DE3588058T3

DE3588058T3 - Knorpel-induzierende Polypeptid-Faktoren aus Knochen

Info

Publication number: DE3588058T3
Application number: DE3588058T
Authority: DE
Inventors: Saeid Seyedin; Thomas Thomas
Original assignee: Celtrix Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Celtrix Pharmaceuticals Inc
Priority date: 1984-07-16
Filing date: 1985-07-08
Publication date: 2005-04-07
Anticipated expiration: 2005-07-09
Also published as: US4810691A; ATE128715T1; CA1261549A; US4774228A; DE3588058T2; JPH0794474B2; US4774322A; JPS6136223A; AU592951B2; AU4501585A; EP0169016B1; AU5649586A; EP0169016A2; DE3588058D1; EP0169016A3; EP0169016B2; AU594949B2

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft die Proteinchemie. Spezieller betrifft sie zwei Proteine, die in Knochen zu finden sind, Co-Faktoren zur Induktion von Knorpelbildung sind und auch im Assay auf transformierenden Wachstumsfaktor vom β-Typ (TGF-β) aktiv sind. Diese Polypeptide werden hierin manchmal als Knorpel-induzierende Faktoren ("cartilage-inducing factors", CIF's) genannt.
In der internationalen Patentanmeldung WO 84/01.106 und in EP-A-0.128.849 werden von menschlichen Blutplättchen, menschlicher Plazenta und Rindernieren stammende TGF-β's beschrieben.
US-A-4.434.094 berichtet über die partielle Reinigung eines die Knochenbildung anregenden, aus Knochen stammenden Proteinfaktors durch Extraktion mit chaotropen Mitteln, Fraktionierung auf Anionen- und Kationenaustauscher-Säulen und die Rückgewinnung der Aktivität von einer bei pH 4,8 an CMC adsorbierten Fraktion. Diese neue Proteinfraktion wurde "Osteogenese-Faktor (OF)" genannt und wurde durch ein Molekulargewicht von unter 30.000 Dalton und durch das beschriebene Reinigungsverfahren charakterisiert. Die Proteine der vorliegenden Erfindung wurden unter Anwendung eines Reinigungsverfahrens, das teilweise jenem in US-A-4.434.094 ähnelt, bis zur Homogenität gereinigt.
EP-A-105.014 beschreibt einen weiteren TGF-β. Dessen dort mit TGF-β1 bezeichnete Struktur wird beschrieben und vermutet, dass die TGF-β's zur Wundheilung eingesetzt werden könnten. TGF-β1 ist jenes Polypeptid, das in der vorliegenden Erfindung mit CIFA bezeichnet wird.
Die Erfindung stellt ein Verfahren zur Gewinnung dieser Polypeptide in im Wesentlichen reiner Form aus Knochen bereit. Beide CIF's sind bei Kombination mit epidermalem Wachstumsfaktor ("epidermal growth factor", EGF) im TGF-β-Assay auf in vitro-Induktion des verankerungsunabhängigen Wachstums von normalen Rattennieren-(NRK-)Zellen in weichem Agar ebenso aktiv. Dieser Assay wird hierin manchmal als TGF-β-Assay bezeichnet. Unter diesem Gesichtspunkt wurde bisher nichts über die Gegenwart von Proteinen mit Aktivität im TGF-β-Assay in Knochen. berichtet. Einer der CIF's, der mit CIF-A bezeichnet wird, besitzt eine partielle (30 Aminosäuren) N-terminale Aminosäuresequenz, die mit jener in der Literatur für aus menschlicher Plazenta stammendem TGF-β beschriebenen identisch ist. Der andere, mit CIF-B bezeichnete CIF besitzt eine partielle N-terminale Aminosäuresequenz, die sich von der aus menschlicher Plazenta stammenden Sequenz unterscheidet und als solche in der vorliegenden Erfindung strukturell beschrieben und beansprucht wird.
Daher besteht ein Aspekt der vorliegenden Erfindung in einem homogenen Chondrogenese/Osteogenese-Protein, wobei das Protein:

(a) in Säugetierknochen anzutreffen ist;
(b) Knorpelbildung fördert;
(c) im TGF-β-Assay Aktivität zeigt;
(d) ein Dimer mit einem ungefähren Molekulargewicht von 26.000 Dalton ist, wie mittels SDS-PAGE bestimmt wurde;
(e) nicht TGF-β1 ist; und
(f) nach einem Verfahren isolierbar ist, das folgende Schritte umfasst: (i) das Behandeln von entmineralisierten Knochen mit einem chaotropen Extraktionsmittel, das nicht-fibröse Proteine löst; (ii) das Unterziehen des Extrakts aus Schritt (i) einer Gelfiltration, um eine chondrogenetisch aktive Fraktion zu gewinnen, die Proteine mit einem Molekulargewicht von 10.000–40.000 Dalton enthält; (iii) das Adsorbieren der chondrogenetisch aktiven Fraktion aus Schritt (ii) an einen Carboxymethylcellulose-Kationenaustauscher bei etwa pH = 4,5–5,5 unter denaturierenden Bedingungen; (iv) das Eluieren der chondrogenetisch aktiven Fraktion vom Kationenaustauscher mittels eines 10 bis 400 mM Natriumchlorid-Gradienten; (v) das Unterziehen des chondrogenetisch aktiven Anteils des Eluats aus Schritt (iv), der nach der Hauptmenge der Proteine eluiert, einer RP-HPLC oder einer nicht-denaturierenden Gelelektrophorese, wobei der Anteil bei einer RP-HPLC zur zwei Peaks chondrogenetischer Aktivität ergibt; und (vi) das Gewinnen des Proteins aus dem zweiten der Peaks bei RP-HPLC oder das Gewinnen des entsprechenden Proteins aus der nicht-denaturierenden Gelelektrophorese.

