DE3486467T3

DE3486467T3 - Verfahren zum Nachweis, Identifizieren und Quantifizieren von Organismen und Viren

Info

Publication number: DE3486467T3
Application number: DE3486467T
Authority: DE
Inventors: David E. E. La Jolla Kohne
Original assignee: Gen Probe Inc
Current assignee: Gen Probe Inc
Priority date: 1983-01-10
Filing date: 1984-01-09
Publication date: 2004-10-14
Anticipated expiration: 2004-01-10
Also published as: CA1215904A; EP0531798A2; DK430384D0; EP0531798B2; JPH05211896A; EP0756010B1; EP0531798B1; DK430384A; AU2846089A; DE131052T1; WO1984002721A1; EP0756010A3; EP0131052A4; ATE202801T1; JPH0578319B2; EP0531798A3; NO843574L; DE3486467D1; DE3486467T2; DE3486254D1

Description

Technisches Gebiet
Diese Erfindung betrifft ein Verfahren und Mittel zum Nachweisen, Identifizieren und Quantifizieren von Organismen in biologischen und anderen Proben. Sie betrifft also das spezifische und sensitive Nachweisen und Quantifizieren eines Organismus, der ribosomale DNA (hiernach R-RNA) oder andere RNA enthält, eines Mitglieds der großen, intermediären oder kleinen Kategorien oder taxonomischen Gruppen solcher Organismen und zuvor unbekannte R-RNA enthaltende Organismen. Die Erfindung ermöglicht sogar den Nachweis der Gegenwart von einem R-RNA enthaltenden Organismus.
Die Erfindung umfaßt außerdem die Verwendung von spezifisch hergestellten Nucleinsäuren, die mit spezifischen Sequenzen komplementär sind, oder Populationen verschiedener Sequenzen der Klasse der RNA-Sequenzen (hiernach spezifische RNA-Vorläufersequenzen oder psRNA), die ausschließlich in den Vorläufer-RNA-Molekülen und nicht in reifen R-RNA-Molekülen vorhanden und in einem Hybridisierungsgemisch bereitgestellt werden, um bestimmte Organismen, Gruppen von Organismen oder Gruppen eukaryontischer Zellen zu bestimmen, zu identifizieren und zu quantifizieren.
Die Neuheit und die Anwendbarkeit und Nichtoffensichtlichkeit der Erfindung sind leichter zu verstehen und nachzuvollziehen, wenn sie im Lichte der hiernach aufgeführten Hintergrundinformationen gesehen wird, die den Stand der Technik umfasst.
Stand der Technik
Jede Zelle aller Lebensformen, außer Viren, enthält Ribosomen und daher auch ribosomale RNA. Ein Ribosom enthält drei unterschiedliche einzelsträngige RNA-Moleküle, nämlich ein großes, ein mittleres und ein kleines Molekül. Die zwei größeren R-RNA-Moleküle unterscheiden sich in verschiedenen Organismen in ihrer Größe.
Ribosomale RNA ist ein direktes Genprodukt und wird durch das R-RNA-Gen codiert. Diese DNA-Sequenz wird als Matrize verwendet, um R-RNA-Moleküle zu synthetisieren. Ein gesondertes Gen ist für jede der ribosomalen RNA-Untereinheiten vorhanden. Mehrfache R-RNA-Gene sind in den meisten Organismen vorhanden, wobei viele höhere Organismen sowohl nukleare als auch mitochondriale R-RNA-Gene enthalten. Pflanzen und bestimmte andere Formen enthalten nukleare, mitochondriale und Chloroplasten-R-RNA-Gene. Zur Erleichterung der hiernach folgenden Diskussion werden die drei getrennten R-RNA-Gene als das R-RNA-Gen bezeichnet.
Zahlreiche Ribosomen sind in allen Zellen jeder Lebensformen vorhanden. Ungefähr 95 bis 90% der gesamten RNA in einer gewöhnlichen Zelle ist R-RNA. Ein Bacterium, wie E. coli, enthält ungefähr 10⁴ Ribosomen pro Zelle, während eine Leberzelle von Säugern ungefähr 5 × 10⁴ Ribosomen enthält. Da jedes Ribosom eine jeder RNA-Untereinheit enthält, enthält die Bakterienzelle und Säugerzelle jeweils 10⁴ und 5 × 10⁶ jeder RNA-Untereinheit.
Nucleinsäurehybridisierung, ein Verfahren, das im Stand der Technik sehr bekannt ist, wurde im Stand der Technik verwendet, um spezifisch äußerst kleine oder große Mengen einer bestimmten Nucleinsäuresequenz nachzuweisen, sogar in der Gegenwart eines sehr großen Überschusses nicht-verwandter Sequenzen. Im Stand der Technik wurde Nucleinsäurehybridisierung zum Beispiel in Veröffentlichungen, umfassend molekulare Genetik von Zellen und Viren, genetische Expression von Zellen und Viren, genetische Analyse lebender Formen, Evolution und Taxonomie von Organismen und Nucleinsäuresequenzen, molekulare Mechanismen von Krankheitsverläufen, diagnostische Verfahren zu bestimmten Zwecken, einschließlich der Nachweis von Viren und Bakterien in Zellen und Organismen verwendet.
Das wahrscheinlich am besten charakterisierte und am meisten untersuchte Gen und Genprodukt sind das R-RNA-Gen und R-RNA, und der Stand der Technik umfaßt die Verwendung der Hybridisierung von R-RNA und ribosomalen Genen in der genetischen Analyse und Evolution und taxonomischer Klassifizierung von Organismen und ribosomalen Gensequenzen. Die genetische Analyse umfaßt zum Beispiel die Bestimmung der Zahl der ribosomalen RNA-Gene in verschiedenen Organismen, die Bestimmung der Ähnlichkeit zwischen den verschiedenen ribosomalen RNA-Genen, die in Zellen vorhanden sind, die Bestimmung der Rate und des Ausmaßes der R-RNA-Synthese in Zellen und die Faktoren, die dies steuern. Evolutions- und taxonomische Untersuchungen umfassen das Vergleichen der R-RNA-Gen-Sequenz von verwandten und sehr unterschiedlichen Organismen.
Es ist bekannt, daß die ribosomale RNA-Gen-Basensequenz in sehr verschiedenen Organismen zumindestens teilweise ähnlich ist und daß die DNA von E. coli bakteriellen ribosomalen RNA-Genen gut mit R-RNA von Pflan zen, Säugern und einer weiten Vielfalt anderer bakterieller Arten hybridisiert. Der Abschnitt des E. coli-Gens, das mit diesen anderen Arten hybridisiert, ist in Abhängigkeit des Verwandtschaftsgrads der Organismen unterschiedlich. Praktisch hybridisiert die ganze R-RNA-Gensequenz mit R-RNA von nah verwandten Bakterienarten, während sie weniger mit R-RNA entfernt verwandter Bakterien hybridisiert und noch weniger mit Säuger-R-RNA.
t-RNA ist wie R-RNA in allen lebenden Zellen, sowie in einigen Viren vorhanden. t-RNA-Gene sind in chromosomalen und Plasmid-DNA von Prokaryonten und in der DNA von eukaryontischen Zellen, einschließlich der DNA des Kerns, der Mitochondrien und Chloroplasten vorhanden. Verschiedene t-RNA-Gene für einen t-RNA-Typ kommen häufig in einer einzigen Zelle vor. t-RNA-Gene von Mitochondrien, Nucleinsäuren und Chloroplasten sind ziemlich verschieden. Viele Virus-Genome umfassen t-RNA-Gene, die für den Virus spezifisch sind.
t-RNA-Moleküle sind direkte Genprodukte und werden in Zellen unter Verwendung des t-RNA-Gens als Matrize synthetisiert. Die t-RNA wird häufig als Teil eines großen RNA-Moleküls synthetisiert und der t-RNA Anteil wird anschließend von diesem Vorläufermolekül getrennt. Nach der Synthese wird ein Abschnitt der Basen des t-RNA-Moleküls chemisch durch die Zelle modifiziert. Ein typisches t-RNA-Molekül enthält von 75 bis 85 Basen.
Zahlreiche t-RNA-Moleküle sind in jeder Zelle aller Lebensformen vorhanden und ungefähr 10% der gesamten RNA der Zelle besteht gewöhnlich aus t-RNA, wobei eine typische Bakterienzelle ungefähr 1,5 × 10⁵ t-RNA-Moleküle der gesamten unterschiedlichen Typen enthält. Wenn jeder unterschiedliche t-RNA-Typ gleichermaßen in einer Bakterienzelle dargestellt ist, dann sind von jedem unterschiedliche t-RNA-Moleküls in jeder Zelle 2500 vorhanden. Eine typische Leberzelle von Säugern enthält ungefähr 10⁸ t-RNA-Moleküle oder einen Durchschnitt von ungefähr 10⁵ Kopien pro Zelle jedes unterschiedlichen t-RNA-Typs.
Während der Proteinsynthese werden einzelne Aminosäuren in der richtigen Reihenfolge durch unterschiedliche spezifische t-RNA angeordnet, wobei jede Aminosäure durch einen anderen t-RNA-Typ angeordnet wird. Einige Aminosäuren werden durch mehr als einen t-RNA-Typ geordnet.
Es gibt bestimmte Viren, die t-RNA-Gene in ihren Genomen enthalten, diese Gene stellen virusspezifische t-RNA her, wenn das Virusgenom in einer Zelle aktiv ist. Diese t-RNA können außerdem in mehrfachen Kopien in jeder infizierten Zelle vorhanden sein.
Der Stand der Technik offenbart die Verwendung der Hybridisierung von t-RNA und t-RNA-Genen, wie im Falle von R-RNA-Genen und R-RNA, in der genetischen Analyse und der Evolution und taxonomischen Klassifizierung von Organismen und t-RNA-Gensequenzen. Die genetische Analyse umfaßt zum Beispiel die Bestimmung der Zahl der t-RNA-Gene in verschiedenen Organismen, die Bestimmung der Ähnlichkeit zwischen den mehrfachen in Zellen vorhandenen t-RNA-Genen, die Bestimmung der Rate und des Ausmaßes der t-RNA-Synthese in Zellen und die Faktoren, die diese steuern. Evolutions- und taxonomische Studien umfassen das Vergleichen der t-RNA-Genbasensequenz von verwandten und sehr unterschiedlichen Organismen.
So wie für R-RNA-Gensequenzen ist es bekannt, daß eine einzelne t-RNA-Gensequenz in verschiedenen Organismen mindestens teilweise ähnlich ist. Die gesamte t-RNA zeigt die gleiche Art von Verwandtschaft und ein Großteil der t-RNA einer Art wird wesentlich mit t-RNA-Genen eines entfernt verwandten Organismus hybridisieren, Mitochondriale Leucyl-t-RNA von Ratten hybridisiert wesentlich mit mitochondrialer DNA von Hühnern und Hefe (Biochemistry, 1975, 14, 10, S. 2037). Es wurde außerdem gezeigt, daß t-RNA-Gene unter Mitgliedern der bakteriellen Enterobacteriaceae-Familie hoch konserviert sind. Der Großteil von t-RNA-Genen von E. coli hybridisiert gut mit t-RNA, die von Arten isoliert wurde, die verschiedene Gene darstellen (J. Bacteriology, 1977, 129, 3, S. 1435–1439). Der Abschnitt des E. coli t-RNA-Gens, der mit anderen Arten hybridisiert, ist in Abhängigkeit des Verwandschaftsgrades der Organismen verschieden. Ein großer Abschnitt der E, coli t-RNA Gensequenz hybridisiert mit t-RNA von eng verwandten Arten, während er wesentlich weniger mit R-RNA von entfernt verwandten Arten hybridisiert.
Die Sensitivität und Einfachheit des Nachweises von Mitgliedern spezifischer Gruppen von Organismen wird unter Verwendung von Sonden, die für die R-RNA dieser Gruppe von Organismen spezifisch sind, sehr durch die große Anzahl der R-RNA-Moleküle, die in jeder Zelle vorhanden sind, erhöht. Zusätzlich wird der Hybridisierungstest wesentlich einfacher gemacht, da in den Zellen vorhandene RNA-Moleküle einzelsträngig sind. Somit ist ein Denaturierungsschritt, der für einen Hybridisierungstest, der jede Fraktion der Zell-DNA nachweist, verwendet werden muß, nicht notwendig, wenn das Zielmolekül RNA ist. Sonden, die für andere Klassen von Zellnucleinsäuren spezifisch sind, außer R-RNA, können verwendet werden, um spezifisch bestimmte Gruppen von Organismen oder Zellen durch Nucleinsäurehybridisierung zu bestimmen, zu identifizieren und zu quantifizieren. Somit umfassen andere RNA-Klassen in prokaryontischen Zellen Boten-RNA (hiernach mRNA) und RNA-Sequenzen, die Teil der Vielfalt von Vorläufermolekülen sind. Zum Beispiel wird R-RNA in bakterieller E. coli als ein Vorläufermolekül mit einer Länge von ungefähr 6000 Basen synthetisiert. Dieses Vorläufermolekül wird anschließend weiterverarbeitet, um die R-RNA-Untereinheiten (im ganzen ungefähr 4500 Basen), die in die Ribosomen eingeführt werden, und die zusätzlichen R-RNA-Sequenzen (im ganzen 1500 Basen), die verworfen werden, zu ergeben. T-RNA-Moleküle und ribosomale 5S RNA werden außerdem synthetisiert und auf die gleiche Weise weiterverarbeitet.
Eukaryontische Zellen enthalten außerdem Vorläufer-mRNA, wie Vorläufer-R-RNA, Moleküle, die größer sind als die End-R-RNA-Moleküle.
Diese Erfindung betrifft daher das spezifische und sensitive Nachweisen, Identifizieren und Quantifizieren von in Zellen vorhandenen Organismen. Insbesondere ist die Erfindung nützlich zum sensitiven Nachweisen, Identifizieren und Quantifizieren von jedem Mitglied unterschiedlich großer Kategorien von Organismen und von eukaryontischen Zellen und in einigen Fällen von zuvor unbekannten Organismen, enthaltend überschüssige R-RNA-Moleküle, die in R-RNA-Molekülen vorhanden sind.
Diese Erfindung hat daher eine breite Anwendung auf jedem Gebiet, auf dem es wichtig ist, die Gegenwart oder Abwesenheit von in Zellen vorhandenen Lebendorganismen, den Zustand der genetischen Expression von einem Organismus, einer Zelle oder Gruppen von Zellen von prokaryontischen oder eukaryontischen Organismen zu bestimmen. Solche Gebiete umfassen medizinische, veterinäre und landwirtschaftliche Diagnostika und industrielle und pharmazeutische Qualitätskontrolle.
Die Erfindung umfasst die Verwendung von spezifisch hergestellten Nucleinsäuren, die mit R-RNA komplementär sind, oder der Klasse von RRNA-Sequenzen (hiernach als spezifische Vorläufer-RNA-Sequenzen oder psRNA bezeichnet), die ausschließlich in den Vorläufer-R-RNA-Molekülen und nicht in reifen R-RNA-Molekülen vorhanden und in einem Hybridisierungsgemisch bereitgestellt werden, um spezifische Organismen, Gruppen von Organismen oder Gruppen eukaryontischer Zellen durch das Verfahren der Nucleinsäurehybridisierung zu bestimmen, zu identifizieren und zu quantifizieren.
Die Neuheit, Anwendbarkeit und Nichtoffensichtlichkeit der Erfindung sind leichter zu verstehen und nachzuvollziehen, wenn sie im Lichte der hiernach aufgeführten Hintergrundinformationen gesehen wird, die den Stand der Technik umfaßt.

1. psRNA sind in allen Organismen und Zellen vorhanden. Zellorganelle, die DNA enthalten, einschließlich Mitochondrien und Chloroplasten, enthalten außerdem psRNA und R-RNA.
2. Viele unterschiedliche psRNA-Sequenzen können in jeder Zelle oder Gruppe von Zellen eines eukaryontischen Organismus vorhanden sein.
3. Die Häufigkeit einer spezifischen psRNA-Sequenz in einem prokaryontischen Organismus oder einer Zelle kann 10 bis 20 mal höher sein. Die Häufigkeit einer spezifischen psRNA-Sequenz in einer eukaryontischen Zelle variiert von 1 bis 2 bis über 104 pro Zelle.
4. In vielen Eukaryonten wird RNA verschiedener Typen von den sich wiederholenden Sequenzabschnitt der DNA hergestellt. Dies kann zu einer Population von häufigen RNA-Molekülen führen, deren Sequenzen untereinander ähnlich, aber nicht identisch sind. Eine Sonde, die komplementär mit einer dieser RNA-Moleküle ist, wird jedoch mit allen anderen ähnlichen RNA-Molekülen hybridisieren.
6. Die Gensequenzen, die verschiedene einzelne psRNA von Viren und Lebendorganismen codieren, sind in unterschiedlichem Maße durch die Evolution konserviert worden.

