DE3588239T3

DE3588239T3 - Verfahren zum Erhalten von DNS, RNS, Peptiden, Polypeptiden oder Proteinen durch DMS-Rekombinant-Verfahren

Info

Publication number: DE3588239T3
Application number: DE3588239T
Authority: DE
Inventors: Marc Ballivet; Stuart A. Kauffman
Original assignee: Kauffman Stuart A Santa Fe
Current assignee: KAUFFMAN, STUART A., SANTA FE, N.MEX., US
Priority date: 1985-03-30
Filing date: 1985-06-17
Publication date: 2007-03-08
Anticipated expiration: 2005-06-18
Also published as: GB2183661A; US5976862A; DE3587814D1; CN86102090A; US20040161816A1; GB8628313D0; HK20292A; DE3587814T2; DE3546807C2; US5824514A; IN165561B; DE3590766C2; CA1341595C; JPS62502235A; DE229046T1; DE3588239T2; EP0229046B1; DE3590766T; CA1339937C; JP2002325594A

Description

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zum Erhalten von DNS, RNS, Peptiden, Polypeptiden oder Proteinen mittels modifizierter Wirtszellen, die Gene enthalten, die in der Lage sind, diese RNS, Peptide, Polypeptide oder Proteine zu exprimieren, das heißt unter Verwendung einer DNS-Rekombinationstechnik.
Die Erfindung zielt insbesondere darauf ab, in stochastischer Weise hergestellte Gene oder Genfragmente auf eine Art herzustellen, die es erlaubt, nach Transkription und Übersetzung dieser Gene, eine sehr große Anzahl völlig neuer Proteine oder Hybride bekannter Proteine in Anwesenheit von Wirtszellen (bakterielle oder eukaryotische Stämme), welche die jeweiligen Gene, die zur Expression dieser Proteine in der Lage sind, enthalten, gleichzeitig zu erhalten und dann eine Auswahl oder eine Trennung unter den Stämmen auszuführen, um diejenigen zu bestimmen, die Proteine herstellen, die gewünschte Eigenschaften zeigen, beispielsweise enzymatische, katalytische, antigene, pharmakologische strukturelle Eigenschaften, oder Liganden-Eigenschaften, und allgemeiner, chemische, biochemische, biologische, etc. Eigenschaften.
Die Erfindung hat gleichermaßen zum Ziel, die Erhaltung von DNS- oder RNS-Sequenzen, die brauchbare Eigenschaften zeigen, insbesondere chemische, biochemische oder biologische Eigenschaften, zu erlauben.
Es versteht sich also, daß sich die Erfindung dazu eignet, auf sehr unterschiedlichen Gebieten der Wissenschaft, der Industrie und der Medizin sehr zahlreiche Anwendungen zu erfahren.
Die Erfindung stellt ein Verfahren zum Identifizieren eines Peptides, eines Polypetides oder eines Proteins, das an einen Liganden bindet, gemäß Anspruch 1 bereit. Die Erfindung stellt andere Verfahren gemäß den Ansprüchen 9, 10, 11, 12, 18, und 19 bereit.
Gemäß einer ersten Art zur Durchführung der Verfahren der Erfindung stellt man die Gene her durch stochastische Copolymerisation der vier Arten von Deoxyphosphonucleotiden A, C, G und T, ausgehend von den zwei Enden eines vorher linearisierten Expressionsvektors, dann Bildung von kohäsiven Enden auf eine Art, um einen ersten, in stochastischer Weise hergestellten DNS-Strang zu bilden, der besteht aus einem Molekül des Expressionsvektors, das zwei in stochastischer Weise hergestellte Sequenzen besitzt, wovon die 3'-Enden komplementär sind, gefolgt von der Synthese des zweiten Stranges dieser in stochastischer Weise hergestellten DNS.
Nach einer zweiten Art der Durchführung stellt man die Gene her durch stochastische Copolymerisation von Oligonucleotiden ohne kohäsive Enden, um so in stochastischer Weise hergestellte DNS-Fragmente zu bilden, gefolgt von der Ligierung dieser Fragmente an einen vorher linearisierten Expressionsvektor.
