DE3531612A1

DE3531612A1 - Verfahren zur herstellung von hyaluronsaeure

Info

Publication number: DE3531612A1
Application number: DE19853531612
Authority: DE
Inventors: Masahiro Tokio/Tokyo Fujii; Hiroshi Yokohama Kanagawa Morita
Original assignee: Chisso Corp
Current assignee: JNC Corp
Priority date: 1984-09-04
Filing date: 1985-09-04
Publication date: 1986-03-27
Also published as: US5071751A; DE3531612C2; FR2569724A1; FR2569724B1; FR2616802B1; FR2616802A1

Description

Chisso Corporation
Osaka/Japan

Verfahren zur Herstellung von Hyaluronsäure

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Hyaluronsäure mit einem Mikroorganismus, der in der Lage ist, Hyaluronsäure zu erzeugen (nachfolgend kurz als "Hyaluronsäure erzeugende Mikrobe" bezeichnet). Insbesondere betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von Hyaluronsäure, bei dem eine Hyaluronsäure erzeugende Mikrobe in einem Kulturmedium, das durch bestimmte Zusätze gekennzeichnet ist, inkubiert wird, um in dem Kulturmedium Hyaluronsäure zu gewinnen und anzusammeln, und bei dem diese dann isoliert wird.

Hyaluronsäure existiert in Bindegeweben wie beispielsweise Gelenken, Glaskörpern, Nabelschnüren, Knorpeln, Häuten und Geflügelkämmen als deren Bestandteil, der wichtige Funktionen innehat wie die Gewährleistung der Flexibilität und der Struktur von Geweben und der Stoffwechselregulierung von Zellen. Hyaluronsäure ist ein sehr großes hochmolekulargewichtiges Polymeres, und eine Lösung davon weist eine hohe Viskoelastizitat und eine wasserhaltende Funktion auf. Demzufolge hat Hyaluronsäure eine Vielzahl von Anwendungen in der Kosmetik und in Arzneimitteln für Wunden, Augenwässern und Arzneimitteln für Arthritis gefunden.

Hyaluronsäure wurde bisher kommerziell nach einem Verfah-

ren erhalten, bei dem es aus Geflügelkämmen, Glaskörpern von Rinderaugen, Nabelschnüren, Walknorpeln und dergleichen extrahiert wurde. Aus lebenden Körpern nach dem Extraktionsverfahren gewonnene Hyaluronsäure liegt jedoch in Form eines Komplexes mit einem Protein oder einem Mucopolysaccharid wie beispielsweise Chondroitin vor, und muß daher komplizierten Arbeitsschritten zur Abtrennung und Reinigung unterzogen werden. Da sie ferner in den

TO meisten Fällen in Form einer Mischung mit Hyaluronidase vorliegt, erwies es sich als nachteilig, daß eine derartige Hyaluronsäure während der Extraktion und der Reinigungsstufen unter Verminderung ihres Molekulargewichts abgebaut werden kann, wodurch in der Folge ihre Viskosität und ihre Fähigkeit, Wasser zu halten, vermindert werden. Angesichts dieser Nachteile wurde in der offengelegten japanischen Patentanmeldung Nr. 56692/1983 ein Versuch beschrieben, Hyaluronsäure nach einem Kultivierverfahren herzustellen. Ein kritischer Punkt dieses Verfahrens ist es jedoch, daß seine Leistungsfähigkeit im Hinblick auf die Erzeugung von Hyaluronsäure gering ist.

Die Erfinder der vorliegenden Erfindung führten intensive Untersuchungen durch, um das genannte Problem bei der Herstellung von Hyaluronsäure mit Hilfe von Mikroben zu lösen. Das Ergebnis dieser Untersuchungen ist die vorliegende Erfindung.

Der vorliegenden Erfindung liegt somit die Aufgabe zugründe, ein Verfahren zur Herstellung von Hyaluronsäure auf biotechnologischem Wege mit einer stabilen und stark erhöhten Leistungsfähigkeit bei niedrigen Kosten anzugeben.

Diese Aufgabe wird durch ein Verfahren gelöst, wie es in den Patentansprüchen beschrieben wird.

