DE3504748A1

DE3504748A1 - METHOD FOR CULTIVATING CELLS IN HIGH DENSITY

Info

Publication number: DE3504748A1
Application number: DE19853504748
Authority: DE
Inventors: Randall G. Medfield Mass. Rupp
Original assignee: Damon Biotech Inc
Current assignee: Abbott Biotech Inc
Priority date: 1984-02-13
Filing date: 1985-02-12
Publication date: 1985-09-05
Also published as: GB8503248D0; BE901702A; DK65085D0; SE8500622D0; AU3857185A; JPS60199380A; IT8567141A1; DK65085A; JPS6110115B2; IT8567141A0; NL8500351A; AU572608B2; GB2154246B; GB2154246A; SE8500622L; NO850534L; FR2559500A1; DE3504748C2; IT1184884B

Description

DAMON BIOTECH, INC. Needham Heights, MA o2194 V.St.A.DAMON BIOTECH, INC. Needham Heights, MA o2194 V.St.A.

Verfahren zur Kultivierung von Zellen in hoherMethod of culturing cells in high

Dichtedensity

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Kultivierung von zerbrechlichen, proliferationsfähigen Zellen, wobei insbesondere der Gasaustausch in Kulturen derartigen Zellen optimiert wird. Zellen, die im erfindungsgemäßen Verfahren kultiviert werden können, sind Tierzelllinien, wie verschiedene Myelomzellen, aus Primärkulturen, natürlich oder künstlich transformierte Zellinien, fusionierte Zellen, wie Hybridome oder bösartige Transformanden,und andere Zellen ohne Zellwände,wie Spheroplasten.The invention relates to a method for culturing fragile cells capable of proliferation, in particular the gas exchange in cultures of such cells is optimized. Cells cultivated in the method according to the invention are animal cell lines, such as various myeloma cells, from primary cultures, natural or artificial transformed cell lines, fused cells such as hybridomas or malignant transformants, and other cells without cell walls such as Spheroplasts.

Es ist wohl bekannt, daß Sauerstoff für die Kultivierung von Tierzellen wesentlich ist und daß die Sauerstoffmenge, die für die Diffusion in eine Zelle zur Verfügung steht, für die Lebensfähigkeit und das Wachstum der Zellen wichtig ist.It is well known that oxygen is essential for the cultivation of animal cells and that the amount of oxygen which is available for diffusion into a cell, is important for the viability and growth of the cells.

0192-DBH-456/K/A10192-DBH-456 / K / A1

Im allgemeinen kann zu wenig Sauerstoff die Zelle töten oder bestenfalls ihr Wachstum begrenzen. Beispielsweise benötigen wachsende Hybridomkulturen mindestens etwa 0,12 mMolIn general, too little oxygen can kill the cell or at best limit its growth. For example, need growing hybridoma cultures at least about 0.12 mmol

Sauerstoff/l/h/10 Zellen. Steht weniger Sauerstoff zur Verfügung, so sind die Mitose und die Proteinproduktion begrenzt. Zuviel Sauerstoff kann zur Vergiftung führen, wobei die Zelle durch Oxidation essentieller Proteine abstirbt. Die Geschwindigkeit der Sauerstoffaufnahme einer Zellkultur erhöht sich mit dem Wachstum der Zellkultur; mit zunehmender Dichte der Zellkultur wird es immer schwieriger, dem Inneren der Kultur entsprechende Mengen an Sauerstoff von der Kulturoberfläche zuzuführen. Oxygen / l / h / 10 cells. If less oxygen is available, thus mitosis and protein production are limited. Too much oxygen can lead to cell poisoning dies due to oxidation of essential proteins. The rate of oxygen uptake in a cell culture increases with it the growth of the cell culture; as the density of the cell culture increases, it becomes more and more difficult to match the interior of the culture To supply quantities of oxygen from the culture surface.

Kohlendioxid, das den pH-Wert und die Dicarbonatkonzentration beeinflußt, wird ebenso für die Aufrechterhaltung des Wachstums von Tierzellen benötigt; die Kontrolle des Kohlendioxids ist wesentlich, wenn größere Mengen an Zellen kultiviert werden sollen.Carbon dioxide, which affects pH and dicarbonate concentration, is also used to maintain growth needed by animal cells; Control of carbon dioxide is essential when growing large numbers of cells should.

In herkömmlichen Laboratoriumsverfahren zur Kultivierung von Säugerzellen werden die Zellen in einer Petrischale in einem Medium suspendiert. Sauerstoff und Kohlendioxid diffundieren durch die Oberfläche des Mediums in die Zellen. Die Tiefe des Kulturmediums beeinflußt die Diffusionsgeschwindigkeit von Sauerstoff und Kohlendioxid zu den Zellen. Mit zunehmender Mediumtiefe nimmt das Verhältnis von Oberfläche zu Volumen des Mediums ab. Zu einem bestimmten Zeitpunkt sind die Sauerstoff- und Kohlendioxidkonzentration in der Luft über der Schale und/oder die Lösegeschwindigkeit in das Medium ungenügend, um das Gesamtvolumen des Mediums mit genügend Gas zu versorgen und die Erfordernisse der wachsenden Zellen zu befriedigen, d.h. der verfügbare Sauerstoff wird zum begrenzenden Wachstumsfaktor. Dementsprechend lehrt der Stand der Technik, daß die Tiefe des Mediums bei statischen Kulturen im Bereich von mm liegen soll. Im allgemeinen beträgtIn conventional laboratory methods of cultivation of mammalian cells, the cells are suspended in a medium in a Petri dish. Oxygen and carbon dioxide diffuse through the surface of the medium into the cells. The depth of the culture medium affects the rate of diffusion of oxygen and carbon dioxide to the cells. With increasing depth of the medium, the ratio of surface increases to volume of the medium. At some point the oxygen and carbon dioxide levels are in the air above the shell and / or the rate of dissolution in the medium is insufficient to cover the total volume of the medium with sufficient To supply gas and to satisfy the needs of the growing cells, i.e. the available oxygen becomes the limiting one Growth factor. Accordingly, the prior art teaches that the depth of the medium in static cultures should be in the range of mm. Generally amounts to

die obere Grenze der Zelldichte für derartige Kulturen etwa 10 Zellen/ml Kulturmedium, wenn die Luf als Sauerstoffversorgung verwendet wird.the upper limit of the cell density for such cultures is about 10 cells / ml of culture medium if the air is used as an oxygen supply.

