DE3539977A1 - Spektrofluorophotometer - Google Patents
SpektrofluorophotometerInfo
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Description
HITACHI, Ltd ' 11. November 1985
H 6641 Al/fa
Spektrofluorophotometer
Die Erfindung betrifft ein Spektrofluorophotometer mit
1,_ Datenverarbeitungsfunktionen und insbesondere ein Spektrofluorophotometer,
welches zur Messung eines Spektrums geeignet ist, das eine Korrekturbehandlung erfordert.
Wenn das Erregungs- oder Fluoreszenzspektrum einer Probe nn mit Hilfe eines Fluorophotometers bestimmt wird, werden
die Wellenlängenscharakteristiken des Photometers mit einer Lichtquelle, einem Spektroskop und einem Detektor einem
der Probe eigenen Spektrum überlagert. Um ein der Probe eigenens Spektrum zu erhalten, ist es erforderlich,
oc. den Effekt der Wellenlängencharakteristiken des Photometers
zu eliminieren. Um diese Forderung zu erfüllen, wird ein von einer Lichtquelle kommender Lichtstrahl durch einen
Strahlenteiler geteilt, um ein Verhältnis der fluorometrischen Intensitäten, gemessen mit einem überwachungsnachweissystem
und einem Fluoreszenznachweissystem, zu
erhalten und hierdurch den Einfluß der Wellenlängencharakteristiken
einer Lichtquelle zu eliminieren, wie in US-PS 4 198 567 gezeigt.
__ Um die Einflüsse der Wellenlängen eines Spektroskops und
35
eines Detektors zu eliminieren, wird eine Probe, deren Wellenlängencharakteristiken bekannt sind, im voraus einer
Messung unterworfen, um die Wellenlängencharakteristiken
1 des Spektroskops und des Detektors zu bestimmen. Die Spektrumskorrektur
erfolgt, nachdem eine Probe, deren Wellenlängencharakteristiken unbekannt sind, einer Messung unterworfen
worden ist, um ein der letzteren Probe eigenes Spektrum zu erhalten.
Die Wellenlängencharakteristiken eines Spektroskops - ändern
sich in Abhängigkeit von der Schlitzbreite. Demzufolge werden die Spektrumskorrekturen während der Bestimmung
der Wellenlängencharakteristiken eines Spektroskops und die Spektrumskorrektur während der Messung einer Probe
mit einer Schlitzbreite durchgeführt, welche auf ein einheitliches Niveau festgelegt ist.
Da eine Spektrumskorrekturbehandlung in großem Umfang in den letzten Jahren durchgeführt worden ist, gab es eine
starke Nachfrage nach der Entwicklung von Techniken zur Durchführung einer solchen Behandlung mit hoher Genauigkeit,
selbst wenn die Schlitzbreite variiert.
Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, ein Spektrofluorophotometer zu schaffen, mit welchem die Wellenlängencharakteristiken
eines Photometers mit großer Genauigkeit, selbst wenn die Schlitzbreite variiert wird, korrigiert
und das Spektrum, welches einer Probe eigen ist, mit großer Genauigkeit bestimmt werden kann.
Um diese Aufgabe zu lösen, wurde eine Spektrumskorrekturbehandlung
erörtert, um folgendes zu entdecken. Bei einer konventionellen Spektrumskorrekturbehandlung wird eine
Verhältnisberechnungsbehandlung durchgeführt, um die Wellenlängencharakteristiken einer Lichtquelle zu eliminieren.
Eine Nullpunktsabweichung in einem Fluoreszenznachweissystem wird gemessen, um den Nullpunkt in einem
Photometer zu justieren, um hierdurch die Spektrumskorrektur
durchzuführen. Eine Abweichung des Nullpunktes in einem Uberwachungsnachweissystem, welches keinen direkten Einfluß auf einen Meßwert hat, wird hierbei jedoch nicht be-
.6.
rücksichtigt. Dies stellt den Hauptgrund dafür dar, daß, wenn die Schlitzbreite variiert wird, eine große Spektrumskorrekturgenauigkeit
nicht erzielt werden kann.