Das Fehlen der Konservierung bei den DNA-Sequenzen vieler dieser RNA ermöglicht die Herstellung von Sonden, die leicht zwischen eng verwandten Organismen unterscheiden können.
Eine große Zahl von Studien wurden mit unterschiedlichen psRNA unternommen (siehe Gene Expression, Bd. 1 und 2, von B. Lewin, bei den Referenzen). Diese umfassen die Hybridisierung der RNA in Untersuchungen über die genetische Analyse, die Regulierung und Evolution in prokaryontischen und eukaryontischen Organismen und Viren.
Hybridisierungsverfahren des Standes der Technik
Zwei basische Nucleinsäurehybridisierungsverfahren sind im Stand der Technik offenbart. In dem einen, der "in Lösung"-Hybridisierung, sind sowohl die Sonde als auch die Testnucleinsäuremoleküle frei in der Lösung. In dem anderen Verfahren wird der Test auf einem festen Träger mobilisiert und die Sonde ist frei in der Lösung. Beide Verfahren werden weit verwendet und sind in der Literatur gut dokumentiert. Ein Beispiel des "in Lösung"-Verfahrens wird hiernach in den Beispielen dargestellt. Außerdem befindet sich in dem Aufsatz von Thomas et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1980, 77, S. 520 ein Beispiel des immobilisierten Verfahrens.
Die Grundkomponenten eines Nucleinsäurehybridisierungstests sind:
1. Sonde
Eine markierte einzelsträngige Nucleinsäuresequenz, die mit den nachzuweisenden Nucleinsäuresequenzen (das heißt, den Zielsequenzen) komplementär ist. wie hier verwendet, ist die Zielsequenz die gesamte Sequenz oder Unter-Sequenz von R-RNA oder anderer RNA.
Die Sondenlänge kann von 5 Basen bis zehntausenden von Basen variieren und ist von dem verwendeten spezifischen Test abhängig. Nur ein Teil des Sondenmoleküls braucht mit der nachzuweisenden Sequenz (hiernach Zielsequenzen) komplementär zu sein. Zusätzlich muß die Komplementarität zwischen der Sonde und der Zielsequenz nicht vollkommen sein. Die Hybridisierung tritt zwischen nicht vollkommen komplementären Molekülen mit dem Ergebnis auf, daß ein bestimmter Abschnitt der Basen in dem hybridisierten Bereich nicht mit der richtigen komplementären Base gepaart ist. Eine Sonde kann entweder aus RNA oder DNA zusammengesetzt sein. Die Form der Nucleinsäuresonde kann ein markiertes einzelsträngiges Molekül mit nur einer Polarität oder ein markiertes einzelsträngiges Molekül mit beiden Polaritäten sein. Die Form der Sonde, wie seine Länge, wird durch den Typ des zu verwendenden Hybridisierungstests bestimmt.
2. Probe
Die Probe kann oder kann nicht das Zielmolekül (d.h. den Organismus von Interesse) enthalten. Die Probe kann eine Vielzahl von Formen annehmen, einschließlich eine Flüssigkeit, wie Wasser oder Serum oder einen Feststoff, wie Staub, Erde oder Gewebeproben. Die Probennucleinsäure muß verfügbar gemacht werden, um mit der Sonde in Kontakt zu treten, bevor eine Hybridisierung zwischen der Sonde und dem Zielmolekül auftreten kann. Somit muß die RNA des Organismus frei von der Zelle sein und unter geeignete Bedingungen gebracht werden, bevor die Hybridisierung auftreten kann. Stand der Technik Verfahren von "in Lösung"-Hybridisierung erfordern die Reinigung der RNA, um Hybridisierung der Proben-RNA mit der Sonde zu erhalten. Das hat bedeutet, daß das beim "in Lösung"-Verfahren zum Bestimmen von Zielsequenzen in einer Probe die Nucleinsäuren der Probe zuerst gereinigt werden müssen, um Proteine, Fette und andere Zellkomponenten zu eliminieren und anschließend mit der Sonde unter Hybridisierungsbedingungen in Kontakt gebracht werden. Die Reinigung der Probennucleinsäuren erfordert mindestens mehrere Stunden und kann abhängig von der Art und Menge der Probe bis zu einem Tag erfordern.
3. Hybridisierungsverfahren
Sonde und Probe müssen unter Bedingungen gemischt werden, die die Nucleinsäurehybridisierung erlauben. Dies umfaßt das Kontaktieren der Sonde und der Probe in Gegenwart eines anorganischen oder organischen Salzes in der richtigen Konzentration und bei der richtigen Temperatur. Die Sonden- und die Proben-Nucleinsäuren müssen für einen Zeitraum in Kontakt gebracht werden, der lang genug ist, damit jede mögliche Hybridisierung zwischen der Sonden- und der Proben-Nucleinsäure auftreten kann.
Die Konzentration der Sonde oder des Zielmoleküls in der Mischung bestimmt die Zeit, die für das Auftreten der Hybridisierung erforderlich ist. Je höher die Sonden- oder die Zielmolekül-Konzentration ist, desto kürzer ist die erforderliche Hybridisierungs-Inkubationszeit.
Eine Nucleinsäure-Hybridisierungs-Inkubationsmischung, die aus den Sonden- und Proben-Nucleinsäuren zusammengesetzt ist, muß bei einer spezifischen Temperatur inkubiert werden, die lang genug für das Auftreten der Hybridisierung ist. Die Zeitdauer, die für das Beenden der Hybridisierung erforderlich ist, ist von der Konzentration der Sonden-Nucleinsäuren, der Konzentration der Proben-Nucleinsäuren, die komplementär mit der Sonde ist, und einer Grund-Hybridisierungsrate, die für die verwendeten Hybridisierungsbedingungen kennzeichnend ist, abhängig. Die Grund-Hybridisierungsrate wird durch den Salztyp, der in der Inkubationsmischung vorhanden ist, seine Konzentration und die Inkubationstemperatur bestimmt. Natriumchlorid, Natriumphosphat und Natriumcitrat sind die für die Hybridisierung am häufigsten verwendeten Salze, und die verwendete Salzkonzentration ist selten über 1 M und manchmal so hoch wie 1,5 bis 2 M. Die oben genannten Salze ergeben vergleichbare Raten der Nucleinsäurehybridisierung, wenn sie in den gleichen Konzentrationen und bei den gleichen Temperaturen verwendet werden, wie die vergleichbaren Kalium-, Lithium-, Rubidium- und Cäsiumsalze. Britten et al., 1974 (Methods in Enzymology, Bd. XXIX, Teil E, Hrsg. Grossman und Moldave, Academic Press, New York, S. 364) und Wetmur und Davidson, 1968 (J. Molecular Biology, Bd. 31, S. 349) Zeigen Daten, die die Standard-Grund-Hybridisierungsraten veranschaulichen, die mit gewöhnlich verwendeten Salzen erreicht werden. Die Hybridisierungsraten von DNA mit RNA weichen etwas von denen von DNA, die mit DNA hybridisieren, ab. Die Größe der Variation ist selten mehr als 10-fach und variiert zum Beispiel abhängig davon, ob ein Überschuß von DNA oder RNA verwendet wird. Siehe Galau et al., 1977 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 74, 6, S. 2306).
Bestimmte Bedingungen führen zu einer Beschleunigung der DNA:DNA Hybridisierung. Eine Phenol- und Salz-Emulsion begünstigt die sehr schnelle DNA-Hybridisierung, wenn die Mischung gerührt wird. Erhöhungen der Rate auf mehrere tausend mal schneller als Standard-DNA-Hybridisierungsraten werden mit diesem System erhalten (Kohne et al., Biochemistry, 1977, Bd. 16, S. 532a). Die Beschleunigung der DNA-Hybridisierungsrate von 50- bis 100-fach über den Standardraten wurde außerdem beobachtet, wenn neutrale und anionische Dextranpolymere in Lösung mit einzelsträngiger DNA gemischt wurde (Wetmur, Biopolymers, 1975, Bd. 14, S. 2517). Es wurde nicht berichtet, daß diese Bedingungen der DNA-Beschleunigungsrate die Hybridisierungsrate der DNA:RNA-Hybridisierung beschleunigen. Ich bin mir keines Stand der Technik Dokumentes bewußt, das eine Bedingung zum Beschleunigen der Rate der RNA:DNA-Hybridisierung dokumentiert.
4. Hybridisierungsassay
Ein Verfahren wird benötigt, um die Gegenwart der Sondenmoleküle, die mit den Zielmolekülen hybridisiert sind, nachzuweisen. Ein solches Verfahren hängt von der Fähigkeit ab, die Sonde, die mit den Zielmolekülen hybridisiert ist, von der Probe, die nicht mit den Zielmolekülen hybridisiert ist, zu trennen. Verfahren im Stand der Technik zum Untersuchen der "in Lösung"-Hybridisierungsmischungen wurden mit Probennucleinsäuren durchgeführt, die zunächst gereinigt und anschließend mit der Sonde in der Hybridisierungs-Inkubationsmischung in Kontakt gebracht wurden.
Hydroxyapatit (HA) wurde als Standardverfahren zum Untersuchen der "in Lösung"-Hybridisierungsmischungen auf die Gegenwart von hybridisierten Sonden verwendet. Unter geeigneten Bedingungen bindet HA selektiv die hybridisierte DNA-Sonde, bindet aber keine Sonde, die nichthybridisiert ist. Andere Verfahren zum Auffinden von hybridisierter Sonde sind verfügbar. Diese umfassen das S₁-Nuclease-Assay, das von der Fähigkeit eines spezifischen Enzyms abhängt, nicht-hybridisierte Sonde in kleine Untereinheiten abzubauen, während die hybridisierte Sonde durch das Enzym nicht abgebaut wird und groß bleibt. Die abgebaute Sonde kann anschließend von der hybridisierten Sonde durch eine Trennungstechnik nach Größe getrennt werden, Verschiedene Verfahren zum Auffinden von "in Lösung"-Hybridisierten Nucleinsäuren sind von Britten et al., 1974, supra, dargestellt.
Bei den Nucleinsäurehybridisierungsverfahren für immobilisierte Proben ist das Hybridisierungsassay in das Hybridisierungsverfahren eingebaut. Diese verfahren umfassen das Fixieren der Probennucleinsäure auf einem inerten Träger und anschließendes Hybridisieren dieser immobilisierten Nucleinsäure mit einer markierten Sonde, die in der Lösung frei vorkommt. Die Hybridisierung jeder Sonde mit der immobilisierten Probennucleinsäure führt zu der Bindung der Sonde an die Probennucleinsäure und daher zur Befestigung der Sonde an den inerten Träger. Nicht-hybridisierte Sonde bleibt in der Lösung zurück und kann von dem inerten Träger und der hybridisierten Sonde weggewaschen werden. Ein solches Verfahren erfordert mindestens mehrere Stunden, um die Probe für die Nucleinsäurehybridisierung herzustellen, und ein bis zwei Stunden zum Waschen und verwendet große Mengen der Sonde. Ein Vorteil dieses Verfahrens ist die Fähigkeit, mehrere Proben auf demselben inerten Träger aufzubringen, und alle Proben zur gleichen Zeit zu hybridisieren und zu behandeln. Beispiele eines solchen immobilisierten Probenverfahrens sind in Analytical Biochemistry, 1983, Bd. 128, S. 415 und J. of Infectious Diseases, 1982, Bd. 145, 6, S. 863 dargestellt.
Bereitstellen der Nucleinsäuren zur Hybridisierung
"In Lösung"-Nucleinsäurehybridisierungsverfahren haben immer Nucleinsäuren verwendet, die von anderen Zellkomponenten befreit worden sind. Nucleinsäuren in Zellen und Viren befinden sich gewöhnlich eng mit anderen Zellkomponenten, meistens Proteinen, in einem Komplex und sind in dieser Farm nicht für die Hybridisierung verfügbar. Einfaches Aufbrechen der Zelle oder des Virus zur Freisetzung des Inhalts macht die Nucleinsäuren für die Hybridisierung nicht verfügbar. Die Nucleinsäuren bleiben in einem Komplex mit anderen Zell- oder Viren-Komponenten, sogar bei der Freisetzung von der Zelle, und können in der Tat in hohem Maße durch Nukleasen, die außerdem freigesetzt werden können, abgebaut werden. Zusätzlich kann eine zu einer solchen Mischung gegebene markierte Sonde an "klebrige" Zell- oder virale Komponenten komplexiert sein und für die Hybridisierung unverfügbar gemacht werden, oder die Probe kann durch die Nucleasewirkung abgebaut werden.
Es gibt eine Vielzahl von Stand der Technik Verfahren zum Reinigen von Nucleinsäuren und einige davon sind von Maniatis et al., supra, beschrieben. Diese Verfahren sind alle zeitaufwendig – eines, das eine Stunde dauert, wird als sehr schnell angesehen – und erfordern viele Eingriffe.
Soviel ich weiß, gibt es kein Stand der Technik Verfahren zum Durchführen der "in Lösung"-Nucleinsäurehybridisierung, das nicht die Verwendung einer Art von Vorreinigungsschritt erfordert, um die Nucleinsäuren für die Hybridisierung verfügbar zu machen.
Die immobilisierten Nucleinsäurehybridisierungsverfahren umfassen das Befestigen der Probennucleinsäure auf einem inerten Träger und anschließendes Hybridisieren dieser immobilisierten Nucleinsäure mit einer markierten Sonde, die in der Lösung frei ist. Das verfahren zum Befestigen der Nucleinsäuren auf dem inerten Träger liefert einen Reinigungsschritt, der geeignet ist, um die gebundenen Nucleinsäuren für die Hybridisierung verfügbar zu machen. Die meisten Zell- oder viralen Bestandteile, die nicht Nucleinsäuren sind, binden nicht an den inerten Träger, und diejenigen, die binden, binden an einer anderen Stelle als die Nucleinsäuren. Ein solches Verfahren erfordert mindestens mehrere Stunden, um die Probennucleinsäuren für die Hybridisierung herzustellen. Ein Vorteil dieses Verfahrens ist die Fähigkeit, mehrere Proben auf dem inerten Träger aufzubringen und sie zusammen durch die Hybridisierungs- und Hybridisierungs-Assay Schritte zu führen. Das Hybridisierungs-Assay besteht aus dem Entfernen des inerten Trägers von der Hybridisierungsmischung. Die Sonde, die mit der befestigten Probe hybridisiert, bleibt auf dem inerten Träger, während nicht-hybridisierte Probe in der Lösung zurückbleibt.
Obgleich die Gegenwart von Organismen durch eines der Vielzahl von Stand der Technik Verfahren nachgewiesen werden kann, ist keines dieser verfahren aus dem einen oder anderen Grund vollkommen zufriedenstellend. Solche Verfahren umfassen z.B, Wachstumsverfahren, optische Nachweisverfahren, serologische und immunochemische Verfahren und biochemische Verfahren, wie unten gezeigt:
Wachstumstests
Es gibt eine Vielzahl von verschiedenen Wachstumstests, wobei jeder von ihnen für das Wachstum eines spezifischen Organismus oder einer Gruppe von Organismen nützlich ist. Wachstumstests besitzen die goten tielle Sensitivität, um einen Organismus nachzuweisen. In der Praxis ist es jedoch schwierig oder sogar unmöglich, viele Organismen zum Wachsen zu bringen. Diese Tests sind meist langwierig, da ein Tag bis zu mehrere Monaten benötigt werden, um sie abzuschließen. Außerdem würde eine sehr große Zahl von Tests erforderlich sein, um die Gegenwart von einem Mitglied einer großen Gruppe von Organismen (z.B. alle Bakterien) nachzuweisen, unter der Annahme, daß die Wachstumsbedingungen für alle Mitglieder der Gruppe bekannt sind.
Optische Nachweisverfahren
Die mikroskopischen Analyse, die mit differentiellem Färbeverfahren verbunden ist, ist sehr wirksam und in vielen Fällen ein schnelles Nachweisverfahren. Das große Problem dieser Methode ist das Nachweisen von spezifischen Organismen in Gegenwart von großen Mengen anderer Organismen, zum Beispiel die Identifizierung einer bestimmten gram-negativen, stäbchenförmigen Bakterienart, in der Gegenwart von vielen verschiedenen gram-negativen, stäbchenförmigen Bakterienarten. Außerdem würde eine große Zahl von Testen erforderlich sein, um die Gegenwart aller Mitglieder einer großen Gruppe von Organismen (wie die Gruppe aller Bakterien) nachzuweisen.
Serologische und immunochemische Verfahren und biochemische Tests
Es gibt eine Vielzahl verschiedener Typen dieser Teste. Sie sind gewöhnlich qualitativ, nicht sehr sensitiv und erfordern häufig einen Wachstumsschritt. Viele dieser Teste würden erforderlich sein, um alle Mitglieder einer großen Gruppe von Organismen nachzuweisen.
U.S. Patent 4 358 535 von Falkow et al. offenbart ein Verfahren zum Nachweisen von genetischem Material, d.h., Genen oder Genomen. In diesem Patent wird eine klinische Probe oder ein Isolat, von dem angenommen wird, daß es ein Pathogen enthält, auf einen inerten porösen Träger, wie einen Nitrozellulosefilter, übertragen und so behandelt, daß die Zellen lokalisiert werden. Die Zellen werden anschließend so behandelt, daß ihre RNA freigesetzt und veranlaßt wird, an den Träger zu binden. Die anschließende Behandlung verursacht eine Trennung der einzelnen DNA-Stränge von dem Genom. Die Stränge werden anschließend mit markierten Sonden, die für die kennzeichnende Polynucleotidsequenz unter Hybridisierungsbedingungen spezifisch sind, kontaktiert. Die Hybridisierung der Sonde an einzelsträngige Polynucleotide von dem Pathogen wird durch die Markierung nachgewiesen.
Das Verfahren dieses Patents zum Nachweisen von Genen oder Genomen besitzt wie die anderen erwähnten Verfahren nicht die Spezifizität, Sensitivität, Schnelligkeit oder leichte Durchführbarkeit wie meine Erfindung. Eine Zusammenfassung der vergleiche des Falkow et al. Verfahrens, so wie es in dem Patent offenbart ist, mit dem Verfahren des Anmelders, wie hier offenbart, wird unten ausgeführt.
Webster (EP-A-155 360) beschreibt vollständig dargestellte Sonden im Gegensatz zu den erfindungsgemäßen Nucleinsäureproben, die mit einer Teil-RNA-Sequenz komplementär sind und in einem Hybridisierungsgemisch bereitgestellt werden.
Mir ist kein Stand der Technik bekannt, der das Nachweisen der Gegenwart oder Abwesenheit von R-RNA, die für eine bestimmte Gruppe von Organismen kennzeichnend ist, unter Verwendung der Nucleinsäurehybridisierung lehrt, worin ein ausgewähltes markiertes Nucleinsäuremolekül, das mit einer R-RNA-Untersequenz einer bestimmten Quelle komplementär ist, verwendet wird. Mir ist auch kein Stand der Technik bekannt, der im allgemeinen das Nachweisen der Gegenwart oder Abwesenheit von R-RNA von einer bestimmten Quelle durch Nucleinsäurehybridisierung unter Verwendung eines markierten Nucleinsäuremoleküls, das mit den gesamten R-RNA-Untersequenzen von einer spezifischen Quelle komplementär ist, offenbart.
Außerdem ist mir kein Stand der Technik bekannt, der das Nachweisen der Gegenwart oder Abwesenheit spezifischer Sequenzen oder Populationen verschiedener spezifischer psRNA-Sequenzen offenbart, um spezifische Organismen, Gruppen von Organismen oder Gruppen eukaryontischer Zellen durch Nucleinsäurehybridisierung nachzuweisen, zu identifizieren und zu bestimmen, worin ausgewählte markierte Nucleinsäuremoleküle verwendet werden, die mit Untersequenz/Untersequenzen, einer Sequenz/Sequenzen oder einer Population von Sequenzen oder Untersequenzen von psRNA von einer bestimmten Quelle komplementär sind.
Außerdem ist mir kein Stand der Technik bekannt, der lehrt: Das Nachweisen der Gegenwart oder Abwesenheit einer Nucleinsäure, die für eine bestimmte Gruppe von Organismen kennzeichnend ist; oder das schnelle Verfügbarmachen der Nucleinsäure einer bestimmten Gruppe von Organismen für die "in Lösung"-Nucleinsäurehybridisierung mit einer spezifischen markierten Sonde für jeden Zweck; das Verwenden eines "in Lösung"-Nucleinsäurehybridisierungsverfahrens, wobei ein schnelles Verfahren zum schnellen Verfügbarmachen der Nucleinsäuren spezifischer Gruppen von Organismen für die Hybridisierung mit einer spezifischen komplementären Sonde mit einem Verfahren zum Nachweisen einer Nucleinsäure eines Organismus kombiniert wird, indem die Rate der "in Lösung"-Hybridisierung der Nucleinsäuren eines Organismus und der markierten Sonde, die mit der Nucleinsäure des Organismus komplementär ist, in großem Maße beschleunigt wird; oder das Bestimmen der antimikrobiellen Sensitivität oder antiviralen Sensitivität einer bestimmten Gruppe von Organismen; oder das Untersuchen auf die Gegenwart von antimikrobiellen Substanzen in Blut, Urin, anderen Körperflüssigkeiten oder Geweben oder anderen Proben; oder das Bestimmen des Wachstumsstadiums der Zellen; oder das Nachweisen von Mikroorganismusinfektionen; oder das schnelle Untersuchen auf die Gegenwart einer Sonde in einer Hybridisierungsmischung, indem die hybridisierte Mischung unter vorbestimmten Bedingungen mit Hydroxyapatit in Kontakt gebracht wird und anschließend die resultierende Losung auf eine spezifische Art und Weise behandelt wird.
Offenbarung der Erfindung
Die Erfindung stellt Mittel zum Nachweisen, Identifizieren und Quantifizieren von Organismen in biologischen und anderen Proben, insbesondere zum spezifischen und sensitiven Nachweisen und Quantifizieren jedes Organismus, der ribosomale RNA (hiernach R-RNA) oder andere RNA enthält, jedes Mitglied von großen, intermediären, kleinen Kategorien oder taxonomischen Gruppen solcher Organismen und zuvor unbekannte R-RNA enthaltende Organismen, bereit. Die Erfindung ermöglicht sogar das Nachweisen der Gegenwart von einem R-RNA enthaltenden Organismus.
Die Erfindung stellt außerdem spezifisch hergestellte Nucleinsäuren bereit, die mit spezifischen Sequenzen oder Populationen verschiedener Sequenzen der Klasse von RNA-Sequenzen (hiernach spezifische Vorläufer-RNA-Sequenzen oder psRNA), die in den Vorläufer-R-RNA-Molekülen, nicht aber in reifen R-RNA-Molekülen vorhanden und in einem Hybridisierungsgemisch bereitgestellt werden, zum Nachweisen, Identifizieren und Quantifizieren spezifischer Organismen, Gruppen von Organismen, Gruppen von eukaryontischen Zellen.
Die Erfindung stellt außerdem Mittel bereit, die als charakterisierende Qualitäten: a) die Fähigkeit haben, spezifisch die Gegenwart von jedem einzelnen von einer großen Zahl von verschiedenen Organismen mit einem einzigen Assay-Verfahren, das ohne Rücksicht auf das Muster der genetischen Expression eines bestimmten Organismus funktioniert, nachzuweisen, b) die Fähigkeit haben, den Test zum Nachweisen von lediglich spezifischen Kategorien von Organismen, sogar in der Gegenwart von Organismen, die nicht zu der Gruppe von Interesse gehören, zu modifizieren, c) außerordentlich hohe Nachweis-Sensitivität und die Fähigkeit haben, die Gegenwart eines Organismus oder einer Zelle nachzuweisen, d) die Fähigkeit haben, die Zahl der vorhandenen Organismen oder Zellen zu quantifizieren und e) keinen Wachstumsschritt erfordern.
Diese Erfindung stellt Mittel bereit zum Nachweisen der antimikrobiellen Sensitivität einer bestimmten Gruppe von Organismen, zum Untersuchen auf die Gegenwart von antimikrobiellen Substanzen im Blut, Urin, anderen Körperflüssigkeiten oder Geweben oder anderen Proben, zum Bestimmen des Wachstumsstadiums der Zellen, zum Nachweisen von Mikroorganismusinfektionen und zum schnellen Untersuchen auf die Gegenwart einer Probe, die hybridisiert hat, in einer Hybridisierungsmischung.
Wie zuvor beschrieben, sind R-RNA-Basensequenzen in sehr unterschiedlichen Organismen zum Teil ähnlich. Je enger zwei Organismen miteinander verwandt sind, desto größer ist der Anteil der gesamten R-RNA, die zwischen den zwei Arten ähnlich ist. Die R-RNA-Sequenz einer bestimmten Art von Organismus kann als Reihe von kurzen R-RNA-Untersequenzen angesehen werden, von denen eine Untereinheit in praktisch allen Lebensformen ähnlich ist. Daher muss die R-RNA von fast allen Lebensformen diese Untersequenz enthalten. Eine andere Untersequenz ist nur in der R-RNA der Mitglieder der Art, zu der der Organismus gehört, ähnlich. Andere Untereinheiten sind innerhalb der Klasse von Organismen, zu der die Art gehört, vorhanden, und so weiter.
Da die R-RNA-Sequenzen sehr unterschiedlicher Organismen zumindestens teilweise ähnlich sind, können die erfindungsgemäßen Sonden, die RNA-Sequenzen nachweisen, die in sehr unterschiedlichen Organismen ähnlich sind, die Gegenwart oder Abwesenheit einer oder mehrerer solcher Organismen in einer Probe nachweisen. Eine markierte Nucleinsäuresequenz oder mit den R-RNA-Sequenzen komplementäre Sequenzen, die in sehr divergierenden Organismen ähnlich sind, können als eine solche Sonde in den Nucleinsäurehybridisierungsassays verwendet werden.
Da die R-RNA-Sequenzen eng verwandter Organismen ähnlicher sind, als solche, die entfernt verwandt sind, kann diese Erfindung, die eine Sonde umfaßt, die nur die R-RNA-Sequenzen nachweist, die in einer bestimmten engen Gruppe von Organismen ähnlich sind, die Gegenwart oder Abwesenheit einer oder mehrerer solcher bestimmten Organismen in einer Probe nachweisen, sogar in der Gegenwart von vielen nicht-verwandten Organismen.
Diese gruppenspezifischen Sonden können für eine Vielfalt von verschieden großen Kategorien spezifisch sein. Eine Sonde kann für eine bestimmte taxonomische Gattung spezifisch sein, während eine andere für eine bestimmte Familie oder eine andere Gattung spezifisch ist.
Gruppenspezifische Sonden haben die Fähigkeit, mit der R-RNA einer Gruppe von Organismen, aber nicht mit der RNA einer anderen Gruppe von Organismen zu hybridisieren. Eine solche gruppenspezifische komplementäre Sequenz wird die Gegenwart von RNA von jedem Mitglied dieser spezifischen Gruppe von Organismen nachweisen, sogar in der Gegenwart einer großen Menge von R-RNA von vielen Organismen, die nicht zu dieser spezifischen Gruppe gehören.
Die Gesamtzahl von R-RNA-Molekülen in einer Probe wird unter Verwendung einer markierten Sequenz oder mit R-RNA-komplementären Sequenzen und standardisierter überschüssiger Sonde oder überschüssiger Probe RNA-Nucleinsäurehybridisierungsmethodik gemessen.
Der R-RNA-Gehalt der Zellen von einer breiten Vielfalt von Organismen ist im Stand der Technik bekannt. In einer großen Gruppe von ähnlichen Organismen, zum Beispiel Bakterien, variiert die Menge der R-RNA pro Zelle ungefähr 2- bis 5-fach. Wenn die Zahl der R-RNA-Moleküle in einer Probe und die breite Klassenidentität der Quelle der R-RNA bekannt ist, kann daher eine genaue Schätzung über die Zahl der in der Probe vorhandenen Zellen berechnet werden. Wenn die breite Klassenidentität nicht bekannt ist, kann sie durch Hybridisierung der Probe mit einer Reihe von ausgewählten Sonden, die mit der R-RNA komplementär sind, bestimmt werden, wobei jede davon für eine bestimmte große Kategorie von Organismen spezifisch ist.
Zur Zeit ist der wirksame Bereich des Nachweises und der Quantifizierung eines einzigen Assayverfahrens von 10⁹ R-RNA-Moleküle (ein Bakterium oder 10^-2 Säugerzellen) bis ungefähr 10¹² R-RNA-Moleküle (10⁸ Bakterien oder 10⁶ Säugerzellen), eine Spanne von ungefähr 10⁸ in Zellzahlen. Ein einziger Test kann außerdem auf eine solche Weise durchgeführt werden, um wirksam von 10³ bis 10¹⁰ Bakterien zu quantifizieren. Der Test ist in dieser Hinsicht ziemlich flexibel.
Da der Test für R-RNA spezifisch ist und die Fähigkeit besitzt, die Gegenwart von sehr wenigen Organismen nachzuweisen, besteht keine Notwendigkeit, die Zahl der Organismen durch einen Wachstumsschritt zu amplifizieren.
In der Praxis umfasst diese erfindungsgemäße Form, die gerichtet ist auf die Bestimmung der Gegenwart von einem R-RNA enthaltenden Organismus in einer Probe, die einen solchen Organismus enthalten kann, im wesentlichen eine Nucleinsäuresonde, die in einem Verfahren nützlich ist, umfassend:

a) Zusammenbringen der Probe oder der in dieser Probe enthaltenen isolierten Nucleinsäuren mit einer Sonde, die markierte Nucleinsäuremoleküle umfaßt, die mit der R-RNA aller Organismen komplementär sind,
b) Inkubieren der resultierenden Mischung unter vorbestimmten Hybridisierungsbedingungen für eine vorbestimmte Zeit und anschließendes
c) Untersuchen der resultierenden Probe auf die Hybridisierung der Sonde, worin die Sonde in einem Hybridisierungsgemisch bereitgestellt wird.

Wenn diese Erfindung gerichtet ist auf das Bestimmen der Gegenwart eines jeden Mitglieds einer spezifischen Kategorie von Organismen, die R-RNA in einer solche Organismen enthaltenden Probe enthält, umfasst das Verfahren:

a) Kontaktieren der Probe oder der Nucleinsäuren darin mit einer Sonde, umfassend markierte Nucleinsäuremoleküle, die nur mit der RNA der Mitglieder der spezifischen Kategorie von Organismen, aber nicht mit der RNA von nicht-verwandten Organismen komplementär sind,
b) Inkubieren der Sonde und der Probe oder der isolierten Nucleinsäuren darin und
c) Untersuchen der inkubierten Mischung auf die Hybridisierung dieser Sonde, worin die Sonde in einem Hybridisierungsgemisch bereitgestellt ist.

Diese Erfindung kann außerdem verwendet werden, um die Zahl der in der zu untersuchenden Probe vorhandenen Organismen zu bestimmen, indem zu dem Untersuchungsschritt des zweiten aufgeführten Verfahrens – in dem Fall, dass die Sondenhybridisierung aufgetreten ist – ein Schritt hinzugefügt wird, worin die Menge der in der Probe vorhandenen R-RNA mit der Zahl der R-RNA-Moleküle, die gewöhnlich in einzelnen zu dieser spezifischen Gruppe gehörenden Organismen vorhanden sind, verglichen wird.
Selbstverständlich ist erfindungsgemäß eine Variante unter den möglichen Variationen eingeschlossen, die anstelle einer einzelnen Sonde von Schritt a) in dem zweiten der obigen Verfahren einer Vielfalt oder eine Gruppe von verschiedenen Sonden umfasst. In einem solchen Fall umfasst jede separate Sonde markierte Nucleinsäuremoleküle, die nur mit der R-RNA einer spezifischen Gruppe von Organismen komplementär sind, und jede Sonde ist spezifisch für eine unterschiedliche Gruppe von Organismen und in einem Hybridisierungsgemisch bereitgestellt wird; Schritt a) wird von der Inkubation jeder Sonde-Probenmischung unter vorbestimmten Hybridisierungsbedingungen für eine vorbestimmte Zeit gefolgt und anschließend wird jede Mischung auf Hybridisierung der Sonde untersucht.
Wie zuvor beschrieben, sind t-RNA-Basensequenzen in sehr unterschiedlichen Organismen zum Teil ähnlich. Je enger zwei Organismen miteinander verwandt sind, desto größer ist der Anteil der gesamten t-RNA, die zwischen den zwei Arten ähnlich ist. Jede t-RNA-Sequenz einer bestimmten Art von Organismus kann als Reihe von kurzen t-RNA-Untersequenzen angesehen werden. Eine Untersequenz ist ähnlich in einer großen verwandten Gruppe von Organismen. Eine andere Untersequenz ist ähnlich in einer mittelgroßen verwandten Gruppe von Organismen, während eine dritte Untersequenz in einer kleinen verwandten Gruppe von Organismen ähnlich ist und so weiter.
Da auch die t-RNA-Sequenzen sehr unterschiedlicher Organismen zumindest teilweise ähnlich sind, kann das Verfahren meiner Erfindung unter Verwendung eine Sonde, die t-RNA-Sequenzen nachweist, die in sehr unterschiedlichen Organismen ähnlich sind, die Gegenwart oder Abwesenheit einer oder mehrerer solcher Organismen in einer Probe nachweisen. Somit können eine markierte Nucleinsäuresequenz oder mit den t-RNA-Sequenzen komplementäre Sequenzen, die in sehr divergierenden Organismen ähnlich sind, worin die Sonde in einem Hybridisierungsgemisch bereitgestellt wird, als eine solche Sonde in den Nucleinsäurehybridisierungsassays verwendet werden.
Da die t-RNA-Sequenzen eng verwandter Organismen ähnlicher sind, als solche, die entfernt verwandt sind, kann diese Erfindung, die eine Sonde umfasst, worin die Sonde in einem Hybridisierungsgemisch bereitgestellt wird, die nur die t-RNA-Sequenzen nachweist, die in einer bestimmten engen Gruppe von Organismen ähnlich sind, die Gegenwart oder Abwesenheit einer oder mehrerer solcher bestimmten Organismen in einer Probe nachweisen, sogar in der Gegenwart von vielen nicht-verwandten Organismen. Solche gruppenspezifischen Sonden können für eine Vielfalt von verschieden großen Kategorien spezifisch sein. Beispielsweise kann eine Sonde für eine bestimmte taxonomische Gattung spezifisch sein, während eine andere für eine bestimmte Familie oder eine andere Gattung spezifisch ist.
Gruppenspezifische Sonden haben die Fähigkeit, mit der t-RNA einer Gruppe von Organismen, aber nicht mit der t-RNA einer anderen Gruppe von Organismen zu hybridisieren. Eine solche gruppenspezifische komplementäre Sequenz wird die Gegenwart von t-RNA von jedem Mitglied dieser spezifischen Gruppe von Organismen nachweisen, sogar in der Gegenwart einer großen Menge von t-RNA von vielen Organismen, die nicht zu dieser spezifischen Gruppe gehören.
In der Praxis der Erfindung, die gerichtet ist auf die Bestimmung der Gegenwart von einem t-RNA enthaltenden Organismus in einer Probe, die einen solchen Organismus enthalten kann, umfasst eine Nucleinsäuresonde, die in dem Verfahren nützlich ist:

a) Zusammenbringen der Probe oder der in dieser Probe enthaltenen isolierten Nucleinsäuren mit einer Sonde, die markierte Nucleinsäuremoleküle umfasst, die mit der t-RNA aller Organismen komplementär sind,
b) Inkubieren der resultierenden Mischung unter vorbestimmten Hybridisierungsbedingungen für eine vorbestimmte Zeit und anschließendes
c) Untersuchen der resultierenden Probe auf die Hybridisierung der Sonde, worin die Sonde in einem Hybridisierungsgemisch bereitgestellt wird.

Meine Erfindung kann außerdem verwendet werden, um die Zahl der in der zu untersuchenden Probe vorhandenen Organismen zu bestimmen, indem zu dem Untersuchungsschritt des zweiten aufgeführten Verfahrens – in dem Fall, dass die Sondenhybridisierung aufgetreten ist – ein Schritt hinzugefügt wird, worin die Menge der in der Probe vorhandenen R-RNA mit der Zahl der t-RNA-Moleküle, die gewöhnlich in einzelnen zu dieser spezifischen Gruppe gehörenden Organismen vorhanden sind, verglichen wird.
Selbstverständlich sind im Umfang meiner Erfindung Variationen eingeschlossen, die anstelle einer einzelnen Sonde von Schritt a) in dem zweiten der obigen Verfahren eine Vielfalt oder eine Gruppe von verschiedenen Sonden umfasst. In einem solchen Fall umfasst jede separate Sonde markierte Nucleinsäuremoleküle, die nur mit der t-RNA einer spezifischen Gruppe von Organismen komplementär sind, und jede Sonde ist spezifisch für eine unterschiedliche Gruppe von Organismen und in einem Hybridisierungsgemisch bereitgestellt wird; Schritt a) wird von der Inkubation jeder Sonde-Probenmischung unter vorbestimmten Hybridisierungsbedingungen für eine vorbestimmte Zeit gefolgt und anschließend wird jede Mischung auf Hybridisierung der Sonde untersucht.
Die erfindungsgemäßen Mittel werden in der folgenden Beschreibung der kennzeichnenden Merkmale dieser erfindungsgemäßen Testverfahren näher dargestellt.
Testverfahren für die Nucleinsäurehybridisierung zum Nachweisen und Quantifizieren von RNA
Ein gewünschter Nachweistest sollte:
a) schnell, b) einfach zu verwenden, c) hochsensitiv und d) in nur einem Labor-Assay bestimmbar und quantifizierbar sein.
Die Existenz einer Nucleinsäuresonde, wobei die Sonde in einem Hybridisierungsgemisch bereitgestellt wird, die mit R-RNA jedes Mitglieds der Gattung Legionella, aber nicht mit R-RNA einer anderen Quelle hybridisieren wird, macht einen schnellen, einfach zu verwendenden, sensitiven in-Lösung-Nachweistest möglich, der zum Beispiel Legionella Bakterien sowohl bestimmen als auch quantifizieren kann, wobei nur ein Labor-Assay, durchgeführt wird und die Reinigung der Nucleinsäuren von der Probe nicht erforderlich ist.
Eine Beschreibung der grundlegenden Aspekte dieses "in Lösung"-Hybridisierungstestverfahrens folgt.
Obgleich das beschriebene Verfahren zum Nachweisen von Mitgliedern der Gattung Legionella entworfen wurde, ist offensichtlich, daß das gleiche Testverfahren mit einer geeigneten Sonde verwendet werden kann, um viele andere Gruppen von Organismen nachzuweisen.
Schritt 1: Herstellung der Probe
Die Probe wird mit einer Lösung, enthaltend ein Detergenz und ein proteolytisches Enzym, gemischt. Das Detergenz lysiert die Bakterien und unterstützt den Vorgang, die Zellkomponenten löslich zu machen, während das Enzym die Zellproteine zerstört, einschließlich solcher Enzyme, die RNA und DNA abbauen. Die Zusammensetzung der Detergenz-Enzymmischung hängt von dem Typ des verwendeten Detergenz und des proteolytischen Enzyms und der Menge und dem zu untersuchenden Probentyp ab. Verwendete Detergenzien umfassen Natriumlaurylsulfat, Sarcosyl^® und Zwittergent^®, während die verwendeten Enzyme Proteinase K und Pronase^® umfassen. Eine Vielzahl von Enzymen, Solubilisierungsmitteln, wie chaotropischen Mitteln, können verwendet werden. Die Sonde kann außerdem in der Detergenz-Enzym-Mischung, die zu der Probe gegeben wird, vorhanden sein.
Das Enzym-Detergenz wirkt sehr schnell auf Legionella Bakterien in der Probe. In den meisten Fällen ist es nicht notwendig, die Mischung zu inkubieren, um die RNA für die "in Lösung"-Hybridisierung mit der Sonde verfügbar zu machen. In bestimmten Fällen ist eine kurze Inkubationszeit erforderlich.
In anderen Situationen ist es nicht notwendig, das proteolytische Enzym einzuschließen, und das Detergenz allein macht die RNA für die "in Lösung"-Hybridisierung mit der Sonde verfügbar.
Diese Methode stellt ein schnelles und einfaches Verfahren bereit, um die Proben-RNA in einen Zustand zu versetzen, der mit der Sonde in einem "in Lösung"-Assay hybridisieren kann. Außerdem ermöglicht es, daß die Hybridisierung "in Lösung" ohne Reinigung der Proben-RNA auftreten kann. Ein Schlüssel dieses Verfahrens ist, daß die Sonde Legionella R-RNA nachweist. R-RNA ist in der Zelle einzelsträngig und zum hybridisieren mit der Sonde bereit, sobald die ribosomalen Proteine von der R-RNA entfernt werden. Im Gegensatz zum direkten Nachweisen der riboso malen R-RNA würde es bei DNA (d.h. das R-RNA-Gen) oder jeder anderen DNA-Sequenz notwendig sein, ein Verfahren hinzuzufügen, durch das das doppelsträngige RNA-Gen in zwei Einzelstränge getrennt wird, bevor die Sonde an sie hybridisieren kann.
Meines Wissens gibt es keinen Stand der Technik, der die Verwendung eines Enzym-Detergens-Probenverfahrens, um R-RNA, im allgemeinen RNA oder DNA für die "in Lösung"-Hybridisierung mit einer Sonde zum Zweck des Nachweisens und Quantifizierens der Gegenwart oder Abwesenheit von Organismen im allgemeinen oder einer spezifischen Gruppe von Organismen verfügbar macht, betrifft.
Schritt 2: Herstellung der Hybridisierungs-Inkubationsmischung
Zu der Mischung aus Probe-Enzym-Detergenz wird die Sonde und ausreichend Salz gegeben, um das Auftreten der Hybridisierung zu ermöglichen, und die resultierende Mischung wird bei einer geeigneten Temperatur inkubiert. Die Salzkonzentration und die Temperatur der Hybridisierungsinkubation wird kombiniert, um das Kriterium zu bestimmen. Das Kriterium der Inkubationsbedingung muß mit dem gleich sein, das verwendet wird, um die Sonde auszuwählen, oder die Spezifität der Sonde kann sich ändern.
Die Inkubationsmischung muß für das Auftreten der Hybridisierung lang genug inkubiert werden. Der Salztyp und die Konzentration bestimmen die Hybridisierungsrate, die erreicht werden kann. Folglich fördern bestimmte Salze eine sehr schnelle Hybridisierung, wenn sie in geeigneter Konzentration verwendet werden. Ein Beispiel eines solchen Salzes ist Natriumphosphat. Eine Legionella spezifische Sonde, die mit gereinigter Legionella R-RNA in 3,0 M Natriumphosphatpuffer (pH = 6,8) (hiernach mit PB bezeichnet) gemischt und bei 76°C inkubiert wird, hybridisiert mehr als 10 mal schneller, als die gleichen Mengen der Legionella Sonde und RNA, die unter Standardbedingungen mit 0,72 M NaCl und bei 76°C inkubiert werden (diese beiden Bedingungen sind in ihrem Kriterium gleich). Andere Salze können außerdem verwendet werden, um die Beschleunigung der Hybridisierungsrate zu bewirken. Diese umfassen die meisten Natrium-, Ammonium-, Rubidium-, Cäsium- und Lithiumsalze.
In 3 M PB bei 76°C wird die Hybridisierungsrate der spezifischen Legionella Sonde mit in der Sondenmischung aus PB-Enzym-Detergenz-Probe vorhandenen Legionella RNA außerdem 100 mal mehr beschleunigt, als die Hybridisierungsraten, die bei Standardinkubationsbedingungen beobachtet werden.
Die Hybridisierung tritt außerdem zwischen der Sonde und der RNA in einer Mischung aus Enzym-Detergenz-Probe unter Standard-Salzkonzentrationsbedingungen auf.
Ein erfindungsgemäßes Merkmal ist, wie zuvor aufgeführt, die Fähigkeit, sehr kleine Zahlen von Organismen durch Bestimmen ihrer R-RNA nachzuweisen. Dies ist durch die große Zahl von R-RNA-Molekülen in jeder Zelle möglich. In Legionella ähnlichen Organismen sind 5000 bis 10000 R-RNA-Moleküle in jeder einzelnen Bakterienzelle vorhanden. Eine der Hauptdeterminanten der Nachweis-Sensitivität, die durch die Nucleinsäurehybridisierung erzielt werden kann, ist die Hybridisierungsrate, die erreicht werden kann. Die Kombination des Nachweises von RNA und der Verwendung der oben beschriebenen Raten-beschleunigenden Inkubationsbedingungen macht es möglich, in einem sehr kurzen Zeitraum äußerst hohe Nachweis-Sensitivität von Bakterien und anderen Zellen unter Verwendung von sehr kleinen Mengen der Probe und Sonde zu erreichen. Ein erläuterndes Beispiel wird später beschrieben.
Meines Wissens gibt es keinen Stand der Technik, der die Verwendung von Raten-beschleunigenden Systemen mit "in Lösung"-Hybridisierungstests zum Bestimmen der Gegenwart oder Abwesenheit eines Organismus oder einer Gruppe von Organismen durch Nachweisen der R-RNA, anderer RNA oder DNA der Organismen von Interesse betrifft. Außerdem ist mir kein Stand der Technik bekannt, der die Verwendung einer Kombination eines Ratenbeschleunigenden Systems und von Mischungen aus Enzym-Detergenz-Probe-Sonde betrifft, um die Gegenwart oder Abwesenheit eines spezifischen Organismus oder einer Gruppe von Organismen durch Nachweisen der R-RNA oder anderer RNA oder DNA des spezifischen Organismus oder der Gruppe von Organismen von Interesse bestimmt.
Schritt 3: Untersuchen der Inkubationsmischung auf die Hybridisierung der Sonden mit der Ziel-R-RNA
Das Zeichen, daß die Probe die Ziel-R-RNA-Moleküle (und daher den Zielorganismus) enthält, ist die Gegenwart von hybridisierter Sonde in der Inkubationsmischung. Folglich muß die Inkubationsmischung am Ende der Inkubationszeit auf die Gegenwart hybridisierter Sonde untersucht werden. Es ist wünschenswert, daß ein solches Assay leicht durchzuführen und schnell ist. Für dieses Assay wird die Inkubationsmischung unter Verwendung von Hydroxyapatit (HA) behandelt. Unter geeigneten Bedingungen bindet HA R-RNA schnell und vollständig, aber es bindet keine nichthybridisierten Sondenmoleküle. Wenn ein Sondenmolekül mit einem Ziel-R-RNA-Molekül hybridisiert wird, bindet die Sonde außerdem an HA, da es physikalisch an die R-RNA gebunden ist.
Der Nachweis von Organismen durch Nachweisen ihrer R-RNA ist ein erfindungsgemäßes Merkmal. Die Fähigkeit von HA, an R-RNA oder RNA im allgemeinen in Sekunden zu binden, ohne überhaupt an die Sonde zu binden, hat die Entwicklung eines Hybridisierungsassay-Verfahrens ermöglicht, das nur wenige Minuten erfordert, hohe Flexibilität besitzt und leicht an die Handhabung vielfältiger Proben angepaßt werden kann. Außerdem kann die Inkubationsmischung aus Probe-Detergenz-Enzym-Sonde in dem geeigneten Puffer verdünnt werden und direkt zum Untersuchen der Gegenwart von hybridisierter Sonde weiterverarbeitet werden.
HA ist im Stand der Technik als eine Substanz bekannt, die zum ' Untersuchen der Hybridisierung von Sonden verwendet wird. Das hier beschriebene Assayverfahren, das große Vorteile gegenüber der Verwendung von HA im Stand der Technik hat (Brenner et al., Analytical Biochem., 1969, 28, S. 477), kann bei Raumtemperatur durchgeführt werden und funktioniert über einen Temperaturbereich von ungefähr 15°C bis ungefähr 90°C. Es benötigt weniger Schritte, das Erwärmen bei jedem Zentrifugationsschritt ist nicht erforderlich, und es kann in der Gegenwart oder Abwesenheit von Detergenzien, wie Zwittergent^® (Calbiochem, San Diego, Kalifornien) und Natriumlaurylsulfat durchgeführt werden. Es ist 3 bis 5 mal schneller und ein einziges Assay kann in 3 bis 5 Minuten durchgeführt werden. Es erfordert ungefähr 5 mal weniger HA. Die Detergenzkonzentration kann von 0 bis 10% reichen, während die Phosphatkonzentrationen von 0,1 M bis 0,2 M reichen, in Abhängigkeit von dem Assaytyp. Das Verfahren kann außerdem auf die Handhabung vielfältiger Proben angepaßt werden.
Andere Verfahren als HA sind verfügbar, um nach der Hybridisierung der Sonde zu suchen. Diese umfassen Enzymassays, wie das S₁-Enzymverfahren, Größentrennungsverfahren und eine Vielzahl von immobilisierten Probenverfahren. Die hier diskutierte Sonde kann bei diesem und jedem anderen Verfahren zum Durchführen der Hybridisierung und der Hybridisierungsassays wirksam verwendet werden.
Verfahren zur Herstellung von gruppenspezifischen R-RNA-Sonden Verschiedene Methoden können verwendet werden, um gruppenspezifische Sonden herzustellen. Bis auf eine dieser Methoden bauen alle auf unterschiedlichen Nucleinsäurehybridisierungsverfahren auf, um die gruppenspezifischen Sondensequenzen zu identifizieren und zu reinigen.
Verfahren A
Das nützlichste Verfahren zum Herstellen von gruppenspezifischen R-RNA-Sonden verwendet rekombinante DNA-Methodik. Die Schritte, die zu diesem Verfahren gehören, sind: (Die spezifischen Details der DNA-rekombinanten Standardtechniken sind in dem Buch "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", T. Maniatis et al., Cold Spring Harbor Laboratory Publication, 1982, beschrieben.)