10 Zellen/ml Kulturmedium, wenn die Luft über dem Kulturmedium10 cells / ml culture medium when the air is above the culture medium

Werden Verfahren zur Kultivierung von Säugerzellen in großtechnischem Maßstab durchgeführt, so ist es schwierig, ausreichende Sauerstoffmengen, die die Bedürfnisse der Zellen befriedigen, zur Verfügung zu stellen (siehe Glacken et al., "Mammalian Cell Culture: Engineering Principles and Scaleup Trends in Biotechnology", Seite 102, Elsevier Science Publications, 0166-9430/83 (1983)). Eine Lösung für dieses Problem ist die Erhöhung der Sauerstoff- und Kohlendioxidkonzentrationen im Luftraum über der Mediumoberfläche bei steigender Zelldichte. Dabei kann jedoch zuviel Sauerstoff an die Mediumoberfläche gelangen und zu einer Vergiftung führen; außerdem muß die Sauerstoffkonzentration im Medium ständig von teuren Meßvorrichtungen und Sauerstoffsensoren überwacht und eingestellt werden, um optimale Gasmengen im Medium aufrechtzuerhalten.Are processes for the cultivation of mammalian cells on an industrial scale Scale performed so it is difficult to get adequate amounts of oxygen to meet the needs of the cells (see Glacken et al., "Mammalian Cell Culture: Engineering Principles and Scaleup Trends in Biotechnology ", p. 102, Elsevier Science Publications, 0166-9430 / 83 (1983). One solution to this The problem is the increase in the oxygen and carbon dioxide concentrations in the air space above the surface of the medium increasing cell density. However, too much oxygen can reach the surface of the medium and lead to poisoning; In addition, the oxygen concentration in the medium must be constantly monitored by expensive measuring devices and oxygen sensors monitored and adjusted in order to maintain optimal gas quantities in the medium.

Bei der Kultivierung von Zellen mit Zellwänden, z.B. prokariotischen Zellen, werden Gase oft direkt durch das Medium geperlt, um die Zellen mit den benötigten Gaskonzentrationen zu versorgen. Das direkte Durchperlen ist jedoch bei der Kultivierung von Zellen ohne Zellwand ungeeignet: Diese Zellen sind zerbrechlich und werden beim Durchperlen des Gases mit einer ausreichenden Geschwindigkeit, um entsprechende Gaskonzentrationen im Medium aufrechtzuerhalten, physikalisch beschädigt. Auch bilden Proteinbestandteile des Mediums, die normalerweise in allen Tierzellkulturen notwendig sind, auf der Mediumoberfläche einen Schaum, der die Zellen einfangen kann. Die in dem Schaum eingeschlossenen Zellen sterben rasch ab. Schaumverhütungsmittel, die dem Medium zugesetzt werden können, sind jedoch gelegentlich für die Zellen der Kultur toxisch.When cultivating cells with cell walls, e.g. prokaryotic Cells, gases are often bubbled directly through the medium to provide the cells with the required gas concentrations to supply. However, direct beading is unsuitable for the cultivation of cells without a cell wall: these Cells are fragile and when the gas is bubbled through them at a sufficient rate, they become appropriate Maintain gas concentrations in the medium, physically damaged. Protein components of the medium, which are normally necessary in all animal cell cultures, also form a foam that traps the cells on the surface of the medium can. The cells trapped in the foam die quickly. Antifoam agents added to the medium but are occasionally toxic to the cells of the culture.

Neuere Entwicklungen auf dem Gebiet der Zellkultivierung beinhalten das Einschließen der Zellen in Kapseln aus Calciumalginat, um so höhere Zelldichten zu erreichen (siehe Glacken). Die US-PS 4 352 883 beschreibt die Einkapselung von Zellen, um sie vor schädlichen Stoffen, wie Bakterien, zu schützen. Die US- 4 409 331 beschreibt ein Verfahren zur Gewinnung von Produkten aus Tier- und anderen Zellen durch Isolieren dieser Produkte aus eingekapselten Zellkulturen, in denen die Zellen sich innerhalb semipermeabler Kapselmembranen befinden. Recent developments in the field of cell cultivation include enclosing the cells in capsules made of calcium alginate, in order to achieve higher cell densities (see Glacken). U.S. Patent 4,352,883 describes the encapsulation of cells to protect them from harmful substances such as bacteria. US-4,409,331 describes a method of extraction of products from animal and other cells by isolating these products from encapsulated cell cultures in which the cells are located within semipermeable capsule membranes.

Aus dem Gesagten ist ersichtlich, daß es wünschenswert wäre, den Gasaustausch bei der Kultivierung von Säugerzellen oder anderen zerbrechlichen Zellen zu verbessern.From the foregoing it can be seen that it would be desirable to use gas exchange in the cultivation of mammalian cells or to improve other fragile cells.

Aufgabe der Erfindung war es, die Gaskonzentration in einem Kulturmedium zu optimieren, ohne die Zellen zu beschädigen oder teure Überwachungsvorrichtungen notwendig zu machen. Eine weitere Aufgabe der Erfindung war es, ein Verfahren zur großtechnischen Kultivierung von Zellen in hoher Dichte ,The object of the invention was to optimize the gas concentration in a culture medium without damaging the cells or require expensive monitoring equipment. Another object of the invention was to provide a method for large-scale cultivation of cells in high density,

beispielsweise 1x10 Zellen/ml in Kulturen von 20 - 30 1 , anzugeben, wobei bei Züchtung von Zellen ohne Zellwände, wie Tierzellen oder Spheroplasten, das für die Zellen notwendige Gas durch direktes Einleiten des Gases in das Medium ohne Beschädigung der Zellen zugeführt werden soll. Außerdem sollten Tierzellen in Dichten kultiviert werden, die mit Zelldichten von vielen Normalgeweben vergleichbar sind.e.g. 1x10 cells / ml in cultures of 20 - 30 1, indicate, with the cultivation of cells without cell walls, such as animal cells or spheroplasts, what is necessary for the cells Gas is to be supplied by introducing the gas directly into the medium without damaging the cells. aside from that Animal cells should be cultivated at densities that are comparable to the cell densities of many normal tissues.

Die Aufgabe wird anspruchsgemäß durch ein Verfahren zur Kultivierung von Zellen ohne Zellwänden in hoher Dichte gelöst, das gekennzeichnet ist durchAccording to the claims, the object is achieved by a method of cultivation solved by cells without cell walls in high density, which is characterized by

A) Durchperlen eines Gases durch ein Wachstumsmedium, um das Medium mit einer praktisch konstanten und für die Lebensfähigkeit und Aufrechterhaltung der Mitose derA) Bubbling a gas through a growth medium, around the medium with a practically constant and for the Viability and maintenance of mitosis

Zelle ausreichenden Gaskonzentration zu versorgen,To supply the cell with sufficient gas concentration,

wobei die Zellen sich in kugelförmigen, in dem Medium suspendierten Kapseln mit semipermeablen Membranen befinden, die die Zellen vor physikalischer Beschädigung schützen und so durchlässig sind, daß sie die für die Lebensfähigkeit und die Aufrechterhaltung der Zellmitose notwendigen Beistandteile durchlassen, undwhereby the cells become spherical, in the medium suspended capsules with semipermeable membranes are located, which protect the cells from physical damage protect and are so permeable that they are essential for the viability and maintenance of cell mitosis let through the necessary accessories, and

B) Wachsenlassen der Zellen.B) Growing the cells.