Der Expressionsvektor kann ein Plasmid sein, insbesondere ein Bakterien-Plasmid. Hervorragende Ergebnisse wurden erhalten durch Verwendung des Plasmids pUC8 als Expressionsvektor. Der Expressionsvektor kann gleichermaßen eine virale DNS oder ein Hybrid aus einem Plasmid und einer viralen DNS sein.
Die Wirtszellen können Prokaryoten-Zellen, wie die Zellen HB 101 und C 600, oder Eukaryoten-Zellen sein.
Wenn man gemäß der oben angegebenen zweiten Durchführungsart vorgeht, kann man Oligonucleotide verwenden, die eine Gruppe palindromischer Octamere bilden.
Besonders gute Ergebnisse werden erhalten bei Verwendung der folgenden Gruppe palindromischer Octamere:
5' GGAATTCC 3'
5' GGTCGACC 3'
5' CAAGCTTG 3'
5' CCATATGG 3'
5' CATCGATG 3'
Man kann gleichermaßen Oligonucleotide verwenden, die eine Gruppe palindromischer Heptamere bilden.
Sehr gute Ergebnisse werden erhalten bei Verwendung der folgenden Gruppe palindromischer Heptamere:
5' XTCGCGA 3'
5' XCTGCAG 3'
5' RGGTACC 3'
worin X = A, G, C oder T und R = A oder T.
Gemäß einer besonders vorteilhaften Durchführungsart isoliert und reinigt man die transformierende DNS der Plasmide, die aus einer Kultur unabhängiger Stämme modifizierter Wirtszellen, die durch Vorgehen in der oben angegebenen Weise erhalten wurden, stammt, dann führt man das Schneiden der gereinigten DNS mittels mindestens eines Restriktionsenzyms, das einer spezifischen enzymatischen Schnittstelle entspricht, die in diesen palindromischen Octameren oder Heptameren vorhanden ist, aber in dem verwendeten Expressionsvektor fehlt, herbei, wobei diesem Schneiden die Inaktivierung des Restriktionsenzyms folgt, und man behandelt dann gleichzeitig die Gesamtheit der so erhaltenen, linearisierten, in stochastischer Weise hergestellten DNS-Fragmente mit der T4 DNA-Ligase, um so ein neues DNS-Ensemble zu erzeugen, das neue, in stochas tischer Weise hergestellte Sequenzen enthält, wobei dieses neue Ensemble also eine Anzahl von in stochastischer Weise hergestellten Genen enthalten kann, die höher ist als die Anzahl an Genen des anfänglichen Ensembles, und man verwendet dieses neue Ensemble transformierender DNS, um Wirtszellen zu modifizieren und die Gene zu klonieren, und schließlich trennt man und/oder wählt man die neuen Stämme von transformierten Wirtszellen aus und isoliert sie, und schließlich kultiviert man sie auf eine Art, um mindestens ein Peptid oder Polypeptid, beispielsweise ein neues Protein, herzustellen.
Die Eigenschaft, die als Auswahlkriterium für die Wirtszellen-Stämme dient, kann die Eignung der von diesem Stamm hergestellten Peptide oder Polypeptide sein, sich an einen gegebenen Liganden zu binden.
Aufgabe der Erfindung ist gleichfalls die Verwendung des durch das oben angegebene Verfahren erhaltenen Peptids oder Polypeptids zum Auffinden und/oder zur Titration eines Liganden.