Die Erfindung stellt außerdem eine Implantat-Zusammensetzung zur Induktion von Chondrogenese/Osteogenese, die das oben definierte Protein enthält, gegebenenfalls zusammen mit einem Chondrogenese-/Osteogenese-Co-Faktor, sowie die Verwendung des oben definierten Proteins bei der Herstellung einer Implantat-Zusammensetzung zur Induktion von Chondrogenese/Osteogenese bereit.
Kurze Beschreibung der Abbildungen
In den Abbildungen ist:
1 eine grafische Darstellung der optischen Dichten (Absorptionsvermögen) (bei 280 nm) und der in vitro-Chondrogenese-Aktivitäten der Gelfiltrations-Fraktionen des nachstehenden Beispiels (Abschnitt C);
2 eine grafische Darstellung der optischen Dichten (bei 280 nm) von Eluat-Fraktionen der präparativen Ionenaustausch-Chromatografie des nachstehenden Beispiels (Abschnitt D);
3 eine grafische Darstellung des UV-Absorptionsvermögens und der elektrophoretischen Profile von Peaks A (CIF-A) und B (CIF-B) der präparativen RP-HPLC des nachstehenden Beispiels (Abschnitt E);
4 eine grafische Darstellung der Ergebnisse der enzymgebundenen Immunabsorptions-Assays (ELISA's) auf die in vitro-Chondrogenese-Aktivität des aus der RP-HPLC des nachstehenden Beispiels erhaltenen CIF-A und CIF-B (Abschnitt E);
5 eine grafische Darstellung der Ergebnisse der ELISA's der Säure-Harnstoff-Gelelektrophorese-Fraktionen des nachstehenden Beispiels (Abschnitt F); und
6 eine grafische Darstellung der Ergebnisse der TGF-β-Assays, beschrieben in Abschnitt f des nachstehenden Beispiels.
Arten der Durchführung der Erfindung
Die Polypeptide der Erfindung wurden aus Knochen isoliert. Die Polypeptide wurden zu diesem Zeitpunkt nur partiell sequenziert. In Anbetracht dessen und da die vollständige Aminosäuresequenz von TGF-β nicht beschrieben wurde, sind die primären Strukturzusammenhänge zwischen den CIF's der Erfindung und TGF-β nicht vollständig bekannt.
Die Polypeptide der Erfindung sind Co-Faktoren zur Induktion von Knorpelbildung. Angesichts ihrer Chondrogenese-Aktivität und der Art der endochondralen Knochenbildung wird auch erwartet, dass sie eine Rolle bei der Osteogenese spielen. Die Polypeptide sind auch im TGF-β-Assay aktiv, und es zeigte sich, dass sie die Bindegewebe-Ablagerung unabhängig von einer Assoziation mit TGF-β-aktivierenden Stoffen fördern.
In Anbetracht dessen, dass die Knochen-induzierenden Proteine von Menschen, Affen, Rindern und Ratten in ihren Fähigkeiten, endochondrale Knochen in xenogenen Implantaten zu erzeugen, nicht artenspezifisch sind [T.K. Sampath et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 80, 6591 (1983)], und dass aus menschlichen Blutplättchen, menschlicher Plazenta oder Rindernieren stammender TGF-β unter Nagetieren, Rindern und Menschen nicht artenspezifisch ist, wird angenommen, dass die Polypeptide der vorliegenden Erfindung bei Säugetierarten in hohem Ausmaß konserviert wurden (d.h., Polypeptide von unterschiedlichen Säugetierarten besitzen Aminosäuresequenzen, die – wenn überhaupt – in einer oder mehreren Einfügungen, Löschungen oder Substitutionen von Aminosäure-Resten variieren, die die nicht artenspezifische Aktivität des Moleküls nicht nachteilig beeinflussen). Unter diesem Gesichtspunkt soll der Ausdruck "im Wesentlichen äquivalent", wie hierin als Beschreibung für Polypeptide gebraucht, Polypeptide bezeichnen, die – entweder nativ oder synthetisch und unabhängig von der Art oder vom Ursprung – dieselbe Aminosäuresequenz wie ein CIF aufweisen, sowie Polypeptide, die eine im Wesentlichen homologe, jedoch unterschiedliche Aminosäuresequenz besitzen, wobei der oder die Unterschiede die nicht artenspezifische Aktivität nicht nachteilig beeinflusst oder beeinflussen. Daher können die Polypeptide von Knochen und sogar von anderen Geweben unterschiedlichen, tierischen Ursprungs stammen oder gemäß rekombinanten DNA-Verfahrensweisen hergestellt werden. Schweine- oder Rinder-Röhrenknochen stellen aufgrund der leichten Verfügbarkeit derartiger Knochen und der großen Mengen der Polypeptide darin bevorzugte natürliche CIF-Quellen dar.