Daher sind gemäß der vorliegenden Erfindung eine Einrichtung zum Unterbrechen des in ein Fluoreszenznachweissystem
einfallenden Lichtes und eine Einrichtung zum Unterbrechen des in ein Überwachungsnachweissystem einfallenden Lichtes
vorgesehen, um in diesen Systemen die entsprechende NuIlpunktskorrektur
durchzuführen.
Weitere Vorteile, Merkmale und Anwendungsmöglichkeiten der vorliegenden Erfindung ergeben sich aus der nachfolgenden
Beschreibung von Ausführungsbeispielen in Verbindung mit der Zeichnung. Darin zeigen:
Fig. 1 eine schematische Darstellung eines Spektrofluorophotometers
als Gesamteinheit gemäß der vorliegenden Erfindung,
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Fig. 2 ein Flußdiagramm des Meßverfahrens eines Spektrumskorrekturvorganges,
und
Fig. 3 eine grafische Darstellung der Vergleichsdaten, die man mit Hilfe eines bekannten Spektrofluorophotometers
und des Spektrofluorophotometers gemäß der vorliegenden Erfindung erhält.
In Fig. 1 wird ein von einer Xenonlampe 10 ausgesandter Lichtstrahl durch eine Linse 12 gesammelt. Der Lichtstrahl
tritt durch einen Eintrittsschlitz 14A in einem Erregungsschlitzbauteil 14 hindurch, um durch ein Erregungsspektroskop 16 einer Spektralaufteilung unterworfen bzw.
spektralisiert zu werden. Das spektralisierte Erregungslicht wird einem Probenbehälter 24 über einen Austrittsschlitz 14B in dem Erregungsschlitzbauteil 14, einen
Spiegel 20 und eine Linse 22 zugeführt. Ein Teil des Erregungslichtes wird durch einen Strahlteiler 18 aufgeteilt
und wird über einen Spiegel 26 und ein Überwachungsfenster 28 geführt, welches in dem Erregungsschlitzbauteil vorgesehen
ist, um einer Messung seiner Lichtmenge mit Hilfe eines Überwachungsdetektors 30 unterworfen zu werden. Die
in dem Probenbehälter 24 erzeugte Fluoreszenz.· wird mit Hilfe einer Linse 32 gesammelt und durch einen Eintrittsschlitz 34A in einem Fluoreszenzschlitzbauteil 34 hindurchgeführt,
um mit Hilfe eines FluoreszenzSpektroskops
36 spektralisiert zu werden. Die spektralisierte Fluoreszenz wird durch einen Austrittsschlitz 34B in dem Fluoreszenzschlitzbauteil
34 und einen Spiegel 38 geführt, um einer Intensitätsmessung mit Hilfe eines Fluoreszenz-detektors
40 unterworfen zu werden. Die Schlitzbauteile 14, 34 und ein Verschluß 48 werden durch ein Steuer- bzw.
Regelsystem 42 gesteuert bzw. geregelt. Ein überwachungssignal
IM und ein Fluoreszenzsignal I0 des Erregungslichtes
werden einem Berechnungselement 46 jeweils über Verstärker 44A und 44B zugeführt, in welchem ein Messwert
I berechnet wird.
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Das Erregungsschlitzbauteil 14 und das Fluoreszenzschlitzbauteil 34 besteht jeweils aus einer Drehscheibe. Diese
Schlitzbauteile sind mit einer Vielzahl von Eintrittsschlitzen 14A , 34A und einer Vielzahl von Austrittsschlitzen
14B, 34B versehen. Das Erregungsschlitzbauteil 14 ist darüberhinaus
mit einer Vielzahl von überwachungsfenstern zusätzlich zu den Eintritts- und Austrittsschlitzen 14A,
14B versehen.