1. Isolieren der Nucleinsäure von einem spezifischen Organismus von Interesse. Standard-Isolierungsverfahren werden verwendet.
2. Unter Verwendung dieser isolierten DNA werden die R-RNA-Gene dieses Organismus kloniert und stellen anschließend große Mengen der ribosomalen Gen-DNA unter Verwendung der rekombinanten DNA-Standardtechnik, wie in Maniatis et al., supra, gezeigt, her.
3. Zerkleinern der R-RNA-Gen-DNA in kurze Stücke mit Restriktionsenzymen und Herstellen einer Bibliothek dieser kurzen DNA-Stücke unter Verwendung der rekombinanten DNA-Standardverfahren, wie in Maniatis et al., supra, gezeigt.
4. Screenen der Bibliothek und Identifizieren eines Klons, der eine kurze R-RNA-Gensequenz enthält, die nur mit R-RNA anderer Mitgliedern der taxonomischen Art des Organismus von Interesse hybridisiert. Isolieren dieses Klons. Er enthält eine artenspezifische DNA-Sequenz, die nur mit der RNA der spezifischen Art komplementär ist, zu der die Organismen von Interesse gehören.

Weiteres Screenen der Bibliothek und Identifizieren und isolieren der folgenden Klone: a) einem Klon, der eine DNA-Sequenz enthält, die komplementär mit R-RNA ist, die nur mit R-RNA von Mitgliedern dieser taxonomischen Gattung, zu der der Organismus von Interesse gehört, hybridisiert, b) einem Klon, der eine DNA-Sequenz enthält, die komplementär mit R-RNA ist, die nur mit R-RNA von Mitgliedern der taxonomischen Reihe, zu der der Organismus von Interesse gehört, hybridisiert, c) einem Klon, der eine DNA-Sequenz enthält, die komplementär ist mit R-RNA, die nur mit R-RNA von Mitgliedern der taxonomischen Familie, zu der der Organismus von Interesse gehört, hybridisiert, d) einem Klon, der eine DNA-Sequenz enthält, die komplementär mit R-RNA ist, die nur mit R-RNA von Mitgliedern der taxonomischen Klasse, zu der der Organismus von Interesse gehört, hybridisiert und e) einem Klon, der eine DNA-Sequenz enthält, die komplementär ist mit R-RNA, die mit R-RNA von so vielen verschiedenen Lebensformen wie möglich hybridisiert.
Das vorgenannte Klonauswahlschema ist nur eines einer Vielzahl von verschiedenen möglichen.
Die Standardverfahren zum Klonieren und Screenen werden verwendet, wie in Maniatis et al., supra, beschrieben.

5. a) Herstellen großer DNA-Mengen von jedem Klon. Isolieren und Reinigen nur der DNA-Sequenz von der DNA jedes einzelnen Klons, die mit R-RNA komplementär ist, unter Verwendung eines der vielen verfahren, die existieren, um dies zu erreichen, z.B. wie in Maniatis et al., supra, beschrieben.
b) In bestimmten Fällen ist die gesamte in einem Klon vorhandene DNA als eine Sonde nützlich, wobei in diesem Fall die gesamte von dem Klonierungsvektor isolierte DNA verwendet wird.
c) In bestimmten anderen Fällen wird einzelsträngige DNA des Klonierungsvektors, der die DNA-Sequenz enthält, die komplementär mit R-RNA ist, als Sonde verwendet. In einem solchen Fall muß dieser Strang isoliert und gereinigt werden unter Verwendung eines der verschiedenen Verfahren, die existieren, um dies zu erreichen, wie von Maniatis et al., supra, beschrieben.
6. Die in 5a, 5b und 5c erhaltene DNA-Sonde muß so markiert werden, daß sie in der Assaymischung identifiziert werden kann. Viele verschiedene Arten von Markierungen können verwendet werden, wobei die meisten verwendeten Markierungen radioaktiv sind. Andere umfassen Fluoreszenz, Enzyme und Biotin. Standardverfahren zum Markieren der DNA werden verwendet, wie in Maniatis et al., supra, aufgeführt.
7. Die gruppenspezifische R-RNA-Gensequenz in dem Klonierungsvektor kommt im doppelsträngigen Zustand vor. Einer dieser Stränge ist mit der R-RNA komplementär und wird mit ihr hybridisieren. Der andere Strang wird nicht mit R-RNA hybridisieren, kann aber verwendet werden, um markierte gruppenspezifische Sequenzen, die mit R-RNA komplementär sind, herzustellen. Dies wird unter Verwendung einer DNA- oder RNA-Polymerase und Nucleinsäurevorläufermolekülen, die markiert sind, durchgeführt. Das Enzym wird unter Verwendung des DNA-Stranges als Matrize die markierten Vorläufer zum Synthetisieren von DNA oder RNA verwenden. Das neu synthetisierte markierte Molekül wird komplementär mit R-RNA sein und kann als gruppenspezifische Sonde verwendet werden. Die DNA-Matrize kann durch verschiedene etablierte Mittel entfernt werden, wobei nur einzelsträngige markierte Nucleinsäure zurückbleibt, wie in Maniatis et al., supra und in dem Artikel von Taylor et al. in Biochemica et Biophys. Acta, 1976, 442, S. 324, beschrieben.

Verfahren B
Verschiedene Enzyme können R-RNA von jeder Quelle als Matrize zum Synthetisieren von markierter DNA, die mit der gesamten R-RNA-Sequenz komplementär ist, verwenden. Gruppenspezifische Sequenzen, die nur mit der RNA von einer bestimmten Klasse von Organismen komplementär sind, können durch ein Hybridisierungs-Auswahlverfahren isoliert werden. Der Teil der synthetisierten markierten DNA, der nur mit der RNA von Mitgliedern einer spezifischen Klasse von Organismen hybridisiert, kann durch Standardhybridisierungsverfahren isoliert werden. Ein Beispiel dieses Verfahrens wird hiernach dargestellt. Eine solche Sonde kann in ausreichender Menge hergestellt werden, um wie unter A beschrieben zu klonieren. Die Basensequenz dieses Klons kann durch Standardverfahren bestimmt werden und die Sequenz, die verwendet wird, um die Herstellung der Sonde zu leiten, kann durch chemische Synthese unter Verwendung von Standardverfahren bestimmt werden.
Verfahren C
Die R-RNA-Nucleotidsequenzen von sehr unterschiedlichen Organismen sind bestimmt worden. Gruppenspezifische Sequenzen, die für eine spezifische Gruppe von Organismen ähnlich sind, können durch Vergleichen dieser bekannten Sequenzen identifiziert werden. Eine Sequenz, die mit dieser gruppenspezifischen R-RNA-Sequenz komplementär ist, kann dann unter Verwendung von Standardmethodiken chemisch synthetisiert und markiert werden.
Herstellung von spezifischen Sonden, die mit psRNA komplementär sind Grundsätzlich die gleichen Methodiken, die verwendet werden, um spezifische Sonden herzustellen, die mit R-RNA komplementär sind, können verwendet werden, um spezifische Sonden für spezifische Klassen oder Populationen von psRNA herzustellen. Die Verfahren zum Isolieren jeder Klasse von RNA und weiteres Fraktionieren sind im Stand der Technik be kannt. Die Form der Sonde kann wieder DNA oder RNA sein, und die Länge der Sonde kann ungefähr 12 bis 1000 Basen lang sein.
Der komplementäre Bereich der Sonde muß nicht perfekt mit der Zielnucleinsäure komplementär sein, und die gesamte Länge der Sonde muß nicht mit dem Zielmolekül komplementär sein.
Isolieren von Probennucleinsäure
Standard Stand der Technik Verfahren können verwendet werden, um eine Nucleinsäure von den zu untersuchenden Proben zu isolieren. Ein Standardverfahren der Nucleinsäureisolierung und -Reinigung ist in dem Abschnitt der Beispiele dargestellt und wird außerdem in Maniatis et al., supra, besprochen.
Eine neue Technik zum Verfügbarmachen von Nucleinsäuren für die "in Lösung"-Hybridisierung, ohne einen Reinigungsschritt durchzufahren, wird hiernach beschrieben.
Durchführen der Nucleinsäurehybridisierung
Eine geeignete Menge markierter Sonde wird mit der Probennucleinsäure gemischt. Diese Mischung wird anschließend auf eine spezifische Salzkonzentration (NaCl wird gewöhnlich verwendet) eingestellt, und die gesamte Mischung wird bei einer spezifischen Temperatur für einen spezifischen Zeitraum inkubiert. Am Ende des Zeitraumes wird die Mischung durch Durchführen eines Hybridisierungsassays untersucht. Viele verschiedene Kombinationen von Salz, Lösungsmittel, Nucleinsäurekonzentrationen, Volumen und Temperaturen erlauben die Nucleinsäurehybridisierung. Die bevorzugte Kombination hängt von den Umständen des Assays ab. Es ist jedoch wichtig, daß das Kriterium (siehe "Definitionen") der Hybridisierungsschritte identisch ist mit den Kriterien, die verwendet werden, um die Gruppensonde zu identifizieren und auszuwählen. wenn die Kriterien unterschiedlich zu dem Hybridisierungsschritt sind, kann sich die Probenspezifität ändern. Siehe "Repeated Sequences in DNA" von Britten und Kohne, Science, 1968, 161, S. 529, "Kinetics of Renaturation of DNA", Wetmur und Davidson, J. Mol. Biol., 1968, 31, S. 349, "Hydroxyapatite Techniques for Nucleic Acid Reassociation" von Kohne und Britten in Procedures in Nucleic Acid Research, 1971, Hrsg. Cantoni und Davies, Harper and Row, Bd. 2, S. 500.
Zwei verschiedene Methoden werden im Hinblick auf die in der Hybridisierungsmischung vorhandene Menge der Sonde und Probennucleinsäure verwendet. In einer, dem überschüssigen Sondenverfahren, ist mehr Sonde vorhanden, als Probennucleinsäure, in diesem Falle RNA. Bei einer anderen, dem überschüssigen RNA-Verfahren, ist mehr R-RNA als Sonde vorhanden. Das überschüssige Sondenverfahren ist das bevorzugte Verfahren zum Bestimmen der Gegenwart von R-RNA in unbekannten Proben. Es beinhaltet verschiedene Vorteile, die unten beschrieben werden. Siehe Tabellen 1 und 2 zur weiteren Besprechung dieser beiden Methoden.
Unter Verwendung des überschüssigen Sondenverfahrens kann der Nachweis und die Quantifizierung mit nur einem Labor-Assaypunkt durchgeführt werden, wenn die geeignete RNA-Sonde verfügbar ist. Wenn die Hybridisierung zum Abschluß geführt hat, ist die Menge der Sonde, die hybridisiert hat, ein direktes Maß der Menge der in der Probe vorkommenden RNA. Die Tatsache, daß die Probe überhaupt hybridisiert, weist darauf hin, daß RNA vorhanden ist, und die Menge der Sonde, die hybridisiert, zeigt die Menge der in der Probe vorhandenen RNA an.
Die Sicherstellung, daß es zu einer bekannten Zeit zum Abschluß der Hybridisierung gekommen ist, ist wichtig, um die RNA zu quantifizieren. Dies wird leicht durch Zugabe von genügend Sonde erreicht, um sicherzustellen, daß die Hybridisierung zu einem ausgewählten Zeitraum zum Abschluß geführt hat. Je mehr Sonde zugegeben wird, desto schneller wird das Ende erreicht. Folglich liefert das überschüssige Sondenverfahren einen Weg, um sicherzustellen, daß die Hybridisierung beendet ist, und zu welchem Zeitpunkt dies erfolgte.
Im Gegensatz dazu kann der Nachweis und die Quantifizierung von DNA nicht mit einem Labor-Assaypunkt durchgeführt werden, wenn das überschüssige R-RNA-Verfahren verwendet wird. Außerdem kann der Zeitpunkt, zu dem der Testpunkt erfolgen soll, nicht in dem überschüssigen RNA-Verfahren vorhergesagt werden. Unbekannte Proben mit kleinen RNA-Mengen hybridisieren wesentlich langsamer, als Proben mit großen RNA-Mengen.
Das Assay für die Hybridisierung
Das Zeichen, daß RNA der spezifischen Gruppe in der Probe vorhanden ist, ist die Gegenwart von doppelsträngiger markierter Sonde.
Viele verschiedene Verfahren, die in der Literatur gut dokumentiert sind, sind zur Untersuchung der Hybridisierungsmischung auf die Gegenwart von markierter Sonde in der doppelsträngigen Form verfügbar. Die Wahl des Verfahrens hängt von dem gewählten Verfahren für den Hybridisierungsschritt, der Zusammensetzung der Hybridisierungsmischung, dem Typ der Markierung auf der Sonde und anderen Faktoren ab. Ein gewöhnlich verwen detes Verfahren wird hiernach beschrieben. Siehe auch Wetmur und Davidson, Kohne und Britten und Thomas et al., supra. Außerdem siehe den Artikel von R. Flavell et al., Eur. J. Biochem., 1974, 47, S. 535. Weiterhin den Artikel von Maxwell et al., Nucleic Acids Research, 1978, 5, S. 2033. In allen Fällen ist es jedoch immer wichtig, daß entweder am oder über dem gleichen Kriterium, das für die Hybridisierungsreaktion verwendet wird, oder bei einem Kriterium, bei dem die Hybridisierung nicht auftreten kann, die Untersuchung durchgeführt wird.
Quantifizierung der Nucleinsäurensequenzen durch die Nucleinsäurehybridisierung
Die Menge der in einer Probe vorkommenden Nucleinsäure kann auf unterschiedlichen Wegen durch Nucleinsäurehybridisierung unter Verwendung von im Stand der Technik bekannten Verfahren bestimmt werden. Die zwei verfahren, die hiernach beschrieben werden, verwenden das Beispiel des Quantifizierens von R-RNA.
Es ist offensichtlich, daß dieses Verfahren allgemein in jedem Fall anwendbar ist, wenn es notwendig ist, die Gegenwart oder Abwesenheit von Organismen, die RNA oder DNA enthalten, zu bestimmen und biologische Proben, wie Sputum, Serum, Gewebeabstriche und andere Tierflüssigkeiten und Gewebe sowie industrielle und pharmazeutische Proben und Wasser davon umfaßt sind. Spezifische Details der Methode ändern sich in Abhängigkeit davon, ob RNA oder DNA quantifiziert wird, aber die allgemeine Methodik ist sowohl für DNA als auch für RNA die Gleiche.
Tabelle 1: Ausgewähltes überschüssiges Sondenverfahren
Sonde: Die Sonde ist eine spezifische, ausgewählte, markierte Sequenz von einem Mitglied der Bakteriengruppe B, die 10% der Basensequenz der R-RNA darstellt und vollständig mit Bakterien-R-RNA der Gruppe B, aber nicht mit R-RNA von anderen Organismen hybridisiert. Die Sande kann nicht mit sich selbst hybridisieren.
Tabelle 2: Überschüssiges R-RNA-Verfahrens die Verwendung einer ausgewählten Sonde
Sonde: Die Sonde ist eine spezifische, ausgewählte, markierte Sequenz von Bakterien der Gruppe B, die ein Zehntel der R-RNA Basensequenz eines Mitglieds der Gruppe B darstellt. Die Sonde hybridisiert vollständig mit R-RNA der Gruppe B, aber nicht mit R-RNA von anderen Organismen. Die Sonde kann nicht mit sich selbst hybridisieren.
Verwendung ausgewählter Sonden, die nur mit einem bestimmten Abschnitt der R-RNA-Sequenz von einer bestimmten Quelle komplementär sind, zum Nachweisen von R-RNA gegenüber der Verwendung von nicht-ausgewählten Sonden, die mit der gesamten R-RNA-Sequenz von einer bestimmten Quelle komplementär sind, zum Nachweisen von R-RNA.
Eine erfindungsgemäße Ausführungsform, die spezifisch ausgewählte Sonden umfasst, die nur mit einem bestimmten Abschnitt der R-RNA-Sequenzen komplementär sind, die in einem Hybridisierungsgemisch bereitgestellt werden, um R-RNA nachzuweisen, zu quantifizieren und zu identifizieren, hat wichtige Eigenschaften und Vorteile gegenüber einer ande ren erfindungsgemäßen Ausführungsform, die nicht ausgewählte Sonden oder Sequenzen, die mit der gesamten R-RNA-Sequenz komplementär sind, verwendet, um R-RNA nachzuweisen. Die Vorteile der Verwendung einer ausgewählten Sonde sowohl in der überschüssigen R-RNA als auch der überschüssigen Sondenhybridisierungsmethodiken sind unten dargelegt. Die Probleme bei der Verwendung einer vollständigen Sonde sind außerdem aufgeführt.
Die Vorteile der Verwendung einer ausgewählten Sonde gegenüber einer vollständigen R-RNA-Sonde, bei der überschüssigen Sondenhybridisierung sowie der überschüssigen R-RNA-Hybridisierung sind unten dargelegt: Vorteile des überschüssigen Sondenhybridisierungsverfahrens
Vorteile des überschüssigen R-RNA-Hybridisierungsverfahrens Probleme mit dar vollständigen Sonde Vorteile der Verwendung von ausgewählten Sonden
Veranschaulichende Ausführungsformen
Diese Erfindung kann als Beispiel dienen, um zu bestimmen, ob eine Probe ein Mitglied einer bestimmten Gruppe von Lebendorganismen enthält. Das Verfahren, das in den folgenden Beispielen beschrieben wird, ist ein Test, der verwendet werden kann, um die Gegenwart eines Mitglieds oder von Mitgliedern einer bestimmten Gruppe von Bakterien in einer Probe nachzuweisen und zu quantifizieren, sogar in der Gegenwart großer Zahlen von Organismen, die nicht Mitglieder dieser bestimmten Gruppe sind.
Wie in den Beispielen dargestellt, umfasst die Erfindung des Anmelders eine gruppenspezifische R-RNA-Sonde, die in einem Hybridisierungsgemisch bereitgestellt wird, die bei einem spezifischen Kriterium mit R-RNA von jedem Mitglied der spezifischen Gruppe von Interesse, aber nicht mit der R-RNA von anderen Organismen hybridisiert. Die Verwendung einer solchen Sonde in einem Nucleinsäurehybridisierungstest ermöglicht das Nachweisen von jedem Mitglied der spezifischen Gruppe, sogar in der Gegenwart großer Zahlen anderer Organismen.
Beispiele, die erfindungsgemäß in der Praxis durchgeführt werden, sind später aufgeführt. Jedes Beispiel beinhaltet die Herstellung einer markierten Nucleinsäuresonde, die nur mit R-RNA von Mitgliedern einer bestimmten Gruppe von Organismen hybridisiert.
Der Grundüberblick des Verfahrens, das verwendet wird, um jede Sonde herzustellen, ist wie folgt:

1. Herstellen einer markierten Nucleinsäure, die mit der R-RNA eines Mitglied der Gruppe von Interesse komplementär ist.
2. Hybridisieren dieser DNA mit R-RNA von einem Mitglied der Gruppe oder Gruppen von Organismen, die evolutionär am meisten mit der Gruppe von Organismen verwandt sind, für die die Sonde spezifisch ist. Auswählen des Abschnittes der markierten Nucleinsäure, die bei einem spezifischen Kriterium nicht mit R-RNA von einem Mitglied dieser am engsten verwandten Gruppe von Organismen hybridisiert. Dieser Abschnitt ist spezifisch für R-RNA der Organismusgruppe von Interesse und hybridisiert nicht mit R-RNA der am engsten verwandten Gruppe oder Gruppen oder jedem anderen Organismus.