Die Vorgangsweise zum Isolieren von CIF aus Knochen ist folgende. Der Knochen wird zuerst unter Verwendung von mechanischen oder Abtragtechniken gereinigt, fragmentiert, weiters beispielsweise mit verdünnter, wässriger Säure, vorzugsweise bei niedriger Temperatur, gewaschen und anschließend durch Extraktion mit einem lipophilen Lösungsmittel, wie z.B. Ether oder Ethylacetat, entfettet. Der Knochen wird danach durch Entfernung der Kalziumphosphate verschiedenster Art, üblicherweise durch Extraktion mit stärkerer Säure, entmineralisiert. Das erhaltene Präparat, ein entmineralisierter Knochen, ist das Ausgangsmaterial für die Herstellung der Polypeptide der vorliegenden Erfindung.
Die anfängliche Extraktion dient zur Entfernung der nicht-fibrösen (z.B. nicht kollagenartigen) Proteine aus dem entmineralisierten Knochen. Dies kann unter Verwendung von chaotropen Mitteln, wie z.B. Guanidin-hydrochlorid (zumindest etwa 4 M), Harnstoff (8 M) plus Salz oder Natriumdodecylsulfat (zumindest etwa 1 Vol.-%-ig) erfolgen. Die Extraktion wird vorzugsweise bei niedrigen Temperaturen in Gegenwart eines Protease-Inhibitors durchgeführt, um die Wahrscheinlichkeit der Digestion oder Denaturierung des extrahierten Proteins zu verringern. Beispiele für gegebenenfalls mitverwendete Protease-Inhibitoren sind Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF), Na triumazid, N-Ethylmaleimid (NEM), Benzamidin und 6-Aminohexansäure. Der pH des Mediums hängt vom verwendeten Extraktionsmittel ab. Der Extraktionsschritt liegt im allgemeinen in der Größenordnung von etwa 4 h bis zu einem Tag.
Nach der Extraktion kann das Extraktionsmittel auf geeignete Weise entfernt werden, wie z.B. mittels Dialyse gegen Wasser, falls gewünscht nach Aufkonzentrieren durch Ultrafiltration. Salze können ebenso durch kontrollierte Elektrophorese oder Molekularsiebe entfernt werden. Es wird auch bevorzugt, während dieses Verfahrens eine niedrige Temperatur beizubehalten, um die Denaturierung der Proteine zu minimieren. Alternativ dazu braucht das Extraktionsmittel nicht entfernt, sondern die Lösung nur aufkonzentriert zu werden, beispielsweise durch Ultrafiltration.
Der Extrakt, im chaotropen Mittel gelöst oder wiedergelöst, wird Gelfiltration unterzogen, um Fraktionen mit einem Molekulargewicht von unter etwa 40.000 Dalton zu erhalten, was zur wesentlichen Erhöhung der Reinheit führt. Die Größentrennung durch Gel erfolgt gemäß Standardverfahren, vorzugsweise auf einer Sephacryl-Säule bei Raumtemperatur (10–25°C). Die niedermolekulare Fraktion wird anschließend Ionenaustausch-Chromatografie unter Verwendung von Carboxymethylcellulose (CMC) bei einem pH von etwa 4,5–5,5, vorzugsweise etwa 4,8, in Gegenwart eines nichtionischen chaotropen Mittels, wie z.B. Harnstoff, unterzogen. Es können auch andere Kationenaustauscher eingesetzt werden, einschließlich jener auf Basis von Polyacrylamid und vernetztem Dextran; es werden jedoch Cellulose-Kationenaustauscher bevorzugt. Natürlich muss die Lösung, wie bei jedem Ionenaustausch-Vorgang, vor dem Aufbringen auf die Säule von konkurrierenden Ionen befreit werden und wird mit einem Gradienten zunehmender Salzkonzentration eluiert, was nach dem Stand der Technik bekannt ist. Die bei etwa 150–250 mM NaCl aus der CMC eluierende Fraktion enthält die CIF's.