In Fig. 2 ist das Messverfahren bei einem Spektrumskorrekturvorgang
gezeigt. Zunächst wird, um die Abweichungen IM0/
Iso des Nullpunktes in einem Nachweissystem zu messen, der
Verschluß 48 geschlossen. Das Erregungsschlitzbauteil 14 wird in eine Position gedreht, in welcher das von der
Xenonlampe kommende Licht nicht in den Überwachungsdetektor 30 eintritt. Während dieser Zeit werden die am Überwachungsdetektor 30 und Fluoreszenzdetektor 40 erhaltenen Messwerte
jeweils als IMri/ Iori in dem Berechnungselement. 46 gespeichert.
Anschließend wird der Verschluß 48 geöffnet, um das Erregungsschlitzbauteil 14 in seine Ausgangsposition
, gezeigt in Fig. 1, zurückzuführen. Im Bereich der Wellenlängen von 200 - 600nm wird ein Probenbehälter mit
Rhodamin B, welches eine Fluoreszenz aussendet, deren Intensität proportional zu der Intensität des Erregungslichtes ist, an einem geeigneten Platz aufgestellt und
die .'Fluoreszenzwellenlänge wird auf das Niveau von
Rhodamin B reguliert. Wenn die Erregungswellenlänge einer Abtastung unterworfen wird, erhält man ein für die Wellenlängencharakteristiken
I„v/. ν des Erregungsspektroskops
und Detektors repräsentatives Spektrum. Die Wellenlängencharakteristiken I„v,, . werden gespeichert, wobei I„v/. λ
den charakteristischen Wert bei der Wellenlänge /S darstellt. Anschließend wird ein Diffusions- bzw. Streuelement,
welches einen vorbestimmten Teil des Erregungslichtes in das Fluoreszenzspektroskop unabhängig von der
Wellenlänge führen kann, in den Probenbehälter eingebracht, und die Erregungs- und Fluoreszenzwellenlängen werden gleichzeitig
abgetastet. Auf der Basis des so erhaltenen Spektrums I0 ,. , und der vorher bestimmten Erregungswellenlänge I1. .,
können die Wellenlängencharakteristiken 1EM(K) des Fluor~
eszenzspektroskops und des Detektors gemäß der Gleichung
1EM(M = 1S(M7 1EX(S) bestimmt werden. Dieser Wert i^^
wirdobenfalls gespeichert. Anschließend wird eine zu
messende Probe in den Probenbehälter eingeführt, um die Intensität I ,. >
zu messen. Demzufolge kann das korrigierte, der Probe eigene Spektrum Ic(^\ gemäß folgender Gleichung
bestimmt werden:
1C(S) 1^) /(IEX(h) X 1EM(S)
wobei I/ν» ein Verhältnis des Fluoreszenzsignals I_ ,. >
zum Aufzeichnungssignal I M.. >
ist. Daher kann Ir/w\ durch
folgende Gleichung ausgedrückt werden:
= 1S(S) 71M(S) X (IEX(S) X 1EM(S)
Gemäß der vorliegenden Erfindung werden beide Abweichungen,
* nämlich die Abweichung Io_ des Nullpunktes im Fluoreszenz-
nachweissystem und die Abweichung IM_ des Nullpunktes in
dem Uberwachungsnachweissystem korrigiert. Daher kann ein korrigiertes Spektrum gemäß der obigen Gleichung bestimmt
werden. In einem konventionellen Spektrofluorophotometer,
in welchem die Messung der Nullpunktsabweichung I„o in dem
Überwachungsnachweissystem nicht erfolgt, wird Ir (y-, entsprechend
folgender Gleichung bestimmt: 10
1CUS) = 1S(K) /(IM(K) + 1MO* X (1EX OyJ x 1EM(N)5
Wenn daher die Intensität des Überwachungslichtes zu gering
ist, um I0 zu vernachlässigen, insbesondere in einem
Fluorophotometer, in welchem eine Xenonlampe als Lichtquelle
verwendet wird, können die Wellenlängencharakte ristiken,welche durch Verhältnisberechnung bestimmt werden,
der Lichtquelle nicht genau -eliminiert werden im Bereich der Wellenlängen von nicht mehr als 300nm aufgrund des Ein-
flusses von I„0;Wenn die Schlitzbreite des Spektroskops
während der Messung der Wellenlängencharakteristiken 1J-V(V1)
I ... des Photometers und während der Messung einer Probe gleich ist, ist der Einfluß von IM_ in !gy/^j / 1EM(V^) e;*-n~
geschlossen und verursacht daher keine Probleme. Wenn die
Sehlitzbreite jedoch variiert, verringert sich die Korrekturgenauigkeit
aufgrund des Effektes von IMO« Entsprechend
der vorliegenden Erfindung erfolgt die Korrektur von IMQ
ebenfalls , so daß, selbst wenn die Schlitzbreite des Spektroskops variiert, sich die Korrekturgenauigkeit nicht
wesentlich ändert selbst im Wellenlängenbereich von nicht mehr als 300nm.
