was used Pharmacia, consisting of a type FBE 3000 flatbed device and a power supply unit the type ECPS 3000/150, as well as LKB Ampholine-PAG Plates pH 3.5-9.5 from LKB, Bromma, Sweden.

In zwei nebeneinanderliegenden Spuren wurden je 25,l einer Lösung von gereinigtem Hu-TNF (290/ug Protein/ml) aufgetragen und 2 h bei einer Leistung von 15 Watt und einer maximalen Spannung von 1200 V fokussiert.25.1 of a solution were added to two adjacent lanes of purified Hu-TNF (290 / ug protein / ml) and applied for 2 hours at one power of 15 watts and a maximum voltage of 1200 V.

Zur Bestimmung des pH-Gradienten wurde eine Mischung aus Eichproteinen (Firma Phanracia) im selben Gel auf getrennt.A mixture of calibration proteins was used to determine the pH gradient (Phanracia company) in the same gel on separately.

Eine der beiden Hu-TNF enthaltenen Bahnen wurde nach Ende der Fokussierung ausgeschnitten und senkrecht zur Laufrichtung in 5 mm breite Streifen geschnitten, die in je 3 ml RPMl-l640 Medium mit 5 % fötalem Kalbsserum über Nacht eluiert wurden. Die Aktivität in den Eluate wurde im biologischen Test bestimmt.One of the two Hu-TNF contained lanes became after focusing cut out and cut into 5 mm wide strips perpendicular to the running direction, which were eluted overnight in 3 ml of RPMI-1640 medium with 5% fetal calf serum. The activity in the eluates was determined in a biological test.

Der Rest des Gels mit der zweiten Hu-TNF enthaltenen Bahn wurde nach der von der Firma LKB empfohlenen Methode fixiert und mit Coomassie Blau gefärbt.The remainder of the gel with the second lane containing Hu-TNF was after fixed using the method recommended by LKB and stained with Coomassie blue.

Mindestens 10 Banden im pH-Bereich von 5.5 bis 7.5 waren erkennbar, zum Teil allerdings an der Grenze der Nachweisbarkeit. Abbildung 6 zeigt die Hu-TNF-Aktivität (6 B) und ein Schema der Proteinbanden im Gel (6 A). Alle Gelabschnitte, die Proteinbanden zeigten, wiesen auch Hu-TNF-Aktivität auf. Die Ausbeute betrug 12 %.At least 10 bands in the pH range from 5.5 to 7.5 were recognizable, in part, however, at the limit of verifiability. Figure 6 shows the Hu-TNF activity (6 B) and a diagram of the protein bands in the gel (6 A). All gel sections, the protein bands also showed Hu-TNF activity. The yield was 12%.

9. Kartierung proteolytischer Spaltprodukte durch Reverse Phase HPLC 2 ml einer Lösung von gereinigtem Hu-TNF (240/ug/ml) wurden durch Reverse Phase HPLC wie unter 6. beschrieben, aufgetrennt. Die Hauptfraktion wurde gesammelt, im Vakuum getrocknet und in 1 % NH4HCO3 pH 8,0 gelöst (1 mg/ml). Zu dieser Lösung wurden 0.01 Volumenteile einer Lösung von 1 mg/ml Trypsin-TPCK (Worthington Biochemical Corporation, Freehold, New Jersey, USA) in Wasser pipettiert und das Gemisch 6 h bei Raumtemperatur inkubiert; anschließend wurde nochmals die gleiche Menge Trypsin zugegeben und über Nacht bei Raumtemperatur verdaut.9. Mapping of proteolytic cleavage products by reverse phase HPLC 2 ml of a solution of purified Hu-TNF (240 / ug / ml) were reversed phase HPLC as described under 6, separated. The main fraction was collected in Vacuum dried and dissolved in 1% NH4HCO3 pH 8.0 (1 mg / ml). To this solution were 0.01 parts by volume of a solution of 1 mg / ml Trypsin-TPCK (Worthington Biochemical Corporation, Freehold, New Jersey, USA) pipetted into water and the mixture for 6 h incubated at room temperature; then the same amount of trypsin was used again added and digested overnight at room temperature.