Im erfindungsgemäßen Verfahren wird eine Impfkultur der zu züchtenden Zellen in kugelförmigen Kapseln eingeschlossen, deren semipermeable Membranen die Zellen vor physikalischer Beschädigung schützen und wesentliche Nährstoffe durchlassen, wie Vitamine, Ionen oder Gase, die für das Wachstum der Zellen notwendig sind. Ein Gas, das von den Zellen benötigte Bestandteile enthält, wird während des Zellwachstums direkt durch das Medium geperlt, entweder kontinuierlich oder diskontinuierlich, und zwischen den Kapsel verteilt. Die Zusammensetzung des eingeleiteten Gases reicht aus, um eine praktisch konstante Sauerstoff- und/oder Kohlendioxidkonzentration im Medium aufrechtzuerhalten, das heißt, eine Konzentration, die groß genug ist, um die Zellen mit Sauerstoff und/oder Kohlendioxid in Mengen, die für die Aufrechterhaltung der Zellmitose und des Zellmetabolismus gut geeignet sind, zu versorgen. Unter Anwendung herkömmlicher Medien und des erfindungsgemäßen Verfahrens ist es möglich, innerhalb der Kapseln Zellen mit Dichten im BereichIn the method according to the invention, a seed culture of the cells to be grown is used Enclosed in spherical capsules, the semipermeable membranes of which form the cells protect against physical damage and allow essential nutrients to pass through, like vitamins, ions or gases that are necessary for the growth of cells. A gas that the cells needed Contains constituents is bubbled directly through the medium during cell growth, either continuously or discontinuous, and distributed between the capsule. The composition of the gas introduced is sufficient in order to maintain a practically constant oxygen and / or carbon dioxide concentration in the medium, i.e. a concentration that is large enough to provide the cells with oxygen and / or carbon dioxide in amounts that are useful for the cells Maintenance of cell mitosis and cell metabolism are well suited to supply. Using conventional Media and the method according to the invention, it is possible within the capsules cells with densities in the range

von 5x10 Zellen/ml nicht suspendierter Kapseln zu züchten. Gegebenenfalls können die von den Zellen produzierten Substanzen entweder aus dem Inneren der Kapsel oder aus dem Medium gewonnen werden.from 5x10 cells / ml of unsuspended capsules to grow. Possibly The substances produced by the cells can either be obtained from the interior of the capsule or from the medium will.

In bevorzugten Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens wird beim Züchten von Tierzellen ein Gas durchgeperlt, das ausgewogene und ausreichende Mengen an Sauerstoff undIn preferred embodiments of the method according to the invention, a gas is bubbled through when growing animal cells, that balanced and adequate amounts of oxygen and

Kohlendioxid enthält, um im Medium einen gewünschten Sauerstoff-/Kohlendioxid-Gehalt aufrechtzuerhalten. Vorzugsweise ist der Gehalt an Sauerstoff und Kohlendioxid des Mediums so groß, daß das Zellwachstum innerhalb der Kapseln beschleunigt wird und maximale Zelldichten erhalten werden. Das bedeutet, daß der Sauerstoff in dem durchgeperlten Gas in Mengen von etwa 0,2 bis 598 mbar (0,15 bis 450 mm Hg) , vorzugsweise mindestens 20 bis 265 mbar (15 bis 200 mm Hg) und insbesondere für Säugerzellen 200 bis 226 mbar (150 - 170 mm Hg) vorliegt. Contains carbon dioxide in order to achieve a desired oxygen / carbon dioxide content in the medium maintain. Preferably the content of oxygen and carbon dioxide of the medium is so large that cell growth within the capsules is accelerated and maximum cell densities are obtained. That means, that the oxygen in the bubbled gas in amounts of about 0.2 to 598 mbar (0.15 to 450 mm Hg), preferably at least 20 to 265 mbar (15 to 200 mm Hg) and in particular for mammalian cells 200 to 226 mbar (150-170 mm Hg) is present.

Säugerzellen, die im erfindungsgemäßen Verfahren günstigerweise gezüchtet werden können, sind genetisch veränderte Zellen, Myelomzellen und Hybridome sowie andere fusionierte Zellen.Mammalian cells that are advantageously used in the method according to the invention Genetically modified cells, myeloma cells and hybridomas as well as other fused cells can be cultured.

Ein wesentlichen Kennzeichen des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Kultivierung von Säugerzellen ist die Tatsache, daß die Zellen durch das Einleiten von Gas ausreichend mit Gas versorgt werden. Das heißt, das selbst dichte und voluminöse Kulturen mit Sauerstoff und/oder Kohlendioxid ausreichend versorgt werden können und der Gasaustausch nicht zum begrenzenden Wachstumsfaktor wird. Das ist durch die Einkapselung der Zellen in Membranen möglich, die sie vor der physikalischen Beschädigung schützt, die normalerweise durch das Perlen des Gases verursacht wird. Das Durchperlen von Gas ist eine wirkungsvolle Methode, das Medium mit optimalen Konzentrationen an Sauerstoff und Kohlendioxid zu versorgen, da die Gaskonzentrationen im eingeleiteten Gas und die Gaskonzentrationen im Medium bei einem Grenzwert der Durchperlgeschwindigkeit im Gleichgewicht gehalten werden können. Die Sauerstoff- und Kohlendioxidkonzentrationen im Medium können auf diese Weise auf optimale Werte eingestellt werden, wenn man ihre Konzentrationen im eingeleiteten Gas überwacht. Teure Oberwachungs- und Gasbestimmungsvorrichtungen sind dadurch überflüssig.An essential characteristic of the method according to the invention for the cultivation of mammalian cells is the fact that the cells are sufficiently supplied with gas by the introduction of gas will. This means that even dense and voluminous cultures are adequately supplied with oxygen and / or carbon dioxide and gas exchange does not become a limiting growth factor. That is by encapsulating the cells possible in membranes that protect them from the physical damage normally caused by the bubbling of the gas caused. Bubbling gas is an effective method of keeping the medium with optimal concentrations of oxygen and to supply carbon dioxide, as the gas concentrations in the introduced gas and the gas concentrations in the medium a limit value of the bubbling speed can be kept in equilibrium. The oxygen and carbon dioxide concentrations in the medium can be adjusted to optimal values in this way if their concentrations in the introduced gas monitored. Expensive monitoring and gas detection devices are therefore superfluous.