Gemäß einer besonders vorteilhaften Durchführungsart ist das Auswahlkriterium für den modifizierten Wirtszellen-Stamm die Eignung der Peptide oder Polypeptide, die Wirkungen eines biologisch aktiven Moleküls, beispielsweise eines Proteins, zu simulieren oder zu modifizieren, und man führt die Trennung und/oder die Auswahl des modifizierten Wirtszellen-Stammes, der mindestens ein Peptid oder Polypeptid mit dieser Eigenschaft herstellt, aus, indem man Antikörper gegen dieses aktive Molekül herstellt und indem man diese Antikörper, nach ihrer Reinigung, zum Identifizieren der Stämme, die dieses Peptid oder Polypeptid enthalten, verwendet, dann, indem man die so identifizierten Stämme kultiviert und indem man das von diesen Stämmen hergestellte Peptid oder Polypeptid abtrennt und reinigt, und schließlich, indem man dieses Peptid oder Polypeptid einem in vitro-Versuch unterzieht, um festzustellen, daß es tatsächlich die Eignung zeigt, die Wirkungen des Moleküls zu simulieren oder zu modifizieren.
Gemäß einer anderen Durchführungsart des erfindungsgemäßen Verfahrens ist die als Auswahlkriterium dienende Eigenschaft, mindestens ein Epitop zu haben, das einem der Epitope eines gegebenen Antigens ähnlich ist.
Nach einer Variante des Verfahrens identifiziert und isoliert man die modifizierten Wirtszellen-Stämme, die die Peptide oder Polypeptide mit der gewünschten Eigenschaft herstellen, mittels Affinitätschromatographie an Antikörpern, die einem von dem natürlichen Teil des DNS-Hybrids exprimierten Protein entsprechen.
Beispielsweise kann man in dem Fall, in dem der natürliche Teil des DNS-Hybrids ein Gen enthält, das die β-Galactosidase exprimiert, vorteilhafterweise die modifizierten Wirtszellen-Stämme durch Affinitätschromatographie an Anti-β-Galactosidase-Antikörpern identifizieren und isolieren.
Nach Expression und Reinigung der Peptide oder hybridischen Polypeptide kann man ihre neuen Teile abtrennen und isolieren.
Die Erfindung betrifft gleichfalls eine Anwendung des oben angegebenen Verfahrens für die Gewinnung eines Impfstoffs, wobei diese Anwendung dadurch gekennzeichnet ist, daß man Antikörper gegen ein pathogenes Mittel isoliert, beispielsweise Antikörper, die nach Injektion dieses pathogenen Mittels in den Organismus eines Tieres, das zur Bildung von Antikörpern gegen dieses Mittel in der Lage ist, gebildet wurden, und daß man diese Antikörper verwendet, um die Klone zu identifizieren, die mindestens ein Protein mit mindestens einem Epitop, das einem der Epitope des pathogenen Mittels ähnlich ist, herstellen, daß man die diesen Klonen entsprechenden modifizierten Wirtszellen-Stämme auf eine Art kultiviert, daß sie dieses Protein herstellen, daß man dieses Protein, ausgehend von den Kulturen dieser Zellstämme, isoliert und reinigt, und daß man dieses Protein für die Gewinnung eines Impfstoffs gegen das pathogene Mittel verwendet.
Beispielsweise kann man für die Gewinnung eines Anti-HVB-Impfstoffs mindestens ein Capsid-Protein des HVB-Virus extrahieren und reinigen, dieses Protein in den Organismus eines Tieres, das zur Bildung von Antikörpern gegen dieses Protein in der Lage ist, injizieren, die so gebildeten Antikörper sammeln und reinigen, diese Antikörper verwenden, um die Klone zu identifizieren, die mindestens ein Protein mit mindestens einem Epitop, das einem der Epitope des HVB-Virus ähnlich ist, herstellen, die modifizierten Wirtszellen-Stämme, die diesen Klonen entsprechen, dergestalt kultivieren, daß sie dieses Protein herstellen, ausgehend von den Kulturen dieser Zellstämme dieses Protein isolieren und reinigen, und dieses Protein zur Gewinnung eines Anti-HVB-Impfstoffs verwenden.