Beispiel 1: Herstellung der Sonde, die mit R-RNA von jedem Bakterium hybridisiert
In einer typischen Situation werden ungefähr 10⁶ bis 10⁷ Säugerzellen in einer Gewebekulturplatte zu gleichen Zeit wachsen gelassen. von Bakterienarten, insbesondere Mitgliedern der taxonomischen Klasse Mollicutes, ist bekannt, daß sie Gewebekulturzellen verunreinigen. Mitglieder der Klasse Mollicutes, anders als die meisten anderen Bakterien, werden nicht leicht durch Antibiotika beseitigt und sind lästige Verunreinigungssubstanzen von Zellkulturen. Viele verschiedene Mollicutes-Arten sind in Gewebekulturzellen nachgewiesen worden. Wenn nur einer dieser Organismen in der Kulturplatte vorhanden ist, hat er das Potential, sogar in der Gegenwart von Antibiotika zu multiplizieren und Hunderte von Organismen pro Zelle herzustellen. Solche Organismen können die Aktivität pro Zelle ändern, wodurch die Ergebnisse verschiedener Untersuchungen und die Vermarktung von Zellkulturerzeugnissen beeinflußt werden. Stand der Technik Verfahren zum Nachweisen dieser Organismen umfassen im allgemeinen qualitative Teste, wobei die am häufigsten verwendeten Wachstumsteste, differentielle Färbungsteste und immunologische Assays sind. Obwohl die Wachstumsteste ziemlich sensitiv sind, benötigen sie 3 bis 6 Wochen. Sie haben den zusätzlichen Nachteil, dass viele Organismen nur schwer oder überhaupt nicht wachsen.
Während die tatsächliche Nachweis-Sensitivität von dem Färbungsverfahren nicht bekannt ist, ist bekannt, dass mehr als ein paar Organismen pro Zelle vorhanden sein müssen.
Immunologische Teste sind qualitative Teste, und sie umfassen die Verwendung eines Antikörpers gegenüber einer bestimmten Art. Während sie schnell durchgeführt werden können, sind sie jedoch nicht sehr sensitiv, außerdem wären viele verschiedene Antikörper erforderlich, um alle Mollicutes-Arten nachzuweisen.
Die unten beschriebene Ausführungsform des Verfahrens des Anmelders ist ein Test, der verwendet werden kann, um die Gegenwart jedes Mitglieds der Gruppe aller Bakterien, einschließlich der taxonomischen Klasse Mollicutes, nachzuweisen und zu quantifizieren, um die Gegenwart von Mollicutes in der Gewebekultur, von Bakterien in Gewebe, das gewöhnlich frei von Bakterien ist, und von Bakterien sogar in der Gegenwart von großen Zahlen von Säugerzellen nachzuweisen.
Wie in dem Beispiel dargelegt, umfasst die Erfindung des Anmelders eine spezifische R-RNA-Sonde, die mit R-RNA von jedem Bakterium komplementär, aber nicht mit Säugerzell-R-RNA komplementär ist und in einem Hybridisierungsgemisch bereitgestellt wird. Die Verwendung einer solchen Sonde in einem Nucleinsäurehybridisierungstest ermöglicht das Nachweisen von jeder Bakterienart sogar in der Gegenwart von großen Zahlen von Säugerzellen.
Eine detaillierte Beschreibung dieser erfindungsgemäßen Ausführungsform folgt:
Herstellung von R-RNA von Säuger- und Bakterienzellen
Säugerzellen werden in 0,3 M NaCl, 0,02 M Tris, pH 7,4 suspendiert. Sarkosyl wird auf eine Endkonzentration von 1% zugegeben, um die Zellen zu lysieren. Sofort nach der Lyse wird ein gleiches Volumen einer 111 Mischung aus Phenol/Chloroform zugegeben, und die resultierende Mischung wird 2 Minuten heftig geschüttelt. Die Mischung wird anschließend zentrifugiert (8000 × g, 10 Minuten), um die wässrige und organische Phase zu trennen. Die wässrige Phase wird gewonnen und zu dieser wird ein weiteres Phenol/Chloroform- Volumen gegeben. Nach dem Schütteln und Zentrifugieren wie oben wird die wässrige Phase wieder zurückgewonnen. Zu dieser werden 2 Volumen 95% Ethanol gegeben, und diese Mischung wird bei –20°C 2 Stunden gehalten, um die Ausfällung der Nucleinsäuren zu erleich tern. Anschließend wird die Mischung zentrifugiert (8000 × g, 10 Minuten), um den Niederschlag am Boden des Reagenzglases zu sedimentieren. Die Flüssigkeit wird anschließend entfernt. Die pelletisierte Nucleinsäure wird in Wasser aufgelöst. Diese Lösung wird anschließend auf 0,2 M NaCl, 5 × 10^-3 M MgCl₂, 5 × 10^-3 M CaCl₂, 0,02 M Tris (pH 7,4), 50 μg/ml Desoxyribonuclease I gebracht und bei 37°C eine Stunde inkubiert. Dann wird ein gleiches Volumen Phenol/Chloroform zugegeben und wie oben geschüttelt. Die wässrige Phase wird wie oben zentrifugiert und zurückgewonnen. Ethanol fällt die RNA wie oben aus. Die Ausfällung wird wie oben zentrifugiert und die pelletisierte RNA in Wasser aufgelöst. Diese Lösung wird auf 2 M LiCl gebracht und bei 4°C 10 bis 20 Stunden gehalten, um die Ausfällung von hochmolekularer RNA zu erleichtern.
Diese Lösung wird anschließend zentrifugiert, um den Niederschlag zu sammeln, und der Niederschlag wird in Wasser aufgelöst. Diese RNA-Präparation enthält mehr als 95% R-RNA.
Bakterielle R-RNA wird mit den folgenden Ausnahmen auf die gleiche Weise isoliert. In den Fällen, in denen ein Detergenz allein nicht die Bakterien lysiert, werden andere Mittel verwendet. Dies umfaßt gewöhnlich vorbehandeln der Bakterien mit einem Enzym (Lysozym), um sie für die Lyse durch Sarkosyl empfänglich zu machen. Nach der Lyse der Bakterien ist das verfahren der Isolierung wie oben.
Gereinigte R-RNA wird bei –70°C aufbewahrt.
Herstellung von radioaktiver DNA (³H-cDNA), die mit Mollicutis R-RNA komplementär ist.
R-RNA von der Art Mycoplasma hominis (M. Hominis), ein Mitglied der taxonomischen Klasse Mollicutes, wird als Matrize verwendet, um radioaktive cDNA, die mit M. Hominis R-RNA komplementär ist, zu synthetisieren.
Diese cDNA wird durch Ausnutzung der Fähigkeit eines Enzyms, Reverse Transkriptase, R-RNA als Matrize zu verwenden und ³H-cDNA Komplementär (cDNA) mit R-RNA herzustellen, hergestellt. Die Reaktionsmischung von Reverse Transkriptase enthält folgendes: 50 mM Tris/HCl (ph 8,3), 8 mM MgCl₂, 0,4 mM Dithiothreitol, 50 mM KCl, 0,1 mM ³H-Deoxythymidintriphosphat (50 Curie pro Millimol), 0,2 mM Deoxydadenosintriphosphat, 0,2 mM Deoxycytidintriphosphat, 0,2 mM Deoxyguanosintriphosphat, 200 μg/ml Oligodeoxyribonucleotidprimer, hergestellt von E. coli DNA, 50 μg/ml M. Hominis R-RNA und 50 Einheiten/ml AMV Reverse Transkriptase. Die Mischung wird 30 Minuten bei 40°C inkubiert. Dann wird Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) (pH 7,3), Natriumdodecylsulfat (SDS), NaCl und Glycogen auf jeweils Endkonzentrationen von 10^-2 M, 1%, 0,3 M und 100 μg/ml. Die Lösung wird anschließend mit 1 Volumen Phenol/Chloroform (1/1) gemischt und 2 Minuten heftig gerührt, anschließend zentrifugiert (8000 × g, 10 Minuten), und die wässrige Phase zurückgewonnen. Die Nucleinsäuren werden durch Zugabe von 2,5 Volumen 95%igem Ethanol ausgefällt. Der Niederschlag wird durch Zentrifugation gewonnen und in H₂0 wieder gelöst. Diese Lösung enthält die Matrize R-RNA und die neu synthetisierte 3H-cDNA.
Diese Lösung wird anschließend auf 0,3 M NaOH gebracht und 45 Minuten bei 50°C inkubiert, in Eis gekühlt und mit 0,3 M HCl neutralisiert. Zweieinhalb Volumen 95%iges EtOH werden anschließend zugegeben, um die Restnucleinsäure auszufällen, und der resultierende Niederschlag wurde in Wasser aufgelöst. Diese Lösung wurde anschließend über eine Sephadex G-100 Säule, die mit 0,3 M NaCl, 0,1% Sarcosyl äquilibriert worden war, geleitet und das ausgeschlossene Volumen wurde gewonnen. Diese Lösung wurde dann mit Ethanol ausgefällt und der resultierende Niederschlag in einem kleinen Wasservolumen gelöst. Das in diesem Abschnitt beschriebene Verfahren entfernt die Matrize R-RNA und jedes Restvorläufer-Material der ³H-cDNA Präparation.
Die ³H-cDNA wird anschließend mit M. hominis R-RNA hybridisiert, um sicherzustellen, daß sie tatsächlich mit dieser R-RNA komplementär ist. Die Hybridisierungsmischung besteht aus 0,05 μg einzelsträngiger ³H-cDNA, 20 μg M, hominis R-RNA und 0,48 M PB (Phosphatpuffer) in einem Milliliter. Diese Mischung wurde 0,2 Stunden bei 65°C inkubiert und anschließend auf 0,14 M PB verdünnt und über eine mit 0,14 M PB bei 65°C äquilibrierte Hydroxyapatit (HA)-Säule geleitet. ³H-cDNA, die mit R-RNA hybridisierte, adsorbierte an der Hydroxyapatit (HA)-Säule, während nicht-hybridisierte ³H-cDNA durch die Säule hindurchlief. Hybridisierte ³H-cDNA wurde anschließend durch Eluieren der HA-Säule mit 0,3 M PB gewonnen. Diese Fraktion wurde anschließend zum Entfernen von PB dialysiert, mit Ethanol ausgefällt, um die Nucleinsäure zu konzentrieren, zentrifugiert und die Nucleinsäure wurde in Wasser gelöst. Diese Lösung wurde anschließend mit NaOH zur Entfernung von R-RNA, wie oben beschrieben, behandelt. Nach der Neutralisierung, der Zugabe von Glucogenträger und der Konzentrierung durch Ethanolausfällung wurde ³H-cDNA in einem kleinen Wasservolumen gelöst. Diese Lösung enthält nur ³H-cDNA, die mit M. hominis R-RNA komplementär ist.
Auswählen der ³H-cDNA, die mit M. hominis RNA, aber nicht mit menschlicher R-RNA komplementär ist Gereinigte ³H-cDNA wird durch Hybridisieren mit einem großen Überschuß an menschlicher R-RNA weiter fraktioniert. Die Hybridisierungsmischung besteht aus 0,05 μg ³H-cDNA, 40 μg menschlicher R-RNA in 1 ml 0,48 M PB. Diese wird bei 68°C eine Stunde inkubiert, und die Mischung wird anschließend auf 0,14 M PB verdünnt und über eine mit 0,14 M PB auf 55°C äquilibrierte HA-Säule geleitet. Die Fraktion (ungefähr 50% der gesamten), die nicht an die HA adsorbierte (d.h., ³H-cDNA, die nicht mit menschlicher R-RNA hybridisiert) wird gesammelt. Diese Fraktion wird unter den gleichen Bedingungen wieder über eine HA-Säule geleitet. Wieder wird die nicht-adsorbierte Fraktion gesammelt. Diese Fraktion wird zum Entfernen von PB dialysiert, mit Ethanol ausgefällt, um die Nucleinsäure zu konzentrieren, und in Wasser gelöst. Diese Lösung wird zur Entfernung von R-RNA mit NaOH, wie zuvor beschrieben, behandelt. Nach der Neutralisierung, der Zugabe von Glycogenträger und der Konzentrierung durch Ethanolausfällung wird die ³H-cDNA in einem kleinen Wasservolumen gelöst. Diese ³H-cDNA Präparation ist komplementär mit M. hominis R-RNA, aber nicht mit menschlicher R-RNA.
Hybridisierung ausgewählter ³H-cDNA mit R-RNA von verschiedenen Quellen
Die Herstellung der ausgewählten ³H-cDNA Sonde ermöglicht das Nachweisen von Bakterien, einschließlich von Mitgliedern der Mollicutis-Klasse in Säugergewebezellkulturen und Säugergeweben, indem die Gegenwart von bakterieller R-RNA durch Nucleinsäurehybridisierung nachgewiesen wird. Ein notwendiges Erfordernis eines solchen Tests ist, daß die ausgewählte Sonde nicht mit R-RNA von Säugerzellen, die nicht die Bakterien enthalten, hybridisiert. Daß dieses Erfordernis erfüllt wird, ist in Tabelle 3 V gezeigt.
Tabelle 3, Teile II und III, zeigen, daß die Sonde alle Mitglieder der Mollicutis-Klasse nachweist und alle Bakterientypen nachweisen sollte. Zum Beispiel Legionella pneumonie, E. coli und Bacillus subtilis sind Beispiele sehr verschiedener Bakterientypen, und die Sonde hybridisiert mit R-RNA jeder dieser Typen. Evolutionäre Überlegungen zeigen, daß diese Sonde mit R-RNA von praktisch allen bekannten oder unbekannten Bakterien hybridisiert. Dies ist auf die sehr starke Konservierung der R-RNA-Nucleotidsequenz während der Evolution zurückzuführen.
Die ausgewählte Sonde ist nützlich zum Nachweisen der Gegenwart einer spezifischen Klasse von Bakterien, Mollicutis, in Gewebekulturzellen. In den meisten Gewebekulturzellen sind Antibiotika in dem Wachstumsmedien vorhanden, und diese verhindern das Wachstum von praktisch allen Bakterien außer Mitgliedern der Klasse Mollicutis. Folglich ist jede Verunreinigung einer Gewebekulturpräparation fast sicher auf ein Mitglied der Klasse Mollicutis zurückzuführen.
Ein wichtiger Aspekt ist die Fähigkeit, die Zahl der vorhandenen Organismen zu bestimmen. In den meisten Fällen werden Zell-Linien und ihre Erzeugnisse verworfen, wenn sich zeigt, daß Zellen – durch Stand der Technik Verfahren – verunreinigt sind. Die Fähigkeit, diese Organismen zu quantifizieren, ermöglicht es, die Schwere jeglicher Wirkungen aufgrund von Kontaminierung zu beurteilen. Der Grad der Kontaminierung kann sehr leicht sein, und es kann nur ein Organismus pro 1000 Zellen vorhanden sein. Dieser Kontaminierungsgehalt würde einen sehr geringen Einfluß auf die Zellen haben und in vielen Situationen brauchen die Zellerzeugnisse nicht verworfen zu werden. Die Entscheidung kann getroffen werden, wertvolle Zell-Linien zu behalten, bis sie schwerer kontaminiert sind. Quantitative Erwägungen sind wichtig zur Beurteilung der Bedeutung jeder Art von bakteriellen Verunreinigung. Tabelle 3: Hybridisierung ausgewählter Mollicutis 3H-cDNA mit R-RNA von sehr unterschiedlichen Quellen
Überschüssige R-RNA Hybridisierungen wurden bei 68°C, 0,48 M PB durchgeführt. Hybridisierungsassays wurden mit Hydroxyapatit bei 67°C in 0,14 M PB, 0,005% Natriumdodecylsulfat durchgeführt. Die Hybridisierungszeit ist ausreichend, um vollständige Reaktion der ³H-cDNA mit nuklearer R-RNA oder mitochondrialer R-RNA sicherzustellen. Nichtbakterielle R-RNA Cot-s von mindestens 2 × 10³ werden in dem Fall von Säugern und dem Vogel erreicht. Ein unspezifisches Signal von 1 bis 2% wurde von den oben dargestellten Hybridisierungswerten abgezogen.
Quantifizierung der R-RNA durch Nucleinsäurehybridisierung
Die Menge der in einer Probe vorhandenen bakteriellen R-RNA kann durch Messen der Kinetik der Hybridisierung der ausgewählten ³H-cDNA Sonde mit der R-RNA, die von einem Gewebe isoliert wurde, und durch Vergleich dieser Kinetik mit der einer bekannten Standardmischung bestimmt werden. Dies kann selbst in der Gegenwart eines großen Überschusses von Säugerzellen R-RNA durchgeführt werden, da die Sonde nicht mit R-RNA hybridisiert (siehe Tabelle 3, V).
Zum Messen der Kinetik enthalten die Hybridisierungmischungen 10^-5 bis 10^-4 μg ³H-cDNA und 1 bis 10³ μg gereinigte Proben R-RNA in 0,01 bis 0,1 ml 0,48 M PB. Diese Mischung wird bei 68°C inkubiert und Aliquote werden entfernt, auf 0,14 M PB verdünnt und auf Hybridisierung zu verschiedenen Zeiten nach Auslösung der Reaktion untersucht. Die Hybridisierungsassays werden unter Verwendung von Hydroxyapatit wie zuvor beschrieben durchgeführt. Die erhaltenen Ergebnisse werden mit der Hybridisierung einer Sonde, die mit einer bekannten Menge von Bakterien R-RNA enthaltenen Standard R-RNA reagiert wurde. Diese Standards sind Mischungen aus Säugerzell R-RNA und bekannten Mengen einer spezifischen Bakterien R-RNA.
Nachweisen und Quantifizieren von Mitgliedern der Klasse Mollicutis in Gewebekulturzellen
Tabelle 4 zeigt Daten, die durch Hybridisierung der ausgewählten Sonde mit isolierter R-RNA (wie zuvor beschrieben) von drei verschiedenen Gewebekulturzellproben erhalten wurden. Nur die Zell-Linie Nummer 3 war nachweislich verunreinigt, und die Kinetik der Reaktion zeigt, daß ungefähr 5 × 10⁷ Bakterienzellen in den Gewebekulturzellen vorhanden sind. Tabelle 4: Nachweis und Quantifizierung von Mollicutis in Gewebekulturzellen
Überschüssige R-RNA Hybridisierungen wurden bei 68°C in 0,48 M PB in einem Volumen von 0,01 bis 0,04 ml durchgeführt. Jede Mischung enthält 2 × 10⁵ μg ³N-cDNA Sonde und 50 bis 200 μg Proben RNA.
Das folgende Beispiel ist eine andere Ausführungsform der erfindungsgemäßen Sonde, die zum Nachweisen sehr kleiner Zahlen, sogar eines Trypanosoms, in der Gegenwart einer großen Zahl von Blutzellen verwendet wird.
Der Nachweis von Trypanosomen ist wichtig, da bestimmte Mitglieder der Protozoangruppe Trypanosoma für Menschen pathogen sind und Krankheiten verursachen, die ostafrikanische Schlafkrankheit, westafrikanische Schlafkrankheit und südamerikanische Trypasomiasis einschließen. Diese Organismen sind groß und haben unterschiedliche charakteristische Formen, in Abhängigkeit vom Stadium des Lebenszyklus. Stand der Technik Verfahrensschritt vertrauen hauptsächlich auf serologisches, differentiales Färben, das mit mikroskopischer Untersuchung und Tierimpfverfahren zum Nachweisen dieser Organismen im Menschen verbunden ist. Die serodiagnostischen Verfahren unterschieden sich in Sensitivität und Spezifizität, und es kann schwierig sein, sie zu interpretieren. Die mikroskopischen Verfahren werden am meisten verwendet, kleine Zahlen von Trypanosomen können jedoch schwer in der Gegenwart von großen Zahlen von Blutzellen nachgewiesen werden. Die Tierimpfung ist ein langwieriges und kostspieliges Verfahren.
Eine erfindungsgemäße Ausführungsform, die in den folgenden Beispielen dargelegt wird, ist eine Sonde, durch die es relativ einfach ist, die Gegenwart eines Trypanosoms nachzuweisen, selbst wenn es zusammen mit einer großen Zahl von Blutzellen vorkommt.
Beispiel 2: Herstellung von radioaktiver DNA, die mit Trypanosom RNA komplementär ist
Radioaktive DNA, die mit R-RNA komplementär ist (³H-cDNA mit Trypanosoma brucei R-RNA) wurde auf die gleiche Weise wie M. hominis ³H-cDNA, was im Detail oben beschrieben ist, hergestellt, außer daß Trypanosoma brucei R-RNA als Matrize verwendet wird.
Auswählen von Trypanosom ³H-cDNA, die mit Trypanosom R-RNA, aber nicht mit menschlicher R-RNA komplementär ist
Dies wird auf die gleiche Weise wie oben für M. hominis beschrieben durchgeführt, außer daß Trypanosoma brucei ³H-cDNA mit menschlicher R-RNA hybridisiert.
Verwendung der ausgewählten Trypanosom ³H-cDNA, um Trypsomen in menschlichem Gewebe oder Flüssigkeit nachzuweisen und zu quantifizieren
Die Herstellung der ausgewählten ³H-cDNA Sonde erlaubt den Nachweis und die Quantifizierung von Trypanosomen in menschlichen Proben durch Nachweisen der Gegenwart von Trypsomen R-RNA. Ein notwendiges Erfordernis eines solchen Tests ist, daß die ausgewählte Sonde nicht mit R-RNA von menschlichen Zellen, die keine Trypanosomen enthalten, hybridisiert.