Die Eluatfraktion aus der Kationenaustausch-Chromatografie wird anschließend zur endgültigen Reinigung RP-HPLC oder einer nicht-denaturierenden Gelelektrophorese unterzogen. Es werden routinemäßige RP-HPLC- und Gelelektrophorese-Verfahren angewandt. Nachstehend wird als Beispiel eine im Handel erhältliche RP-HPLC-Säule unter Anwendung einer kommerziell vorgegebenen RP-HPLC-Arbeitsvorschrift angeführt. Diese Endreinigung liefert die beiden Polypeptide in im Wesentlichen reiner Form. "Im Wesentlichen rein" bedeutet, dass ein Polypeptid weniger als etwa 5 Gew.-% Verunreinigungen enthält.
Beispiel
Das folgende Beispiel soll zur Illustration des auf eine bestimmte Probe angewandten Reinigungsverfahrens dienen und die Erfindung nicht einschränken.
A. Herstellung von entmineralisierten Knochen
Rindermittelfußknochen wurden direkt aus dem Schlachthof erhalten und auf Trockeneis transportiert. Die Knochen wurden von Mark und Nicht-Knochen-Gewebe befreit, in Fragmente von unter 1 cm Durchmesser zerbrochen und in einer Mühle bei 4°C zu einem Pulver vermahlen. Die gepulverten Knochen wurden zweimal mit 9,4 l zweifach destillierten Wassers pro kg Knochen jeweils etwa 15 min lang und über Nacht in 0,01 n HCl bei 4°C gewaschen. Die gewaschenen Knochen wurden mittels 3 × 3 Volumsteile Ethanol, gefolgt von 3 × 3 Volumsteilen Diethylether jeweils 20 min lang bei Raumtemperatur entfettet. Das resultierende, entfettete Knochenpulver wurde in 0,5 n NCl (25 l/kg entfettete Knochen) bei 4°C entmineralisiert. Die Säure wurde dekantiert, der erhaltene DMB gewaschen, bis der pH des Waschwassers über 4 lag, und auf einer Nutsche getrocknet.
B. Extraktion von nicht-kollagenartigen Proteinen
Der in Absatz A erhaltene DMB wurde mit 3,3 l von 4 M Guanidin-HCl, 10 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) (pH 6,8), 1 mM PMSF, 10 mM NEM pro kg 16 h lang extrahiert, die Suspension vakuumfiltriert und das unlösliche Material erneut 4 h lang extrahiert. Die löslichen Fraktionen wurden vereinigt, mittels Ultrafiltration unter Verwendung einer Amicon Ultrafiltrationseinheit (10K) auf zumindest das 5fache aufkonzentriert und das Konzentrat gegen 6 × 35 Volumsteile kalten, entionisierten Wassers 4 d lang dialysiert und anschließend lyophilisiert. Alle Verfahrensschritte dieses Absatzes wurden bei 4°C durchgeführt, mit Ausnahme der Lyophilisierung, die unter Standardbedingungen erfolgte.
C. Gelfiltration
Der Extrakt aus Absatz B wurde erneut in 4 M Guanidin-HCl gelöst und auf einer Sephacryl S-200-Säule fraktioniert, die zuvor mit 4 M Guanidin-HCl, 0,02% Natriumazid, 10 mM EDTA (pH 6,8) äquilibriert worden war. Die Fraktionen wurden auf ihr Absorptionsvermögen bei 280 nm und mittels (nachstehend beschriebenen) ELISA auf Chondrogenese-Aktivität getestet und vereinigt, wie in 1 gezeigt. Fraktion F2 aus 1, die eine niedermolekulare Fraktion darstellte ("low molecular weight", LMW, 10.000–40.000 Dalton) und die höchste Aktivität besaß, wurde gegen 6 × 180 Volumsteile entionisiertes Wasser dialysiert und lyophilisiert. Alle Vorgänge mit Ausnahme von Lyophilisierung und Dialyse (4°C) erfolgten bei Raumtemperatur.
D. Ionenaustausch-Chromatografie
Fraktion F2 aus Absatz C wurde in 6 M Harnstoff, 10 mM NaCl, 1 mM NEM, 50 mM Natriumacetat (pH 4,8) gelöst und bei 10.000 U/min 5 min lang zentrifugiert. Der Überstand wurde auf einer CM52-Säule (im Handel erhältliche CMC-Säule) fraktioniert, die in demselben Puffer äquilibriert worden war. Die gebundenen Proteine wurden unter Verwendung eines 10 mM bis 400 mM NaCl-Gradienten in demselben Puffer und einem Gesamtvolumen von 350 ml und mit einer Fließrate von 27 ml/h aus der Säule eluiert. Wie in 2 dargestellt, wurden drei Hauptfraktionen, CM-1, CM-2 und CM-3, abgenommen. Jede Fraktion wurde gegen 6 × 110 Volumsteile entionisiertes Wasser 4 d lang dialysiert und lyophilisiert. Alle obigen Vorgänge mit Ausnahme der Dialyse (4°C) erfolgten bei Raumtemperatur.
