DE3539977C2 - - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Spektrofluorophotometer gemäß dem Oberbegriff von Anspruch 1.

Wenn das Fluoreszenzspektrum einer Probe mit Hilfe eines Fluorophotometers bestimmt wird, werden die Wellenlängencharakteristiken des Photometers mit Lichtquelle, Spektroskop und Detektor einem der Probe eigenen Spektrum überlagert. Um ein der Probe eigenes Spektrum zu erhalten, ist es erforderlich, den Effekt der Wellenlängencharakteristiken des Photometers zu eliminieren. Um diese Forderung zu erfüllen, wird unter anderem ein von einer Lichtquelle kommender Lichtstrahl durch einen Strahlenteiler geteilt, um ein Verhältnis der fluorometrischen Intensitäten, gemessen mit einem Überwachungsnachweissystem und einem Fluoreszenznachweissystem, zu erhalten und hierdurch den Einfluß der Wellenlängencharakteristiken einer Lichtquelle zu eliminieren, wie in US-PS 41 98 567 gezeigt.

Um die Einflüsse der Wellenlängen eines Spektroskops und eines Detektors zu eliminieren, wird eine Probe, deren Wellenlängencharakteristiken bekannt sind, im voraus einer Messung unterworfen, um die Wellenlängencharakteristiken des Spektroskops und des Detektors zu bestimmen. Die Spektrumskorrektur erfolgt, nachdem eine Probe, deren Wellenlängencharakteristiken unbekannt sind, einer Messung unterworfen worden ist, um ein der letzteren Probe eigenes Spektrum zu erhalten.

Die Wellenlängencharakteristiken eines Spektroskops ändern sich in Abhängigkeit von der Spaltbreite. Demzufolge werden die Spektrumskorrekturen während der Bestimmung der Wellenlängencharakteristiken eines Spektroskops und die Spektrumskorrektur während der Messung einer Probe mit einer Spaltbreite durchgeführt, welche auf ein einheitliches Niveau festgelegt ist.

Die DE-OS 25 35 398 beschreibt einen mit einer Blitzlampe oder einer pulsierenden Lampe arbeitenden Spektralfluoreszenzmesser, bei dem zwischen einem Erregungsmonochromator und der Probenstation eine Einrichtung angeordnet ist, mit der Strahlung aus dem Anregungslicht ausgekoppelt und als Bezugsstrahlung auf einen Bezugsstrahlungsdetektor geleitet wird. Diese Einrichtung kann dabei eine reflektierende Einrichtung zur Erzielung intermittierender Reflexion auf den Bezugsstrahlungsdetektor, d. h. z. B. ein rotierender Spiegelzerhacker sein. Die Druckschrift erwähnt auch einen Austrittsspalt des Erregungsmonochromators und einen Eintrittsspalt eines Emissionsmonochromators.

Die DE-OS 33 39 006 offenbart einen Spaltmechanismus zur Verwendung für einen Monochromator. Der Spaltmechanismus ist in der Lage, nicht nur die Spaltbreite, sondern auch die Spalthöhe zu verändern und weist eine Vielzahl von Spaltpaaren auf einer um eine Achse drehbaren Scheibe auf. Die Spaltpaare sind dabei am Umfang der Scheibe so angeordnet, daß sich die Spalte eines Paares diametral gegenüberliegen.

Der vorliegenden Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Spektrofluorophotometer zu schaffen, mit welchem die Wellenlängencharakteristiken selbst dann, wenn die Spaltbreite variiert wird, mit verbesserter Genauigkeit bestimmt werden kann.

Die Lösung dieser Aufgabe erfolgt mit einem Spektrofluorophotometer mit den Merkmalen gemäß Anspruch 1. Weiterbildungen sind in den Unteransprüchen beschrieben.

Die Erfindung wird anhand der nachfolgenden Beschreibung von Ausführungsbeispielen in Verbindung mit der Zeichnung näher erläutert. Darin zeigt

Fig. 1 eine schematische Darstellung eines Spektrofluorophotometers als Gesamteinheit gemäß der vorliegenden Erfindung,

Fig. 2 ein Flußdiagramm des Meßverfahrens eines Spektrumskorrekturvorganges, und

Fig. 3 eine grafische Darstellung der Vergleichsdaten, die man mit Hilfe eines bekannten Spektrofluorophotometers und des Spektrofluorophotometers gemäß der vorliegenden Erfindung erhält.