Die entstandenen Fragmente wurden durch Reverse Phase HPLC auf einer unter 6. beschriebenen Anlage mit einer Micro-Bondapak Trennsäule der Firma Waters (3,9 x 300 mm; Teilchengröße lOyum) aufgetrennt.The resulting fragments were by reverse phase HPLC on a System described under 6 with a Micro-Bondapak separation column from Waters (3.9 x 300 mm; particle size 10yum) separated.

Bei einer Flußrate von 2 ml/min wurde folgendes Programm verwendet: Laufmittel A: 0,1 % Trifluoressigsäure in Wasser Laufmittel B: 0,1 % Trifluoressigsäure in Acetonitril o - 55 min: 0-55 % Laufmittel B 55 - 65 min: 55 % Laufmittel B Die eluierten Peptide wurden bei Wellenlängen von 214 nm und 280 nm registriert.The following program was used at a flow rate of 2 ml / min: Mobile phase A: 0.1% trifluoroacetic acid in water Mobile phase B: 0.1% trifluoroacetic acid in acetonitrile o - 55 min: 0-55% mobile phase B 55 - 65 min: 55% mobile phase B Die eluted peptides were recorded at wavelengths of 214 nm and 280 nm.

Tabelle 6 zeigt die Kapazitätskoeffizienten k' und die relativen Peakhöhen (bei 214 nm) der erhaltenen Peptide. Der Kapazitätskoeffizient k' ist definiert als wobei tR die Retentionszeit der Substanz, tRo die Retentionszeit des Lösungsmittels ist. Tabele 6 relative Peptid k' relative Peptid k' Peakhöhe Peakhöhe 1 1,1 14 13 21,2 4 2 4,9 8 14 22,7 2 3 10,5 4 15 24,4 3 4 10,7 4 16 25,0 44 5 11,5 4 17 25,5 25 6 12,3 4 18 26,5 5 7 13,1 2 19 27,5 100 8 14,1 18 20 29,0 4 9 14,2 18 21 29,3 3 10 14,5 24 22 29,3 3 11 15,9 3 23 29,3 2 12 18,0 3 Die Peptide 2, 10, 11, 16, 17 und 19 zeigten starke Absorption auch bei 280 nm.Table 6 shows the capacity coefficients k 'and the relative peak heights (at 214 nm) of the peptides obtained. The capacity coefficient k 'is defined as where tR is the retention time of the substance, tRo is the retention time of the solvent. Table 6 relative peptide k 'relative peptide k' peak height peak height 1 1.1 14 13 21.2 4 2 4.9 8 14 22.7 2 3 10.5 4 15 24.4 3 4 10.7 4 16 25, 0 44 5 11.5 4 17 25.5 25 6 12.3 4 18 26.5 5 7 13.1 2 19 27.5 100 8 14.1 18 20 29.0 4 9 14.2 18 21 29, 3 3 10 14.5 24 22 29.3 3 11 15.9 3 23 29.3 2 12 18.0 3 The peptides 2, 10, 11, 16, 17 and 19 showed strong absorption even at 280 nm.

In analoger Weise wurde ein durch Reverse Phase HPLC endgereinigtes Hu-TNF (siehe oben) durch Staphylococcus aureus V8 Portease verdaut: Zu einer Lösung von Hu-TNF (0,5 mg/ml in 125 mM Tris.Cl pH 6,8; 0,5 % SDA, 10 % Glycerin)wurden 10 % (v/v) einer Lösung des Enzyms in Wasser (1 mg/ml) pipettiert und das Gemisch 6 Stunden bei 37 0C inkubiert. Die entstandenen Fragmente wurden wie oben beschrieben durch Reverse Phase HPLC aufgetrennt. Tabelle 7 zeigt Kapazitätskoeffizienten und relative Peakhöhen (gemessen bei einer Wellenlänge von 214 nm) der erhaltenen Peptide.In an analogous manner, it was finally purified by reverse phase HPLC Hu-TNF (see above) digested by Staphylococcus aureus V8 Portease: into a solution of Hu-TNF (0.5 mg / ml in 125 mM Tris.Cl pH 6.8; 0.5% SDA, 10% glycerol) 10% (v / v) of a solution of the enzyme in water (1 mg / ml) and the mixture Incubated at 37 ° C. for 6 hours. The resulting fragments were as described above separated by reverse phase HPLC. Table 7 shows capacity coefficients and relative peak heights (measured at a wavelength of 214 nm) of the peptides obtained.

