DE3446636A1

DE3446636A1 - Verfahren zur herstellung eines immunreaktiven poroesen traegermaterials

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Publication number: DE3446636A1
Application number: DE19843446636
Authority: DE
Inventors: Helmut Dr.rer.nat. 8000 München Jering; Rainer Dr.rer.nat. 8124 Seeshaupt Schäfer
Original assignee: Boehringer Mannheim GmbH
Current assignee: Roche Diagnostics GmbH
Priority date: 1984-12-20
Filing date: 1984-12-20
Publication date: 1986-06-26
Also published as: US4820644A; DK594485A; NO165696B; IE58809B1; DK594485D0; CA1256368A; AU5106485A; JPS61151463A; NO855160L; AU566478B2; ZA859674B; ES550286A0; DD244418A5; IE853089L; EP0185372B1; DE3568490D1; JPH0521510B2; EP0185372A1; ES8704269A1; NO165696C

Description

Patentanwälte Dipl.-Ing. H. Wejckma^n, Dipl.-Phys. Dr. K. Fincke

Dipl.-Ing. F. A.Weickmann, Dipl.-Chem. B. Huber Dr.-Ing. H. Liska, Dipl.-Phys. Dr. J. Prechtel

HVa

interne Nummer 2651

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MDHLSTRASSE 22

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TELEGRAMM PATENTWEICKMANN MÖNCHEN

BOEHRINGER MANNHEIM GMBH
Sandhofer Straße 112-132, D-6800 Mannheim-Waldhof

Verfahren zur Herstellung eines immunreaktiven porösen

Trägermaterials

Beschreibung

Immunreaktive poröse Trägermaterialien spielen in verschiedenen Zweigen der Technik eine wichtige Rolle. Beispielsweise werden derartige Materialien für analytische und präparative Verfahren benötigt, bei welchen ein Partner einer Immunreaktion an eine unlösliche Matrix fixiert eingesetzt wird. Die Fixierung des Partners der Immunreaktion an den unlöslichen Träger kann durch chemische oder physikalische Kräfte erfolgen. So sind seit langem Methoden zur Herstellung kovalenter Bindungen zwischen einem festen Trägermaterial und einer daran zu bindenden chemischen Substanz, wie insbesondere auch biologischen aktiven Proteinen, bekannt. Ein Nachteil dieser Methoden besteht generell darin, daß sie eine chemische Veränderung am biologisch aktiven Material bewirken, die in vielen Fällen auch eine Veränderung der biologischen Aktivität zur Folge hat. Eine weitere bekannte Methode ist die Einschlußpolymerisation derartiger biologisch aktiver Substanzen. Hier bleibt zwar das Molekül als solches in der Regel unverändert und behält daher auch seine biologische Wirksamkeit unverändert bei. Die Zugänglichkeit für den anderen, in einer flüssigen Phase vorliegenden Partner der Immunreaktion ist jedoch drastisch beschränkt. Daher wurde vielfach auf das dritte bekannte Verfahren zurückgegriffen, welches die Nachteile der kovalenten Bindung und der Einschlußpolymerisation vermeidet, nämlich die adsorptive Fixierung an einem geeigneten Trägermaterial. Diese Methode wiederum hat jedoch den Nachteil, daß die Bindung an den festen Träger wesentlich schwächer ist als bei den beiden zuerst erwähnten Methoden und nur auf bestimmten Kunststoffoberflächen in der Regel eine akzeptable Bindungsstabilität erzielt werden konnte.

Spezielle Probleme ergaben sich hinsichtlich der Haftfestigkeit bei einer adsorptiven Bindung, bei der also sowohl eine kovalente Fixierung, als auch eine Einschlußpolymerisation, vermieden werden soll dann, wenn poröse Trägermaterialien angewendet werden sollen. Aus der US-PS 3,888,629 ist eine Methode bekannt, die dieses Haftfestigkeitsproblem löst, indem im porösen Trägermaterial die Fixierung durch Ablaufenlassen einer Immunreaktion zwischen den beiden Partnern einer Immunreaktion, also zwischen Antikörper und Antigen oder Hapten, durchgeführt wird. Man imprägniert hierzu das poröse Trägermaterial entweder mit einer Lösung des ersten Partners der Immunreaktion und danach mit einer Lösung des zweiten Partners der Immunreaktion, so daß die Immunreaktion selbst im porösen Trägermaterial ablaufen kann unter permanenter Fixierung des gewünschten immunreaktiven Stoffes ohne chemische Veränderung oder Nachteilen hinsichtlich seiner Zugänglichkeit für andere Reaktionspartner (PCT-WO 82/02601). In einer zweiten bekannten Methode werden die beiden Lösungen der jeweiligen Partner der Immunreaktion erst rasch zusammengemischt und dann sofort das poröse Trägermaterial damit imprägniert (US-A-3 888 629).

Diese Methode der Bindung eines immunreaktiven Stoffes auf einem porösen Trägermaterial löst zwar die oben beschriebenen Probleme, weist jedoch einen anderen Nachteil auf, nämlich eine ungleichmäßige Verteilung der fixierten immunreaktiven Substanz auf dem Trägermaterial. Dieser Nachteil ist besonders dann gravierend, wenn dieses immunreaktive poröse Trägermaterial z. B. für Zwecke der quantitativen Analyse niedrig konzentrierter Haptene oder Proteine eingesetzt werden

soll. Die Forderung nach Stabilität des Antigen-Antikörper-Netzwerkes sowie nach niedrigen Gleichgewichts-Dissoziations-Konzentrationen der immunreaktiven Partner aus den Immunkomplexen relativ zur Konzentration der zu bestimmenden Haptene und Proteine läßt sich nur erreichen, wenn der verwendete Antikörper eine hohe Affinität zum jeweiligen Antigen besitzt. Erfahrungsgemäß setzt die Präzipitatbildung beim Mischen derartig immunreaktiver Partner spontan ein. Bei der Herstellung technischer Mengen eines Immunadsorbers durch Imprägnieren eines porösen Trägermaterials mit kurz zuvor gemischten Lösungen der immunreaktiven Partner kommt es erwartungsgemäß zu zeitlich und räumlich unkontrollierbarer Präzipitatbildung auf dem Trägermaterial.