In Fig. 1 wird ein von einer Xenonlampe 10 ausgesandter Lichtstrahl durch eine Linse 12 gesammelt. Der Lichtstrahl tritt durch einen Eintrittsspalt 14 A in einem ersten beweglichen Bauteil 14 hindurch, um durch ein Erregungsspektroskop 16 einer Spektralaufteilung unterworfen bzw. spektral zerlegt zu werden. Das spektral zerlegte Erregungslicht wird einem Probenbehälter 24 über einen Austrittsspalt 14 B in dem ersten beweglichen Bauteil 14, einen Spiegel 20 und eine Linse 22 zugeführt. Ein Teil des Erregungslichtes wird durch einen Strahlteiler 18 aufgeteilt und wird über einen Spiegel 26 und ein Überwachungsfenster 28 geführt, welches in dem ersten beweglichen Bauteil (14) vorgesehen ist, um einer Messung seiner Lichtmenge mit Hilfe eines Überwachungsdetektors 30 unterworfen zu werden. Die in dem Probenbehälter 24 erzeugte Fluoreszenz wird mit Hilfe einer Linse 32 gesammelt und durch einen Eintritts­ spalt 34 A in einem zweiten beweglichen Bauteil 34 hindurchgeführt, um mit Hilfe eines Fluoreszenzspektroskops 36 spektral zerlegt zu werden. Die spektral zerlegte Flureszenz wird durch einen Austrittsspalt 34 B in dem zweiten beweglichen Bauteil 34 und einen Spiegel 38 geführt, um einer Intensitätsmessung mit Hilfe eines Fluoreszenzdetektors 40 unterworfen zu werden. Die Bauteile 14, 34 und ein Verschluß 48 werden durch ein Steuer- bzw. Regelsystem 42 gesteuert bzw. geregelt. Ein Überwachungssignal I _{M (λ)} und ein Fluoreszenzsignal I _{S (λ)} des Erregungslichtes werden einem Berechnungselement 46 jeweils über Verstärker 44 A und 44 B zugeführt, in welchem ein Meßwert

I _(λ) = I _{S (λ)} /I _{M (λ)}

berechnet wird.

Das erste bewegliche Bauteil 14 und das zweite bewegliche Bauteil 34 besteht jeweils aus einer Drehscheibe. Diese Bauteile sind mit einer Vielzahl von Eintrittsspalten 14 A, 14 b und einer Vielzahl von Austrittsspalten 34 A, 34 B versehen. Das erste bewegliche Bauteil 14 ist darüberhinaus mit einer Vielzahl von Überwachungsfenstern (28) zusätzlich zu den Eintritts- und Austrittsschlitzen 14 A, 14 B versehen.

In Fig. 2 ist das Meßverfahren bei einem Spektrumskorrekturvorgang gezeigt. Zunächst wird, um die Abweichungen I _{M 0}, I _{S 0} des Nullpunktes in einem Nachweissystem zu messen, der Verschluß 48 geschlossen. Das erste bewegliche Bauteil 14 wird in eine Position gedreht, in welcher das von der Xenonlampe kommende Licht nicht in den Überwachungsdetektor 30 eintritt. Während dieser Zeit werden die am Überwachungsdetektor 30 und Fluoreszenzdetektor 40 erhaltenen Meßwerte jeweils als I _M0, I _S0 in dem Berechnungselement 46 gespeichert. Anschließend wird der Verschluß 48 geöffnet, um das erste bewegliche Bauteil 14 in seine Ausgangsposition, gezeigt in Fig. 1, zurückzuführen. Im Bereich der Wellenlängen von 200-600 nm wird ein Probenbehälter mit Rhodamin B, welches eine Fluoreszenz aussendet, deren Intensität proportional zu der Intensität des Erregungslichtes ist, an einem geeigneten Platz aufgestellt und die Fluoreszenzwellenlänge wird auf das Niveau von Rhodamin B reguliert. Wenn die Erregungswellenlänge einer Abtastung unterworfen wird, erhält man ein für die Wellenlängencharakteristiken I _{EX (λ)} des Erregungsspektroskops und Detektors repräsentatives Spektrum. Die Wellenlängencharakteristiken I _{EX (λ)} werden gespeichert, wobei I _{EX (λ)} den charakteristischen Wert bei der Wellenlänge λ darstellt. Anschließend wird ein Diffusions- bzw. Streuelement, welches einen vorbestimmten Teil des Erregungslichtes in das Fluoreszenzspektroskop unabhängig von der Wellenlänge führen kann, in den Probenbehälter eingebracht, und die Erregungs- und Fluoreszenzwellenlängen werden gleichzeitig abgetastet. Auf der Basis des so erhaltenen Spektrums I _(λ) = I _{S (λ)} /I _{M (λ)} und der vorher bestimmten Wellennlängencharakteristik I _{EX (λ)} ′ können die Wellenlängencharakteristiken I _{EM (λ)} des Fluoreszenzspektroskops und des Detektors gemäß der Gleichung