Peak 5 entspricht einem Bestandteil von unverdautem Hu-TNF.Peak 5 corresponds to a component of undigested Hu-TNF.

Tabelle 7 Peptid k' relative Peptid k' relative Peakhöhe Peakhöhe 1 26,6 21 5 28,9 32 2 26,9 86 6 32,1 7 3 27,3 43 7 35,3 5 4 28,3 100 Die Peptide 1,2,3,4,5 und 7 zeighten starke Absorption auch bei 280 nm.Table 7 peptide k 'relative peptide k' relative peak height peak height 1 26.6 21 5 28.9 32 2 26.9 86 6 32.1 7 3 27.3 43 7 35.3 5 4 28.3 100 The peptides 1, 2, 3, 4, 5 and 7 show strong absorption even at 280 nm.

10. Kartierung proteolytischer Spaltprodukte durch SDS-Gelelektrophorese Eine Lösung von gereinigtem Hu-TNF wurde durch diskontinuierliche SDA-Gelelektrophorese nach Laemmli (21) in einem 0,75 mm dicken Gel mit 15 % Acrylamid aufgetrennt (siehe 7, 25 ul mit 7 fig pro Bahn).10. Mapping of proteolytic cleavage products by SDS gel electrophoresis A solution of purified Hu-TNF was prepared by discontinuous SDA gel electrophoresis according to Laemmli (21) separated in a 0.75 mm thick gel with 15% acrylamide (see 7, 25 ul with 7 fig per lane).

Das Gel wurde 20 min gefärbt (siehe 7)und solange entfärbt, bis die Hu-TNF-Banden gerade sichtbar wurden. The gel was stained for 20 min (see 7) and decolorized until the Hu-TNF bands just became visible.

Die gesamte Region mit allen drei Banden wurde aus mehreren Bahnen ausgeschnitten und für eine Peptidkartierung nach der Methode von Cleveland (22) eingesetzt. Im Gegensatz zum dort beschriebenen Verfahren wurde jedoch die gesamte Region des Gels mit allen drei Banden, im Winkel von 90 Grad zur ursprünglichen Laufrichtung gedreht, in das Gel (15 % Acrylamid, 1,5 mm Dicke) eingesetzt. Verdaut wurde mit Staphylococcus aureus V8 Protease.The entire region with all three bands was made up of multiple lanes cut out and used for peptide mapping according to the Cleveland method (22) used. In contrast to the method described there, however, the entire Region of the gel with all three bands at 90 degrees to the original Rotated running direction, inserted into the gel (15% acrylamide, 1.5 mm thick). Digested was made with Staphylococcus aureus V8 protease.

Bahn A in Abbildung 7 zeigt die unverdauten Proteine, Bahn B eine unvollständige Verdauung durch 0,2/ng Protease, Bahn C eine vollständige Verdauung durch 2,ug Protease. Die Proteine wurden in nur je zwei Peptide gespalten, von denen eines ein in allen drei Proteinen identisches Molekulargewicht von etwa 6000 aufweist.Lane A in Figure 7 shows the undigested proteins, Lane B one incomplete digestion by 0.2 / ng protease, lane C, complete digestion by 2 µg protease. The proteins were split into only two peptides each, one of which one has an identical molecular weight of about 6,000 in all three proteins.