Tabelle 5 zeigt, daß dieses Erfordernis erfüllt wird. Tabelle 5 Hybridisierung der ausgewählten Trypanosoma brucei ³HcDNA mit R-RNA verschiedener Quellen

R-RNA Quelle	Hybridisierung von ³H-cDNA mit R-RNA
	(%)
keine RNA zugegeben	1%
Trypanosoma brucei R-RNA	98%
Bakterielle R-RNA (Mycoplasma hominis)	1%
Menschliche R-RNA	1%
Menschliche R-RNA, von der bekannt ist, daß sie mit Trypanosoma brucei verunreinigt ist	98%

Überschüssige R-RNA Hybridisierungen wurden bei 65°C in 0,48 M PB durchgeführt. Die Reaktionen wurden 24 Stunden durchgeführt und die Hybridisierungszeit ist ausreichend, um die vollständige Reaktion menschlicher nuclearer oder mitochondrialer R-RNA und Bakterien R-RNA sicherzustellen. Hybridisierungsassays wurden mit Hydroxyapatit bei 72°C in 0,14 M PB, 0,005% Natriumdodecylsulfat durchgeführt.
Ein Beispiel einer Sonde, die erfindungsgemäß hergestellt wurde, ist nur für Mitglieder der Gattung Legionella spezifisch. Die Sonde hybridisiert zu mehr als 50% mit Nucleinsäuren von diversen Mitgliedern der Gattung Legionella und hybridisiert nicht bedeutend mit Nucleinsäuren von Säugern, Hefe und einer Vielzahl von sehr unterschiedlichen Bakterienstämmen (Tabelle 8). Die Sonde hybridisiert sogar sehr mit Legionella Arten, wie L. pneumophila und L. micdadei, die nur wenig oder keine starke DNA-Verwandtheit zeigen. Andere bekannte Legionella Arten können durch diese Sonde, die in Tabelle 6 verwendet wurde, nachgewiesen werden, wie in Tabelle 7 gezeigt. Alle bekannten Legionella Arten (bisher 23 verschiedene Arten) wurden untersucht und alle konnten mit der in Tabelle 6 verwendeten Sonde spezifisch nachgewiesen werden.
Die Spezifizität dieser Sonde macht es möglich, die Gegenwart von Legionella Arten nachzuweisen und zu quantifizieren, sogar in der Gegenwart großer Zahlen von nicht-verwandten Bakterien oder Säugerzellen. Folglich wurden Leberzellen eines mit L, pneumophila infizierten Hamsters auf die Gegenwart und Zahl der Legionella Organismen unter Verwendung der spezifischen Sonde und gut etablierter Nucleinsäurehybridisierungsverfahren untersucht. Die Leber wurde zuvor durch einen mikrobiologischen Wachstumstest untersucht, der anzeigte, daß ungefähr 10⁷ Legionella Organismen pro Gramm in der infizierten Leber vorhanden waren. Die Nucleinsäurehybridisierungsanalyse zeigte ungefähr 1 bis 2 × 10⁸ Legionella Organismen pro Gramm Leber. Diese Ergebnisse weisen darauf hin, daß die Plattierungswirksamkeit in dem Wachstumstest ungefähr 5 bis 10% ist.
Die spezifische Sonde ermöglicht das hochsensitive und schnelle Nachweisen von Legionella Organismen sogar in der Gegenwart von großen Zahlen von Säugerzellen. In einem Assay, das weniger als 1 Tag dauerte, wies die Sonde leicht die Gegenwart von ungefähr 400 Legionella Organismen, die mit 0,4 mg Leber (ungefähr 2 × 105 Zellen) gemischt worden war, nach. Tabelle 6: Hybridisierung der Legionella spezifischen Sonde mit Nucleinsäuren von sehr verschiedenen Quellen
Überschüssige R-RNA Hybridisierungen wurden bei 76°C, 0,48 M PB durchgeführt. Die Hybridisierungsassays wurden mit Hydroxyapatit bei 72°C in 0,14 M PB, 0,005% Natriumdodecylsulfat durchgeführt. Die Hybridisierungszeit ist ausreichend, um die vollständige Reaktion der ³HcDNA mit nuclearer R-RNA oder mitochondrialer R-RNA sicherzustellen. Nicht-bakterielle R-RNA-Cot's von mindestens 2 × 10³ werden im Fall von Säugern und Vögeln erreicht.
Tabelle 7: Andere Legionella Arten, die durch die spezifische Nucleinsäuresonde der Tabelle 7 nachgewiesen werden können
Arten

L. WA-316
L. WO-44-3C (L. feeleii)
L. Phoenix-1
L. WA-270 A
L. PF-209C-C₂
L. SC 65C3 (ORW)
L. Jamestown 26G1-E2
L. MSH-4
L. Lansing 3
L. SC-18-C9
L. SC-63-C7
L. 81-716 (L. Wadsworthii)

Beispiel 3: Herstellung einer Sonde, die nur mit R-RNA von Mitgliedern der Gattung Legionella hybridisiert
Herstellung radioaktiver DNA, die mit Legionella R-RNA komplementär ist R-RNA von der Art Legionella pneumophila wird als Matrize verwendet, um markierte (radioaktive) cDNA (komplementäre DNA), die mit Legionella pneumophila R-RNA komplementär ist, zu synthetisieren. Diese cDNA wird hergestellt unter Ausnutzung der Fähigkeit eines Enzyms, Reverse Transkriptase, R-RNA als Matrize zu verwenden und ³H-cDNA, die mit R-RNA komplementär ist, herzustellen. Dies wird auf die gleiche Weise durch geführt, wie für die Herstellung von M. hominis ³H-cDNA beschrieben, außer daß Legionella pneumophila R-RNA als Matrize verwendet wird.
Auswählen der radioaktiven Sonde, die nur mit R-RNA von Mitgliedern der Gattung Legionella hybridisiert
Gereinigte ³H-cDNA wird durch Hybridisierung mit einem großen Überschuß von R-RNA von E. coli, Acholeplasma laidlawii und Providentia stuartii fraktioniert. Die Hybridisierungsmischung besteht aus 0,5 bis 1 μg ³H-cDNA und 20 μg jeder Bakterien R-RNA in 1 ml 0,48 M PB. Diese Mischung wird eine Stunde bei 76°C inkubiert, und die Mischung wird anschließend auf 0,14 M PB verdünnt und Ober eine auf 72°C, 0,14 M PB äquilibrierte HA geleitet. Die ³H-cDNA Fraktion, die nicht an HA adsorbiert (d.h. ³H-cDNA, die nicht mit der R-RNA hybridisiert), wurde gesammelt. Diese Fraktion wurde unter den obigen Bedingungen über eine HA geleitet und die nicht-adsorbierte Fraktion wurde wieder gesammelt. Diese ³H-cDNA wurde anschließend konzentriert und mit Bakterien R-RNA wie oben beschrieben wieder hybridisiert. Die nicht-adsorbierte Fraktion wurde gesammelt und konzentriert und anschließend mit Bakterien R-RNA für ein drittes Mal, wie oben beschrieben, hybridisiert und wie oben auf HA fraktioniert. Die nicht-adsorbierte Fraktion wurde gesammelt, basenbehandelt, um jede vorhandene R-RNA zu entfernen und mit Wasser konzentriert. Diese ³H-cDNA Präparation hybridisiert mit jedem Mitglied der Legionella Gattung und nicht mit R-RNA von anderen Quellen.
Hybridisierung der Legionella spezifischen ³H-cDNA Sonde mit R-RNA und R-RNA-Genen verschiedener Quellen
Die ausgewählte Sonde erlaubt das Nachweisen jedes Mitglieds der Gattung Legionella in einer Probe, indem die Gegenwart von Legionella R-RNA durch Nucleinsäurehybridisierung nachgewiesen wird. Ein notwendiges Erfordernis eines solchen Testes ist, daß die Legionella spezifische Sonde nicht mit R-RNA von anderen Quellen hybridisiert.
Quantifizierung von Legionella R-RNA durch Nucleinsäurehybridisierung mit dem überschüssigen R-RNA-Verfahren
Die Menge der in einer Probe vorhandenen Bakterien R-RNA kann durch Messen der Kinetik der Hybridisierung der ausgewählten ³H-cDNA Sonde mit R-RNA, die von einer Gewebeprobe isoliert wurde, und durch Vergleichen dieser Kinetik mit der einer bekannten Standardmischung bestimmt werden. Dies kann in Gegenwart eines großen Überschusses von Säugerzell R-RNA durchgeführt werden, da die Sonde nicht mit dieser R-RNA hybridisiert.
Zum Messen der Kinetik kann die Hybridisierungsmischung zum Beispiel 10^-5 bis 10^-4 μg 3H-cDNA und 0,01 bis 10³ μg gereinigte Proben-RNA in 0,01 bis 0,1 ml 0,48 M PB enthalten. Diese Mischung wird bei 76°C inkubiert, Aliquote werden entfernt, auf 0,14 M PB verdünnt und auf Hybridisierung zu verschiedenen Zeiten nach dem Auslösen der Reaktion untersucht. Die Hybridisierungsassays wurden unter Verwendung von Hydroxyapatit, wie zuvor beschrieben, durchgeführt. Die erhaltenen Ergebnisse sind mit der Hybridisierungskinetik der Sonde verglichen worden, die mit Standard R-RNA, enthaltend bekannte Mengen Bakterien R-RNA, reagiert wurde. Diese Standards sind Mischungen aus Säugerzellen R-RNA und bekannten Mengen einer spezifischen Bakterien R-RNA.
Tabelle 8 zeigt Daten der Quantifizierung von in Wasserproben und in einer identifizierten Hamsterleberprobe enthaltenem Legionella pneumophila. Die Wasserproben und Leberproben wurden auf Gegenwart von L. pneumophila durch standardquantitative Wachstumsassays am Centers for Disease Control in Atlanta, Georgia, titriert. Tabelle 8
Überschüssiges Sondenverfahren
Die Menge der in einer Probe vorhandenen Bakterien R-RNA kann außerdem durch Hybridisierung gemessen werden unter Bedingungen, bei denen ein Überschuß von Legionella spezifischer ³H-cDNA Sonde im Verhältnis zu der Menge der vorhandenen Legionella R-RNA vorliegt. Diese Mischung wird bis zum Abschluß hybridisiert. Zu diesem Zeitpunkt ist jedes in der Probe vorhandene Legionella R-RNA Molekül mit Sondenmolekülen gesättigt. Durch Vergleichen der Menge der mit der R-RNA hybridisierten Sonde mit einer geeigneten konstruierten Standard-Kalibrierungskurve kann die Menge der R-RNA in einer Probe bestimmt werden. Eine gute Schätzung der gesamten Zahl von in der Probe vorhandenen Legionella pneumophila Bakterien kann anschließend berechnet werden, indem die durchschnittliche Zahl der R-RNA-Moleküle pro L. pneumophila Bakterium bekannt ist.
Die Tabelle 9 zeigt Daten zur Quantifizierung von in Wasserproben vorkommenden L. pneumophila, die durch das Verfahren der beschleunigten Hybridisierungsrate der überschüssigen Probe-Enzym-Detergenz-Probe, das in einem späteren Abschnitt detaillierter beschrieben wird. Die Wasserproben wurden auf die Gegenwart von F. pneumophila durch Standard quantitative Wachstumsteste titriert. Es erfordert Tage, diese Assays abzuschließen, während das Hybridisierungsassay ungefähr eine Stunde braucht. Tabelle 9
Sonde, die nur für R-RNA von Mitgliedern der Gattung Legionella spezifisch ist
A. Analyse der Wasserprobe: Verfahren der beschleunigten Hybridisierungsrate

1. Herstellung der Probe und Hybridisierungs-Inkubationsmischung so schnell wie möglich in der folgenden Reihenfolge. a) 9 μl Probe b) 2 μl Enzym-Detergenz-Lösung, enthaltend: 5 mg/ml Proteinase K, 0,5 M Tris (pH 8,1), 8% Natriumdodecylsulfat (SDS), 4% Natriumsarcosinat, 0,25 M NaCl, 0,016 M EDTA, 0,016 M EGTA c) 1 μl der in Wasser gelösten Sonde d) 20 μl 4,8 M PB
2. Inkubieren der Mischung bei 76°C für einen geeigneten Zeitraum, so daß die Hybridisierungsreaktion abgeschlossen ist.
3. Das Hybridisierungsassay wird wie folgt durchgeführt: a) Zugeben der Inkubationsmischung zu 1 ml einer Raumtemperaturwarmen Lösung, enthaltend: 0,05 g Hydroxyapatit (HA), 0,054 M PB, 0,02% Zwittergent^®14 (CalBiochem)(hiernach mit Z-14 bezeichnet). b) 30 Sekunden Schütteln der Mischung bei Raumtemperatur, Zugeben von 5 ml 0,14 M PB, 0,02% Z-14 und Inkubieren der Mischung bei 72°C. c) Zentrifugieren der Lösung, um HA zu pelletisieren. Alle Zentrifugationen wurden bei Raumtemperatur durchgeführt. Abgießen und Zurückbehalten der flüssigen Fraktion. Dies ist die Waschflüssigkeit 1. d) Zugeben von 0,14 M PB, 0,02% Z-14 Lösung zu dem Pellet. Suspendieren des HA-Pellets, indem es gewirbelt wird. Zentrifugieren, um HA zu pelletisieren und Abgießen und Aufbewahren der flüssigen Fraktion. Dies ist die Waschflüssigkeit 2. e) wiederholen des Schritts d. Dies ist Waschflüssigkeit 3. f) Zugeben von 6 ml 0,03 M PB und Suspendieren des HA-Pellets durch Wirbeln. Zentrifugieren der Suspension, um HA zu pelletisieren und Abgießen der Flüssigkeit und Untersuchen auf die Gegenwart der Sonde. Diese Fraktion enthält die hybridisierte Sonde, wenn welche vorhanden ist.

Es ist nicht notwendig, die hybridisierte Sonde von HA unter bestimmten Bedingungen zu eluieren, wenn die Sonde mit einem Markierungsstoff markiert ist, der in Gegenwart von HA nachgewiesen werden kann, kann folglich das Pellet aus Schritt e) direkt auf die Sonde untersucht werden. Im Fall eines Markierungsstoffes, wie Jod125, kann das das HA-Pellet enthaltende Reagenzglas direkt in ein Gamma-Nachweisgerät eingeführt werden.
Andere Modifizierungen können außerdem gemacht werden, um den Test schneller und leichter zu machen. Das Volumen und die verwendete HA Menge kann verringert werden und die Zahl der Waschvorgänge kann auch verringert werden, in Abhängigkeit von der Situation. In einem anderen Fall kann es wünschenswert sein, das HA Volumen oder die Zahl der Waschvorgänge zu erhöhen. Eine Vielzahl von Salzen außer Natriumphosphat und andere Detergenzien können außerdem in diesem Assay verwendet werden.
B. Analyse einer flüssigen Proben Verfahren der Standardhybridisierungsrate

1. Herstellung der Probe und einer Hybridisierungs-Inkubationsmischung. In der folgenden Reihenfolge werden so schnell wie möglich gemischt: a) 14 μl Probe b) 2 μl Enzym-Detergenz-Lösung, beschrieben in A c) 1 μl Sonde d) 3 μl 3,2 M PB 0,03 M EDTA, 0,03 M EGTA
2. Inkubieren der Mischung bei 76°C für einen geeigneten Zeitraum, so daß die Hybridisierung zum Abschluß gekommen ist.
3. Das Hybridisierungsassay wird wie folgt durchgeführt: a) Zugeben der Inkubationsmischung zu 1 ml einer Lösung, enthaltend: 0,14 M PB, 0,02% Z-14, 0,05 g HA b) Von diesem Punkt ab ist das Protokoll identisch mit dem in A beschriebenen.

C. Analyse einer Gewebeprobe: Verfahren der beschleunigten Hybridisierungsrate
Ein 10%iges Leberhomogenat in Wasser wird als Gewebeprobe verwendet.

1. Herstellung der Probe und der Inkubationsmischung. In der folgenden Reihenfolge werden so schnell wie möglich gemischt: a) 8 μl Probe (10% Leberhomogenat) b) 3 ml Enzym-Detergenz-Lösung, enthaltend: 8% SDS, 4% Natriumsarcosinat, 0,25 M NaCl, 0,016 M EDTA, 0,016 M EGTA, 0,38 M Tris (pH 8,2), 195 mg/ml Pronase^® c) 1 μl Sonde, die nur für Legionella R-ANA spezifisch ist d) 20 μl 4,8 M PB
2. Inkubieren der Mischung bei 76°C für einen geeigneten Zeitraum, um sicherzustellen, daß die Hybridisierungsreaktion abgeschlossen ist.
3. Das Hybridisierungsassay wird wie in dem Abschnitt über die Analyse einer Wasserprobe beschrieben durchgeführt; Verfahren der beschleunigten Rate.

D. Analyse einer Gewebeprobe: Verfahren der Standard-Hybridisierungsrate
Ein 10%iges Leberhomogenat in Wasser wird als Probe verwendet.

1. Herstellung der Probe und der Inkubationsmischung. In der folgenden Reihenfolge werden so schnell wie möglich gemischt: a) 12 μl Probe b) 4 μl Enzym-Detergenz-Lösung, beschrieben in B c) 1 μl Sonde, die nur spezifisch für Legionella R-RNA ist d) 3 μl 3,2 M PB, 0,03 M EDTA, 0,03 M EGTA.
2. Inkubieren der Mischung bei 76°C.
3. Das Hybridisierungsassay wird wie folgt durchgeführt: a) Zugeben der Inkubationsmischung zu 1 ml einer Lösung, enthaltend: 0,14 M PB, 0,02% Z-14, 0,05 g HA b) von diesem Punkt ab ist das Assay identisch mit dem in A beschriebenen.

Eine detaillierte Beschreibung der Tests der Nucleinsäurehybridisierung, um Legionella pneumophila Bakterien in Wasser und Leberproben nachzuweisen, wird unten erläutert.
Beispiel 4: Schneller sensitiver Nachweis von Legionella Bakterien in Wasser
Probe: Verfahren der beschleunigten Rate

1. Die folgenden Komponenten werden so schnell wie möglich in der folgenden Reihenfolge gemischt: a) 4,5 μl Wasserprobe, enthaltend ungefähr 105 Legionella pneumophila Bakterien pro ml. Die Zahl der Bakterien im Wasser wurde am Centers for Disease Control in Atlanta durch einen Wachstumstest bestimmt. b) 1 μl der Enzym-Detergenz-Lösung, beschrieben in A. c) 0,5 μl Legionella spezifische Sonde. Die Menge der Sonde gleicht 7,5 × 10^-6 μg. d) 10 μl 4,8 M PH Das Zusammensetzen der Hybridisierungsmischung erfordert ungefähr 2 Minuten.
2. Inkubieren der Mischung 36 Minuten bei 76°C.
3. Durchführen des Hybridisierungsassays wie in A beschrieben. Dies erforderte ungefähr 5 Minuten.
4. Untersuchen der Fraktionen auf die Gegenwart der Sonde. Dies erforderte ungefähr 10 Minuten.