Diese Aufgabe wird somit dadurch gelöst, daß für die Inkubation einer Hyaluronsäure erzeugenden Mikrobe ein Kulturmedium verwendet wird, das gemäß einer ersten Alternative als Zusatz ein Blutserum enthält, oder das gemäß einer zweiten Alternative als Zusatz ein bakteriolytisches

Enzym, ein oberflächenaktives Mittel oder ein bakteriolytisches Enzym plus oberflächenaktives Mittel enthält. Durch diese Zusätze wird die Ausbeute an Hyaluronsäure bei den Verfahren dieser Art erheblich erhöht. 10

Nachfolgend wird die Erfindung noch näher erläutert.

Als Hyaluronsäure erzeugende Mikroben, die in dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden können, können beispielsweise erwähnt werden Streptococcus pyogenes, Streptococcus equi, Streptococcus equisimilis, Streptococcus dysgalactiae, Streptococcus zooepidemicus und Pasteurella multocida.

Als Serum kann bei dem erfindungsgemäßen Verfahren irgendeines der Seren Rinderblutserum, Pferdeblutserum, Schweineblutserum, Ziegenblutserum, Schafblutserum, Geflügelblutserum und menschliches Blutserum verwendet werden. Als Rinderblutserum kann ein Blutserum verwendet werden, das von einem Fötus, einem neugeborenen Kalb, einem Kalb, einer Kuh oder einem Bullen gewonnen wurde. Anstelle des Blutserums kann auch Gesamtblut von einem Rind, einem Pferd, einem Schwein, einer Ziege, einem Schaf, einem Geflügel oder einem Menschen verwendet werden. Alternativ dazu kann auch ein von einem Blutserum irgendeines der genannten Tiere oder eines Menschen abgeleiteter Bestandteil anstelle von Blutserum verwendet v/erden. Die Menge des dem Kulturmedium zuzusetzenden Blutserums liegt vorzugsweise im Bereich von 0,3 bis 5,0 Volumen%, vorzugsweise bei 1,5 Volumen%.

Als bakteriolytisches Enzym können in dem erfindungsgemäßen Verfahren alle bakteriolytisch aktiven Enzyme verwendet werden, wobei jedoch Lysozym besonders bevorzugt ist. Die Menge des zu dem Kulturmedium zugesetzten bakteriolytischen Enzyms ist keinen speziellen Einschränkungen unterworfen, liegt jedoch vorzugsweise im Bereich von 100 bis 2.500 Einheiten, besonders bevorzugt von 300 bis 2.000 Einheiten, und ganz besonders bevorzugt von 500 bis 1.000 Einheiten, jeweils pro Liter Kulturmedium. Eine zu geringe Menge des zugesetzten bakteriolytischen Enzyms führt dazu, daß nur eine geringe Menge von Hyaluronsäure gewonnen und angesammelt wird. Eine zu große Menge des zugesetzten bakteriolytischen Enzyms führt in nachteiliger Weise zu einer derart starken Bakteriolyse, daß das Wachstum der Hyaluronsäure erzeugenden Mikrobe gestört wird.

Was den Zeitpunkt der Zugabe des bakteriolytischen Enzyms zu dem Kulturmedium betrifft, so ist es bevorzugt, die Zugabe unter aseptischen Bedingungen nach der Sterilisation eines Kulturmediums, zu dem das Enzym zugesetzt werden soll, durchzuführen, beispielsweise nach einer Sterilisation nach dem Druckdampf-Sterilisierverfahren, und einem anschließenden Abkühlen auf eine Temperatur von 45°C oder weniger.

Beispiele für oberflächenaktive Mittel, die in dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden können, sind Cetyltrimethylammoniumbromid, Cetylpyridiniumchlorid, Tween 80 (Handelsname eines von Kao Kagaku Kabushiki Kaisha hergestellten Tensids), Tween 90 (Handelsname eines von Kao Kagaku Kabushiki Kaisha hergestellten Tensids), Natriumlaurylsulfat, Triton X-IOO (Handelsname eines von Rohm & Haas Co. hergestellten Tensids), Span 80 (Handelsname eines von Kao Kagaku Kabushiki Kaisha hergestellten Tensids), Span 90 (Handelsname eines von Kao Kagaku Kabu-

shiki Kaisha hergestellten Tenside), Nonion (Handelsname eines von Nippon Oil & Fats Co., Ltd. hergestellten Tensids) und Diethylhexylsulfosuccinat. Die Menge des zu dem Kulturmedium zuzusetzenden oberflächenaktiven Mittels beträgt vorzugsweise 0,5 bis 10 g, bevorzugt 0,5 bis 3 g, und besonders bevorzugt 1,0 bis 2,0 g, jeweils pro Liter des Kulturmediums. Das oberflächenaktive Mittel wird zu dem Kulturmedium vor der Sterilisierung des Kulturmediums mit Druckdampf zugesetzt.

Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren kann das Kulturmedium, dem anschließend das Blutserum oder das bakteriolytische Enzym und/oder das oberflächenaktive Mittel zugesetzt wird, irgendein üblicherweise für die Inkubation einer Hyaluronsäure erzeugenden Mikrobe verwendetes Kulturmedium sein, das beispielsweise 2,0 bis 3,0 % Glucose, 0,3 % Kaliumdihydrogenphosphat, 0,2 % Kaliummonohydrogenphosphat, 0,01 % Natriumthiosulfat, 0,01 % Magnesiumsulfatheptahydrat, 0,002 % Natriumsulfit, 0,001 % Kobalt(ll)-chlorid, 0,001 % Mangan(II)chlorid und 0,5 % eines Entschäumungsmittels enthält, und das beispielsweise einen pH von 6,0 bis 8,5 aufweist, oder ein Medium, das 2,0 % Glucose, 0,3 % Kaliumdihydrogenphosphat, 0,2 % Kaliummonohydrogenphosphat, 0,01 % Natriumthiosulfat, 0,01 % Magnesiumsulfat-heptahydrat, 0,002 % Natriumsulfit und 0,5 % eines Entschäumungsmittels enthält und einen pH von beispielsweise 6,0 bis 8,5 aufweist (dabei bedeutet die Angabe % wie auch in der nachfolgenden Beschreibung % Gewicht pro Volumen, wobei das Gewicht und das Volumen als Gramm und Liter ausgedrückt werden, es sei denn, die nachfolgende Beschreibung definiert % anders).

Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren zur Herstellung von Hyaluronsäure wird ein Kulturmedium, das kein Blutserum enthält, sterilisiert, beispielsweise nach dem Druckdampf-

Sterilisierverfahren, und auf eine Temperatur von 45°C oder darunter abgekühlt, bei der das Blutserum zu dem erwähnten Kulturmedium unter aseptischen Bedingungen zugesetzt werden kann. Anschließend wird eine Hyaluronsäure erzeugende Mikrobe auf das erhaltene Kulturmedium überimpft. Das Kulturmedium wird dann durch Durchblasen von Luft bewegt oder bei Raumtemperatur 1 bis 2 Tage bei einer Temperatur von vorzugsweise 25°C bis 40⁰C, besonders bevorzugt bei 35°C, stehengelassen und bei einem kontrollierten pH von vorzugsweise 6,5 bis 8,0, besonders bevorzugt von etwa 7,0, um die Inkubation zu bewirken, woran sich die weitere Zugabe eines Saccharid-Bestandteils in einer Menge von 3 % und eine weitere Inkubation für einen Zeitraum von 10 Stunden bis 2 Tagen anschließt, um Hyaluronsäure zu gewinnen und anzusammeln.

Alternativ dazu wird ein Kulturmedium, das weder ein bakteriolytisches Enzym noch ein oberflächenaktives Mittel enthält oder ein Kulturmedium, das ein oberflächenaktives Mittel und kein bakteriolytisches Enzym enthält, sterilisiert, beispielsweise nach dem Druckdampf-Sterilisierverfahren, und auf eine Temperatur von 45°C oder darunter abgekühlt, bei der ein bakteriolytisches Enzym zu dem Kulturmedium unter aseptischen Bedingungen zugesetzt wird, woran sich das Überimpfen einer Hyaluronsäure erzeugenden Mikrobe auf das erhaltene Kulturmedium unter aseptischen Bedingungen anschließt. Wenn kein bakteriolytisches Enzym zugesetzt werden soll, wird ein ein oberflächenaktives Mittel enthaltendes Kulturmedium sterilisiert, beispielsweise nach dem erwähnten Druckdampf-Sterilisierverfahren, und auf eine Temperatur von 45°C oder darunter abgekühlt, bei der eine Hyaluronsäure erzeugende Mikrobe auf das Kulturmedium unter aseptischen Bedingungen überimpft wird. Das Kulturmedium wird dann durch Durchblasen eines Luft-