Biologische Charakterisierung des erfindungsgemäß Hu-TNF: 11.1 Hemmung der Proliferation von HeLa-Zellen und Vergleich mit Human-Interferonen Zellen der humanen Cervic-Carcinomlinie HeLa (29) wurden in Eagle's Minimum Essential Medium (12) mit 10 % fötalem Kalbsserum, Penicillin (100 E/ml) und Streptomycin (50 E/ml) gezüchtet. In 3 cm-Kunststoff-Gewebekulturschalenwurden je 50 000 Zellen in 2,5 ml Medium eingesetzt. Je zwei Schalen erhielten folgende Zusätze: a) Medium b) Hu-TNF c) rekombinantes Human-IFN-alpha2arg (33), = 98 % rein, Die Kulturen wurden sechs Tage bei 37 0C inkubiert; anschließend wurden die Zellen trypsiniert und die Zellzahl in Haemocytometerkammern bestimmt. Das Ergebnis zeigt Abbildung 8.Biological characterization of the Hu-TNF according to the invention: 11.1 inhibition the proliferation of HeLa cells and comparison with human interferon cells of the human cervic carcinoma line HeLa (29) were in Eagle's Minimum Essential Medium (12) with 10% fetal calf serum, penicillin (100 U / ml) and streptomycin (50 U / ml) bred. In 3 cm plastic tissue culture dishes, 50,000 cells per 2.5 ml of medium used. Two dishes each received the following additives: a) Medium b) Hu-TNF c) recombinant human IFN-alpha2arg (33), = 98% pure, cultures became six Incubated for days at 37 ° C .; then the cells were trypsinized and the cell number determined in hemocytometer chambers. The result is shown in Figure 8.

11.2 Hemmung der Proliferation von A549-Zellen und Vergleich mit Human-Interferonen Zellen der humanen Lungen-Karzinomlinie A549 (30) wurden, wie unter 11.1 beschrieben, in Kulturschalen in Gegenwart von Hu-TNF-alpha und IFN-gamma sechs Tage inkubiert. Das Ergebnis zeigt Abbildung 9.11.2 Inhibition of the proliferation of A549 cells and comparison with human interferons Cells of the human lung carcinoma line A549 (30) were, as described under 11.1, incubated in culture dishes in the presence of Hu-TNF-alpha and IFN-gamma for six days. The result is shown in Figure 9.

I1.3LIemltlung der Proliferation von Maus-L929 Zellen und Vergleich mit Maus-Interferonen Maus-L929-Zellen (31) wurden, wie unter 11.1 beschrieben, gezüchtet und in Kulturschalen in Gegenwart folgender Zusätze inkubiert: a) Hu-TNF b) Maus-IFN alpha/beta, spezifische Aktivität 4,4 x 10^7 E/mg (Firma Enzo Biochem Inc, New York, USA) c) rekombinantes Maus-IFN-gamma (35), > = 98 % rein Die Zellen wurden fünf Tage bei 37°C inkubiert, anschließend trypsiniert und die Zellzahl in Haemocytometerkammern bestimmt.I1.3L: Determination of the proliferation of mouse L929 cells and comparison with mouse interferons Mouse L929 cells (31) were, as described under 11.1, grown and incubated in culture dishes in the presence of the following additives: a) Hu-TNF b) mouse IFN alpha / beta, specific activity 4.4 x 10 ^ 7 U / mg (Enzo Biochem Inc, New York, USA) c) recombinant mouse IFN-gamma (35),> = 98% pure The cells were incubated for five days at 37 ° C., then trypsinized and the Cell count in hemocytometer chambers determined.

Das Ergebnis zeigt Abbildung 10. The result is shown in Figure 10.

11.4 Hemnung der Proliforation von maus-Zellen (Linie B16) und Vergleich mit Maus-Interferzonen B 16 (32) Maus-Melanomzellen wurden, wie unter 11.1 beschrieben, gezüchtet, in Kulturschalen angesetzt und in Gegenwart von Hu-TNF, Maus-IFN-alpha/beta und Maus-IFN-gamma (siehe 11.3) fünf Tage inkubiert. Das Ergebnis zeigt Abbildung 11.11.4 Inhibition of the proliferation of mouse cells (line B16) and comparison with mouse interfering zones B 16 (32) mouse melanoma cells were, as described under 11.1, grown, grown in culture dishes and in the presence of Hu-TNF, mouse IFN-alpha / beta and mouse IFN-gamma (see 11.3) incubated for five days. The result is shown in the illustration 11.