Die Erfindung wird anhand der folgenden Figuren näher erläutert:The invention is explained in more detail with reference to the following figures:

Fig. 1 ist die schematische Darstellung von Säugerzellen, die in einer für das erfindungsgemäße Verfahren geeigneten Mikrokapsel eingeschlossen sind;1 is a schematic representation of mammalian cells which are used in a for the method according to the invention suitable microcapsule included;

Fig.2 ist die schematische Darstellung eines, für das erfindungsgemäße Verfahren geeigneten Apparats zur Zellkultivierung;Fig. 2 is the schematic representation of one for which cell cultivation apparatus suitable for the process according to the invention;

Fig. 3 stellt graphisch die Gesamtzellzahl je ml Medium gegen die Dauer verschiedener diskontinuierlicher Kulturen mit und ohne Durchperlen von Gas dar;3 graphically depicts the total number of cells per ml of medium versus the duration of various discontinuous cultures with and without gas bubbling;

Fig. 4 ist die graphische Darstellung der Zellzahl je ml nicht suspendierter Kapseln gegen die Dauer einer kontinuierlich gespeisten, eingekapselten Kultur unter Einleiten von Gas, wobei die im erfindungsgemäßen Verfahren erreichbaren Zelldichten dargestellt sind; undFigure 4 is a graph of cell counts per ml of unsuspended capsules versus duration a continuously fed, encapsulated culture with the introduction of gas, the in the invention Process achievable cell densities are shown; and

Fig. 5 ist eine der Figur 4 entsprechende graphische Darstellung des Wachstums einer diskontinuierlich gespeisten Kultur.Figure 5 is a graph similar to Figure 4 of the growth of a discontinuous fed culture.

Das erfindungsgemäße Verfahren beruht auf der Beobachtung, daß Zellen ohne Zellwände, zum Beispiel Säugerzellen, die innerhalb semipermeablen Membranen eingekapselt sind, gegenüber beim Durchperlen von Gas verursachterphysikalischer Beschädigung und Sauerstoffvergiftung praktisch immun sind. Außerdem kann das durchgeperlte Gas wirkungsvoll zur Versorgung der Zellen mit Sauerstoff und/oder Kohlendioxid eingesetzt werden. Im erfindungsgemäßen Verfahren können die Konzentrationen an Sauerstoff und Kohlendioxid so ausge-The method according to the invention is based on the observation that cells without cell walls, for example mammalian cells that are encapsulated within semipermeable membranes, are virtually immune to physical damage and oxygen poisoning caused by gas bubbling. In addition, the bubbled gas can be effective in supplying the cells with oxygen and / or carbon dioxide can be used. In the process according to the invention, the concentrations of oxygen and carbon dioxide can be

wogen werden, daß im Medium optimale Mengen vorhanden sind, wodurch erhöhte Zellausbeuten in Zellkulturgefäßen mit größeren Abmessungen erreicht werden können. Da die Sauerstoff- und Kohlendioxidkonzentrationen im Medium ihrer Konzentration im durchgeperlten Gas proportional sind, fallen die Überwachung der Gaskonzentration und die damit verbundenen Kosten weg.be weighed that optimal amounts are present in the medium, whereby increased cell yields in cell culture vessels with larger Dimensions can be achieved. Because the oxygen and carbon dioxide concentrations in the medium of their concentration are proportional in the bubbled gas, the monitoring of the gas concentration and the associated costs are reduced path.

Fig. 1 zeigt, daß Säugerzellen 11 in kugelförmigen und typischerweise sphärischen Kapseln 13 gemäß dem Verfahren der US-PS 4 352 883 eingekapselt werden können. Ein bevorzugtes Verfahren zur Einkapselung von Säugerzellen ist in der gleichzeitig eingereichten DE-OS (entsprechend US-Anmeldung 579 494) beschrieben. Ein typisches Verfahren zur Einkapselung besteht in der Herstellung einer Suspension, die in 11 (1 g/1 00 ml Lösung) Natriumalginat (NaG-Kelco LV ) etwa 10⁶ Zellen/ml enthält. Die Zelldichte dieser Suspension bestimmt schließlich die Zellzahl je Kapsel in der Impfkultur. Die Suspension wird in eine Spritzkopfvorrichtung übergeführt, die aus einem Gehäuse mit einer Lufteinlaßdüse oben und einem länglichen hohlen Reibungskörper, der in einen Stopfen eingepaßt ist, besteht. Eine Spritze und beispielsweise eine 10-ml-Spritze , die mit einer Stufenpumpe verbunden und mit einer Nadel, wie einer Teflon-beschichteten Nadel mit einem inneren Durchmesser von 0,025 cm (0,01 inch) ausgerüstet ist, wird oben am Gehäuse angebracht, so daß die Nadel über die Länge des Gehäuses reicht. Das Innere des Gehäuses ist so ausgelegt, daß die Nadelspitze einem ständigen laminaren Luftstrom, der als Luftmesser wirkt, ausgesetzt ist. Bei der Verwendung wird die Spritze, die das einzuhüllende Material enthält, oben am Gehäuse angebracht; die Stufenpumpe drückt Tropfen der Lösung zur Spitze der Nadel, wo jeder Tropfen vom Luftstrom abgeschnitten wird und etwa 2,5 bis 3,5 cm in eine 1,2lige CaI ciumchloridlösung fällt. Es entstehen Gelklumpen, die durch Absaugen gesammelt werden. Die Gelklumpen werdenFig. 1 shows that mammalian cells 11 can be encapsulated in spherical and typically spherical capsules 13 according to the method of U.S. Patent 4,352,883. A preferred method for encapsulating mammalian cells is described in the simultaneously filed DE-OS (corresponding to US application 579 494). ^{A typical method of encapsulation consists in the preparation of a suspension which contains about 10 6} cells / ml in 11 (1 g / 100 ml solution) sodium alginate (NaG-Kelco LV). The cell density of this suspension ultimately determines the number of cells per capsule in the inoculation culture. The suspension is transferred to a spray head assembly consisting of a housing with an air inlet nozzle on top and an elongated hollow friction body fitted into a plug. A syringe, such as a 10 ml syringe connected to a stage pump and equipped with a needle such as a Teflon-coated needle with an inner diameter of 0.025 cm (0.01 inch), is attached to the top of the housing, see above that the needle extends the length of the housing. The interior of the housing is designed so that the needle tip is exposed to a constant laminar flow of air, which acts as an air knife. In use, the syringe containing the material to be wrapped is attached to the top of the housing; the step pump pushes drops of the solution to the tip of the needle, where each drop is cut off from the air stream and falls about 2.5 to 3.5 cm into a 1.2 liter calcium chloride solution. Gel clumps are formed which are collected by suction. The gel lumps will be