Stroms bewegt oder stehengelassen, vorzugsweise bei einer Temperatur von 25°C bis 4O°C, besonders bevorzugt von 3O°C bis 35⁰C, und bei einem kontrollierten pH von vorzugsweise 6,5 bis 8,0, besonders bevorzugt von 7,0, und zwar für einen Zeitraum von 1 bis 2 Tagen, um die Inkubation zu bewirken. Daran schließt sich eine weitere Zugabe eines Saccarid-Bestandteils in einer Menge von 3 % zu dem Kulturmedium und eine weitere Inkubation für 1 bis 2 Tage zur Gewinnung und Ansammlung von Hyaluronsäure an.

Danach wird das Kulturmedium durch Zentrifugentrennung oder Filtration von der Mikrobe befreit, und das erhaltene Filtrat wird durch Ultrafiltration oder Dialyse von niedermolekulargewichtigen Substanzen befreit. Anschliessend kann ein Alkohol wie beispielsweise Methanol oder Ethanol zu dem von niedermolekulargewichtigen Substanzen befreiten Filtrat zugesetzt werden, um ein rohes Hyaluronsäureprodukt auszufällen. Die ausgefällte Hyaluronsäure wird dann in Wasser wieder aufgelöst. Danach wird Cetyltrimethylammoniumbromid zu der erhaltenen Lösung zugesetzt, um eine differenzierte Ausfällung mit dem Cetyltrimethylammoniumbromid zu bewirken. Anschließend wird ein bekanntes Reinigungsverfahren wie beispielsweise eine Ionenaustausch-Chromatographie oder eine Gel-Permeations-Chromatographie zur Reinigung der erhaltenen Hyaluronsäure verwendet.

Indem man gemäß der vorliegenden Erfindung ein Kulturmedium verwendet, das als Zusatz ein Blutserum oder ein bakteriolytisches Enzym und/oder ein oberflächenaktives Mittel enthält, wird die Ausbeute an Hyaluronsäure pro Liter Kulturmedium, verglichen mit einem Inkubationsverfahren, das unter Verwendung eines üblichen Kulturmediums, das keinen der genannten Zusätze enthält, durchgeführt

wird, erheblich verbessert, beispielsweise um das 4 bis 5fache (vgl. Vergleichsbeispiele). Da es außerdem so gut wie keine Qualitätsabweichungen zwischen verschiedenen Proben des zu verwendenden bakteriolytischen Enzyms und des oberflächenaktiven Mittels gibt, kann Hyaluronsäure stets in konstanter Qualität und mit konstanter Ausbeute hergestellt werden. Somit schafft die vorliegende Erfindung ein epochemachendes Verfahren zur Herstellung von Hyaluronsäure. Der Gehalt an Verunreinigungen in der nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhaltenen Hyaluronsäure ist so außerordentlich gering, daß das Produkt des erfindungsgemäßen Verfahrens eine Hyaluronsäure der höchsten Qualitätsstufe ist. Sie kann daher in vorteilhafter Weise für Anwendungen auf pharmazeutischen und kosmetischem Gebiet verwendet werden.

Wie eben erläutert wurde, hat es sich bestätigt, daß das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung von Hyaluronsäure ein Verfahren ist, das in der Lage ist, Hyaluronsäure hoher Reinheit auf stabile Weise mit einer hohen Leistungsfähigkeit zu erzeugen.

Die nachfolgenden Beispiele erläutern die vorliegende Erfindung im Vergleich mit Vergleichsbeispielen, wobei diese Beispiele jedoch nicht im Sinne einer Beschränkung des Schutzbereichs der Erfindung ausgelegt werden dürfen.