Vorteilhafterweise, gemäß einer Durchführungsart des erfindungsgemäßen Verfahrens, bestehen die Wirtszellen aus Bakterien der Gattung Escherichia coli, deren Genom weder das natürliche, die β-Galactosidase exprimierende Gen, noch das Gen EBG enthält, das heißt E. Coli-Bakterien (Z^–, EBG^–), man kultiviert die modifizierten Wirtszellen in Anwesenheit des Mediums X-gal und des Induktors IPTG, bis man in dem Kulturmedium die Klone auffindet, die für die β-Galactosidase-Funktion positiv sind, und schließlich transplantiert man dann diese DNS in einen Wirtszellen-Stamm, der geeignet ist für die Kultur in großer Menge im Hinblick auf die industrielle Produktion mindestens eines Peptids oder Polypeptids.
Die als Auswahlkriterium der transformierten Wirtszellen-Stämme dienende Eigenschaft kann gleichermaßen die Eignung der mittels Kultur dieser Stämme hergestellten Polypeptide oder Proteine sein, sich an eine gegebene Verbindung zu binden.
Diese Verbindung kann, insbesondere, vorteilhafterweise ausgewählt werden unter den Peptiden, den Polypeptiden und den Proteinen, insbesondere den Regulatorproteinen der Transkriptionsaktivität der DNS.
Andererseits kann die Verbindung gleichermaßen unter den DNS- und RNS-Sequenzen ausgewählt werden.
Gegenstand der Erfindung sind gleichermaßen die in dem Fall erhaltenen Proteine, in dem die als Auswahlkriterium der transformierten Wirtszellen-Stämme dienende Eigenschaft genau in der Eignung dieser Proteine besteht, sich an Proteine, die für die Transkriptionsaktivität der DNS regulatorisch sind, oder auch an DNS- oder RNS-Sequenzen, zu binden.
Gegenstand der Erfindung ist außerdem die Verwendung eines Proteins, das in dem ersten besonderen Fall, der soeben erwähnt wurde, erhalten wurde, als cis-regulatorische Sequenz der Replikation oder der Transkription einer angrenzenden DNS-Sequenz.
Gegenstand der Erfindung ist andererseits gleichermaßen die Verwendung der Proteine, die in dem zweiten, oben erwähnten, besonderen Fall erhalten wurden, zur Modifizierung der Transkriptions- oder Replikations-Eigenschaften einer DNS-Sequenz in einer Zelle, die diese DNS-Sequenz enthält und dieses Protein exprimiert.
Gegenstand der Erfindung ist gleichermaßen ein Verfahren zur Herstellung von DNS, dadurch gekennzeichnet, daß man gleichzeitig in einem identischen Medium Gene herstellt, die zumindest teilweise aus synthetischen, stochastischen Polynucleotiden bestehen, daß man die so erhaltenen Gene in Wirtszellen einführt, dergestalt, daß ein Ensemble modifizierter Wirtszellen hergestellt wird, daß man eine Trennung und/oder eine Auswahl dieses Ensembles ausführt, dergestalt, daß die Wirtszellen, die in ihrem Genom stochastische DNS-Sequenzen, die mindestens eine gewünschte Eigenschaft zeigen, enthalten, identifiziert werden, und daß man schließlich die DNS, ausgehend von den so identifizierten Wirtszellen-Kulturen, isoliert.
Gegenstand der Erfindung ist außerdem ein Verfahren zur Herstellung von RNS, dadurch gekennzeichnet, daß man gleichzeitig, in einem identischen Medium, Gene herstellt, die zumindest teilweise aus synthetischen, stochastischen Polynucleotiden bestehen, daß man die so erhaltenen Gene in Wirtszellen einführt, dergestalt, daß ein Ensemble modifizierter Wirtszellen hergestellt wird, daß man gleichzeitig die so hergestellten unabhängigen Stämme modifizierter Wirtszellen kultiviert, daß man eine Trennung und/oder eine Auswahl dieses Ensembles ausführt, dergestalt, daß die Wirtszellen, die stochastische RNS-Sequenzen, die mindestens eine gewünschte Eigenschaft zeigen, beinhalten, identifiziert werden, und daß man die RNS, ausgehend von Kulturen so identifizierter Wirtszellen, isoliert.