zur Gelexpansion insgesamt etwa 11 min in isotone Natriumchloridlösung, die dreimal erneuert wird, eingebracht. Dann wird eine Membran um die Gelklumpen durch Inberührungbringen mit einer 750 mg/1 Poly-L-lysin (Sigma Chemical Company, mit einem Molekulargewicht von 65.000 Dalton) enthaltender.isotoner Natriumchloridlösung gebildet. Nach einer Reaktionszeit von 12 min werden die entstandenen Kapseln 10 min mit einer 1,4 g/l 2-Cyclohexylaminoethan-sulfonsäure-Puffer (CHES, Sigma) und 0,2 % Calciumchlorid enthaltenden Natriumchloridlösung gewaschen. Die Kapseln werden etwa 8 min mit einer 0,31 Calciumchlorid enthaltenden Natriumchloridlösung gewaschen; eine zweite Membran wird um die Kapseln gebildet und zwar durch 10 min langes Umsetzen mit einer 105 mg/1 Polyvinylamin (PoIyscience, mit einem Molekulargewicht von 50.000 bis 150.000 Dalton) enthaltenden Natriumchloridlösung. Die Kapseln werden zweimal mit isotoner Natriumchloridlösung im Verlauf von 7 min gewaschen und durch 7minütiges Eintauchen in eine 5x10 % Natriumalginat enthaltende Natriumchloridlösung nachbeschichtet. Die Kapseln werden weitere 4 min in Natriumchloridlösung gewaschen; der intrakapsuläre Raum wird durch zweimaliges Eintauchen, das erste Mal während 20 min und das zweite Mal während 6 min, in eine 55 mM (mMol/1) Natriumcitrat enthaltende Natriumchloridlösung wieder verflüssigt. Die Kapseln 13 werden zweimal in Natriumchloridlösung und einmal während 4 min im Medium gewaschen; dann sind sie für die Inkubation in einem Wachstumsmedium 16 fertig.to expand the gel for a total of about 11 minutes in isotonic sodium chloride solution, which is renewed three times. A membrane is then formed around the gel lump by contacting it with an isotonic sodium chloride solution containing 750 mg / l poly-L-lysine (Sigma Chemical Company, having a molecular weight of 65,000 Daltons). After a reaction time of 12 minutes, the resulting capsules are washed for 10 minutes with a sodium chloride solution containing 1.4 g / l of 2-cyclohexylaminoethane sulfonic acid buffer (CHES, Sigma) and 0.2 % calcium chloride. The capsules are washed with a sodium chloride solution containing 0.31 calcium chloride for about 8 minutes; a second membrane is formed around the capsules by reacting for 10 minutes with a sodium chloride solution containing 105 mg / l polyvinylamine (PoIyscience, with a molecular weight of 50,000 to 150,000 Daltons). The capsules are washed twice with isotonic sodium chloride solution in the course of 7 minutes and subsequently coated by immersion for 7 minutes in a sodium chloride solution containing 5 × 10% sodium alginate. The capsules are washed for a further 4 minutes in sodium chloride solution; the intracapsular space is liquefied again by dipping twice, the first time for 20 minutes and the second time for 6 minutes, in a sodium chloride solution containing 55 mM (mmol / l) sodium citrate. The capsules 13 are washed twice in sodium chloride solution and once for 4 minutes in the medium; then they are ready for incubation in a growth medium 16.

Die in Fig. 1 dargestellten Kapseln, die nach diesem Verfahren hergestellt worden sind, haben Membranen, die für höher molekulare Proteine, Bakterien und zu kultivierende Zellen praktisch undurchlässig sind.The capsules shown in Fig. 1, which have been produced by this process, have membranes for higher molecular weight Proteins, bacteria and cells to be cultivated are practically impermeable.

Fig. 2 stellt schematisch eine Vorrichtung zur Zellkultivierung gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren dar. Die Vorrichtung besteht aus einem elektropolieren, 50 1 fassenden GefäßFig. 2 shows schematically an apparatus for cell cultivation according to the method according to the invention. The apparatus consists of an electropolishing vessel with a capacity of 50 liters

10 aus rostfreiem Stahl (316L), das mit einer Kopfplatte verschlossen ist. Ein Motor 14 treibt den Rührerschaft und die sich in der Kultur 22 befindenden Schaufeln 18 und 20 an. Die Kultur 22 enthält ein herkömmliches Medium, wie ein modifiziertes Eagle-Medium mit zugesetztem Serum. Es kann aber auch ein hypertones Medium mit einer Osmolarität von etwa 360 mOsmol sein, wie es in der gleichzeitig eingereichten DE-OS (entsprechend der US-Anmeldung 579 492) beschrieben ist. Eine Vielzahl von Kapseln, wie sie in Figur 1 dargestellt sind, werden in dem Medium suspendiert. Typischerweise sind die Kapseln sphärisch oder kugelförmig und haben einen Durchmesser unter etwa 2 mm. Kapseln mit einem mittleren Durchmesser von etwa 0,8 mm sind gut geeignet.10 made of stainless steel (316L) that comes with a headstock is locked. A motor 14 drives the stirrer shaft and the blades 18 and located in the culture 22 20 at. Culture 22 contains conventional medium such as modified Eagle medium with added serum. It but can also be a hypertonic medium with an osmolarity of about 360 mOsmol, as in the submitted at the same time DE-OS (corresponding to US application 579 492) is described. A variety of capsules like those in Figure 1 are suspended in the medium. Typically the capsules are spherical or spherical in shape and have a diameter of less than about 2 mm. Capsules with a mean diameter of about 0.8 mm are well suited.

Das von den Zellen benötigte Gas wird durch Einleiten eines Sauerstoff- und Kohlendioxid enthaltenden Gas durch ein steriles Filter 24, ein Luftrohr 26 und eine Gasfritte zugeführt. Die Gasfritte 28 kann ein Porzellanfilter mit Mikroporen von 2,5 pm sein. Für das Wachstum von Tierzellen kann das Gas 95VoI.% Luft und 51 Kohlendioxid enthalten. Die Gasblasen aus der Gasfritte steigen durch das Medium zwischen den Kapseln auf. Die Perlgeschwindigkeit sollte ausreichen, um einen Sauerstoffpartialdruck im Medium aufrechtzuerhalten, der praktisch dem Sauerstoffpartialdruck im Gas entspricht. Der Sauerstoffdruck im Medium kann somit auf einen Wert eingestellt werden,der dem Wert entspricht, oder etwa darüber liegt, den die Zellen für optimales Wachstum benötigen. Da im Medium Serumbestandteile vorhanden sind, entsteht durch das Durchperlen des Gases ein Schaum, der sich im Raum 30 über dem Medium des Gefäßes 10 sammelt. Sollten die Zellen vorübergehend in den Schaum transportiert werden, so sind sie durch die Kapseln vor der Hydratation und mechanischer Beschädigung geschützt. Auf diese Weise kann das Durchperlen von Gas durch eine Kultur in Kapselform den Sauerstoffbedarf einer wachsenden ZellpopulationThe gas required by the cells is supplied by passing a gas containing oxygen and carbon dioxide through a sterile filter 24, an air tube 26 and a gas frit. The gas frit 28 can be a porcelain filter with micropores of 2.5 μm. For the growth of animal cells, the gas can be 95VoI. % Air and 51 carbon dioxide. The gas bubbles from the gas frit rise through the medium between the capsules. The bubbling speed should be sufficient to maintain an oxygen partial pressure in the medium which practically corresponds to the oxygen partial pressure in the gas. The oxygen pressure in the medium can thus be set to a value that corresponds to or is approximately above the value that the cells need for optimal growth. Since serum components are present in the medium, the bubbling of the gas creates a foam which collects in space 30 above the medium of the vessel 10. If the cells are temporarily transported into the foam, they are protected from hydration and mechanical damage by the capsules. In this way, bubbling gas through a culture in capsule form can meet the oxygen needs of a growing cell population