Streptococcus equi, FERM Nr. BP-879 (FERM, Kitaku Gyomu Kakari, Tokyo Biseibutsu Kitaku Center, Kogyogizitsuin Biseibutsu Kogyo Gizitsu Kenkyujyo, Higashi, 1-1-3, Yatabemachi, Tsukubagun, Ibarakiken, Japan 305), der in dem erfindungsgemäßen Verfahren als Hyaluronsäure erzeugende Mikrobe verwendet wurde, wurde vom Medical Science Research Institute, das mit dem Medical Department der

Tokyo University verbunden ist, erhalten, und Streptococcus zooepidemicus, PERM Nr. BP-878, wurde vom National Institute of Animal Health des Ministeriums für Landwirtschaft, Forstwesen und Fischereiwesen von Japan erhalten. 5

Beispiel 1 und Vergleichsbeispiel 1

22,5 ml eines Blutserums aus einem neugeborenen Rind wurden unter aseptischen Bedingungen zu 1,5 1 eines Kulturmediums zugesetzt, das 2,0 % Glucose, 0,3 % Kaliumdihydrogenphosphat, 0,2 % Kaliummonohydrogenphosphat, 0,011 % Natriumthiosulfat, 0,01 % Magnsiumsulfat-heptahydrat, 0,002 % Natriumsulfit und 1,0 % Sojaöl enthielt und einen pH von 7,0 aufwies. 100 ml eines im voraus hergestellten Kulturmediums von Streptococcus equi wurden auf das erhaltene Kulturmedium überimpft, und die Mikrobe wurde mit einem Luftstrom mit einer Begasungsrate von 0,7 vvm bei einer Rührergeschwindigkeit von 300 U/min bei einer Temperatur von 35°C 40 Stunden inkubiert, wobei der pH Wert automatisch auf 7,0 eingeregelt wurde. Danach wurden zu dem Kulturmedium unter aseptischen Bedingungen 25 g Glucose zugesetzt, woran sich eine weitere 10-stündige Inkubation anschloß. 1,6 1 eines ionenausgetauschten Wassers wurden anschließend zu dem erhaltenen Kulturmedium zugesetzt, woran sich eine Zentrifugenabscheidung zur Entfernung der Mikrobe anschloß. Zu dem auf diese Weise erhaltenen Überstand wurde verdünnte Salzsäure zugesetzt, um den pH auf 5,5 einzustellen. Die erhaltene Lösung wurde mit Hilfe eines Hohlfaser-Ultrafilters auf ein Volumen von 0,75 1 konzentriert und gegen ionenausgetauschtes Wasser dialysiert. Die erhaltene Lösung wurde nach bekannten Verfahren gereinigt; und zwar nacheinander durch differenzierende Fällung mit Ethylalkohol, Behandlung mit Cetylpyridinylammoniumchlorid und durch Chromatographie mit

Ionenaustausch-Cellulofine (Handelsname), wobei 8,7 g eines weißen Pulvers eines gereinigten Natriumhyaluronats erhalten wurden.

Die Menge des Produkts betrugt 5,8 g pro Liter des Kulturmediums. Der Proteingehalt des gereinigten Natriumhyaluronats betrugt 0,05 Gew.%. Das Molekulargewicht des gereinigten Natriumhyaluronats wurde durch Gel-Permeationschromatrographie mit Sepharose 6B (Handelsbezeichnung), hergestellt von Pharmacia Finechemicals Co., bestimmt und zu 2 χ 10 Dalton ermittelt. Eine physiologische Kochsalzlösung, die 1 Gew.% Natriumhyaluronat enthielt, wurde intravenös einem Kaninchen injiziert, das jedoch keinerlei pyrogene Reaktion zeigte.

In einem als Vergleichsbeispiel 1 durchgeführten Durchgang wurde eine Hyaluronsäure erzeugende Mikrobe unter den gleichen Bedingungen in dem gleichen Verfahren wie in Beispiel 1 inkubiert, mit der Ausnahme, daß ein Kulturmedium verwendet wurde, bei dem gegenüber Beispiel 1 der Serumsbestandteil weggelassen worden war. Das erhaltene Kulturmedium wurde der gleichen Behandlung und Reinigung wie in Beispiel 1 unterzogen, wobei 0,9 g eines weißen Pulvers eines gereinigten Natriumhyaluronats erhalten wurden. Die Menge des Produkts betrugt 0,6 g pro Liter des Kulturmediums.