Die quantitative Dosierung des Immunosorbens erfolgt zweckmäßigerweise durch Ausschneiden einer bestimmten Papierfläche bei einem immunreaktiven Papier, durch Auswahl einer bestimmten Anzahl von Kügelchen bei einem kugelförmigen porösen Trägermaterial oder durch Auswiegen einer bestimmten Menge des immunreaktiven Trägermaterials. Bei ungleichmäßiger Verteilung des fixierten immunreaktiven Stoffes scheidet eine derartige einfache Dosierungsmethode jedoch aus.

Ein weiterer Nachteil der bekannten Immunpräzipitationstechnik besteht darin, daß sie sehr hochgereinigte Antigene benötigt, was eine Vorreinigung durch Immunosorption und damit eine aufwendige Herstellungsweise nötig macht.

Der vorliegenden Erfindung liegt nunmehr die Aufgabe zugrunde, auf einfache Weise poröse immunreaktive Trägermaterialien herzustellen, welche eine überlegene

Homogenität hinsichtlich der Verteilung des immunreaktiven Bestandteils aufweisen und sich leicht und einfach herstellen lassen, insbesondere keine aufwendige Vorreinigung für die Herstellung erfordern.

Gelöst wird diese Aufgabe erfindungsgemäß durch ein Verfahren zur Herstellung eines immunreaktiven, porösen Trägermaterials durch Aufbringung von je einer Lösung eines ersten Partners einer Immunreaktion und eines mit diesem präzipitierenden zweiten Partners einer Immunreaktion, Inkubation des mit den Lösungen getränkten Trägermaterials zur Immunpräzipitation, Waschen und Trocknen des imprägnierten Trägermaterials, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß man eine Lösung beider Partner der Immunreaktion herstellt, welche einen Hemmstoff für die Immunpräzipitation enthält, das Trägermaterial mit dieser Lösung imprägniert und dann die Immunpräzipitation durch Entfernen des Hemmstoffes auslöst.

Wesentliches Merkmal der Erfindung ist die Verwendung eines Immunpräzipitations-Hemmstoffes, der reversibel wirksam ist und durch einfache Entfernung oder chemische Veränderung seine Hemmwirkung verliert. In Gegenwart des Hemmstoffes können die Partner der zur Präzipitation führenden Immunreaktion sich völlig homogen verteilen und aufgrund der sehr langsam einsetzenden Fällung erhält man eine völlig gleichmäßige Bedeckung des Trägermaterials mit der jeweils gewünschten immunreaktiven Substanz, die auch im großtechnischen Ansatz zu völlig gleichmäßigen und reproduzierbaren Resultaten führt.

Im Gegensatz zu dem bekannten Verfahren des sequentiellen Aufbringens von Antigen und Antikörper (heterogenes Verfahren), wie es in Beispiel 4 beschrieben ist, wird bei dem erfindungsgemäßen "homogenen" Verfahren mit einer homogenen Lösung von Antigen und Antikörper getränkt. Dabei werden zwei Ausführungsformen unterschieden: Beim "1-Schritt-Verfahren" wird der Hemmstoff, der in der Tränklösung enthalten ist, während des Herstellungsverfahrens aus der Lösung entfernt. Beim "2-Schritt-Verfahren" wird der poröse Träger zunächst mit einem Wirkstoff vorgetränkt, der die Wirkung des Hemmstoffs bei der nachfolgenden Tränkung mit den immunreaktiven Komponenten aufhebt.

Als Hemmstoffe der Immunpräzipitation werden im Rahmen der Erfindung vorzugsweise solche Substanzen verwendet, welche bei immunosorptiven Aufreinigungen als Desorptionsmittel eingesetzt werden. Besonders bevorzugt werden hierzu Säuren oder chaotrope Ionen der Hofmeister-Reihe (lyotrope Reihe), wie sie beispielsweise beschrieben sind in "Structure and Stability of Biological Macromolecules, 1969, Marcel Dekker, Inc., New York, Seite 427, verdünnte Basen und bestimmte organische Verbindungen oder Lösungsmittel wie Acetonitril, Harnstoff oder Glycerin.

Unter den im Rahmen des Verfahrens der Erfindung geeigneten Säuren kommen sowohl flüchtige, als auch nicht flüchtige Säuren in betracht. Flüchtige Säuren können nach Imprägnierung des Trägermaterials zur Aufhebung der Hemmwirkung leicht entfernt werden, z. B. durch Erwärmen, Vakuum und dergleichen. Bei nicht flüchtigen Säuren läßt sich ein analoger Effekt durch Einsatz

eines Salzes einer flüchtigen Säure, welches von der nicht flüchtigen Säure zerlegt wird, unter Freisetzung der flüchtigen Säure, erzielen. Bevorzugte Beispiele sind Essigsäure, Propionsäure und Salzsäure für flüchtige Säuren. Weiterhin sind als Hemmstoffe organische Verbindungen geeignet, welche reversibel sowohl die Proteinais auch die Wasserstruktur beeinflussen können und beispielsweise in "J.P. Brandts, Conformatial Transitions of Proteins in Water", enthalten in "Structure and Stability of Biological Macromolecules, 1969, Marcel Dekker, Inc., New York, Seite 213-290 beschrieben sind. Besonders bevorzugt werden Glycerin und Harnstoff.