befriedigen, wodurch extrem hohe Zelldichten erhalten werden können. Das Gas verläßt die Kultur durch den Ausgang 32 und das Filter 34. Ein typischer Gasdurchsatz für eine 30-1-Kultur beträgt 5,6 l/h (0,2 standard cubic feet/h).satisfy, whereby extremely high cell densities can be obtained. The gas leaves the culture through the exit 32 and the filter 34. A typical gas flow rate for a 30-1 culture is 5.6 l / h (0.2 standard cubic feet / h).

Wird das erfindungsgemäße Verfahren chargenweise durchgeführt, so wird das Medium einfach zusammen mit den, die Impfkultur enthaltenden Mikrokapseln in das Gefäß 10 eingebracht; die Kultur wird mit durchperlendem Gas bis zur maximalen Dichte gezüchtet. Die beste Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist vermutlich die, Medium durch die Kultur zu leiten und zwar durch Einführen eines kontinuierlichen oder diskontinuierlichen Mediumstroms durch den Einlaß 38 und Abziehen des Mediums durch das Filterelement 40. Das Filterelement 40 kann aus einem Sieb aus rostfreiem Stahl mit Poren, die kleiner als der Durchmesser der Kapseln sind, z.B. 50 - 100 pm, bestehen. Das Medium kann durch das Ventil 42 abgezogen werden. Die Höhe des Mediums in der Kultur kann durch das durchsichtige Rohr 44 beobachtet werden. Ein typischer Durchsatz für das Medium , das durch den Einlaß 38 ein und durch das Filter 40 austritt, beträgt 4 bis 12 ml/min.If the process according to the invention is carried out in batches, so the medium is simply introduced into the vessel 10 together with the microcapsules containing the inoculation culture; the Culture is grown to maximum density with bubbling gas. The best embodiment of the invention The method is believed to be to pass through the culture by introducing a continuous or discontinuous flow of medium through inlet 38 and withdrawal of the medium through filter element 40. The filter element 40 may consist of a stainless steel screen with pores smaller than the diameter of the capsules, e.g. 50 - 100 pm, pass. The medium can be drawn off through the valve 42. The level of the medium in the culture can be can be observed through the transparent tube 44. A typical flow rate for the medium passing through inlet 38 in and out through the filter 40 is 4 to 12 ml / min.

Sollen von den Zellen produzierte Proteine oder andere Substanzen gewonnen werden, so hängt die Durchführung des Verfahrens vom Verhältnis der effektiven Molekülgröße der interessierenden Substanz und der Permeabilität der Kapselmembran ab. Wie in den oben angegebenen Patentschriften beschrieben wird, kann die Permeabilität der Kapselmembranen innerhalb gewisser Grenzen eingestellt werden. Ist das interessierende Protein zu groß, um die Membran zu passieren, so reichert es sich innerhalb der Mikrokapsel an; ist es für einen Durchgang durch die Membran klein genug, so sammelt es sich im extrakapsulären Raum an.If proteins or other substances produced by the cells are to be obtained, the implementation of the Method of the ratio of the effective molecular size of the substance of interest and the permeability of the capsule membrane away. As described in the patents cited above, the permeability of the capsule membranes can be set within certain limits. If the protein of interest is too large to cross the membrane, then so it accumulates inside the microcapsule; if it is small enough to pass through the membrane, it collects in the extracapsular space.

In der Praxis bestimmt der Fachmann die gewünschte, in dem Medium 22 zu lösende Menge an Sauerstoff und/oder Kohlendioxid. Die gewählten Gaskonzentrationen und-Anteile hängen von der Art der zu kultivierenden Zellen ab, sind jedoch unabhängig von der vorhandenen ober beabsichtigten Zelldichte. Bei den meisten Tierzellen liegt die gewünschte Sauerstoffkonzentration (Partialdruck) zwischen 20 bis 266 mbar (15 - 200 mm Hg). So ist beispielsweise die gewählte Sauerstoffkonzentration für eine Zellkultur größer als die die früher als Mindestbedarf für ein starkes Zellwachstum angegeben wurde, nämlich 0,12 mMol Sauerstoff/l/h/10⁹ Zellen.In practice, the person skilled in the art determines the desired amount of oxygen and / or carbon dioxide to be dissolved in the medium 22. The selected gas concentrations and proportions depend on the type of cells to be cultivated, but are independent of the existing or intended cell density. For most animal cells, the desired oxygen concentration (partial pressure) is between 20 and 266 mbar (15 - 200 mm Hg). For example, the selected oxygen concentration for a cell culture is greater than that previously specified as the minimum requirement for strong cell growth, namely 0.12 mmol oxygen / l / h / 10 ⁹ cells.