Beispiel 2

1,5 1 eines Kulturmediums/ das 2,0 % Glucose, 0,5 % eines Hefeextrakts, 1,5 % Pepton, 0,3 % Kaliumdihydrogenphosphat, 0,2 % Kaliummonohydrogenphosphat, 0,011 % Natriumthiosulfat, 0,01 % Magnesiumsulfat-heptahydrat, 0,002 % Natriumsulfit, 0,001 % Kobalt(II)Chlorid, 0,001 % Mangan-

(Il)chlorid und 0,5 % Sojabohnenöl enthielt und einen pH von 7,0 aufwies, wurden in einen Kleinfermenter (minijar fermentor) mit einem Innenvolumen von 3,0 1 gegossen und mit Druckdampf bei 120⁰C 15 Minuten sterilisiert, wonach auf Raumtemperatur abgekühlt wurde. 0,75 mg (675 Einheiten) Eialbumin-Lysozym wurden unter aseptischen Bedingungen zu dem erhaltenen Kulturmedium zugesetzt. Anschließend wurden 0,1 1 eines im voraus hergestellten Kulturmediums von Streptococcus zooepidemicus auf das Kulturmedium überimpft, und die Mikrobe wurde unter einem Luftstrom von 0,7 vvm bei einer Rührergeschwindigkeit von 300 U/min bei 35°C 24 Stunden inkubiert, wobei der pH automatisch auf 7,0 eingeregelt wurde. Danach wurden 100 ml einer 50 %igen wäßrigen Glucoselösung unter aseptischen Bedingungen zu dem Kulturmedium zugesetzt. Die Inkubation wurde unter den obigen Inkubationsbedingungen 26 Stunden fortgesetzt. Zu dem erhaltenen Kulturmedium wurden 3,2 1 eines ionenausgetauschten Wassers zugesetzt, wonach gerührt wurde und eine Zentrifugenabscheidung zur Entfernung der Mikrobe durchgeführt wurde. Der auf diese Weise erhaltene überstand wurde mit Hilfe eines Hohlfaser-Ultrafilters auf 1,6 1 konzentriert und gegen ionenausgetauschtes Wasser dialysiert. Zu der erhaltenen Lösung wurde Natriumacetat zugesetzt, so daß ein Natriumacetat-Gehalt von 0,5 % erhalten wurde, woran sich die Zugabe von 5 1 Ethanol zur Ausfällung von Polysacchariden einschließlich Hyaluronsäure anschloß, die anschließend durch Zentrifugenabscheidung isoliert wurden.

Die isolierten Polysaccharide, die Hyaluronsäure enthielten, wurden in 0,5 1 ionenausgetauschtem Wasser aufgelöst, und es wurden 0,23 1 einer 4 %igen wäßrigen Cetyltrimethylammoniumbromidlösung zu der erhaltenen Lösung zugesetzt, woran sich die Abtrennung eines gebildeten Niederschlag anschloß. Der Niederschlag wurde in 40 ml einer

wäßrigen Natriumchloridlösung mit einer Konzentration von 0,3 mol/1 dispergiert, woran sich eine Zentrifugenabscheidung anschloß. Zu der überstehenden Lösung wurden 120 ml Ethanol zugesetzt, woran sich die Abtrennung eines gebildeten Niederschlags anschloß. Der Niederschlag wurde in ionenausgetauschtem Wasser aufgelöst, durch Ionenaustausch-Chromatographie gereinigt und es wurden 7,8 g eines weißen Pulvers von gereinigtem Natriumhyaluronat erhalten. Die Menge des Produkts betrug 5,2 g pro Liter des Kulturmediums. Das gereinigte Natriumhyalurat hatte einen Proteingehalt von 0,05 Gew.%. Die Grenzviskosität (η ) des gereinigten Natriumhyaluronats betrug, gemessen mit einem Übbellohde-Viskometer, 17,3 dl/g. Dadurch wurde bestätigt, daß das Molekulargewicht 1.005.000 Dalton betrug.