In Fig. 3 sind die obigen Tatsachen illustriert, wobei die Korrekturgenauigkeiten eines konventionellen Fluorophotometers
(A) und des erfindungsgemäßen Fluorophotometers (B) gezeigt sind,welche mit variierter Schlitzbreite erzielt
werden. Wie man erkennt, steigt die Korrekturgenauigkeit
! -KO-
im umgekehrten Verhältnis mit der Größe der Veränderungen in der Schlitzbreite an. Entsprechend der vorliegenden Erfindung,
bei welcher I„_ gemessen wird, wobei das in den
Überwachungsdetektor einfallende Licht unterbrochen ist, sind keine Verschlüsse zum Durchführen dieser Messung
zusätzlich vorgesehen. Es wird ein Schlitzmechanismus, welcher für ein Spektroskop unverzichtbar ist, verwendet.
Obwohl die Korrekturgenauigkeit des Photometers in großem -^q Maße verbessert wird, ist der Aufbau des Photometers
identisch mit dem Aufbau eines bekannten Photometers.Wenn das Niveau eines Aufzeichnungssignals Ih. während der
Korrektur von I _ im wesentlichen Null geworden ist, hat
Mu
selbst eine kleine Veränderung des Signals einen großen
, c Einfluß auf einen Hesswert. Daher ist das Überwachungssignal-Einführungsfenster
so geformt,daß es größer wird, wenn die Schlitzbreite verringert wird, um zu verhindern,
daß das Überwachungssignal Ι«/ι \ extrem klein wird. Bei
dem oben beschriebenen Ausführungsbeispiel wird ein Ver-Schluß 48 benutzt, um daß ins Fluoreszenznachweissystem
einfallende Licht zu unterbrechen. Selbst wenn das Unterbrechen des einfallenden Lichtes durch Drehen des Fluoreszenzschlitzbauteils
34 erfolgt, kann der gleiche Effekt erzielt werden. Da der Verschluß 48 eine größere Ansprech-
2i- fähigkeit hat als ein Verschluß, welcher ein Schlitzbauteil
verwendet, kann er wirksam benutzt werden, um ζ. B. die Fluoreszenzdämpfungsrate zu messen, während vorübergehend
das zu einer Probe fortschreitende Erregungslicht unterbrochen wird. Wenn zwischen der Xenonlampe und dem Er-
OQ regungsschlitzbauteil 14 ein Verschluß vorgesehen wird,
um das in das Überwachungsnachweissystem und Fluoreszenzsystem einfallende Licht gleichzeitig zu unterbrechen, kann
der gleiche Effekt erzielt werden.
nc Gemäß der vorliegenden Erfindung können die Wellenlängencharakteristiken
der Lichtquelle aus einem Spektrum, das man durch ein Fluorophotometer erhält, entfernt werden
unabhängig von der Lichtmenge (Intensität des Erregungs-
lichtes) der Lichtquelle. Dies ermöglicht die Verbesserung der Spektrumskorrekturgenauigkeit, ein primäres Problem
bei Fluorophotometern, und eine einfache Messung eines einer Probe eigenen Spektrums.