Als Hemmstoffe kommen weiterhin in Frage chaotrope Ionen, wie Tiercyanate und Jodide. Beispiele für andere, geeignete Ionen sind: Fluoride, Bromide, Perchlorate, Guanidin und Sulfate. Ihre Entfernung zwecks Aufhebung der Präzipitationshemmung kann durch Extraktion, z. B. mit organischen Lösungsmitteln oder Gemischen von organischen Lösungsmitteln (z. B. Ester) oder Gemischen aus organischen Lösungsmitteln und Wasser, beispielsweise Wasser/Alkohol-Gemischen gegebenenfalls mit Zusatz von Ionophoren und dergleichen erfolgen. In der Regel genügt dabei bereits eine Veränderung der Ionenstärke, um den gewünschten Effekt zu erzielen, doch kann auch eine vollständige Entfernung des Hemmstoffes erfolgen. Auch ein Zusatz von Komplexbildnern wie EDTA kommt in Frage, z. B. zur Entfernung von hemmenden Metallsalzen wie

Die molaren Konzentrationen der zur Präzipitation führenden immunreaktiven Partner können in weiten Bereichen variiert werden. Vorzugsweise werden sie bei der Erfindung so eingesetzt, daß derjenige Partner,

dessen Immunreaktivität im fertigen Trägermaterial ausgenützt werden soll, nicht im Überschuß vorliegt. Besonders bevorzugt werden die zur Präzipitation führenden Partner im Verhältnis des Heidelberger Maximums eingesetzt. Dies heißt, daß die beiden Reaktionspartner in dem für die Präzipitation günstigsten Verhältnis eingesetzt werden. Dieses Verhältnis läßt sich durch Trübungstests leicht vorher festlegen. Eine entsprechende Trübungskurve findet sich beispielsweise in "Methods in Immunology and Immunochemistry", Band III, Academic Press 1971, Kapitel 13, Seite 10. Bei der Erstellung einer solchen Kurve wird die Trübung aufgetragen, die bei konstanter Menge eines der Reaktionspartner mit zunehmenden Mengen des anderen Reaktionspartners erhalten wird. Das Trübungsmaximum ist das Heidelberger Maximum.

Um möglichst hohe Stabilität des trägerfixierten immunreaktiven Körpers zu erreichen, soll einer der Partner der Immunpräzipitation vorzugsweise ein präzipitierender Antikörper mit möglichst hoher Affinität zum Antigen sein.

Die Partner der Immunpräzipitation im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens sind einerseits ein Antigen ζ. B. ein Hapten oder ein Protein, andererseits ein Antikörper. Das Antigen kann natürlich selbst ebenfalls einen Antikörper darstellen. In einem solchen Falle, wenn also der zu präzipitierende immunreaktive Bestandteil selbst ein Antikörper ist, kann dieser auch als Fab, Fab¹ bzw. (Fab¹)»-Fragment eingesetzt werden und zwar sowohl eines monoklonalen, als auch eines polyklonalen Antikörpers. Der präzipitierende Anti-Antikörper,

der dann für die Fällung eingesetzt wird, muß entsprechend ausgewählt werden. Der Anti-Antikörper selbst kann dann polyklonal oder monoklonal oder ein (Fäb')y-Fragment davon sein. Handelt es sich beim Anti-Antikörper um einen monoklonalen Antikörper oder ein Fragment davon, so sollten diese zweckmäßig zwei unterschiedliche Epitope am Antigen erkennen. Jedoch können auch monoklonale Antikörper bzw. deren (Fab¹)~-Fragmente verwendet werden, die nur ein Epitop erkennen (was häufiger ist), wenn dieses Epitop auf dem Antigen mindestens zweimal vorhanden ist. Auch können Mischungen von monoklonalen Antikörpern als Anti-Antikörper-Fraktion für die Immunpräzipitation eingesetzt werden.

Als zu prazipitierender immunreaktiver Stoff kann vorzugsweise auch ein Protein verwendet werden, an das ein Hapten oder Antigen gekoppelt ist. In diesem Falle wird zweckmäßig ein prazipitierender Antikörper als zweiter Partner der Immunreaktion verwendet, welcher gegen das Protein gerichtet ist. In einer weiteren Ausführungsform kann an den präzipitierenden Antikörper ein Hapten oder Antigen gekoppelt sein. Dabei kann der andere Partner der Immunreaktion unmarkiert oder mit dem gleichen oder einem anderen Hapten oder Antikörper gekoppelt sein. Alternativ ist das zu präzipitierende Protein selbst ein spezifischer Antikörper, der von einem Anti-Antikörper präzipitiert wird.

Wie oben bereits erwähnt, ist es ein spezieller Vorteil des erfindungsgemaßen Verfahrens, daß man wenigstens einen Partner für Immunreaktion in ungereinigter Form einsetzen kann. Im Gegensatz zu den bekannten Immunpräzipitations-Verfahren, bei denen die Präzipitation

augenblicklich nach Zusammengeben der Immunreaktionspartner einsetzt, kann bei dem erfindungsgemäßen Verfahren die Geschwindigkeit der Präzipitation in Suspension oder im porösen Trägermaterial so kontrolliert erfolgen, daß keine Mitreißeffekte bei Fremdsubstanzen auftreten und letztere nicht vorher entfernt werden müssen, sondern nach der Immunpräzipitation einfach ausgewaschen werden können. Ein derartiger Waschschritt ist ohnedies bevorzugt, da hierbei kleine Präzipitatpartikel, weniger stabile Immunkomplexe und adsorptiv gebundene Antigene entfernt werden. Zur Waschung eignen sich daher Puffer mit hoher Ionenstärke, Detergenzien, organische Lösungsmittel und dergleichen sowie die Präzipitate stabilisierende Zusätze (Kohlenhydrate und Proteine).

Wenn auf eine Vorreinigung der Komponenten der Immunpräzipitationsreinigung verzichtet werden soll, ist es zweckmäßig, Lösungen, welche das jeweilige Antigen und den jeweiligen Antikörper enthalten, erst im optimalen (Heidelberger-)Verhältnis zu mischen, das ausgefallene Präzipitat zu waschen und durch Zusatz des Hemmstoffes der Immunpräzipitation, vorzugsweise durch Säurezusatz, wieder aufzulösen. Man erhält so eine Mischung der Partner der Immunpräzipitationsreaktion, die direkt auf das poröse Trägermaterial aufgetragen werden kann.

Natürlich ist es im Rahmen der Erfindung auch möglich, die Partner der Immunreaktion vorher getrennt über Immunadsorber in üblicher Weise aufzureinigen, dann mit einem Hemmstoff zu eluieren und die Eluate entweder direkt für das erfindungsgemäße Verfahren einzusetzen oder erst durch Lyophilisation stabile Lagerformen der Reaktionspartner herzustellen. Die Hemmung der Immunpräzipitation sowie die Verlangsamung der Fällung im

Trägermaterial nach Aufhebung der Hemmwirkung kann durch physikalische Methoden unterstützt werden, wie z. B. Temperaturerniedrigung oder Viskosxtätserhöhung.