Die Zahl der in der Hybridisierungsmischung vorhandenen Legionella Bakterien betrug ungefähr 500. Diese Zahl von Organismen wurde in ungefähr 1 Stunde vom Start bis zum Ende unter Verwendung von weniger als 10^-5 μg der Sonde nachgewiesen und quantifiziert. 23% der Sonde hybridisierte mit der Legionella R-RNA in diesem Test, der so konstruiert wurde, daß er ein überschüssiger Sondenhybridisierungstest ist. Der obige Test kann so modifiziert werden, daß große Volumen auf die Gegenwart von Legionella Bakterien untersucht werden. 1 ml einer Wasserprobe, enthaltend 10⁴ Legionella Bakterien pro ml wurde folglich 30 Minuten zen trifugiert, um die Bakterien zu pelletisieren. Eine kleine Menge des Enzym-Detergenz wurde zu dem Pellet gegeben, und ein Hybridisierungstest wurde mit dieser Mischung unter Verwendung des Verfahrens der beschleunigten Rate durchgeführt, und die Legionella Bakterien wurden einfach bestimmt. Viel größere Probenvolumen können zentrifugiert werden und andere verfahren zum Konzentrieren der Bakterien, einschließlich Membranfiltration, können außerdem verwendet werden. Diese Modifizierungen machen es möglich, eine kleine Zahl von Bakterien in einem großen Probenvolumen nachzuweisen. Luftproben können auch durch Verfahren konzentriert werden, einschließlich der Membranfiltrationsverfahren, und kleine Bakterienzahlen können in großen Luftprobenvolumen nachgewiesen werden.
Beispiel 5: Schneller, sensitiver Nachweis von Legionella Bakterien in einer Hamsterleberprobe

1. Die folgenden Komponenten wurden so schnell wie möglich in der folgenden Reihenfolge gemischt: a) 4 μl von einem 10%igen Leberhomogenat einer mit Legionella pneumophila infizierten Hamsterleber. Dies ist äquivalent mit 400 μg Leber oder ungefähr 6 × 10⁴ Leberzellen. Ungefähr 750 Legionella pneumophila waren in dieser Probe vorhanden. b) 4 ml der Enzym-Detergenz-Lösung, zusammengesetzt aus 45 mg/ml Proteinase K, 8% SDS, 4% Natriumsarcosinat, 0,5 M Tris (pH 8,2), 0,008 M EDTA, 0,008 M EGTA, 0,25 M NaCl. c) 4 μl der Legionella spezifischen Sonde. Die Menge der Sonde betrug ungefähr 10^-5 μg.
2. 3 Stunden Inkubieren der Mischung bei 76°C.
3. Durchführen des Hybridisierungsassays wie in A beschrieben.
4. Untersuchen der resultierenden Fraktionen auf die Gegenwart der mit Legionella R-RNA hybridisierten Sonde.

Die Zahl der in der Hybridisierungsmischung vorhandenen Legionella Bakterien betrug ungefähr 750, und die Menge der in dieser Zahl von Legionella Zellen vorhandenen R-RNA betrug ungefähr 1,1 × 10-5 μg. Die Zahl der vorhandenen Leberzellen betrug ungefähr 6 × 10⁴, und die Menge vorhandener Leber R-ANA betrug ungefähr 1 μg. 10% der Legionella spezifischen Sonde hybridisierte. Kontrolltests wurden mit nichtinfizierter Leber auf die gleiche Weise durchgeführt und weniger als 1% dieser Sonde verhielt sich, als wenn sie hybridisiert. Die Beispiele 4 und 5 stellen nur zwei der vielen möglichen Konfigurationen eines solchen Testes dar. Teste, die verschiedene Volumen, Salze, Detergenzien, Sonden, Probentypen, proteolytische Enzyme, HA Mengen, Inkubationszeiten, Organismustypen, Sondenmengen, Temperaturen der Inkubation und beschleunigende Systeme der Hybridisierungsrate können erfolgreich innerhalb des allgemeinen Kontextes der hier beschriebenen Teste verwendet werden. Jede der R-RNA-Sonden kann in einem System vergleichbar mit den oben beschriebenen verwendet werden. Sonden, die keine R-RNA-Sonden sind, können außerdem mit guter Wirkung in diesen Systemen mit einigen Modifizierungen verwendet werden. Zum Beispiel kann ein Test, der für eine bestimmte DNA-Sequenz in einem spezifischen Organismus oder Gruppe von Organismen spezifisch ist, exakt wie oben beschrieben durchgeführt werden, wenn ein Schritt eingeschlossen wird, der doppelsträngige DNA in die einzelsträngige Form umwandelt. In anderen Fällen müssen unterschiedliche Modifizierungen des Verfahrens verwendet werden. Es ist schwierig, Bakterien, wie Mycobakterien und Bacilli aufzubrechen. Ein Schritt, der diese Bakterien aufbricht, muß anschließend in Kombination mit dem oben beschriebenen verfahren verwendet werden. Eine einzelne Inkubation mit dem Enzym Lysozym macht zum Beispiel in Abwesenheit von Detergenzien die meisten Bacillus Bakterien empfänglich für die Lyse durch Detergenzien. Auf der anderen Seite ist es sehr schwierig, Mycobakterien zu lysieren, und sie müssen vielleicht physisch aufgebrochen werden, bevor sie untersucht werden können.
Eine Modifizierung des obigen Verfahrens kann außerdem in Verbindung mit jeder Transfer R-RNA-Sonde oder einer Sonde, die für eine andere in einem Organismus vorhandene R-RNA spezifisch ist, verwendet werden.
Ein Schritt, der darauf gerichtet ist, kleine Bakterienzahlen oder andere Zellen aus einem großen Probenvolumen, wie Luft oder Flüssigkeit, zu konzentrieren, kann außerdem in Verbindung mit dem Hybridisierungstest verwendet werden, um die meisten anderen bakteriellen Organismen oder andere Typen von Organismen nachzuweisen.
Während oben im Detail die Herstellung und Verwendung einer Nucleinsonde beschrieben ist, die nur mit Nucleinsäuren von Mitgliedern der Gattung Legionella hybridisiert, ist für den Fachmann aus diesem Beispiel und den anderen offensichtlich, daß andere Sonden auf Basis der oben veranschaulichten verfahren hergestellt werden können. Folglich würde das verwendete Verfahren, um solche anderen Sonden herzustellen, wie folgt sein:

1. Herstellen markierter Nucleinsäure, die komplementär mit der R-RNA von einem Mitglied der Gruppe von Interesse ist.
2. Hybridisieren dieser DNA mit der R-RNA von einem Mitglied der Gruppe von Organismen, die evolutionär am engsten verwandt mit der Gruppe von Organismen ist, für die die Sonde spezifisch ist. Auswählen der Fraktion der markierten Nucleinsäure, die bei einem spezifischen Kriterium nicht mit R-RNA von einem Mitglied dieser am engsten verwandten Gruppe von Organismen hybridisiert. Diese Fraktion ist spezifisch für die Organismusgruppe von Interesse. Beispiele davon sind:
a) Die Herstellung einer markierten Sonde, die nur mit R-RNA von einem Mitglied der Bakteriengattung Leptospira und nicht mit R-RNA von anderen Quellen hybridisiert.
b) Die Herstellung einer markierten Sonde, die nur mit R-RNA von einem Mitglied der Bakteriengattung Mycoplasma und nicht mit R-RNA von anderen Quellen hybridisiert.
c) Die Herstellung einer markierten Sonde, die nur mit R-RNA von einem Mitglied der Bakteriengattung Enterobacteriaceae und nicht mit R-RNA von anderen Quellen hybridisiert.
d) Die Herstellung einer markierten Sonde, die nur mit R-RNA von einem Mitglied der anaeroben Gruppe von Bakterien und nicht mit R-RNA von anderen Quellen hybridisiert.
e) Die Herstellung einer markierten Sonde, die nur mit R-RNA von einem Mitglied der Gruppe Fungi und nicht mit R-RNA von anderen Quellen hybridisiert.
f) Die Herstellung einer markierten Sonde, die nur mit R-RNA jedes Mitglieds der Chlamydia Gruppe und nicht mit R-RNA von anderen Quellen hybridisiert.
g) Die Herstellung einer markierten Sonde, die nur mit R-RNA jedes Mitglieds der Bakterien-Familie Mycobacteriaceae und nicht mit R-RNA von anderen Quellen hybridisiert.
h) Die Herstellung einer markierten Sonde, die mit R-RNA jedes Lebendorganismus hybridisiert.
i) Die Herstellung einer markierten Sonde, die nur mit R-RNA von einem Säuger und nicht mit R-RNA von anderen Quellen hybridisiert.