Die Eigenschaft kann die Eignung sein, sich an eine gegebene Verbindung, die beispielsweise ein Peptid, ein Polypeptid oder ein Protein sein kann, zu binden.
Nun wird das erfindungsgemäße Verfahren sowie bestimmte seiner Anwendungen unter Bezugnahme auf nicht beschränkende Ausführungsbeispiele detaillierter beschrieben.
Zuerst werden Ausführungsarten beschrieben, die besonders vorteilhaft sind für die Ausführung der Synthese von in stochastischer Weise hergestellten Genen und die Einführung dieser Gene in Bakterien, in einer Weise, um transformierte Bakterienstämme herzustellen.
I) Direktsynthese an einem Expressionsvektor
a) Linearisierung des Vektors
30 μg (das heißt näherungsweise 10¹³ Moleküle) des Expressionsvektors pUC8 werden durch zweistündige Inkubation bei 37° (mit 100 Einheiten des Restriktionsenzyms PstI in einem Volumen von 300 μl des passenden Standardpuffers linearisiert. Der linearisierte Vektor wird mit Phenol-Chloroform behandelt, dann mit Ethanol ausgefällt, in einem Volumen von 30 μl wieder aufgenommen und auf ein 0,8%-iges Agarosegel aufgebracht, in TEB-Standardmedium. Nach dreistündiger Wanderung in einem Feld von 3 V/cm wird der lineare Vektor elektroeluiert, mit Ethanol ausgefällt und in 30 μl Wasser wieder aufgenommen.
b) Stochastische Synthese mittels des Enzyms
Terminale Transferase (TdT)
Man läßt 30 μg des linearisierten Vektors mit 30 Einheiten TdT in 300 μl des passenden Puffers zwei Stunden lang bei 37°C in Anwesenheit von 1 mM dGTP, 1 mM dCTP, 0,3 mM dTTP und 1 mM dATP reagieren: man wählt eine niedrigere Konzentration an dTTP mit dem Ziel, die Häufigkeit von „Stop"-Codons in der entsprechenden Messenger-RNS zu verringern. Ein ähnliches Ergebnis, wenn auch weniger günstig, kann erhalten werden, indem man für ATP eine geringere Konzentration verwendet als für die anderen Deoxynucleotid-triphosphate. Der Fortschritt der Polymerisationsreaktion am 3'-Ende der PstI-Stellen wird durch Gelanalyse aliquoter Teile, die im Laufe der Reaktion entnommen werden, verfolgt.
Wenn die Reaktion einen mittleren Wert von 300 Nucleotiden pro 3'-Ende erreicht oder überschreitet, wird sie unterbrochen, und die freien Nucleotide werden mittels differentieller Ausfällung oder mittels Durchgang durch ein Molekularsieb des Typs Biogel P60 von dem Polymer abgetrennt. Nach Konzentrierung mittels Ausfällung mit Ethanol wird das Polymer infolge einer ergänzenden Polymerisation mittels TdT zunächst in Anwesenheit von dATP, dann von dTTP, unterzogen. Diese zwei letzteren Reaktionen werden getrennt mittels einer Gelfiltration und während kurzer Zeitspannen (30 Sekunden bis 3 Minuten) ausgeführt, dergestalt, daß sie zur sequentiellen Anfügung von 10 bis 30 A, gefolgt von 10 bis 30 T, am 3'-Ende der Polymere führen.