E. RP-HPLC
Die lyophilisierten Fraktionen CM-2 und CM-3 aus Absatz D wurden vereinigt, in 0,1%-iger Trifluoressigsäure (TFA) gelöst und Aliquote der Lösungen auf eine Vydac C18-RP-HPLC-Säule (4,6 mm Innendurchmesser × 25 cm) aufgebracht und 5 min lang bei 1 ml/min mit 0,1 %-iger TFA gewaschen. Das Lösungsmittel zur Elution war ein 0–60% Acetonitril-Gradient in 0,1%-iger TFA mit einer Steigerungsrate von 2%/min.
Aus der RP-HPLC der vereinigten Fraktionen CM-2 und CM-3 wurden zwei Peaks erhalten: Peak A nach etwa 29,5 min und Peak B nach etwa 31,2 min. 3 zeigt das Absorptionsvermögen und die elektrophoretischen Profile (reduziert und nicht-reduziert) der Peaks A und B. Die Proteine dieser Peaks wurden mit CIF-A bzw. CIF-B bezeichnet.
Die Proteine wurden in 0,1%-iger TFA-Lösung in Acetonitril, der Elutionslösung, bis zur Verwendung bei –20°C aufbewahrt.
F. Alternative Reinigung durch Gelelektrophorese
Die vereinigten, lyophilisierten Fraktionen CM-2 und CM-3 wurden mittels Gelelektrophorese gemäß der allgemeinen Vorgangsweise nach S. Paynim und R. Chalkley, Arch. Bioch. Biophys. 130, 337–346 (1969) auf einem Essigsäure-Harnstoff-Gel fraktioniert.
G. Assay auf in vitro-Chondrogenese-Aktivität
Die Gegenwart des gewünschten Proteins in den Fraktionen wurde während der Reinigung unter Anwendung eines in vitro-Assays auf die Produktion von Knorpel-spezifischen Proteoglykanen (PG) getestet, deren Identität mittles ELISA bestätigt wurde. Dieser Assay ist ein Agarosegel-Kulturmodell unter Verwendung von aus Rattenfötenmuskeln isolierten Mesenchymzellen. Er untersucht die Fähigkeit der Proben, die Produktion von PG zu induzieren. Der Zusammenhang zwischen der Induktion von in vitro-Knorpelbildung und der Knochenbildung in vivo war von S. Seyedin et al., J. Cell Biol. 97, 1950–1953 (1983) gezeigt worden.
Die Zellkultur wurde hergestellt, indem Muskelgewebe aseptisch von den oberen Gliedmaßen von 19 Tage alten Sprague Dawley-Rattenföten entfernt, das Gewebe zerkleinert und in Eagle's Minimum Essential Medium (MEM) mit 10% Rinderfötenserum (FBS) und 50 Einheiten Penicillin, 50 μg Streptomycin pro ml, kultiviert wurde. Das Zellwachstum erreichte üblicherweise innerhalb einer Woche Konfluenz, woraufhin die Zellen trypsinisiert, 1 : 2 aufgeteilt und innerhalb der ersten drei Passagen für Versuche eingesetzt wurden.
Die Zellen wurden entweder mit Vergleichsmedium oder mit zu testenden Proben in Agarosegel-Kulturen eingebracht. Die Vorgangsweise war im Prinzip jene von Benya et al., Cell 30, 215 (1982). Kurz gesagt wurden die Zellmonoschichten durch Trypsinisierung abgenommen, auf einem Hämozytometer gezählt und mit dem Doppelten der abschließenden Zellkonzentration erneut in dem Medium, mit oder ohne der zu testenden Proteinfraktion, suspendiert. Das Vergleichsmedium war entweder Hams F-12, Dulbecco's Minimum Essential Medium (DMEM) oder CMRL 1066 (Gibco), die jeweils 10% FBS und Antibiotika enthielten. Die Testproteinfraktionen in 0,01 n HCl wurden mit demselben Volumen 1 %-iger niedrig schmelzender Agarose (Bio-Rad, Nr. 162-0017) in F-12 direkt auf die gewünschte Konzentration an Testprotein verdünnt und 0,2 ml der Verdünnung in 17 mm-Näpfe eingebracht, die mit 0,15 ml 1 %-iger hochschmelzender Agarose (Bio-Rad, Nr. 162-0100) beschichtet worden waren. Die resultierenden Kulturen wurden bei 37°C 5 min lang inkubiert, bei 4°C 10 min lang abgeschreckt und danach mit 1 ml des jeweiligen Mediums (Vergleich oder Testprotein) überschichtet. Die Zellen wurden anschließend in einer feuchten Atmosphäre mit 5% CO₂ und 95% Luft kultiviert und danach alle 3–4 d durch vollständigen Austausch des Vergleichsmediums ernährt. Nach 7 d wurden die Kulturen eingefroren und vor dem Assay bei –80°C gelagert.