Als Träger kommen im Rahmen der Erfindung übliche feste Träger für ixnmunreaktive Substanzen in betracht. Ein derartiges Trägermaterial, welches häufig auch als Matrix bezeichnet wird, kann beispielsweise aus Glas, Kunststoff, Papier, porösem Metall und dergleichen bestehen, vorausgesetzt, das Trägermaterial ist ausreichend von zusammenhängenden flüssigkeitsdurchlässigen Hohlräumen durchsetzt. Geeignet sind natürliche, künstliche, organische oder anorganische Polymere. Ebenso kommen faserartige, schwammartige oder gesinterte Substanzen in betracht. Als Trägermaterialien können flächige, partikuläre oder andere dreidimensionale poröse Körper eingesetzt werden. Bevorzugt werden flächige poröse Träger verwendet wie Papier, Schaumstoff-Folien, Glasfasermatten und dergleichen. Da das erfindungsgemäße Verfahren eine völlig homogene Verteilung der immunreaktiven Substanz in diesen flächigen Matrizes ergibt, kann eine Dosierung höchst einfach anhand der Flächeneinheiten erfolgen. Derartige immunreaktive flächige Trägermaterialien eignen sich besonders für Verwendung als feste Phase in den heterogenen Immunoassays.

Die Anwendung eines erfindungsgemäß hergestellten immunreaktiven Trägermaterials im Rahmen des heterogenen Enzymimmunoassays kann z. B. so erfolgen, daß Hapten (H) oder Protein (P), das in einer Probe wie Pufferlösung, Serum, Plasma, Urin, Kulturüberstand, u. a. enthalten

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ist, mit einem markierten Binder (B) versetzt wird. Als Binder kommen u. a. Antikörper, Fab -Fragment bzw. Fab-Fragment sowie Liganden in Frage, welche spezifisch mit dem Hapten oder Protein reagieren. Als Markierung des Binders kann z. B. ein Enzym, Fluoreszenz-Label oder Radioisotop, verwendet werden, in den nachfolgenden Beispielen wurde die ß-Galactosidase gewählt. Die Menge des zugegebenen Binders kann molmäßig sowohl im Überschuß als auch im Unterschuß zu dem in der Probe vorhandenen Hapten oder Protein vorliegen.

Diese Mischung wird für eine konstante Zeit inkubiert, während der sich die Komplexe H-B bzw. P-B bilden. Nach Ablauf dieser Zeitspanne liegen im Reaktionsgemisch drei Spezies vor, nämlich der Komplex, bestehend aus Hapten/Protein, und Binder (H-B, P-B), restliches freies Hapten/Protein (H/P) und restlicher freier Binder (B).

Die Trennung dieser Spezies erfolgt in einem zweiten Schritt mittels Immunosorption. Dazu wird das Gemisch auf die erfindungsgemäß hergestellte Immunpräzipitation-Festphase aufgetragen, die das nachzuweisende Hapten bzw. den Antikörper gegen das zu bestimmende Protein gebunden enthält.

- Beim Hapten-Test bindet nunmehr der freie Binder, nicht aber der mit Hapten abgesättigte Binder an die Festphase. Folglich enthält der überstand bzw. das Eluat der Festphase den mit dem Hapten der Probe abgesättigten Binder. Die quantitative Bestimmung des Haptens erfolgt nunmehr über die Markierung des Binders, in den vorliegenden Beispielen über die Bestimmung der ß-Galactosidase mittels o-Nitrophenyl-ß-D-galactosid oder Chlorphenolrot-ß-D-galactosid.

- Beim Protein-Test bindet der Komplex aus Protein und Binder, nicht jedoch der freie Binder an die Festphase, Reste des freien Binders werden durch Waschen vom erfindungsgemäß hergestellten Immunosorbens entfernt. Der quantitative Nachweis des Proteins erfolgt über den markierten Binder, in den folgenden Beispielen über die Bestimmung der ß-Galactosidase mittels o-Nitrophenyl-ß-D-galactosid oder Chlorphenolrot-ß-D-galactosid.

Eine andere Anwendung sind !competitive Immuntests. Der Einsatz des erfindungsgemäß hergestellten immunreaktiven Trägermaterials kann so erfolgen, daß der Analyt (Hapten oder Protein), der in der Probe enthalten ist, mit einer konstanten Menge an markiertem Analyten versetzt wird. Die Markierung kann z. B. ein Enzym, ein Fluoreszenz-Label, Radioisotop und anderes sein. Diese Mischung wird auf die Matrix gegeben. Auf der Matrix ist ein Antikörper immobilisiert, welcher gegen den Analyten gerichtet ist. Die Mischung wird auf der Matrix eine bestimmte Zeit inkubiert. Während dieser Zeit konkurrieren sowohl unveränderter Analyt als auch markierter Analyt um die Bindungsstellen auf der Matrix. Je mehr Analyt in der Probe vorhanden ist, desto weniger markierter Analyt wird von der Matrix gebunden und umgekehrt. Am Ende der Inkubationsphase wird die Flüssigkeit aus der porösen Matrix entfernt, z. B. durch Zentrifugieren. Bestimmt wird dann die Menge des markierten Analyten entweder in der freien Phase oder die Menge des an die Matrix gebundenen markierten Analyten.

Eine weitere Anwendung der erfindungsgemäß hergestellten Trägermaterialien kann so erfolgen, daß der Analyt (Hapten oder Protein) mit einer konstanten Menge an

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markiertem Antikörper, der gegen den Analyten gerichtet ist, versetzt wird. Mögliche Arten der Markierung des Antikörpers wurden weiter oben beschrieben. Diese Mischung wird entweder eine bestimmte Zeit inkubiert und dann auf das poröse Trägermaterial gegeben oder alternativ sofort nach Mischung auf das poröse Trägermaterial gegeben. Wenn der Analyt ein Hapten ist, enthält das Trägermaterial das nachzuweisende Hapten oder ein Derivat davon in fixierter Form, falls der Analyt ein Protein ist, enthält das Trägermaterial das nachzuweisende Protein oder ein Derivat davon ebenfalls in fixierter Form. Wurde die erste Mischung vor Auftragung auf das Trägermaterial inkubiert, so bindet markierter Antikörper mit noch freien Bindungsstellen an das poröse Trägermaterial. Wurde die Mischung sofort auf das Trägermaterial gegeben, so konkurrieren der Analyt aus der Probe und der an das Trägermaterial fixierte Analyt um die Bindungszellen des markierten Antikörpers. Am Ende der Inkubationsphase wird die Flüssigkeit aus dem porösen Trägermaterial entfernt und die Menge des markierten Antikörpers entweder in der flüssigen Phase oder auf dem porösen Trägermaterial bestimmt.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung weiter.