Beispiel 3

1,5 1 eines Kulturmediums, das 2,0 % Glucose, 0,5 % Hefeextrakt, 1,5 % Pepton, 0,3 % Kaliumdihydrogenphosphat, 0,2 % Kaliummonohydrogenphosphat, 0,011 % Natriumthiosulfat, 0,01 % Magnesiumsulfat-heptahydrat, 0,002 % Natriumsulfit, 0,001 % Kobalt (iDchlorid, 0,001 % Mangan-(Il)chlorid, 0,5 % Sojabohnenöl und 1,5 g Tween 80 (Handelsbezeichnung) als oberflächenaktives Mittel enthielt und einen pH von 7,0 aufwies, wurden in einen Kleinfermenter (minijar fermentor) mit einem Innenvolumen von 3,0 1 gegossen und mit Druckdampf bei 120°C 15 Minuten sterilisiert, wonach auf Raumtemperatur abgekühlt wurde. Anschließend wurden O₇I 1 eines vorher hergestellten KuI-turmediuins von Streptococcus equi auf das erhaltene Kulturmedium unter aseptischen Bedingungen überimpft, und die Mikrobe wurde unter den gleichen Inkubationsbedingungen nach dem gleichen Inkubationsverfahren wie in Beispiel 2 inkubiert. Danach wurde das Kulturmedium der gleichen Rei-

nigungsbehandlung wie in Beispiel 2 unterzogen, und es wurden 6,1 g eines weißen Pulvers von Natriumhyaluronat erhalten. Die Menge des Produkts betrug 4,1 g des Kulturmediums. Das gereinigte Natriumhyaluronat wies einen Proteingehalt von 0,03 Gew.% auf. Die Grenzviskosität (r£ ) betrug, gemessen mit einem Ubbellohde-Viskometer, 12,0 dl/g. Dadurch wurde bestätigt, daß das Molekulargewicht 628.000 Dalton betrug.

Beispiel 4

0,7 g Tween 80 (Handelsname) als oberflächenaktives Mittel wurden zu 1,5 1 eines Kulturmediums zugesetzt, das 2,0 % Glucose, 0,5 % Hefeextrakt, 1,5 % Pepton, 0,3 % Kaliumdihydrogenphosphat, 0,2 % Kaliummonohydrogenphosphat, 0,011 % Natriumthiosulfat, 0,01 % Magnesiumsulfat-heptahydrat, 0,002 % Natriumsulfit, 0,001 % Kobalt(iDchlorid, 0,001 % Mangan(IDchlorid und 0,5 % Sojabohnenöl enthielt und einen pH von 7,0 aufwies. Das Kulturmedium wurde anschließend in einen Kleinfermenter mit einem Innenvolumen von 3,0 1 gegossen und mit Druckdampf bei 120°C 15 Minuten sterilisiert, woran man auf Raumtemperatur abkühlen ließ. 0,4 mg (360 Einheiten) Eialbumin-Lysozym wurden dann zu dem Kulturmedium unter aseptischen Bedingungen zugesetzt.

Anschließend wurden 0,1 1 eines vorher hergestellten Kulturmediums von Streptococcus zooepidemicus auf das Kulturmedium überimpft und die Mikrobe wurde unter den gleichen Inkubationsbedingungen und nach dem gleichen Inkubationsverfahren wie in Beispiel 2 inkubiert. Anschließend wurde das erhaltene Kulturmedium der gleichen Reinigungsbehandlung wie in Beispiel 2 unterzogen, und es wurden 8,0 g eines weißen Pulvers eines gereinigten Natriumhyaluronats erhalten. Die Menge des Produkts betrug 5,3 g pro Liter des Kulturmediums. Das gereinigte Natriumhyaluronat wies

einen Proteingehalt von 0,04 Gew.% auf. Die Grenzviskosität (τι ) betrug, gemessen mit einem Ubbellohde-Viskometer, 15,0 dl/g. Dadurch wurde bestätigt, daß das Molekulargewicht 837.000 Dalton betrug.

Vergleichsbeispiel 2

1,5 1 eines Kulturmediums, das 2,0 % Glucose, 0,5 % Hefeextrakt, 1,5 % Pepton, 0,3 % Kaliumdihydrogenphosphat, 0,2 % Kaliummonohydrogenphosphat, 0,011 % Natriumthiosulfat, 0,01 % Magnesiumsulfat-heptahydrat, 0,002 % Natriumsulfit, 0,001 % Kobalt(Il)chlorid, 0,001 % Mangan-(Il)chlorid und 0,5 % Sojabohnenöl enthielt und einen pH von 7,0 aufwies, wurden in einen Kleinfermenter mit einem Innenvolumen von 3,0 1 gegossen und mit Druckdampf bei 120°C 15 Minuten sterilisiert, wonach auf Raumtemperatur abgekühlt wurde. Anschließend wurden 0,1 1 eines vorher hergestellten Kulturmediums von Streptococcus zooepidemicus auf das Kulturmedium überimpft, und die Mikrobe wurde unter den gleichen Inkubationsbedingungen und nach dem gleichen Inkubationsverfahren wie in Beispiel 2 inkubiert. Danach wurde das Kulturmedium der gleichen Reinigungsbehandlung wie in Beispiel 2 unterzogen, und es wurden 1,5 g eines weißen Pulvers eines gereinigten Natriumhyaluronats erhalten. Die Menge des Produkts betrug 1,0 g pro Liter des Kulturmediums. Das gereinigte Natriumhyaluronat hatte einen Proteingehalt von 0,03 Gew.%. Die Grenzviskosität (η ) betrug, gemessen mit einen Ubbellohde-Viskometer, 12,0 dl/g. Dadurch wurde bestätigt, daß das Molekulargewicht 628.000 Dalton betrug.