Die Konzentration der Gase im Medium hängt praktisch von der Konzentration der Gase im durchgeperlten Gas ab, vorausgesetzt, die Einleitgeschwindigkeit ist hoch genug, um Schwankungen der Sauerstoff/Kohlendioxid-Konzentration, die durch die Zellatmung verursacht werden, auszugleichen. Als Grenzwert sollte die Einleitgeschwindigkeit groß genug sein, um ein Gleichgewicht zwischen dem Gas und der flüssigen Phase im Gefäß 10 aufrechtzuerhalten. Das gewünschte Gasgemisch kann mit der gewählten Einleitgeschwindigkeit der Gasfritte 28 zugeführt werden, die das Gas in die Kultur 22 mit einer solchen Geschwindigkeit abgibt, daß praktisch eine konstante Sauerstoffkonzentration im Medium vorhanden ist. Für ein 30 1 fassendes Kulturgefäß ist eine geeignete Einleitgeschwindigkeit 5,6 l/h (0,2 standard cubic foot/h). Die Kapseln 13 schützen die Zellen 11 im Medium vor mechanischer Beschädigung, Sauerstoffvergiftung oder Dehydratation, wenn die Zellen in den Schaum im Luftraum über dem Medium transportiert werden. Im erfindungsgemäßen Verfahren muß die Sauerstoffkonzentration des Mediums nicht überwacht werden, da sich ein Gleichgewicht zwischen den Konzentrationen der im Medium 22 gelösten Gase und den vorgewählten Konzentrationen der durchgeperlten Gasen einstellt.The concentration of the gases in the medium depends practically on the concentration of the gases in the bubbled gas, provided that the rate of discharge is high enough to prevent fluctuations in the oxygen / carbon dioxide concentration caused by cellular respiration caused to balance. As a limit value, the discharge velocity should be large enough to achieve equilibrium between the gas and the liquid phase in the vessel 10. The desired gas mixture can with the selected inlet speed of the gas frit 28 are fed, which the gas in the culture 22 with such a speed indicates that there is practically a constant oxygen concentration in the medium. For a 30 1 capacity Culture vessel, a suitable feed rate is 5.6 l / h (0.2 standard cubic foot / h). The capsules 13 protect the Cells 11 in the medium from mechanical damage, oxygen poisoning or dehydration if the cells are in the foam be transported in the air space above the medium. In the process according to the invention, the oxygen concentration must of the medium cannot be monitored, since there is an equilibrium between the concentrations of the gases dissolved in the medium 22 and the preselected concentrations of the bubbled gases.

Bei fortdauerndem Durchperlen des Gases tritt bei den Zellen 11 innerhalb der Kapseln 13 Mitose auf. Hat die Zellkultur die gewünschte Zelldichte erreicht, so können die von den Zellen produzierten Substanzen, wie Antikörper, entweder aus dem Inneren der Zellen oder aus dem extrakapsulären Medium gewonnen werden.If the gas is continuously bubbled through, mitosis occurs in the cells 11 within the capsules 13. Did the cell culture When the desired cell density is reached, the substances produced by the cells, such as antibodies, can either can be obtained from inside the cells or from the extracapsular medium.

Durch das Einleiten von Gas in eine Zellkultur in Mikrokapselform im erfindungsgemäßen Verfahren können Zelldichten vonBy introducing gas into a cell culture in microcapsule form in the method according to the invention, cell densities of

etwa 5 χ 10 Zellen/ml nicht suspendierter Kapseln oder etwa¹ about 5 χ 10 cells / ml of unsuspended capsules or about ¹

1x10 Zellen/ml Kulturmedium erreicht werden. Das bedeutet eine Verbesserung von etwa zwei Größenordnungen gegenüber herkömmlichen Kultivierungsverfahren. Neben der höheren Zellproduktausbeute durch Erhöhung der Zelldichte gestattet das erfindungsgemäße Verfahren die Kultivierung von Zellen in großtechnischem Maßstab, da das erfindungsgemäße Durchperlen von Gas durch ein Kulturmedium einen wirkungsvollen Gasaustausch für Säugerzellen in Mikrokapselform bringt.1x10 cells / ml culture medium can be achieved. That means an improvement of about two orders of magnitude over conventional cultivation methods. In addition to the higher cell product yield by increasing the cell density, the method according to the invention allows the cultivation of cells in on an industrial scale, since the bubbling of gas through a culture medium according to the invention results in an effective gas exchange for mammalian cells in microcapsule form.

Die Beispiele erläutern die Erfindung. Beispiel 1 The examples illustrate the invention. example 1

Etwa 800 ml nicht suspendierter Kapseln, die je ml etwa 10 Maus-Hybridomzellen enthalten, werden gleichmäßig in genügend Medium verteilt, um zwei Impfkulturen in Kapselform mit einem Volumen von 3 1 herzustellen. Gleichzeitig werden zwei Medien mit einem Volumen von 3 1 hergestellt, die eine entsprechende Anzahl der gleichen Zellen je Volumensinheit des Mediums enthalten. Als Medium wird Standard-Eagles Medium verwendet, dem 5 I embryonales Kälberserum zugegeben worden ist. Die vier Impfkulturen werden unter schwachem Rühren und ohne Zugabe von frischen Medium 10 Tage kultiviert. Durch eine eingekapselte und eine nicht eingekapselte Kultur wird während 5 Tagen Gas mit einer GeschwindigkeitAbout 800 ml of unsuspended capsules, each ml containing about 10 mouse hybridoma cells, are evenly distributed in sufficient medium to produce two inoculum cultures in capsule form with a volume of 3 liters. At the same time, two media with a volume of 3 liters are produced which contain a corresponding number of the same cells per unit volume of the medium. Standard Eagle's medium to which 5 l of embryonic calf serum has been added is used as the medium. The four inoculum cultures are cultivated for 10 days with gentle stirring and without the addition of fresh medium. An encapsulated and an unencapsulated culture gas is released at one rate for 5 days

von 8,5 l/h (0,3 standard cubic feet/h) und dann von 2,8 l/h (1,0 standard cubic feet/h) durchgeperlt. Die beiden anderen Impfkulturen werden nicht begast. Das eingeleitete Gas besteht aus 5 Vol.I Kohlendioxid und 95 VoI-I Luft. Die Zelldichte der Kulturen wird bestimmt, die Ergebnisse sind in Fig. 3 angegeben.of 8.5 l / h (0.3 standard cubic feet / h) and then 2.8 l / h (1.0 standard cubic feet / h). The two others Inoculation cultures are not fumigated. The gas introduced consists of 5 volumes of carbon dioxide and 95 volumes of air. The cell density of cultures is determined, the results are given in FIG.