- Leerseite -
Claims (8)
1. Spektrofluorophotometer, gekennzeichnet
durch eine Lichtquelle (10), ein Erregungsspektroskop (16) zum Spektralisieren des von der Licht-
quelle kommenden Lichtes ,einen Überwachungsdetektor (30) zum Überwachen des von dem Erregungsspektroskop kommenden
Lichtes, eine Probe (24) , welche mit dem vom Erregungsspektroskop kommenden Licht beaufschlagt
wird, ein FluoreszenzSpektroskop (36) zum Spektralisieren
der von der Probe kommenden Fluoreszenz,ein Fluoreszensdetektor
(40) zum Nachweis dem vom Fluoreszenzspektroskop kommenden Lichtes, ein Berechnungselement (46) zum Verarbeiten
von Signalen von dem Überwachungsdetektor und dem Fluoreszenzdetektor, und durch eine Einrichtung zum Unterbrechen
des von der Lichtquelle zum Überwachungsdetektor und zum Fluoreszenzdetektor gerichteten Lichtes.
2. Spektrofluorophotometer nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,
daß die lichtunterbrechende Einrichtung zwischen der Lichtquelle (10) und dem ErregungsSpektroskop (16)
angeordnet ist.
3. Spektrofluorophotometer nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet,
daß eine Einrichtung (48) zum Unterbrechen des vom Erregungsspektroskop (16) zur Probe (24) gerichteten
Lichtes zwischen diesen vorgesehen ist.
4. Spektrofluorophotometer nach einem der Ansprüche T bis
3, gekennzeichnet durch ein Erregungsschlitzbauteil (14),
welches zwischen der Lichtquelle (10) und dem Erregungsspektroskop (16) angeordnet ist und Eintrifctsschlitze (14A),
in welche Licht von der Lichtquelle eingeführt wird, und Austrittsschlitze (14B) aufweist, über welche das Licht
von dem Erregungsspektoskop abgegeben wird, durch einen Strahlenteiler (18) zum Teilen des vom Erregungsspektroskop
kommenden Lichtes, wobei der Überwachungsdetektor (30) einen der vom Strahlenteiler kommenden Strahlen nachweist
und die Probe (24) mit dem anderen Strahl vom Strahlenteiler beaufschlagt wird, und durch ein Fluoreszenzschlitzbauteil
(34), welches zwischen der Probe (24) und dem Fluoreszenzspektroskop (36) angeordnet ist
jQ und Eintrittsschlitze (34A), in welche die Fluoreszenz
von der Probe eingeführt wird, und Austrittsschlitze (34B) aufweist,über-welche das vom Fluoreszenzspektroskop
kommende Licht abgegeben wird.
, p.
5. Spektrof luorophotometer nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet,
daß das Erregungsschlitzbauteil (14) aus einer Drehscheibe besteht, wobei das Erregungsschlitzbauteil
gedreht wird, um das von der Lichtquelle (10) kommende Licht zu unterbrechen.
6. Spektrofluorophotometer nach Anspruch 4 oder 5, dadurch
gekennzeichnet, daß das Erregungsschlitzbauteil (14) mit einem überwachungsfenster (28) versehen ist, um das Licht
vom Strahlenteiler (18) zum Überwachungsdetektor (30) zu oc führen.
7. Spektrofluorophotometer nach einem der Ansprüche 4 bis
6, dadurch gekennzeichnet, daß das Erregungsschlitzbauteil (14) mit einer Vielzahl von Paaren von Eintritts-
_n schlitzen (14A), Austrittsschlitzen (14B) und Uberwachungsfenstern
(28) versehen ist.
8. Spektrofluorophotometer nach einem der Ansprüche 4 bis
7, dadurch gekennzeichnet, daß eine Einrichtung (48)
,_ zum Unterbrechen des vom Erregungsspektroskop (16) zur
Probe (24) gerichteten Lichtes zwischen dem Strahlenteiler (18) und der Probe (24) vorgesehen ist.
Spektrofluorophotometer nach einem der Ansprüche bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß das Fluoreszenzschlitzbauteil
(34) eine Drehscheibe ist, in welcher eine Vielzahl von Paaren von Eintritts- und Austrittsschlitzen (34A, 34B) vorgesehen ist.
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