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Nature 227, 680-685 (1970) 22. Cleveland, D.W., Fischer, S.G., Kirschner, M.W. & Laemmli, U.K. (1977) J. Biol. Chem. 252, 1102-1106 23. Kramer, S.L. & Granger, G.A. (1975) Cell. Immunol. 15, 57-68 24. Granger, G.A., Moore, G.E., White, J.G. Matzinger, P., Sundsmo, J.S. Shupe, S., Kolb, W.P., Kramer, J. & Glade, P.R. (1970) J. Immunology 104, 1476-1485 25. Amino, N., Linn, E.S., Pysher, T.J., Mier, R,,Moore, G.E. & Degroot, L.J. (1974) J. Immunology 113, 1334-1344 26. Evans, C.H. (1981) Cell. Immunol. 63, 1-15 27. Williams, T.W. & Bellanti, J.A. (1983) J. Immunol. 130, 518-520 28. Umeda, T., Hara, T. & Nijima, T. (1983) Cell. Molec. Biol. 29, 349-352 29. Gey, G.O., Coffman, W.D. & Kubicek, M.T. (1952) Cancer Res. 12, 264 30. Giard, D.J. (1973) J. Natl. Cancer Inst. 51, 1417-1423 31. Sanford, K.K., Earle, W.R. & Likely, G.D. (1948) J. Natl. Cancer Inst. 9, 229 32. Fidler, I.J. (1970) J. Natl. Cancer Inst. 45, 773 33. Dworkin-Rastl, E., Swetly, P. & Dworkin, M.B.(1983) Gene 21, 237-248 34. Gray, P.W., Leung, D.W., Pennica, D., Yelverton, E., Najarian, R., Simonsen, C.C., Derynck, R., Sherwood, P., Wallace, D.M., Berger, S.L., Levinson, A.D. Nature 227, 680-685 (1970) 22. Cleveland, D.W., Fischer, S.G., Kirschner, M.W. & Laemmli, U.K. (1977) J. Biol. Chem. 252, 1102-1106 23. Kramer, S.L. & Granger, G.A. (1975) Cell. Immunol. 15, 57-68 24. Granger, G.A., Moore, G.E., White, J.G. Matzinger, P., Sundsmo, J.S. Shupe, S., Kolb, W.P., Kramer, J. & Glade, P.R. (1970) J. Immunology 104, 1476-1485 25. Amino, N., Linn, E.S., Pysher, T.J., Mier, R ,, Moore, G.E. & Degroot, L.J. (1974) J. Immunology 113, 1334-1344 26. Evans, C.H. (1981) Cell. Immunol. 63, 1-15 27. Williams, T.W. & Bellanti, J.A. (1983) J. Immunol. 130, 518-520 28. Umeda, T., Hara, T. & Nijima, T. (1983) Cell. Molec. Biol. 29, 349-352 29. Gey, G.O., Coffman, W.D. & Kubicek, M.T. (1952) Cancer Res. 12, 264 30. Giard, D.J. (1973) J. Natl. Cancer Inst. 51, 1417-1423 31. Sanford, K.K., Earle, W.R. & Likely, G.D. (1948) J. Natl. Cancer Inst. 9, 229 32. Fidler, I.J. (1970) J. Natl. Cancer Inst. 45, 773 33. Dworkin-Rastl, E., Swetly, P. & Dworkin, M.B. (1983) Gene 21, 237-248 34. Gray, P.W., Leung, D.W., Pennica, D., Yelverton, E., Najarian, R., Simonsen, C.C., Derynck, R., Sherwood, P., Wallace, D.M., Berger, S.L., Levinson, A.D.

& Goeddel, D.V. (1982) Nature 295, 503-508 35. Gray, P.W. & Goeddel, D.V. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 5842-5846 Verzeichnis der Abkürzungen IFN Interferon CPG Controlled Pore Glass, Porenkontrolliertes Glas FPLC Fast Protein Liquid Chromatography HPLC High Performance Liquid Chromatography SDS Natriumdodecylsulfat Tris Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan TNF Tumor-Nekrose-Faktor Tween 20 Polyoxyethylen-sorbitan-monolaureat, n=20, Molekulargewicht etwa 1200 Hu-TNF Humaner Tumor-Nekrose-Faktor - Leerseite - & Goeddel, D.V. (1982) Nature 295: 503-508 35. Gray, P.W. & Goeddel, D.V. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 5842-5846 directory the abbreviations IFN Interferon CPG Controlled Pore Glass FPLC Fast Protein Liquid Chromatography HPLC High Performance Liquid Chromatography SDS Sodium Dodecyl Sulphate Tris Tris (hydroxymethyl) aminomethane TNF Tumor Necrosis Factor Tween 20 polyoxyethylene sorbitan monolaureate, n = 20, molecular weight about 1200 Hu-TNF Human tumor necrosis factor - blank page -

Claims

1. A process for the preparation of Human Tumor Necrosis Factor, thereby characterized in that lymphoblastoid cells in a suitable medium with the addition a promoter and that the extract, cell culture supernatant or the filtrate is treated with pore-controlled glass and that is adsorbed on the glass Factor is selectively eluted from the adsorbent.