Aus Fig. 3 ist ersichtlich, daß nach 6 Tagen die nicht begaste, eingekapselte Kultur auf eine Zelldichte von 8x10 Zellen/ml Kultur und die nicht begaste,herkömmliche Zellkultur auf eine Dichte von 3x10 Zellen/ml gewachsen war. Die begaste, nicht eingekapselte und die begaste,eingekapselte Kultur erreichten eine Dichte von 1,5 χ 10 bzw. 1,3 χ 10 Zellen/ml. Danach fiel die Zelldichte sowohl der nicht begasten als auch der begasten Suspensionskultur rasch ab, bis am 10. Tag die Dichte beider Kulturen unter 2x10 Zellen/ml lag. Das zeigt, das das Durchperlen von Gas durch nicht eingekapselte Kulturen keine deutlich günstigere Wirkung hat, wenn man sie mit der gleichen Kultur vergleicht, die im Medium gelösten Sauerstoff aus dem Luftraum verwertet. Die nicht begaste, eingekapselte Kultur ist nur geringfügig ertragreicher, die Zelldichte beträgt etwa 7x10 Zellen/ml und nimmt am 9. Tag ab. Im Gegensatz dazu steigt die Zelldichte der eingekapselten,begasten Kultur vom 2. Tag bis zum 9. Tag an, die Zelldichte bleibt danach auf etwa 3x10 Zellen/ml. Dieses Beispiel zeigt, daß die Lebensfähigkeit und das Wachstum der Zellen in empfindlichen Tierzellen beschleunigt wird, wenn durch die Kultur in Kapselform Gas geperlt wird, und daß sowohl die Einkapselung als auch das Durchperlen des Gases dafür notwendig sind.From Fig. 3 it can be seen that after 6 days the not fumigated, encapsulated culture to a cell density of 8x10 cells / ml Culture and the non-gassed, conventional cell culture had grown to a density of 3x10 cells / ml. The fumigated The non-encapsulated and the gassed, encapsulated culture reached a density of 1.5 10 and 1.3 10 cells / ml, respectively. Thereafter, the cell density of both the non-fumigated and the fumigated suspension culture fell rapidly until day 10 the density of both cultures was below 2x10 cells / ml. That shows that bubbling gas through unencapsulated cultures does not have a significantly better effect if you use them compares with the same culture that utilizes oxygen from the air space dissolved in the medium. Who did not fumigate encapsulated culture is only slightly more productive, the cell density is about 7x10 cells / ml and increases on the 9th day. In contrast, the cell density of the encapsulated, fumigated culture increases from day 2 to day 9 on, the cell density then remains at about 3x10 cells / ml. This example shows that cell viability and growth accelerated in sensitive animal cells when gas is bubbled through the culture in capsule form, and that both encapsulation and bubbling of the Gas are necessary for this.

Example 2

Zwei eingekapselte Hybridomzellkulturen werden in Eagle-Medium, das mit 5 % embryonalem Kälberserum, dem lOOfachen der Normalkonzentration an Eisen (III)-Ionen und der doppelten Normalkonzentration an Aminosäuren versetzt, worden ist,Two encapsulated hybridoma cell cultures are placed in Eagle medium to which 5 % embryonic calf serum, 100 times the normal concentration of iron (III) ions and twice the normal concentration of amino acids have been added,

suspendiert. Das Medium hat einen osmotischen Druck von etwa 360 mCfemol. Die Kultur 1 hat eine Anfangszelldichte von 5x10 Zellen/ml Kultur. Dieser Kultur wird während 13 Tagen frisches Medium mit einem Durchsatz von 6 ml/min und dann 5 Tage lang mit einem Durchsatz von 11 ml/min zugeführt. Der Kultur 2 (mit einer Anfangszelldichte von 1x10 Zellen/ml) wird 9 Tage lang frisches Medium mit einem Durchsatz von 4 ml/min und dann chargenweise durch Ersatz von 10 1 Medium pro Tag an jedem der Tage 9 bis 20 zugeführt. Durch beide Kulturen wird während des Wachstumszyklus Luft mit einer Geschwindigkeit von 5,6 l/h (0,2 standard cubic feet/h) durchgeperlt. Die Zelldichte jeder Kultur wird bestimmt. Die Ergebnisse sind in den Fig. 4 und 5 angegeben. Aus Fig. 4 ist ersichtlich, daß die kontinuierlich gespeiste Kultur am und nach dem 17. Tag eine Zelldichtesuspended. The medium has an osmotic pressure of about 360 mCfemol. Culture 1 has an initial cell density of 5 × 10 cells / ml of culture. This culture is during Fresh medium for 13 days at a flow rate of 6 ml / min and then for 5 days at a flow rate of 11 ml / min fed. Culture 2 (with an initial cell density of 1x10 cells / ml) is mixed with fresh medium for 9 days a throughput of 4 ml / min and then in batches by replacing 10 1 medium per day on each of days 9 to 20 fed. Air is passed through both cultures at a rate of 5.6 l / h (0.2 standard cubic feet / h) bubbled through. The cell density of each culture is determined. The results are in Figs 5 specified. From Fig. 4 it can be seen that the continuously fed culture on and after the 17th day a cell density

Q OQ O

von 1x10 bis 5 χ 10 Zellen/ml nicht suspendierten Kapseln erreicht. Da das Volumen des Mediums etwa 5 mal größer ist als das Volumen der Kapseln, bedeutet dies, daß die Zelldichte j'
beträgt.from 1 × 10 to 5 × 10 cells / ml of unsuspended capsules is achieved. Since the volume of the medium is about 5 times larger than the volume of the capsules, this means that the cell density j '
amounts to.

7 R7 R

dichte je ml Kultur etwa 2x10 bis 1 χ 10 Zellen /mldensity per ml of culture about 2 × 10 to 1 × 10 cells / ml

Aus Fig. 5 ist ersichtlich, daß die chargenweise gespeisteFrom Fig. 5 it can be seen that the batch fed

Kultur auch eine Dichte über 1x10 Zellen/nil nicht suspendierter Kapseln erreicht.Culture also a density above 1x10 cells / nil unsuspended Capsules reached.

Claims

Expectations

1. Method of culturing cells without cell walls in high density,
marked by

A) bubbling a gas through a growth medium, to the medium with a practically constant and for viability and maintenance to supply sufficient gas concentration to mitosis of the cells, whereby the cells are arranged in spherical, in the medium suspended capsules with semipermeable membranes are located, which the cells protect from physical damage and are so permeable that they are essential for viability and maintaining mitosis of the cells necessary Let constituents through, and

B) Growing the cells.

2. The method according to claim 1,

characterized by the additional stage of gaining either from within the capsules or from the medium of substances produced by the cells.

3. The method according to claim 1 or 2, characterized by the use of animal cells and an oxygen-containing one Gas.

0192-DBH-456 / K / A1

4. The method according to any one of claims 1 to 3, characterized by the use of a gas that also contains carbon dioxide.

5. The method according to any one of claims 1 to 4, characterized by the use of mammalian cells.

6. The method according to any one of claims 1 to 5, characterized by the use of an oxygen-containing gas that has balanced and sufficient amounts of oxygen and Contains carbon dioxide in order to maintain an optimal, practically constant oxygen and carbon dioxide concentration for to maintain metabolism and the acceleration of cell mitosis in the medium.

7. The method according to any one of claims 1 to 6, characterized by the use of a gas with an oxygen partial pressure in the medium of 20 to 265 mbar (i5 - 200 mmHg).

8. The method according to any one of claims 1 to 7, characterized by the use of fused cells as animal cells.

9. The method according to any one of claims 1 to 7, characterized by the use of genetically modified cells.

10. The method according to any one of claims 1 to 7, characterized by the use of myeloma cells.

11. The method according to any one of claims 1 to 10, characterized by marked growing the animal cells to a density of at least about 5x10 cells / ml culture.