Gewinnung der für den Test verwendeten Einsatzstoffe und Testführung

A) Herstellung von Polyhaptenen (PH):

Die Herstellung von PH ist Stand der Technik. So kann z. B. ein Digoxin- oder Diphenyl-Hydantoin-PH über reaktive unsymmetrische Dicarbonsäureester/aktivierte Haptenester und deren Bindung an ein Trägerprotein gewonnen werden.

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Die Herstellung von T3- und T4-PH kann beispielsweise durch direkte Kupplung der NH^-Gruppen von Hormon und Protein mittels Bis-Imidaten erfolgen (EU-A 0078952) , oder durch die Carbodiimid-Reaktion (Aherne et al., Brit. J. Clin. Pharm. .3/ 56 (1976)) oder die "gemischte-Anhydrid"-Reaktion (Erlanger et al., Methods in Immunology and Immunochemistry, ed. Williams and Chase, Acad. Press (New York 1967) p. 149 ff). Alternativ kann die NH₂~Funktion von T3 oder T4 in einem ersten Schritt mit der Acetyl-, Trifluoracetyl-, t-Butoxicarbonyl- oder der Benzyl-oxicarbonyl-Gruppe geschützt werden. Anschließend wird die Carboxyl-Funktion in einen aktivierten Ester überführt, z. B. N-hydroxysuccinimidester, N-hydroxyphthalimidester, N-hydroxibenztriazolester. Ein Beispiel für ein so aktiviertes T4 ist beschrieben in EU-A 0108400, Beispiel 3. Umsetzung mit dem Trägerprotein ergibt das PH.

Die Auswahl der Trägerproteine unterliegt keinen Einschränkungen, sofern nur ein entsprechender "fällender" Antikörper zur Verfügung steht bzw. hergestellt werden kann.

Soweit eine immunsorptive Aufreinigung von Antigen und Antikörper erfolgte, wurde als Träger das "Äffinitätsadsorbers, Glutardialdehyd aktiviert" von Boehringer Mannheim (Best. Nr. 665525) verwendet. Für die unten beschriebenen Beispiele wurde nach Vorschrift des Herstellers für die Antigen-Aufreinigung ein Schaf-Antikörper gegen Kaninchen-IgG bzw. ein spez. Antikörper gegen das Hapten und für die Antikörper-Aufreinigung Kaninchen-IgG an den Träger gebunden. Die Durchführung der Immunosorption erfolgte, wie in der Arbeitsanleitung zum Affinitätsadsorbens beschrieben.

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B) Herstellung des Binders (Beispiel Digoxin):

Gewinnung des Antiserums gerichtet gegen Digoxin Die Herstellung des Immunogens, nämlich Humanserum-Albumin, konjugiert mit Digoxin, erfolgte so, wie von V.P. Butler jr. und J.P. Chen, Proc. Nat. Acad. Sei. US 51, 71-78 (1967) sowie von T.W. Smith, V.P. Butler und E. Haber, Biochemistry 9, 331-337 (1970) ausführlich beschrieben wurde. Mit diesem Immunogen wurden Schafe immunisiert und das entsprechende Antiserum gewonnen.

Herstellung des Binders

Antiserum, gerichtet gegen Digoxin, wurde über Ammoniumsulfat-Pällung und Passage über DEAE-Cellulose zur IgG-Fraktion aufgereinigt. Die Papain-Spaltung wurde nach R.R. Porter, Biochem. J. 73,119-126 (1959) durchgeführt.

Die Fab-Fragmente wurden von den nicht verdauten IgG-Molekülen und den Fc-Fragmenten mittels Gelfiltration über Sephadex G 100 und Ionenaustauschchromatographie über DEAE-Cellulose nach Literaturvorschrift (K. Malinowski und W. Manski in "Methods in Enzymology"; J.J. Langone und H. van Vunakis eds., Academic Press, Vol. 73 (1981) pp. 418-459) abgetrennt. Die resultierende Fab-Fraktion wurde chromatographisch gereinigt und an ß-Galactosidase nach der Vorschrift von T. Kitiwaga in "Enzyme Immunoassay; Ishikawa, T. Kawai, K. Miyai, eds. Igaku Shoin, Tokyo/New York (1981) pp. 81-89, gekoppelt.

C) Herstellung der Schafantikörper gegen Kaninchenbzw. Maus-IgG/Fc^

Kaninchen-Schlachtserum bzw. Mäuseserum wurde einer Ammonsulfat-Fällung unterzogen. Nach Passage über DEAE-Cellulose und Papain-Spaltung, Gel- und Ionenaustauschchromatographxe (siehe B)) erhält man die Fc-Fragmente des Kaninchen- bzw. Maus-IgG's als Immunogene.

Die Aufarbeitung der Schaf-Antiseren erfolgt wie unter B) beschrieben (Immunosorption siehe A)).

D) Testführung (Beispiel Digoxin):

Digoxin-Standards in Humanserum (entnommen aus dem Elisa-Kit von Boehringer Mannheim, Best. Nr. 199656) wurden 1:7,5 mit 0,9 % NaCl-Lösung verdünnt. Zu 200 μΐ verdünntem Standard wurde 200 μΐ Binder (20 mU/ml, bestimmt mit ortho-nitrophenylß-D-galactosid), hergestellt wie unter B) beschrieben, in PBS pH 7,2 (Phosphate buffered saline) bei 37⁰C inkubiert.