c) Synthese des zweiten Strangs der in stochastischer Weise hergestellten DNS
Jedes Vektormolekül besitzt, am Ende der vorausgehenden Arbeitsgänge, zwei stochastische Sequenzen, deren 3'-Enden komplementär sind. Das Polymeren-Gemisch wird nun unter Bedingungen inkubiert, die die Hybridisierung dieser komplementären Enden begünstigen (150 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl, pH 7,6, 1 mM EDTA, 10 Minuten lang bei 65°C, dann Absenkung der Temperatur auf 22°C mit 3 bis 4°C/Stunde). Die Hybrid-Polymere werden dann zwei Stunden lang bei 4°C in Anwesenheit der vier Nucleotid-triphosphate (200 mM) der Wirkung von 60u (Einheiten) des großen Fragments der Polymerase I (Klenow) unterzogen. Dieser Schritt bewirkt die Synthese des zweiten Stranges ausgehend vom 3'-Ende der Hybrid-Polymere. Die sich aus dieser Direktsynthese ausgehend von einem linearisierten Vektor ergebenden Moleküle werden dann zum Transformieren kompetenter Zellen verwendet.
d) Transformation kompetenter Stämme
100 bis 200 ml kompetenter Zellen HB101 oder C600, mit der Konzentration von 10¹⁰ Zellen/ml, werden 30 Minuten lang bei 0°C in Anwesenheit von 6 mM CaCl₂, 6 mM Tris-HCl, pH 8, 6 mM MgCl₂, mit dem Präparat von in stochastischer Weise hergestellter DNS inkubiert. Auf das Gemisch wird ein Wärmeschock von 3 Minuten bei 37°C ausgeübt, gefolgt von der Zugabe von 400 bis 800 ml Kulturmedium NZY ohne Antibiotikum. Die transformierte Kultur wird 60 Minuten lang bei 37°C inkubiert, dann durch Zugabe des 40 μg/ml Ampicillin enthaltenden Mediums NZY auf 10 l verdünnt. Nach 3 bis 5 Stunden Inkubation bei 37°C wird die amplifizierte Kultur einem Zentrifugieren unterzogen, und der Bodensatz der transformierten Zellen wird gefriergetrocknet und bei –70°C aufbewahrt. Eine derartige Kultur weist 3 × 10⁷ bis 10⁸ unabhängige Transformanten auf, von denen jede ein einzigartiges, in stochastischer Weise hergestelltes Gen, eingefügt in einen Expressionsvektor, enthält.
II) Synthese von in stochastischer Weise hergestellten Genen ausgehend von Oligonucleotiden ohne kohäsive Enden
Diese Vorgehensweise stützt sich auf die Tatsache, daß die Polymerisierung vernünftig ausgewählter palindromischer Oligonucleotide es erlaubt, in stochastischer Weise hergestellte Gene zusammenzubauen, die in keinem der sechs möglichen Leserahmen ein „Stop"-Codon enthalten, wobei eine ausgewogene Repräsentierung von Triplets, die alle Aminosäuren spezifizieren, sichergestellt wird. Außerdem, und um die Wiederholung von Sequenzmustern in dem sich ergebenden Protein zu vermeiden, können die Oligonucleotide eine Anzahl an Basen aufweisen, die kein Vielfaches von drei ist. Das folgende Beispiel beschreibt die Verwendung einer möglichen Kombination von Oligonucleotiden, die diese Kriterien erfüllt:
a) Wahl einer Gruppe von Octameren
Die folgende Gruppe von Oligonucleotiden:
5' GGAATTCC 3'
5' GGTCGACC 3'
5' CAAGCTTG 3'
5' CCATATGG 3'
5' CATCGATG 3'
besteht aus fünf Palindromen (also autokomplementär), bei denen leicht nachzuprüfen ist, daß ihre stochastische Polymerisation kein „Stop"-Codon erzeugt und alle Aminosäuren spezifiziert.