I _{EM (λ)} = I _(λ) /I _{EX (λ)}

bestimmt werden. Dieser Wert I _{EM (λ)} wird ebenfalls gespeichert. Anschließend wird eine zu messende Probe in den Probenbehälter eingeführt, um die Intensität I _(λ) zu messen. Demzufolge kann das korrigierte, der Probe eigene Spektrum I _{C (λ)} gemäß folgender Gleichung bestimmt werden:

I _{C (λ)} = I _(λ) /(I _{EX (λ)} × I _{EM (λ)}

wobei I _(λ) ein Verhältnis des Fluoreszenzsignals I _{S (λ)} zum Aufzeichnungssignal I _{M (λ)} ist. Daher kann I _{C (λ)} durch folgende Gleichung ausgedrückt werden:

I _{C (λ)} = I _{S (λ)} /[I _{M (λ)} × I _{EX (λ)} × I _{EM (λ)} ]

Gemäß dem vorliegenden Spektrofluorophotometer werden beide Abweichungen, nämlich die Abweichung I _S0 des Nullpunktes im Fluoreszenznachweissystem und die Abweichung I _M0 des Nullpunktes in dem Überwachungsnachweissystem korrigiert. Daher kann ein korrigiertes Spektrum gemäß der obigen Gleichung bestimmt werden. In einem konventionellen Spektrofluorophotometer, in welchem die Messung der Nullpunktsabweichung I _M0 in dem Überwachungsnachweissystem nicht erfolgt, wird I _{C (λ)} entsprechend folgender Gleichung bestimmt.

I _{C (λ)} = I _{S (λ)} /[(I _{M (λ)} + I _M0) × I _{EX (λ)} × I _{EM (λ)} ]

Wenn daher die Intensität des Überwachungslichtes zu gering ist, um I _M0 zu vernachlässigen, insbesondere in einem Fluorophotometer, in welchem eine Xenonlampe als Lichtquelle verwendet wird, können die Wellenlängencharakteristiken, welche durch Verhältnisberechnung bestimmt werden, der Lichtquelle nicht genau eliminiert werden im Bereich der Wellenlängen von nicht mehr als 300 nm aufgrund des Einflusses von I _M0. Wenn die Spaltbreite des Spektroskops während der Messung der Wellenlängencharakteristiken I _{EX (λ)} , I _{EM (λ)} des Photometers und während der Messung einer Probe gleich ist, ist der Einfluß von I _M0 in I _{EX (λ)} , I _{EM (λ)} eingeschlossen und verursacht daher keine Probleme. Wenn die Spaltbreite jedoch variiert, verringert sich die Korrekturgenauigkeit aufgrund des Effektes von I _M0. Entsprechend dem vorliegenden Spektrofluorophotometer erfolgt die Korrektur von I _M0 ebenfalls, so daß, selbst wenn die Schlitzbreite des Spektroskops variiert, sich die Korrekturgenauigkeit nicht wesentlich ändert selbst im Wellenlängenbereich von nicht mehr als 300 nm.