Die Kulturen wurden getestet, indem sie bei 4°C aufgetaut, in 4 M Guanidin-HCl mit 50 nM Na-Acetat, 13 mM EDTA, 6 mM NEM und 3 nM PMSF (pH 5,8) homogenisiert, und durch Schütteln über Nacht extrahiert wurden. Die überstehende Fraktion nach Zentrifugieren bei 25.000 G (40 min bei 4°C) wurde über Nacht bei 4°C gegen 50 Volumsteile 0,2 M NaCl, 50 mM Tris (pH 7,4) dialysiert. Der Überstand wurde mittels ELISA auf PG getestet, wie von Renard et al., Anal. Biochem. 104, 205 (1980) und in US-A 4,434,094 beschrieben.
Um den ELISA kurz zu beschreiben, wurde gemäß Standardtechniken Antiserum gegen PG in Hasen produziert, die keine Kreuzreaktivität mit Hyaluronsäure oder mit aus Rattenknochen extrahiertem PG zeigten. Gereinigtes PG (S. Seyedin et al., siehe oben) aus Chondrosarkom-Gewebe von Swarm-Ratten wurde als Standard-Antigen verwendet. Die dialysierten Proben wurden für den Assay 1 : 2 (v /v) in Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS) mit 0,05% Tween 20,1 mg/ml Rinderserumalbumin (BSA) (pH 7,2) verdünnt. Meerrettich-peroxidase-konjugiertes Ziegen-Anti-Hasen-IgG (Tago) war der zweite Antikörper mit o-Phenylendiamin als Substrat.
Die Ergebnisse der ELISA's von mittels RP-HPLC gereinigtem CIF-A und CIF-B sind in 4 dargestellt. Wie dort gezeigt, liegt die Empfindlichkeit des Assays innerhalb von 1–5 ng/ml Kulturmedium. Die Ergebnisse der ELISA's der Gelscheiben aus Abschnitt F sind in 5 dargestellt. Diese Ergebnisse sind mit jenen für CIF-A und CIF-B aus der RP-HPLC vergleichbar (entsprechen den Gelscheiben 7 und 6).
H. Charakterisierung von gereinigtem CIF-A und CIF-B
CIF-A erwies sich als ein Protein mit 25.800 Dalton, das bei Reduktion ein Polypeptid mit 14,800 Dalton ergab, wie durch Messungen der Beweglichkeiten der Proteine in einem 15%-igen Polyacrylamid-Gel nach Laemmli [U.K. Laemmli et al., Nature 227, 680 (1970)] in SDS gezeigt wurde. Es versteht sich, dass die so bestimmten Molekulargewichte ungefähre Werte sind, die vom angewandten Messverfahren abhängen. Die Konformation des Proteins beeinflusst dessen Beweglichkeit in diesem System, weshalb die erhaltenen Molekulargewichte bei Bestimmung ge mäß anderer Verfahren ähnlich, aber nicht unbedingt identisch sind. Das Vorliegen einer einzelnen Bande im Profil des reduzierten Proteins zeigt, dass das Protein wahrscheinlich ein Dimer aus zwei Polypeptid-Ketten mit im Wesentlichen äquivalenten Aminosäuresequenzen (d.h. ein Homodimer) ist. Die Diskrepanz zwischen den Molekulargewichten des Dimers und der einzelnen Ketten ist verfahrensbedingt.
CIF-A behielt seine Aktivität im obigen ELISA-Assay aus Absatz G sogar nach Erhitzen auf 100°C in PBS für 3 min, nach Behandlung mit Collagenase über 2 h in 0,1 M Tris (pH 7,4), 5 mM CaCl₂, 0,02 mM PMSF, mit einem Verhältnis von Collagenase zu Protein von 400 Einheiten/mg Protein, und nach Behandlung mit Trypsin über 2 h bei 37°C in 50 mM Tris (pH 7,4), 10 mM CaCl₂, mit einem Verhältnis von Trypsin zu Protein von 100 Einheiten/mg Protein, bei. Das Protein verlor jedoch nach Behandlung über 1 h bei Raumtemperatur in PBS, die 5 mM Dithiothreitol (DTT) enthielt, an Aktivität, was Reduktion der Disulfid-Bindungen bewirkte. In ähnlicher Weise führte SDS-Behandlung oder Fraktionierung auf SDS-PAGE zur Inaktivierung des Proteins, vermutlich aufgrund von Denaturierung oder Komplexierung durch das SDS. Die partielle Aminosäure-Zusammensetzung von CIF-A ist in Tabelle 1 angeführt.
Tabelle 1
Aminosäuresequenz-Analyse von CIF-A zeigte, dass er die folgende, einzelne N-terminale Sequenz besitzt:
Diese N-terminale Sequenz ist identisch mit jener, die für von menschlicher Plazenta stammenden TGF-β berichtet wurde.
CIF-B wies bei Messungen nach demselben Verfahren ein etwas unterschiedliches Molekulargewicht von 26.000 Dalton auf. Dieser Unterschied kann verfahrensbedingt sein. Daher wird für beide Proteine ein mittels SDS-PAGE gemessenes Molekulargewicht von ungefähr 26.000 Dalton angenommen. Bei Reduktion zeigte das Protein von Peak B eine einzelne Bande bei etwa 14.200 Dalton, was zeigt, dass es wahrscheinlich auch ein Homodimer ist. Es weist die in Tabelle 2 angeführte Aminosäure-Zusammensetzung auf.