Danach werden 50 μΐ des Gemisches auf 1 cm² des flächigen immunreaktiven Trägermaterials gegeben. Man inkubiert weitere 5 Minuten bei 37⁰C und zentrifugiert 1 Minute mit einer Eppendorf-Zentrifuge.

Die Enzymaktivität der Digoxin-Binder-Komplexe in der freien Phase kann nunmehr kinetisch durch Zusatz von Chlorphenolrot-ß-D-Galactosid (Herstellung nach DE 33 45 748) bei 578 nm gemessen werden.

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In den Beispielen ist jeweils der Verlauf der "ansteigenden" Eichkurven aufgezeigt, wobei die Digoxin-Konzentration des unverdünnten Serums (X-Achse) gegen die gemessene optische Dichte bei 578 nm (Y-Achse) aufgetragen ist.

Alternativ kann die überschüssige, d. h. die an die Festphase gebundene Menge Binder wie oben bestimmt und gegen die jeweilige Digoxin-Konzentration aufgetragen werden, man erhält eine "fallende" Eichkurve.

Beispiel 1

Herstellung von T3-(Trijodthyronin)-Immunpräzipitat-Vliesen.

Als Antigen wurde verwendet: Polyhapten, bestehend aus Kaninchen-IgG und daran gebundenem T3 (Molverhältnis IgG:T3 = 1:3). Das Antigen wurde immunsorptiv über eine Anti-T3-Säule aufgereinigt (siehe A)).

Als Antikörper wurde verwendet: polyklonaler Antikörper, gerichtet gegen den Fc-Teil des Kaninchen-IgG¹s. Der Antikörper wurde immunsorptiv über eine Kaninchen-IgG-Säule aufgereinigt (siehe A)).

Als Vlies wurde verwendet: Mischvlies aus Zellwolle und Polyester (Firma KaIff, Euskirchen, Deutschland), oder aus Linters, Zellwolle, Polyamid, (Firma Binzer, Hatzfeld, Eder, Deutschland).

Antigen und Antikörper werden getrennt in 1 inM Essigsäure aufgenommen (jeweils c=l mg/ml), man läßt eine Stunde bei Raumtemperatur stehen. Die Lösungen werden dann im Verhältnis 1:3 (das Antigen-/Antikörper-Verhältnis entspricht dann dem des Heidelberger-Maximums) gemischt und mit dem neunfachen Volumen einer Lösung aus 250 inM Essigsäure und 5 mM Natriumacetat verdünnt.

Das Vlies wird durch die Tränklösung gezogen, abgequetscht und 6 Minuten bei 30° im Umlufttrockenschrank getrocknet. Man wäscht eine Stunde absteigend chromatographisch mit PBS-Puffer pH 6,0 und trocknet 30 Minuten bei 30⁰C im Umlufttrockenschrank.

Das Verhältnis aus Meßbereich (Standard 5 ng T3/ml Standard 0) zu Standard 0 beträgt 11,8 (siehe Tabelle 1)

Tabelle 1

Vergleich T3-Immunpräzipitat-Vliese, hergestellt nach unterschiedlichen Verfahren

Verfahren Beispiel Meßbereich/Standard

horn. 2-Schritt 2 12,0

horn. 1-Schritt 1 11,8

heterog. 2-Schritt analog 4 1,6

Suspension analog 5 0,19

Beispiel 2

Herstellung von TS-Immunpräzipitat-Vliesen. (Homogenes 2-Schritt-Verfahren)

Antigen, Antikörper und Vliese sind die gleichen, wie im Beispiel 1. Das Vlies wird mit 50 mM NaCl getränkt und anschließend 30 Minuten bei 50⁰C im Umlufttrockenschrank getrocknet.

Antigen und Antikörper werden getrennt in 1 mM Essigsäure aufgenommen (jeweils c=l mg/ml), man läßt eine Stunde bei Raumtemperatur stehen. Die beiden Lösungen werden im Verhältnis 1:3 gemischt, und mit dem neunfachen Volumen an 50 mM Essigsäure verdünnt.

Die Lösung wird auf das Vlies dosiert (Flüssigkeitssättigung des Vlieses) und das imprägnierte Vlies wird 60 Minuten bei 30⁰C im Umluftrockenschrank getrocknet.

Man wäscht eine Stunde absteigend chromatographisch mit PBS-Puffer pH 6,0, und trocknet 30 Minuten bei 3O⁰C im Umlufttrockens ehrank.

Das Verhältnis aus Meßbereich (Standard 5 ng T3/ml Standard 0) zu Standard 0 beträgt 12,0 (siehe Tabelle 1) .

Beispiel 3

Herstellung von Digoxin-Immunpräzipitat-Vliesen. (Homogenes l-Schritt-Verfahren)

Als Antigen wurde verwendet: Polyhapten, bestehend aus Kaninchen-IgG und daran gebundenem Digoxin (IgG: Digoxin 1:3 bis 1:4). Das Antigen wurde immunsorptiv über eine Anti-K-Fcy^Säule aufgereinigt (siehe A)).

Als Antikörper wurde der gleiche polyklonale Antikörper eingesetzt wie im Beispiel 1.

Als Vlies wurde ein Mischvlies aus Zellwolle und Polyester verwendet (Firma KaIff, Euskirchen, Deutschland).

Antigen und Antikörper werden getrennt in 100 mM aufgenommen, und zwar in den Konzentrationen 1 mg/ml bzw. 3,5 mg/ml und die beiden Lösungen im Verhältnis 1:1 gemischt. Die Tränklösung wird dann mit dem vierfachen Volumen an 200 mM Natrium-citrat-Puffer, pH 3,0, verdünnt .

Das Vlies wird durch diese Tränklösung gezogen, abgequetscht, mit Umluft 10 Minuten bei 75⁰C getrocknet und wie im Beispiel 1 nachgewaschen und wie zuvor getrocknet) .

Mit so hergestellten Digoxin-Immunprazipitat-Vliesen wurde die in Fig. 1 gezeigte Eichkurve erhalten. Verwendet wurden die Standards 0, 0,3, 0,75, 1,75, 3, 5 ng Digoxin/ml. Das Verhältnis von Meßbereich (Standard 5 ng Digoxin/ml - Standard 0) zu Standard 0 beträgt 4,9.