In Fig. 3 sind die obigen Tatsachen illustriert, wobei die Korrekturgenauigkeiten eines konventionellen Fluorophotometers (A) und des vorliegenden Fluorophotometers (B) gezeigt sind, welche mit variierter Spaltbreite erzielt werden. Wie man erkennt, steigt die Korrekturgenauigkeit im umgekehrten Verhältnis mit der Größe der Veränderungen in der Spaltbreite an. Entsprechend dem vorliegenden Spektrofluorophotometer bei welchem I _M0 gemessen wird, wobei das in den Überwachungsdetektor einfallende Licht unterbrochen ist, sind keine Verschlüsse zum Durchführen dieser Messung zusätzlich vorgesehen. Es wird ein Spaltmechanismus, welcher für ein Spektroskop unverzichtbar ist, verwendet. Obwohl die Korrekturgenauigkeit des Photometers in großem Maße verbessert wird, ist der Aufbau des Photometers identisch mit dem Aufbau eines bekannten Photometers. Wenn das Niveau eines Überwachungssignals I _{M (λ)} während der Korrektur von I _{M 0} im wesentlichen Null geworden ist, hat selbst eine kleine Veränderung des Signals einen großen Einfluß auf einen Meßwert. Daher ist das Überwachungssignal- Einführungsfenster so geformt, daß es größer wird, wenn die Spaltbreite verringert wird, um zu verhindern, daß das Überwachungssignal I _{M (λ)} extrem klein wird. Bei dem oben beschriebenen Ausführungsbeispiel wird ein Verschluß 48 benutzt, um daß ins Fluoreszenznachweissystem einfallende Licht zu unterbrechen. Selbst wenn das Unterbrechen des einfallenden Lichtes durch Drehen des zweiten beweglichen Bauteils 34 erfolgt, kann der gleiche Effekt erzielt werden. Da der Verschluß 48 eine größere Ansprechfähigkeit hat als ein Verschluß, welcher ein Spaltbauteil verwendet, kann er wirksam benutzt werden, um z. B. die Fluoreszenzdämpfungsrate zu messen, während er vorübergehend das zu einer Probe fortschreitende Erregungslicht unterbrochen wird. Wenn zwischen der Xenonlampe und dem ersten beweglichen Bauteil 14 ein Verschluß vorgesehen wird, um das in das Überwachungsnachweissystem und Fluoreszenzsystem einfallende Licht gleichzeitig zu unterbrechen; kann der gleiche Effekt erzielt werden.

Claims (3)

1. Spektrofluorophotometer mit
einer Lichtquelle (10),
einem Erregungsspektroskop (16) des zum spektralen Zerlegen von der Lichtquelle (10) kommenden Lichtes,
einem Überwachungsdetektor (30) zum Überwachen des vom Erregungsspektroskop (16) kommenden Lichtes,
einer Probe (24), welche mit dem vom Erregungsspektroskop (16) kommenden Licht beaufschlagt wird,
einer Probe (24), welche mit dem vom Erregungsspektroskop (16) kommenden Licht beaufschlagt wird,
einem Strahlenleiter (18) zum Teilen des vom Erregungsspektroskop (16) kommenden Lichtes, wobei der Überwachungsdetektor (30) einen der vom Strahlenteiler (18) kommenden Strahlen nachweist und wobei die Probe (24) mit dem anderen Strahl vom Strahlenteiler (18) beaufschlagt wird,
einem Fluoreszenzspektroskop (36) des zum spektralen Zerlegen von der Probe (24) kommenden Fluoreszenzlichtes,
einem von Überwachungsdetektor (30) getrennten Fluoreszenzdetektor (40) zum Nachweis des vom Fluoreszenzspektroskop (36) kommenden Lichtes,
einem Berechnungselement (46) zum Verarbeiten von Signalen von dem Überwachungsdetektor (30) und dem Fluoreszenzdetektor (40),
gekennzeichnet durch
ein erstes bewegbares Bauteil (14), das zwischen der Lichtquelle (10) und dem Erregungsspektroskop (16) angeordnet ist und welches aufweist:
eine Vielzahl von Paaren von Eintritts- und Austrittsspalten (14 A, 14 B), wobei das Licht von der Lichtquelle (10) jeweils in einen Eintrittsspalt (14 A) eintritt und wobei das Licht vom Erregungsspektroskop (16) jeweils aus einem Austrittsspalt (14 B) austritt, und
mindestens ein Überwachungsfenster (28), um das Licht vom Strahlenteiler (18) zum Überwachungsdetektor (30) zu führen oder zu unterbrechen und
ein zweites bewegbares Bauteil (34), das zwischen der Probe (24) und dem Fluoreszenzspektroskop (36) angeordnet ist und eine Vielzahl von Paaren von Eintritts- und Austrittsspalten (34 A, 34 B) aufweist, wobei das Fluoreszenzlicht von der Probe (24) jeweils in einen Einrittsspalt (34 A) eintritt und das vom Fluoreszenzspektroskop (36) kommende Licht jeweils aus einem Austrittspalt (34 B) austritt.

2. Spektrofluorophotometer nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das erste und das zweite bewegbare Bauteil (14, 34) jeweils aus einer Drehscheibe besteht, die zum Unterbrechen des einfallenden Lichtes drehbar ist.

3. Spektrofluorophotometer nach Anspruch 1 oder 2, gekennzeichnet durch einen Verschluß (48) zwischen dem Strahlenteiler (18) und der Probe (24) zum Unterbrechen des vom Erregungsspektroskop (16) zur Probe (24) gerichteten Lichtes.