Tabelle 2
Aminosäuresequenz-Analyse zeigte, dass CIF-B die folgende, einzelne, N-terminale Sequenz besitzt:
Seine übrigen Eigenschaften waren bei qualitativer Bestimmung gleich jenen zuvor für CIF-A beschriebenen.
I. Assay auf TGF-β-Aktivität
CIF-A und CIF-B wurden im TGF-β-Bioassay getestet. Der Assay erfolgte wie in Methods for Preparation of Media, Supplements, and Substrats for Serum-Free Animal Cell Culture (1984), S. 181–194, Alan R. Liss, Inc., beschrieben. Die Ergebnisse des Assays sind in 6 angegeben. Wie dort dargestellt, zeigen beide Proteine im Assay einen klaren Dosis-Response und erfordern die Gegenwart eines Aktivators (EGF), um aktiv zu sein. Die Aktivitätswerte sind mit jenen, die für von menschlichen Blutplättchen, menschlicher Plazenta oder Rindernieren stammendem TGF-β berichtet werden, vergleichbar.
Die Fähigkeit der CIF's, einer Trypsin-Behandlung standzuhalten, ohne an Aktivität einzubüßen, macht es möglich, sie aus entmineralisiertem Knochenpulver mittels enzymatischer Spaltung zu isolieren. In einem derartigen Verfahren wird das entmineralisierte Knochenpulver mit einer wässrigen Lösung von Trypsin und/oder anderen Proteasen, die die interessierenden Proteine nicht abbauen, unter Bedingungen, bei denen derartige Enzyme aktiv sind, digeriert. Durch diese Behandlung wird der Hauptteil anderer Proteinkomponenten im Pulver digeriert. Die interessierenden Proteine können aus dem resultierenden Digest gemäß einem oder mehreren der zuvor beschriebenen Fraktionierungsverfahren (Gelfiltration, Ionenaustausch-Chromatografie, RP-HPLC oder nicht-denaturierende Gelelektrophorese) gereinigt werden. Je nach dem Ausmaß der Freisetzung der CIF's aus der Knochenmatrix, ohne mit anderen Materialien komplexiert zu werden, kann der Einsatz von solubilisierenden Mitteln vermieden werden. Unter diesem Aspekt sind die reinen Proteine im Wesentlichen wasserlöslich.
Die CIF's dienen zur Induktion von Knorpel/Knochen-Wachstum zur Heilung, zum Ersatz oder zur Vermehrung von Knorpel/Knochen-Gewebe bei Tieren, einschließlich von Menschen. Für die Chondrogenese/Osteogenese wirksame Mengen der Proteine können mit in Knochen vorkommenden Chondrogenese/Osteogenese-Co-Faktoren kombiniert und mit pharmakologisch und physiologisch annehmbaren, flüssigen oder festen Trägern, wie z.B. gereinigtem Collagen, zur Implantation formuliert werden. Das Gewichtsverhältnis von aktivem Protein zu Träger liegt typischerweise im Bereich von 1 : 50 bis 1 : 1.000. Die Implantate können gemäß herkömmlichen chirurgischen Techniken, einschließlich von Injektion als aktiver Bestandteil, an vorbestimmten Stellen im Patienten eingebracht werden. Collagenartige Implantate, die nur CIF-B als aktiven Bestandteil, mit einem Verhältnis CIF : Träger von über etwa 1 : 6.000, enthalten (d.h., frei von jeglichem Aktivator oder Co-Faktor sind), förderten die Ablagerung von collagenartigem Bindegewebe.
Die CIF's können auch auf dieselbe Weise wie von menschlichen Blutplättchen, menschlicher Plazenta oder Rindernieren stammender TGF-β verwendet werden, um nicht arten-spezifische Zellvermehrung zu fördern (zu bewirken und beizubehalten). In derartigen Anwendungen wird einer oder beide CIF's in etwa stöchiometrischen Verhältnissen mit einem THF-β-Aktivator, wie z.B. EGF oder TGF-α, kombiniert. Klinische Anwendungen der Zellvermehrungs-Aktivität dieser Zusammensetzungen umfassen topische Verabreichung zur Heilung von Verbrennungen oder Wunden, Implantation zur Gewebevermehrung und systemische Verabreichung zur Heilung von inneren Wunden. Bei derartigen Anwendungen werden der CIF und der Aktivator in zur Induktion von Zellvermehrung ausreichenden Mengen mit pharmazeutisch annehmbaren Trägern formuliert, die der jeweiligen Art der Verabreichung angepasst sind. Topische Dosierformen werden typischerweise als Sprays, Gele, Salben oder Pasten formuliert. Implantate werden injizierbar formuliert. Systemische Dosierformen können zur enteralen Verabreichung (z.B. als Flüssigkeiten, Pillen, Tabletten) oder zur parenteralen Injektion formuliert werden. Die bei derartigen Anwendungen eingesetzten Dosierungen können wegen der Art der Zellvermehrung und der Unterschiedlichkeit der Wunden und anderer Verletzungen nicht genau angegeben werden.