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Beispiel 4 (Vergleich)

Herstellung von Digoxin-Immunpräzipitat-Vliesen. (Heterogenes 2-Schritt-Verfahren)

Antigen, Antikörper und Vlies sind die gleichen wie im Beispiel 3.

Antigen und Antikörper getrennt werden in 1 mM Essigsäure aufgenommen (c=5 mg/ml bzw. 17,5 mg/ml). Man läßt 30 Minuten bei Raumtemperatur stehen, dann wird die Antigen-Lösung mit dem 50fachen Volumen PBS-Puffer pH 6,0 verdünnt und auf das Vlies getränkt, man trocknet 10 Minuten bei 75⁰C im ümlufttrockenschrank. Das trockene Vlies wird anschließend mit der Antikörper-Lösung, die mit obigem Puffer 50fach verdünnt wurde, getränkt und man trocknet 10 Minuten bei 75⁰C. Nach Waschen des Vlieses mit dem gleichen Puffer, wird 10 Minuten bei 75⁰C getrocknet.

Man erhält die in Fig. 2 gezeigte gekrümmte Eichkurve, das Verhältnis aus Meßbereich (Standard 5 ng Digoxin/ml - Standard 0) zu Standard 0 beträgt 1,6. (Alternativ kann zunächst der Antikörper und dann das Antigen getränkt werden.)

Beispiel 5 (Vergleich)

Herstellung von Digoxin-Immunpräzipitat-Vliesen. (Suspensionsverfahren)

Antigen, Antikörper und Vlies sind die gleichen wie im Beispiel 3. Antigen und Antikörper werden je für sich in 100 mM Essigsäure aufgenommen (c=l mg/ml bzw. c=3,5

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mg/ml), man läßt 15 Minuten bei Raumtemperatur stehen. Ein Teil Antigenlösung, ein Teil Antikörperlösung und 1,5 Teile 100 mM Kaliumphosphat-Puffer, pH 7,6, werden gemischt; man läßt eine Stunde bei Raumtemperatur stehen. Die gebildete Suspension wird abzentrifugiert, der Überstand verworfen und der Niederschlag im 9fachen Volumen PBS-Puffer pH 6,0, resuspendiert (homogenisiert) Die Suspension wird so auf das Vlies getränkt, daß das Vlies mit Flüssigkeit gesättigt ist. Danach wird 10 Minuten bei 75⁰C im Umlufttrockenschrank getrocknet. Nach einstündigem Waschen mit PBS-Puffer pH 6,0, wird erneut 10 Minuten bei 75⁰C getrocknet.

Man erhält eine gekrümmte Eichkurve (siehe Fig. 3); das Verhältnis aus Meßbereich (Standard 5 ng Digoxin/ml Standard 0) zu Standard 0 beträgt 0,19.

Beispiel 6

Herstellung von Diphenylhydantoin (DPH) Immunpräzipitat-Vliesen (Homogenes 1-Schritt-Verfahren mit Präzipitat-Waschungen)

Als Antigen wurde verwendet: Polyhapten, bestehend aus Kaninchen-IgG und daran gebundenem Diphenylhydantoin.

Als Antikörper wurde verwendet: polyklonaler Antikörper, gerichtet gegen den Fc-Teil des Kaninchen-IgGs.

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Antigen und Antikörper (jeweils nicht innnunsorptiv aufgereinigt) werden je für sich in 100 inM Essigsäure aufgenommen (c=l mg/ml bzw. c=20 mg/ml); man läßt 15 Minuten bei Raumtemperatur stehen.

Ein Teil Antigen-Lösung, zwei Teile Antikörper-Lösung und zwei Teile 100 mM Kalium-phosphat-Puffer, pH 7,6, werden gemischt, man läßt die Suspension eine Stunde bei Raumtemperatur stehen. Das Präzipitat wird abzentrifugiert, der überstand wird verworfen und das Präzipitat wird im neunfachen Volumen 100 mM Kaliumphosphat-Puffer resuspendiert. Dieser Zentrifugations-/ Waschschritt wird dreimal wiederholt, dann wird das Präzipitat auf die gleiche Art noch zweimal mit destiliertem Wasser salzfrei gewaschen.

Das Präzipitat wird in 100 mM Essigsäure aufgenommen (c=5 mg/ml); man läßt die klare Antigen-/Antikörper-Lösung 15 Minuten bei Raumtemperatur stehen und verdünnt dann mit dem vierfachen Volumen an 200 mM Natriumcitrat-Puffer, pH 3,0.

Das Vlies wird durch diese Tränklösung gezogen, abgequetscht, 10 Minuten bei 75⁰C getrocknet und wie im Beispiel 1 nachgewaschen und wie zuvor getrocknet.

Mit so hergestellten DPH-Immunpräzipitat-Vliesen wurde die in Fig. 4 gezeigte Eichkurve erhalten. Verwendet wurden die Standards 0, 2,5, 5, 10, 20, 30 μg DPH/ml. Das Verhältnis von Meßbereich (Standard 30 μg DPH/ml Standard 0) zu Standard 0 beträgt 18,2.

Beispiel 7

Herstellung von TSH-Immunpräzipitat-Vliesen. (Homogenes 1-Schritt-Verfahren mit Präzipitat-Waschung)

Als Antigen wurde verwendet: monoklonaler Antikörper, gerichtet gegen human-TSH. Der Antikörper (aus Ascites) wurde durch Ammonsulfat-Fällung und Chromatographie an DEAE-Cellulose aufgereinigt.

Als Antikörper wurde verwendet: polyklonaler Antikörper, gerichtet gegen den Fc-Teil des Maus-IgG. Der Antikörper wurde durch Ammonsulfat-Fällung und Chromatographie an DEAE-Cellulose aufgereinigt.

Antigen und Antikörper werden jeweils in 100 itiM Kaliumphosphat-Puffer, pH 6,0, 0,9% NaCl, aufgenommen (c=l mg/ml bzw. c=17 mg/ml). Die beiden Lösungen werden gemischt, man läßt die Suspension 30 Minuten bei Raumtemperatur stehen. Das Präzipitat wird abzentrifugiert, der überstand wird verworfen, und das Präzipitat wird im neunfachen Volumen des obigen Puffers resuspendiert. Dieser Zentrifugations-/Waschschritt wird fünfmal wiederholt, dann wird das Präzipitat auf die gleiche Art noch zweimal mit destilliertem Wasser salzfrei gewaschen.