Claims

PATENT-UND RECHTSANWÄLTE PATENTANWÄLTE DIPL.-ING. W. EITLE · DR. RER. NAT. K. HOFFMANN · DIPL.-ΙΝβ. W. LEHN DIPL.-INQ. K. FDOHSLE . DR. RER. NAT. B. HANSEN . DR. RER. NAT. H.-A. BRAUNS ■ DIPL-ΙΝΘ. K. DIPL-ING. K. KOHLMANN · RECHTSANWALT A. NETTE 42 525 and/kü Chisso Corporation Osaka/Japan Verfahren zur Herstellung von Hyaluronsäure Patentansprüche

1. Verfahren zur Herstellung von Hyaluronsäure mit den Stufen

Inkubieren eines Mikroorganismus, der in der Lage ist, Hyaluronsäure zu erzeugen, in einem Kultur-

medium, das entweder

a) Blutserum oder ν

b) ein bakteriolytisches Enzym und/oder ein oberflächenaktives Mittel

als Zusatz enthält, um in dem Kulturmedium Hyaluronsäure zu gewinnen und anzusammeln, und

Isolieren von Hyaluronsäure aus dem Kulturmedium.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das genannte Blutserum ein Serum aus der Gruppe ist, die aus Rinderblutserum, Pferdeblutserum, Schweineblutserum, Ziegenblutserum, Schafblutserum, Geflügelblutserum und menschlichem Blutserum besteht.

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3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet , daß als das genannte Blutserum Gesamtblut verwendet wird, wobei dieses Gesamtblut aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Rinderblut, Pferdeblut, Schweineblut, Ziegenblut, Schafblut, Geflügelblut und menschlichem Blut besteht.

4. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß als Blutserum ein von Blutserum abgeleiteter Bestandteil verwendet wird, wobei dieser Bestandteil von einem Blutserum der Gruppe Rinderblutserum, Pferdeblutserum, Schweineblutserum, Ziegenblutserum, Schafblutserum, Geflügelblutserum und menschlichem Blutserum abgeleitet ist.

5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als bakteriolytisches Enzym Lysozym verwendet wird.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet , daß der Mikroorganismus, der in der Lage ist, Hyaluronsäure zu erzeugen, auf das Kulturmedium überimpft wird, das als Zusatz Blutserum oder ein bakteriolytisches Enzym und/oder ein oberflächenaktives Mittel enthält, und das erhaltene Kulturmedium zur Bewirkung der Inkubation durch Durchleiten eines Luftstroms bewegt oder mit Luft in Berührung gebracht wird, während die Inkubationstemperatur im Bereich von 25⁰C bis 40°C und der pH-Wert im Bereich von 6,5 bis 8,0 gehalten wird, um Hyaluronsäure zu gewinnen und anzusammeln.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet , daß der Mikroorganismus, der in der Lage ist, Hyaluronsäure zu erzeugen, aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Streptococcus equi, streptococcus zooepidemicus, Streptococcus pyogenes, Streptococcus equisimilis und Streptococcus dysgalactiae besteht.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch

gekennzeichnet, daß der Mikroorganismus, der in der Lage ist, Hyaluronsäure zu erzeugen, Streptococcus equi (FERM Nr. BP-879) ist.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch

gekennzeichnet, daß der Mikroorganismus, der in der Lage ist, Hyaluronsäure zu erzeugen, Streptococcus zooepidemicus (FERM Nr. BP-878) ist.