Claims

Homogenes chondrogenes/osteogenes Protein, wobei das Protein (a) in Säugetierknochen anzutreffen ist; (b) Knorpelbildung fördert; (c) im In-vitro-Chondrogenitäts-Assay Aktivität zeigt; (d) ein Dimer mit einem mittels SDS-PAGE bestimmten ungefähren Molekulargewicht von 26.000 Dalton ist; (e) nicht TGF-β1 ist; und (f) nach einem Verfahren isolierbar ist, das die folgenden Schritte umfasst: (i) das Behandeln von entmineralisiertem Knochen mit einem chaotropen Extraktionsmittel, das nicht-fibröse Proteine solubilisiert; (ii) das Unterwerfen des Extrakts aus Schritt (i) einer Gelfiltration, um eine chondrogen aktive Fraktion zu gewinnen, die Proteine mit einem Molekulargewicht von 10.000–40.000 Dalton enthält; (iii) das Adsorbieren der chondrogen aktiven Fraktion aus Schritt (ii) an einen Carboxymethylcellulose-Kationenaustauscher bei einem pH von etwa 4,5–5,5 unter denaturierenden Bedingungen; (iv) das Eluieren der chondrogen aktiven Fraktion vom Kationenaustauscher mittels eines NaCl-Gradienten von 10 bis 400 mM; (v) das Unterziehen des chondrogen aktiven Anteils des Eluats aus (iv), der nach der Hauptmenge der Proteine eluiert, einer RP-HPLC oder nichtdenaturierender Gelelektrophorese, wobei der Anteil bei RP-HPLC nur zwei Peaks mit chondrogener Aktivität ergibt; und (vi) das Gewinnen des Proteins vom zweiten der beiden Peaks aus der RP-HPLC oder das Gewinnen des entsprechenden Proteins aus der nichtdenaturierenden Gelelektrophorese.
Verfahren nach Anspruch 1, worin der Knochen unter (a) Rinderknochen ist.
Verfahren zur Herstellung einer Implantat-Zusammensetzung zur Induktion von Chondrogenese/Osteogenese, wobei das Verfahren die Aufnahme eines Proteins nach Anspruch 1 in die Zusammensetzung umfasst.
Verwendung eines nach Anspruch 1 hergestellten Proteins bei der Herstellung einer Implantat-Zusammensetzung zur Induktion von Chondrogenese/Osteogenese. PATENTANSPRÜCHE für Vertragsstaat AT (geändert) 1. Verfahren zum Isolieren eines homogenen chondrogenenlosteogenen Proteins, wobei das Protein: (a) in Säugetierknochen anzutreffen ist; (b) Knorpelbildung fördert; (c) im In-vitro-Chondrogenitäts-Assay Aktivität zeigt; (d) ein Dimer mit einem mittels SDS-PAGE bestimmten ungefähren Molekulargewicht von 26.000 Dalton ist; (e) nicht TGF-β1 ist; und wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst: (i) das Behandeln von entmineralisiertem Knochen mit einem chaotropen Extraktionsmittel, das nicht-fibröse Proteine solubilisiert; (ii) das Unterwerfen des Extrakts aus Schritt (i) einer Gelfiltration, um eine chondrogen aktive Fraktion zu gewinnen, die Proteine mit einem Molekulargewicht von 10.000–40.000 Dalton enthält; (iii) das Adsorbieren der chondrogen aktiven Fraktion aus Schritt (ii) an einen Carboxymethylcellulose-Kationenaustauscher bei einem pH von etwa 4,5–5,5 unter denaturierenden Bedingungen; (iv) das Eluieren der chondrogen aktiven Fraktion vom Kationenaustauscher mittels eines NaCl-Gradienten von 10 bis 400 mM; (v) das Unterziehen des chondrogen aktiven Anteils des Eluats aus (iv), der nach Hauptmenge der Proteine eluiert, einer RP-HPLC oder nichtdenaturierender Gelelektrophorese, wobei der Anteil bei RP-HPLC nur zwei Peaks mit chondrogener Aktivität ergibt; und (vi) das Gewinnen des Proteins vom zweiten der beiden Peaks aus der RP-HPLC oder das Gewinnen des entsprechenden Proteins aus der nichtdenaturierenden Gelelektrophorese. 2. Verfahren nach Anspruch 1, worin der Knochen unter (a) Rinderknochen ist. 3.Verfahren zur Herstellung einer Implantat-Zusammensetzung zur Induktion von Chondrogenese/Oseogenese, wobei das Verfahren das Aufnehmen eines Proteins nach Anspruch 1 in die Zusammensetzung umfasst. 4. Verwendung des nach Anspruch 1 hergestellten Proteins bei der Herstellung einer Implantat-Zusammensetzung zur Induktion von Chondrogenese/Osteogenese.