Ein Ausführungsbeispiel der Verwendung von Sonden, die für psRNA spezifisch sind, um Organismen oder Zellen nachzuweisen, zu quantifizieren und zu identifizieren
Sonden, die für psRNA spezifisch sind, können auf eine Weise analog zu denen für R-RNA verwendet werden, um eine spezifische große oder kleine Gruppe von Organismen oder Zellen nachzuweisen, zu identifizieren und zu quantifizieren. Da die evolutionäre Konservierung der einzelnen Gene, die solche verschiedenen R-RNA herstellen, stark variiert, ist es möglich, Sonden herzustellen, die Mitglieder einer sehr großen Klasse von Organismen nachweisen und Sonden, die Mitglieder von ziemlich kleinen Klassen von Organismen oder Zellen nachweisen.
Ein Beispiel umfaßt bestimmte Gensequenzen, die psRNA codieren und während der Evolution nicht konserviert wurden. Solche Gensequenzen einer Art von Organismus hybridisieren nicht mit DNA von entfernt verwandter Arten. Eine Sonde, die für eine bestimmte psRNA-Sequenz spezifisch ist, oder eine Population verschiedener psRNA-Sequenzen von einem Organismustyp können verwendet werden, um Mitglieder einer kleinen Gruppe von eng verwandten Organismen nachzuweisen, zu quantifizieren und zu identifizieren.
Ein anderes Beispiel ist die Entwicklung einer für eine Sequenz oder Sequenzen von psRNA spezifische Sonde, die verwendet werden kann, um Körperflüssigkeiten auf spezifische Zellschädigung und Zerstörung zu untersuchen. Bei bestimmten Krankheiten werden Zellen zerstört und ihr Inhalt einschließlich der Zellnucleinsäuren wird in das zirkulierende Blut freigesetzt. Leberschädigung aufgrund von Hepatitis ist ein solcher Zustand, und es ist bekannt, daß DNA sowie RNA als Ergebnis der Zellschädigung von Leberzellen in das zirkulierende Blut eindringen. Eine Sonde kann hergestellt werden, die spezifisch für eine R-RNA-Sequenz oder Sequenzen, die nur charakteristisch für Leberzellen sind und nicht in anderen normalen Zelltypen vorkommen, ist. Das Vorhandensein solcher R-RNA ist sehr bekannt. Diese Probe kann anschließend verwendet werden, um leberspezifische psRNA-Sequenzen in Blutproben durch Methodiken der Nucleinsäurehybridisierung, wie hier beschrieben, nachzuweisen, zu identifizieren und zu quantifizieren. – Das Auftreten von Leberschädigung und ihr Ausmaß können bestimmt werden, da die im Blut vorhandene R-RNA Menge das Ausmaß der Zellschädigung reflektiert.
Sonden, die für eine bestimmte psRNA-Sequenz oder Sequenzen spezifisch sind, die nur in einer spezifischen Art von Leberzelle vorkommen, können außerdem hergestellt und verwendet werden, um die Gegenwart der RNA-Sequenzen als Folge der Schädigung einer spezifischen Leberzellart im Blut nachzuweisen und zu quantifizieren. Je häufiger die spezifische RNA-Sequenz in einer Leberzelle ist, desto höher ist selbstverständlich die Nachweis-Sensitivität der R-RNA.
Die Schädigung eines jeden Körpergewebes oder Organs (einschließlich Herz, Niere, Hirn, Muskel, Pankreas, Milz usw.) kann auf diese Weise nachgewiesen und quantifiziert werden. Andere Körperflüssigkeiten, einschließlich Rückenmarksflüssigkeit und Urin können außerdem auf die Gegenwart dieser spezifischen R-RNA untersucht werden.
Ein nützlicher anfänglicher Screeningtest für Gewebeschädigung von jeder Quelle kann unter Verwendung einer für R-RNA spezifischen Sonde und Untersuchen von Blut oder anderen Körperflüssigkeiten auf die Gegenwart von R-RNA-Sequenzen durchgeführt werden. Die Quantifizierung der vorhandenen R-RNA liefert einen Hinweis über das Ausmaß der Zellschädigung, ohne die Quelle zu identifizieren.
Die obigen Beispiele zur Verwendung von Nucleinsäuresonden, die für bestimmte Sequenzen oder Populationen von Sequenzen von psRNA spezifisch sind, zum Zweck des Nachweisens, Identifizierens und Quantifizierens bestimmter Gruppen von Organismen oder Zellen, enthaltend solche psRNA-Sequenzen, durch Nucleinsäurehybridisierungsverfahren sind nur veranschaulichend, aber nicht beschränkend.
Die Bestimmung der Sensitivität von Mikroorganismen gegen antimikrobielle Mittel
Eine große Zahl von verschiedenen klinischen Situationen erfordern die Bestimmung von antimikrobiellen Mitteln, die für eine Vielzahl von verschiedenen Bakterien und Antibiotika empfänglich sind (siehe "Antibiotics in Laboratory Medicine" von V. Lorian, Herausgeber; Veröffentlichung: Williams and Wilkens, Baltimore, 1980). Alle diese Situationen verwenden ein Verfahren zum Bestimmen und Quantifizieren spezifischer Klassen von Mikroorganismen. In vielen dieser verfahren würde die Verwendung der zuvor beschriebenen Nucleinsäurehybridisierungstests die Bestimmung der Sensitivität gegen antimikrobielle Mittel stark beschleunigen.
Da die Organismen in einer Probe wachsen und sich teilen, erhöht sich die RNA-Menge in der Kultur. Eine Verdoppelung der Organismen filtert zu einer zweifachen Erhöhung der RNA-Menge der verschiedenen Typen, die in der Kultur vorhanden sind. Folglich kann das Wachstum des Organismus durch Bestimmen der in der Kultur vorhandenen RNA-Menge zu verschiedenen Zeiten nach dem Beginn der Wachstumsinkubation verfolgt werden. Eine Erhöhung der vorhandenen RNA-Menge mit der Zeit zeigt das Wachstum des Organismus an. Die Größe der Erhöhung zeigt das Ausmaß des Wachstums an. Die Wachstumsrate ist dann der Wachstumsgrad pro Zeitdauer. Sonden, die für R-RNA oder psR-RNA spezifisch sind, können einzeln oder in Kombination verwendet werden, um das Wachstum von Organismen zu messen, da sich die Menge jeder dieser RNA in einer Kultur sich mit dem Wachstum der Organismen erhöhen wird.
Eine Kultur einer spezifischen Klasse von Organismen, die in der Gegenwart eines Mittels oder von Mitteln wachsen gelassen wurden, die vollständig das Wachstum hemmen, werden keine RNA Erhöhung mit der Zeit zeigen, während Kulturen, die teilweise durch ein solches Mittel gehemmt werden, eine niedrige RNA Anhäufungsrate zeigen werden. Eine Kultur, die nicht gehemmt wird, wird die gleiche Rate der RNA Erhöhung, wie die Kontrollkultur zeigen, die das Mittel nicht enthält.
Ein Beispiel dafür ist die Bestimmung der Empfänglichkeit von in einer klinischen Sputumprobe vorhandenem Mycobacterium tuberculosis. Der erste Schritt beim Diagnostizieren einer solchen Probe ist, einen direkten Abstrich vom Sputum zum Färben herzustellen, um Säure-feste Bacilli nachzuweisen. Schätzungsweise sind mindestens 10⁴ bis 10⁵ M. tuberculosis Organismen pro ml Sputum erforderlich, um einen positiven direkten Abstrich zu ergeben. Jedoch werden nur 10 bis 100 dieser Organismen durch Kulturwachstumsverfahren gewonnen.
Wenn die Sputumprobe einen positiven Abstrich zeigt, wird die Probe anschließend behandelt, um alle Bakterien, außer Mycobacterien, abzutöten und eine verdünnte behandelte Probe wird auf einem Agarmedium, enthaltend antimikrobielles Mittel, und auf einem Kontroll-Agar, das das Mittel nicht enthält, plattiert. Lebende einzelne Bakterien bilden Kolonien auf dem Kontroll-Agar, während das Wachstum auf dem Agar mit dem geeigneten antimikrobiellen Mittel gehemmt wird. Das Zahlenverhältnis des Organismus auf dem Kontroll-Agar gegenüber denen mit dem Mittel behandelten Agar ist dann ein Maß der Wirksamkeit des antimikrobiellen Mittels.
Eine kleine Kolonie enthält mindestens 10⁶ Bakterien. Dies bedeutet, daß mindestens 20 Teilungen zur Bildung einer Bakterienkolonie benötigt werden, und jede Teilung erfordert mindestens 12 Stunden, d.h. 240 Stunden oder 10 Tage werden mindestens benötigt. In den meisten Fällen braucht es zwei bis viermal so lange (3 bis 6 Wochen), bis Kolonien auftreten.
Ein zuvor beschriebenes Verfahren für Legionella verringert die Zeit bedeutend, die zum Bestimmen der Empfänglichkeit des antimikrobiellen Mittels benötigt wird. Eine Sonde, die nur für R-RNA von Mitgliedern der Gattung Mycobacterien spezifisch ist, kann in einem solchen Test verwendet werden. Eine solche Sonde erlaubt die Quantifizierung und eine Nachweis-Sensitivität, ähnlich wie zuvor für Legionella beschriebenen. Ein Nucleinsäurehybridisierungstest unter Verwendung der Bedingungen der beschleunigenden Hybridisierungsrate und der überschüssigen Sonden-Hybridisierung erlaubt den leichten Nachweis von ungefähr 200 Mycobacterienzellen. Ein Schritt wird hinzugefügt, um die Zerstörung der Mycobacterienzellen sicherzustellen, so daß die R-RNA frei ist, um zu hybridisieren. Mycobacterien hybridisieren nicht leicht in der Gegenwart von Enzym-Detergenz-Lösungen.
wie oben erwähnt, enthält eine minimale positive Sputumprobe (wie durch Säurefärbung bestimmt) ungefähr 10⁴ bis 10⁵ Mycobacterienzellen pro ml und 10 bis 10² Zellen können als Kolonie bildende Einheiten nachgewiesen werden. Für Studien der Sensitivität von Medikamenten auf Agar werden ausreichend Mycobakterien zu den Kontroll- und experimentellen Agaroberflächen gegeben, um sicherzustellen, daß 40 bis 50 Kolonien auf dem Kontroll-Agar, auf dem kein antimikrobielles Mittel vorhanden ist, auftreten. wenn bei der Verwendung eines Nucleinsäurehybridisierungsassays eine solche Vorgehensweise befolgt wird, bedeutet dies, daß die Kultur mit ungefähr 50 Mycobacterien beginnt und dann ungefähr 3 bis 4 Zellteilungen oder ungefähr 2 bis 3 Tage benötigt werden, um einen nachweisbaren Gehalt von Zellen zu erhalten. Wenn eine deutliche Wachstumsinhibierung durch das Mittel aufgetreten ist, ist die Kontrolle positiv, und die Kultur, die das Mittel enthält, ist negativ. Es ist klar, daß die Verwendung des hochsensitiven Nucleinsäurehybridisierungsverfahrens die Zeit bedeutend verringert, die benötigt wird, um die Empfänglichkeit zu bestimmen, und zwar 5 bis 10fach.
Das vorhergehende ist nur ein Beispiel der Möglichkeiten der Verwendung von Nucleinsäurehybridisierungstests – wie für Legionella beschriebene – zur Bestimmung der Sensitivität gegen antimikrobielle Mittel. Die Sensitivität jedes Mikroorganismus kann durch die Verwendung einer Kombination von 5tandard-Wachstumsmethodiken und eines Assays für Mikroorganismen, der auf der Nucleinsäurehybridisierung basiert, bestimmt werden. In vielen Fällen erlauben außerdem die Spezifität und Sensitivität der Nucleinsäurehybridisierungstests für Mikroorganismen die Bestimmung der antibiotischen Sensitivität von spezifischen Organismen, sogar in der Gegenwart eines großen Überschusses von anderen Mikroorganismen oder eukaryontischen Zellen.
Es ist offensichtlich, daß die gleiche Methode verwendet werden kann, um die Gegenwart von Antimikroorganismus-Aktivität in Blut, Urin, anderen Körperflüssigkeiten und -Geweben und anderen Proben zu bestimmen. In diesem Fall kann das erfindungsgemäße Nucleinsäurehybridisierungsverfahren verwendet werden, um die Wirkung der Blut-, Urin- oder anderen Probe auf das Wachstum einer spezifischen Gruppe von Organismen, die mit der besagten Blut-, Urin- oder anderen Probe unter Bedingungen in Berührung gebracht wurden, bei denen Wachstum auftritt, wenn antimikrobielle Aktivität nicht vorhanden ist, zu beobachten und zu quantifizieren.
Ein Verfahren zur Bestimmung des Wachstumsstadiums der Zelle
Die gesamte Rate der Proteinsynthese in einer Zelle wird durch die Zahl der Ribosomen pro Zelle bestimmt. Die Rate der t-RNA-Synthese steht außerdem mit der Zahl von Ribosomen pro Zelle in Beziehung. Die Hemmung der Proteinsynthese in einer Zelle führt zu der Einstellung der R-RNA-Synthese durch die Zellen. Tatsächlich führt die Beendigung des Zellwachstums durch jedes Mittel zu der Einstellung der R-RNA-Synthese, und die Verlangsamung des Zellwachstums führt zu einer Verringerung der R-RNA-Synthese.
Die neu synthetisierten R-RNA-Moleküle sind größer als die Summe der reifen R-RNA-Untereinheiten, die in dem Ribosom vorhanden sind. Zum Beispiel wird die R-RNA von E. coli als ein 6000 Basen langes Vorläufermolekül synthetisiert. Das Vorläufermolekül wird anschließend weiterverarbeitet, um R-RNA-Untereinheiten (insgesamt ungefähr 4500 Basen), die anschließend in die Ribosomen eingeführt werden, und "extra" oder Vorläufer-spezifische RNA (ps R-RNA) Sequenzen, die schließlich durch die Zelle abgebaut werden, zu ergeben R-RNA wird in nicht-wachsenden Zellen nicht synthetisiert und daher sind in diesen Zellen keine spezifischen R-RNA-Vorläufersequenzen vorhanden. In diesem Fall sind viele R-RNA-Moleküle in der Zelle vorhanden, aber keine ps R-RNA Sequenzen.
In einer langsam wachsenden Zelle wird eine kleine R-RNA-Vorläufermenge synthetisiert und eine kleine psR-RNA-Menge ist vorhanden.
In einer schnell wachsenden Zelle wird eine große R-RNA-Vorläufermenge synthetisiert und mehrere tausend psR-RNA-Sequenzen sind vorhanden. Die Abwesenheit von psR-RNA in einer Zelle bedeutet, daß die Zelle nicht wächst. Das Verhältnis von R-RNA zu psR-RNA in einer Zelle ist ein Hinweis auf die Wachstumsrate einer Zelle.
Antimikrobielle Mittel inhibieren das Zellwachstum. Zellen, die nicht durch das Mittel wachstumsgehemmt sind, enthalten große psR-RNA-Mengen. In Zellen, die nur teilweise wachstumsgehemmt sind, ist psR-RNA in einer kleinen Menge vorhanden. Das Verhältnis von R-RNA zu psR-RNA gilt als Maß des Hemmungsgrades.
Eine Nucleinsäuresonde, die für psR-RNA-Sequenzen einer bestimmten Gruppe von Mikroorganismen spezifisch ist, kann in einem Nucleinsäurehybridisierungstest verwendet werden, um die Gegenwart oder Abwesenheit von psR-RNA in solchen Mikroorganismen zu bestimmen und zu quantifizieren, wenn die Organismen in der Gegenwart und Abwesenheit eines bestimmten antimikrobiellen Mittels oder einer Gruppe solcher Mittel wachsen gelassen werden. Dies kann sogar in der Gegenwart von großen Zahlen von Organismen durchgeführt werden, die nicht mit der Gruppe von Mikroorganismen von Interesse verwandt sind.
Es ist offensichtlich, daß dieses Nucleinsäurehybridisierungsverfahren außerdem verwendet werden kann, um Substanzen mit antimikrobieller Aktivität in Blut, Urin, anderen Körperflüssigkeiten und -geweben und anderen Proben zu bestimmen.
Dieses Verfahren zur Bestimmung des Wachstums von Zellen kann verwendet werden, um das Wachstumsstadium jeder Zelle, die R-RNA synthetisiert, zu bestimmen. Das obige Beispiel ist nur eines von vielen, das für ein solches Verfahren verwendet werden.
Wenn bekannt ist, daß Mitglieder einer bestimmten Kategorie von Organismen in einer Probe vorhanden sind, ist es möglich, eine einzelne Sonde zu verwenden, um das Wachstumsstadium dieser Organismen zu bestimmen. Wenn zum Beispiel keine ps R-RNA in den Organismen nachgewiesen werden kann, sind sie im nicht-wachsenden Stadium. Wenn psR-RNA nur in kleinen Mengen in Organismen im Vergleich zu der Zahl von vorhandenen Organismen nachgewiesen werden, wachsen die Organismen langsam. Wenn große psR-RNA-Mengen im Vergleich zu der Zahl von vorhandenen Organismen nachgewiesen werden, wachsen die Organismen schnell.
Eine andere Methode zur Bestimmung des Wachstumsstadiums eines bestimmten Organismus oder einer Klasse von Organismen baut auf der Verwendung von zwei Sonden auf, wobei jede nur mit R-RNA einer bestimmten Kategorie von Organismen hybridisiert. Eine Sonde ist spezifisch für eine stabile RNA (R-RNA oder t-RNA), wobei die RNA in diesem Organismus in ungefähr der gleichen Menge in nicht-wachsenden und schnell wachsenden Organismen oder Zellen vorhanden ist, die andere Sonde ist spezifisch für eine bestimmte mRNA, psmRNA, pst-RNA, pssnRNA, hnRNA, pshnRNA oder psR-RNA Sequenz oder Sequenzen, wobei die RNA in schnell wachsenden Zellen oder Organismen häufig vorkommt und in nicht-wachsenden Organismen oder Zellen abwesend ist oder in kleinen Mengen vorkommt. Diese Sonden werden verwendet, um die in der Probe vorhandenen Mengen der RNA, für die jede spezifisch ist, nachzuweisen, zu identifizieren und zu quantifizieren. Das Verhältnis der Mengen dieser R-RNA gibt einen Hinweis über das Wachstumsstadium dieser Organismen oder Zellen.
Ein spezifisches Beispiel umfaßt die Verwendung der zwei Sonden, wobei eine für R-RNA der Mitglieder einer spezifischen Kategorie von Organismen oder Zellen spezifisch ist und die andere für psR-RNA der gleichen Kategorie von Organismen oder Zellen spezifisch ist, um die in der Zelle vorhandenen R-RNA und psR-RNA nachzuweisen, zu identifizieren und zu quantifizieren. Das Verhältnis der in der Probe enthaltenen psR-RNA zur R-RNA-Menge ist ein Indikator des Wachstumsstadiums der Organismen oder Zellen. In schnell wachsenden Zellen sind mehrere tausend psR-RNA Kopien vorhanden, und das psR-RNA/RNA-Verhältnis ist maximal. In langsam wachsenden Zellen ist eine verhältnismäßig kleine psR-RNA-Menge vorhanden, und das psR-RNA/RNA-Verhältnis ist wesentlich niedriger. In nichtwachsenden Zellen sollte psR-RNA abwesend sein, und das psR-RNA/RNA-Verhältnis ist minimal.
Das gleiche zwei Sonden-Verfahren kann mit einer Vielzahl von verschiedenen Kombinationen von oben erwähnten Sonden verwendet werden und kann in der Gegenwart von Organismen oder Zellen durchgeführt werden, die nicht Mitglieder der spezifischen Kategorie sind, die durch die Sonde nachgewiesen werden.
Eine offensichtliche Anwendung der hier beschriebenen Sonden zur Bestimmung des Wachstumsstadiums von spezifischen Kategorien von Organismen ist die Verwendung dieser Sonden, um die Gegenwart von antimikrobiellen Mitteln in Blut, Urin, anderen Körperflüssigkeiten oder -geweben oder anderen Proben zu bestimmen oder die Sensitivität dieser spezifischen Kategorien von Organismen gegen spezifische antimikrobielle Mittel oder Gruppen solcher Mittel zu bestimmen. Zum Beispiel haben Bakterien, die vollständig durch ein bestimmtes Mittel im Wachstum gehemmt sind, ein minimales psR-RNA/RNA-Verhältnis.
Verfahren zum Nachweisen von Infektionen durch Mikroorganismen durch Untersuchen einer phagozytischen Zelle des Organismus
Die äußerst hohe Sensitivität und Nachweisspezifität, die die Nucleinsäurehybridisierungstests unter Verwendung von zuvor beschriebenen Sonden, die für R-RNA spezifisch sind, kennzeichnet, erlaubt eine einfache Lösung des Problems eine geeignete klinische Probe für die Diagnose von Mikroorganismen zu erhalten. Eine einfache Bluttestprobe, die die weiße Blutzellen (hiernach als WBC) Fraktion enthält, ist in einer großen Zahl von Fällen ausreichend.
Eine Möglichkeit, diese WBC-Methode zu verwenden, ist zunächst die WBC-Probe mit einer markierten Sonde zu hybridisieren, die mit R-RNA jedes Mitglieds jeder Bakteriengruppe hybridisiert, aber nicht mit R-RNA einer anderen Quelle. Eine solche Sonde dient als allgemeine Screening-Vorrichtung für alle Bakterien. Proben, die für Bakterien-R-RNA positiv sind, werden anschließend mit einer Hierarchie von anderen Sonden untersucht, um die Bakterien, die vorhanden sind, weiter zu identifizieren. Zum Beispiel kann eine Sonde, die mit R-RNA jedes Mitglieds der Familie Enterobacter hybridisiert, aber nicht mit R-RNA jeder anderen Quelle, verwendet werden, um Enterobakterien nachzuweisen oder auszuschließen, während eine Sonde, die nur für anaerobe R-RNA spezifisch ist, verwendet wird, um anaerobe Bakterien nachzuweisen.
Die obige Darstellung ist nur eine von vielen Verwendungsmöglichkeiten der WBC als primäre klinische Probe zur schnellen Diagnose von Infektionen von Mikroorganismen durch Nucleinsäurehybridisierung. Zum Beispiel werden verschiedene Kombinationen von Sonden in Abhängigkeit von den klinischen Symptomen des Patienten verwendet, um eine Diagnose zu erhalten.
Die unten aufgeführten Veröffentlichungen sind von Interesse im Zusammenhang mit verschiedenen erfindungsgemäßen Aspekten und sind hier als Teil der Offenbarung heranzuziehen.
1. Repeated Sequences in DNA
R.J. Britten und D.E. Kohne, Science, 1968, 161, S. 529
2. Kinetics of Renaturation of DNA
J.G. Wetmur und N. Davidson, J. Mol. Biol., 1968, 31, S. 349
3. Hydroxyapatite Techniques for Nucleic Acid Reassociation
D.E. Kohne und R. J. Britten in Procedures in Nucleic Acid Research, 1971, Hrsg. Cantoni und Davies, Harper and Row, Bd. 2, S. 500
4. Hybridization of Denatured DNA and Small Fragments
Transferred to Nitrocellulose
P.S. Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1980, 77, S. 5201
5. DNA-DNA Hybridization on Nitrocellulose Filters: General Considerations and Non-Ideal Kinetics
R. Flavell et al., Eur. J. Biochem., 1974, 47, S. 535
6. Assay of DNA-RNA Hybrids by S₁ Nuclease Digestion and Adsorption to DEAE-Cellulose Filters
I. Maxwell et al., Nucleic Acids Research, 1978, 5, S. 2033
7. Molecular Cloning: A Laboratory Manual
T. Maniatis et al., Cold Spring Harbor Publication, 1982
8. Efficient Transcription of RNA into DNA by Avian Sarcoma Virus Polymerase
J. Taylor et al., Biochimica et Biophys. Acta, 1976, 442, S. 324
9. Use of Specific Radioactive Probes to Study Transcription and Replication of the Influenza Virus Genome
J. Taylor et al., J. Virology, 1977, 21, 2, S. 530
10. Virus Detection by Nucleic Acid Hybridization: Examination of Normal and ALS Tissue for the Presence of Poliovirus
D. Kohne et al., Journal of General Virology, 1981, 56, S. 223–233
11. Leukemogenesis by Bovine Leukemia Virus
R. Kettmann et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1982, 79, 8, s. 2465–2469
12. Prenatal Diagnosis of a Thalassemia: Clinical Application of Molecular Hybridization
Y. Kan et al., New England Journal of Medicine, 1976, 295, 21, S. 1165– 1167
13. Gene Deletions in a Thalassemia Prove that the 5' Locus is Functional
L. Pressley et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1980, 77, 6, S. 3586–3589
14. Use of Synthetic Oligonucleotides as Hybridization Probes
S.V. Suggs et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1981, 78, S. 6613
15. Identification of Enterotoxigenic E, coli by Colony Hybridization Using 3 Enterotoxin Gene Probes
S.L. Mosely et al., J. of Infect. Diseases, 1982, 145, 6, S. 863
16. DNA Reassociation in the Taxonomy of Enteric Bacteria
D. Brenner, Int. J. Systematic Bacteriology, 1973, 23, 4, S. 298–307
17. Comparative Study of Ribosomoal RNA Cistrons in Enterobacteria and Mycobacteria
R. Moore et al., J. Bacteriology, 1967, 94, S. 1066–1074
18. Ribosomal RNA Similarities in the Classification of Rhodococcus and Related Taxa
M. Modarski et al., J. General Microbiology, 1980, 118, S. 313–319
19. Retention of Common Nucleotide Sequences in the Ribosomal DNA of Eukaryotes and Some of Their Physical Characteristics
J. Sinclair et al., Biochemistry, 1971, 10, S. 2761
20. Homologies Among Ribosomal RNA and Messenger RNA Genes in Chloroplasts, Mitochondria and E. coli
H. Bohnert et al., Molecular and General Genetics, 1980, 179, S. 539–545
21. Heterogeneity of the Conserved Ribosomal RNA Sequences of Bacillus subtilis
R. Doe et al., J. Bacteriology, 1966, 92, 1, S. 88
22. Isolation and Characterization of Bacterial Ribosomal RNA Cistrons
D. Kohne, Biophysical Journal, 1968, 8, 10, S. 1104–1118
23. Taxonomic Relations between Archaebacteria Including 6 Novel Genera Examined by Cross Hybridization of DNAs and 16S R-RNAs
J. Tu et al., J. Mol. Evol., 1982, 18, S. 109
24. R-RNA Cistron Homologies Among Hyphomicrobium and Various Other Bacteria
R. Moore, Canadian J. Microbiology (1977), 23, S. 478
25. Conservation of Transfer RNA and 5S RNA Cistrons in Enterobacteriaceae
D.J. Brenner et al., J. Bacteriology, Bd. 129, 3, (März 1977), S 1435
26. Sequence Homology of Mitochondrial Leucyl-tRNA Cistron in Different Organisms
S. Jakovcic et al., Biochemistry Bd. 14, 10, (20. Mai 1975), S. 2037
27. Synthetic Deoxynucleotides as General Probes for Chloroplast t-RNA Genes
J. A. Nickoloff und R.B. Hallick, Nucleic Acids Research, Bd. 10, 24, 1982, S. 8191–8210
28. Antibiotics in Laboratory Medicine
V. Lorian Hrsg., Williams and Wilkens (Baltimore/London), 1980
29. Diagnostic Microbiology
Finegold und Martin, Herausgeber, C.V. Mosby Co. (St. Louis), 1982
30. Spotblot: A Hybridization Assay for Specific DNA Sequences in Multiple Samples
M. Cunningham, Analytical Biochemistry, Bd. 128, 1983, S. 415
31. (29) Analysis of Repeating DNA Sequences by Reassociation
R. Britten et al., in: Methods in Enzymology XXIX, S. 363, Hrsg. Grossman und Moldave, Academic Press, New York, 1974
32. Studies on Nucleic Acid Reassociation Kinetics: Retarded Rate of Hybridization of RNA with Excess DNA
G. Galau et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 74, 6, 1974, S. 2306
33. Acceleration of DNA Renaturation Rates
J. Wetmur, Biopolymers, Bd. 14, 1975, S. 2517
34. Room Temperature Method for increasing the Rate of DNA
Reassociation by Many Thousandfold: The Phenol Emulsion Reassociation Technique
D. Kohne et al., Biochemistry, Bd. 16, 24, 1977, S. 5349
35. Molecular Biology
D. Freifelder, Science Books International (Boston) Van Nostrand Reinhold Co. (New York), 1983
36. Gene Expression 2
B. Lesain, J. Wiley & Sons, Wiley-Interscience Publication, 1980, New York
37. Gene Expression 1
B. Lewin, J. Wiley & Sons, Wiley-Interscience Publication, 1974, New York
Wie in der Beschreibung und den Ansprüchen verwendet, werden die folgenden Ausdrücke wie folgt definiert: Definition der Ausdrücke

Claims

Nucleinsäuresonde für die Verwendung in einem Hybridisierungstest zur Bestimmung des Vorhandenseins oder einer Menge nicht-viraler, zu einer Gruppe gehörender Zielorganismen, wobei die Gruppe aus mindestens einem, aber weniger als alle nicht-virale Organismen besteht, worin die Organismen ribosomale Nucleinsäure enthalten, und worin ribosomale Nucleinsäure aus Nichtzielorganismen, die nicht zu der Gruppe gehören, während des Hybridisierungstests vorliegen kann, welche umfasst: ein oder mehrere Nucleinsäuremoleküle mit Sequenzen, die genügend komplementär sind zur Hybridisierung an nur eine oder mehrere ribosomale Untereinheit-Nucleinsäuresequenzen, die in der ribosomalen Nucleinsäure aus der Gruppe der Zielorganismen vorliegt, und nicht an die ribosomale Nucleinsäure aus den Nichtzielorganismen; und worin die Nucleinsäuremoleküle in der Länge kürzer als das entsprechende Nucleinsäuremolekül ist, das aus der ribosomalen Untereinheit-Nucleinsäure besteht, worin die Sonde in einem Hybridisierungsgemisch bereitgestellt wird.
Sonde nach Anspruch 1, worin das Nucleinsäuremolekül ein einzelner DNA-Strang ist.
Sonde nach Anspruch 1, worin das Nucleinsäuremolekül ein einzelner RNA-Strang ist.
Sonde nach Anspruch 1, worin die Sonde markiert ist.
Sonde nach Anspruch 4, welche durch Einschluss von mindestens einem radioaktiven Atom markiert wurde.
Sonde nach Anspruch 4, die durch Konjugation mit mindestens einem Fluoreszenzpigment markiert wurde.
Sonde nach Anspruch 4, die durch kovalente Verknüpfung mit mindestens einem Biotinmolekül daran markiert wurde.
Sonde nach Anspruch 1, worin die Gruppe der Zielorganismen eine Spezies ist, und jedes Nucleinsäuremolekül nachweisbar an die ribosomale Nucleinsäure nur der Spezies und nicht an die ribosomale Nucleinsäure eines Organismus, der zu einer anderen Spezies in der entsprechenden Gattung gehört, hybridisiert.
Sonde nach Anspruch 1, worin die Gruppe der Zielorganismen eine Gattung ist, und jedes Nucleinsäuremolekül nachweisbar an die ribosomale Nucleinsäure nur von der Gattung und nicht an die ribosomale Nucleinsäure eines Organismus, der zu einer anderen Gattung in der entsprechenden Familie gehört, hybridisiert.
Sonde nach Anspruch 1, worin die Gruppe der Zielorganismus eine Familie ist, und jedes Nucleinsäuremolekül nachweisbar nur an die ribosomale Nucleinsäure der Familie und nicht an die ribosomale Nucleinsäure eines Organismus, der zu einer anderen Familie in der entsprechenden Ordnung gehört, hybridisiert.
Sonde nach Anspruch 1, worin die Gruppe der Zielorganismen eine Ordnung ist, und worin jedes Nucleinsäuremolekül nachweisbar nur an ribosomale Nucleinsäure der Ordnung und nicht an ribosomale Nucleinsäure eines Organismus, der zu einer anderen Ordnung in der entsprechenden Klasse gehört, hybridisiert.
Sonde nach Anspruch 1, worin die Gruppe der Zielorganismen eine Klasse ist, und jedes Nucleinsäuremolekül nachweisbar nur an ribosomale Nucleinsäure der Klasse und nicht an die ribosomale Nucleinsäure eines Organismus, der zu einer anderen Klasse in dem entsprechenden Reich gehört, hybridisiert.
Sonde nach Anspruch 1, worin jedes Nucleinsäuremolekül chemisch synthetisiert wird.
Sonde nach Anspruch 13, worin jedes Nucleinsäuremolekül komplementär zu einer gruppenspezifischen rRNA-Sequenz ist, die identifiziert wird durch Vergleich bekannter Sequenzen der rRNA aus verschiedenen Organismen.
Sonde nach Anspruch 1, worin die Sonde ausgewählt ist, um ausreichend komplementär für die Hybridisierung an eine oder mehrere rRNA-Untereinheit-Subsequenzen zu sein, die spezifisch für die Gruppe der nicht-viralen Zielorganismen sind, und um kürzer in der Länge zu sein als die rRNA-Untereinheit, an die die Sonde hybridisiert.
Sonde nach Anspruch 15, worin die Sonde ausgewählt ist durch Identifizieren eines Klons, der eine DNA-Sequenz komplementär zur rRNA enthält, die nur an rRNA aus Mitgliedern dieser Gruppe hybridisiert.
Sonde nach Anspruch 15, worin die Sonde ausgewählt ist durch eine Hybridisierungsselektion.
Sonde nach Anspruch 15, worin die Sonde ausgewählt ist durch Vergleich von Nucleotidsequenzen ribosomaler Nucleinsäure aus verschiedenen Organismen zur Identifizierung der gruppenspezifischen Sequenzen und zur chemischen Synthetisierung der gruppenspezifischen Sequenzen.
Sonde nach Anspruch 18, worin die ribosomale Nucleinsäure rRNA ist, und die gruppenspezifische Sequenz komplementär zur gruppenspezifischen rRNA-Sequenz ist.
Sonde nach Anspruch 18 oder 19, worin die Sonde markiert ist.
Sonde nach Anspruch 1, worin die Sonde in einer Probenmischung vorliegt, der ein zur Sonde komplementäres Molekül fehlt.