Natürlich könnte man gleichfalls andere Gruppen palindromischer Octamere, die keine „Stop"-Codone erzeugen und alle Aminosäuren der Polypeptide spezifi zieren, verwenden. Es versteht sich gleichfalls, daß man Gruppen nicht palindromischer Octamere unter der Bedingung verwenden könnte, auch ihre Komplemente zur Bildung doppelkettiger Segmente einzusetzen.
b) Zusammenfügung eines in stochastischer Weise hergestellten Gens ausgehend von einer Gruppe von Octameren
Man läßt ein Gemisch, aufweisend 5 μg eines jeden der oben angegebenen Oligonucleotide (vorausgehend mittels eines an sich bekannten Verfahrens an 5' phosphoryliert) in einem Volumen von 100 μl, das 1 mM ATP, 10% Polyethylenglycol und 100u T₄-DNS-Ligase, in dem passenden Puffer, enthält, bei 13°C 6 Stunden lang reagieren. Dieser Schritt bewirkt die stochastische Polymerisation der Oligomere in doppelkettiger Form, ohne kohäsive Enden. Man isoliert dann die sich aus dem Zusammenfügen von 20 bis 100 Oligomeren ergebenden Polymere mittels Durchgang durch ein Molekularsieb (Biogel P60). Nach Konzentrierung wird diese Fraktion erneut unter den oben beschriebenen Bedingungen der von der T₄-DNS-Ligase katalysierten Polymerisation unterzogen. Man isoliert also, wie weiter oben beschrieben, die sich aus dem Zusammenfügen von mindestens 100 Oligomeren ergebenden Polymere.
c) Herstellung des Plasmid-Wirts
Der Expressionsvektor pUC8 wird, wie oben beschrieben, mittels des Enzyms Sma I in dem passenden Puffer linearisiert. Der mittels des Enzyms Sma I linearisierte Vektor weist keine kohäsiven Enden auf. Der linearisierte Vektor wird dann bei 37°C 30 Minuten lang mit der alkalischen Phosphatase des Kälberdarms (CIP) mit einer Menge von einer Einheit pro μg des Vektors in dem passenden Puffer behandelt. Das Enzym CIP wird dann durch zwei aufeinanderfolgende Extraktionen mit Phenol-Chloroform inaktiviert. Der linearisierte und dephosphorylierte Vektor wird mit Ethanol ausgefällt, dann in Wasser zu 1 mg/ml wieder aufgenommen.
d) Ligierung von in stochastischer Weise hergestellten Genen an den Vektor
Äquimolare Mengen Vektor und Polymer werden gemischt und in Anwesenheit von 1000 u T₄-DNA-Ligase, 1 mM ATP, 10% Polyethylenglycol in dem passenden Puffer bei 13°C 12 Stunden lang inkubiert. Dieser Schritt bewirkt die Ligierung der Polymere in den Expressionsvektor und erzeugt doppelkettige, ringförmige, und folglich transformierende Moleküle.
Transformation der kompetenten Stämme
Man schreitet zur Transformation der kompetenten Stämme auf die vorangehend beschriebene Art.
III) Zusammenfügen eines in stochastischer Weise hergestellten Gens ausgehend von einer Gruppe von Heptameren
Diese Vorgehensweise unterscheidet sich von der gerade beschriebenen durch die Tatsache, daß sie anstelle von Octameren palindromische Heptamere, die ein variables kohäsives Ende aufweisen, verwendet. Sie zeigt den Vorteil, das Zusammenfügen von in stochastischer Weise hergestellten Sequenzen, die einen geringeren Anteil identischer Muster aufweisen, zu erlauben.
a) Wahl einer Gruppe von Heptameren Man kann beispielsweise die drei folgenden palindromischen Heptamere verwenden:
5' XTCGCGA 3'
5' XCTGCAG 3'
5' RGGTACC 3'
für die X = A, G, C oder T und R = A oder T, und deren Polymerisation keine „Stop"-Codone erzeugen kann und Triplets aufweist, die alle Aminosäuren spezifizieren.