Das Präzipitat wird in 50 mM Essigsäure aufgenommen (c= 5 mg/ml), man läßt die klare Antigen-/Antikörper-Lösung 15 Minuten bei Raumtemperatur stehen und verdünnt dann mit dem vierfachen Volumen an 20 mM Natriumacetat-Lösung.

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Das Vlies wird durch diese Tränklösung gezogen, abgequetscht und dann 30 Minuten bei 37⁰C im Umlufttrockenschrank getrocknet. Man wäscht eine Stunde absteigend chromatographisch mit Phosphatpuffer, pH 6,5 und trocknet 30 Minuten bei 37⁰C.

Mit so hergestellten TSH-Immunpräzipitat-Vliesen wurde die in Fig. 5 gezeigte Eichkurve erhalten; verwendet werden die Standards 0, 2, 6, 12, 24, 48 μϋ TSH/ml.

Beispiel 8

Herstellung von TSH-Immunpräzipitat-Vliesen. (Homogenes 2-Schritt-Verfahren mit Präzipitat-Waschung)

Eingesetzt wurde das gewaschene Präzipitat aus Beispiel 7.

Es wurde das gleiche Vlies wie im Beispiel 7 verwendet. Das trockene Vlies wurde anschließend mit 50 mM NaCl getränkt und getrocknet (10 Minuten 75⁰C).

Das Präzipitat wurde in wenig 500 mM Essigsäure aufgenommen (gerade soviel, daß sich das Präzipitat löst), dann wird mit 5 mM Essigsäure auf c=l mg/ml verdünnt. Die Lösung wird auf das Vlies dosiert (Flüssigkeitssättigung des Vlieses). Man trocknet 30 Minuten bei 30⁰C im Umlufttrockenschrank. Dann wird das Vlies chromatographisch mit Natriumacetat und anschließend mit Phosphatpuffer, pH 6,5 gewaschen und bei 37⁰C getrocknet.

Mit so hergestellten TSH-Immunpräzipitat-Vliesen wurde die in Fig. 6 gezeigte Eichkurve erhalten, verwendet werden die Standards 0, 2, 6, 12, 24, 48 IU TSH/ml.

Beispiel 9

Vergleich der Stabilitäten der Tränklösungen

Antigen und Antikörper sind die gleichen wie im Beispiel 1. Antigen und Antikörper werden jeweils in einer Lösung aus dem Hemmstoff, 0,1 M NaCl und 0,5 % RSA separat gelöst. Die beiden Lösungen werden mit 0,2 N HCl (Essigsäure und Propionsäure liefern vergleichbare Ergebnisse) auf pH 6,0, pH 4,0 bzw. pH 2,0 eingestellt. Dann werden die Lösungen von Antigen und Antikörper vom jeweils gleichen pH gemischt, und der zeitliche Verlauf der Präzipitatbildung verfolgt. Fig. 7 zeigt, daß bei pH 6,0 sofort nach Mischung von Antigen und Antikörper Immunpräzipitat ausfällt, bei pH 4,0 kommt es zu geringer, nach 1 Stunde noch nicht abgeschlossener und bei pH 2,0 nicht mehr zur Präzipitatbildung.

Claims

Patentansprüc h e

1. ) Verfahren zur Herstellung eines immunreaktiven,

porösen Trägermaterials durch Aufbringung von je einer Lösung eines ersten Partners einer Immunreaktion und eines mit diesem präzipitierenden zweiten Partners einer Immunreaktion, Inkubation des mit den Lösungen getränkten Trägermaterials zur Immunpräzipitation, Waschen und Trocknen des imprägnierten Trägermaterials, dadurch gekennzeichnet , daß man eine Lösung beider Partner der Immunreaktion herstellt, welche einen Hemmstoff für die Immunpräzipitation enthält, das Trägermaterial mit dieser Lösung imprägniert und dann die Immunpräzipitation durch Entfernen des Hemmstoffes auslöst.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Partner der Immunreaktion ein Protein und einen gegen dieses Protein gerichteten Antikörper oder ein Fragment davon verwendet.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet , daß man ein Protein verwendet, an das ein Hapten oder Antigen gekoppelt ist.

4. Verfahren nach Anspruch 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß man einen gegen das Protein gerichteten Antikörper oder ein Fragment davon verwendet, an den ein Hapten oder Antigen gekoppelt ist.

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5. Verfahren nach Anspruch 2 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß man als Protein einen spezifischen Antikörper verwendet.

6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man als Hemmstoff eine Säure verwendet.

7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet , daß man eine flüchtige Säure verwendet und diese nach der Imprägnierung des Trägermaterials abdampft.

8. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet , daß man als Hemmstoff eine nicht flüchtige Säure verwendet und ein Trägermaterial einsetzt, welches mit einem Salz einer flüchtigen Säure imprägniert ist.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß man als Hemmstoff Glycerin oder Harnstoff einsetzt und diese nach Imprägnierung des Trägermaterials mit einem Gemische aus mindestens einem organischen Lösungsmitteln und Wasser extrahiert.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß man als Hemmstoff ein Metallsalz verwendet und dessen Hemmwirkung im Trägermaterial durch Komplexbildner aufhebt.

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11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß man als Hemmstoff ein chaotropes Ion der Hofmeister-Serie verwendet.

12. Verfahren nach Ansprch 11, dadurch gekennzeichnet , daß man als Hemmstoff ein Thiocyanat verwendet.

13. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet , daß man als Hemmstoff ein Alkalijodid verwendet.

14. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man die Partner der Immunreaktion im Verhältnis des Heidelberger-Maximums einsetzt.

15. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man wenigstens einen Partner der Immunreaktion in ungereinigter Form einsetzt.

16. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man aus den Partnern der Immunreaktion zunächst ein Suspensionsprazipitat herstellt, das nach Waschen durch Zusatz eines Hemmstoffes gelöst und anschließend zur Tränkung des porösen Trägers eingesetzt wird.