2. The method according to claim 1, characterized.

that cleaning via pore-controlled glass is a treatment with an anion exchanger.

3. The method according to claim 1 and 2, characterized in that to cleaning via pore-controlled glass, treatment with an anion exchanger and followed by lectin.

4. Process for the production of human tumor necrosis factor according to Claim 1, characterized in that an extract containing Hu-TNF, cell supernatant or a filtrate containing Hu-TNF: a) through a column of pore-controlled glass is given, b) the interfering components are removed with a suitable eluent, c) the factor is eluted with ethylene glycol, d) the eluate is dialyzed and over a Anion exchange column is chromatographed and e) the fractions showing a Hu-TNF activity show to be chromatographed on a lectin column.

5. The method according to any one of the preceding claims, characterized in, that human B-lymphoblastoid cells are used.

6. The method according to any one of the preceding claims, characterized in, that RPMI-1788 / EBI cells are used.

7. The method according to any one of the preceding claims, characterized in, that up to 10% fetal calf serum is added to the culture medium.

8. The method according to any one of the preceding claims, characterized in, that as a tumor promoter an ester of phorbol or mezerein in concentrations of 1-40 ng / ml, preferably up to 20 ng / ml, is added.

9. The method according to any one of the preceding claims, characterized in, that after proliferation of the cells in serum-containing medium, the cells in serum-free Medium to be transferred.

10. The method according to any one of the preceding claims, characterized in, that extracts, culture supernatants, filtrates or lysates of microorganisms are used which contain genes for the Hu-TNF and express the factor.

11. Human tumor necrosis factor, its salts and derivatives, which are im are essentially free of impurities.

12. Human tumor necrosis factor according to claim 11, characterized in that that its molecular weight is 70,000 daltons (+ 10%).

13. Human tumor necrosis factor according to claims 11 to 12, thereby characterized that he under denaturing conditions in three species with the Molecular weights 21,500, 23,000 and 24,000 Dalton (each + 10%) split.

14. Human tumor necrosis factor according to claims 11 to 13, thereby characterized in that it is cytotoxic in biological test methods known from the literature Activity shows.

15. Human tumor necrosis factor according to claims 11 to 14, thereby characterized in that the N-terminal amino acid sequence has amino acids 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 NH2-LEU-pRO-GLY-VAL-GLY-LEU- X -PRO-SER-ALA-11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 -ALA-GLN- X - ALA-ARG-GLN-HI S-PRO-LYS -MET -TYR VAL 21 22 23 -ASP-LEU-ALA.

16. Mixture of proteolytic cleavage products, thus producible that the human tumor necrosis factor according to any one of claims 11 to 15 by trypsin is generated.

17. Mixture of proteolytic cleavage products, producible in that the human tumor necrosis factor according to any one of claims 11 to 15 by Staphylococcus aureus V 8 protease is generated.

18. amino acid sequence, characterized in that it contains at least the Amino acids 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 NH2-LEU-PRO-GLY-VAL-GLY-LEU- X -PRO-SER-ALA-11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 -ALA-GLN- X -ALA-ARG-GLN-HIS-PRO-LYS-MET-TYR VAL 21 22 23 -ASP-LEU-ALA-has.

19. Gene sequence, characterized in that it is used for human tumor necrosis factor according to claim 11 with dp N-terminal amino acid sequence 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 NH2-LEU-PRO-GLY-VAL-GLY-LEU- X -PRO-SER-ALA-11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 -ALA-GLN- X -ALA-ARG-GLN-HIS-PRO-LYS-MET-TYR VAL 21 22 23 -ASP-LEU-ALA-coded.

20. Medicines for the treatment of malignant diseases in humans, characterized in that it is a component of at least one compound from the Claims 11 to 18, containing salts or derivatives thereof.