Selbstverständlich könnte man gleichermaßen jede andere Gruppe von Heptameren, die eben diese Bedingungen erfüllen, verwenden.
b) Polymerisation einer Gruppe von Heptameren
Diese Polymerisation geschieht genau in der vorausgehend im Fall der Octamere beschriebenen Weise.
c) Eliminierung der kohäsiven Enden
Die so erhaltenen Polymere weisen an ihren zwei 5'-Enden eine ungepaarte Base auf. Es ist also notwendig, die komplementäre Base an die entsprechenden 3'-Enden anzufügen. Dies geschieht auf die folgende Weise: Man läßt 10 μg doppelsträngige Polymere mit 10 u Klenow-Enzymen in Anwesenheit der vier Deoxynucleotid-phosphate (200 mM) in einem Volumen von 100 μl 60 Minuten lang bei 4°C reagieren. Das Enzym wird durch Extraktion mit Phenol-Chloroform inaktiviert, und die Polymere werden durch differenzierende Ausfällung von den übrigen freien Nucleotiden befreit. Die Polymere werden dann an das (vorher linearisierte und dephosphorylierte) Wirts-Plasmid ligiert, indem man in der oben beschriebenen Weise vorgeht.
Es ist festzustellen, daß die zwei letzteren Vorgehensweisen, die gerade beschrieben wurden, palindromische Octamere oder Heptamere, die spezifische Restriktionsenzym-Stellen darstellen, verwenden. Diese Stellen fehlen bei der Mehrzahl der pUC8-Expressionsvektoren. Es ist daher möglich, die Komplexität eines Anfangs-Präparats stochastischer Gene beträchtlich zu erhöhen, indem man in der folgenden Weise vorgeht: Man stellt die DNS der Plasmide her, die von einer Kultur von 10⁷ unabhängigen Transformanten, die nach einer der beiden letzteren oben beschriebenen Vorgehensweisen erhalten wurden, stammen. Diese gereinigte DNS unterzieht man dann einem partiellen Verdau durch das Restriktionsenzym Cla I (Vorgehensweise II) oder durch das Restriktionsenzym Pst I (Vorgehensweise III). Nach Inaktivierung des Enzyms wird die partiell verdaute DNS mit der T₄-DNA-Ligase behandelt, was die Wirkung hat, daß eine äußerst große Anzahl neuer Sequenzen, die die grundlegenden Eigenschaften der Ausgangssequenzen konservieren, erzeugt wird. Dieses neue Ensemble in stochastischer Weise hergestellter Sequenzen wird dann zum Transformieren kompetenter Zellen verwendet.
Übrigens können die in stochastischer Weise hergestellten Gene, die durch Vorgehen gemäß den Vorgehensweisen II und III kloniert wurden, aus dem Expressionsvektor pUC8 intakt ausgeschnitten werden, indem man die Restriktionsstellen verwendet, die dem Klonierungsvektor eigen sind und in der in stochastischer Weise hergestellten DNS nicht vorhanden sind.
Die Rekombination im Inneren der in stochastischer Weise hergestellten Gene, die durch die beiden letzteren Vorgehensweisen, die eben beschrieben wurden, erzeugt wurden, wobei sich die Rekombination aus der inneren Homologie und den Musterwiederholungen ergibt, liefert ein wichtiges zusätzliches Verfahren zur in vivo-Mutagenese codierender Sequenzen. Daraus ergibt sich eine Steigerung der Anzahl neuer Gene, die durchgesehen werden können.
Schließlich kann man für alle Verfahren zur Erzeugung synthetischer neuer Gene zahlreiche übliche Techniken zur Modifizierung von Genen in vivo oder in vitro verwenden, wie Änderung des Leserahmens, Inversion von Sequenzen im Vergleich mit ihrem Promotor, oder Verwendung von Wirtsstämmen, die eine oder mehrere Suppressor-tRNS exprimieren.
Unter Bezugnahme auf den vorangehenden Beschreibungsteil wird man verstehen, daß es möglich ist, durch enzymatische Polymerisation von Nucleotiden und Oligonucleotiden eine äußerst große Anzahl (beispielsweise über eine Milli arde) verschiedener Gene in vitro zu konstruieren. Diese Polymerisation geschieht nach einem stochastischen Verfahren, das durch die jeweiligen Konzentrationen der in dem Reaktionsmedium anwesenden Nucleotide oder Oligonucleotide bestimmt wird.
Wie oben angegeben, können zum Klonieren derartiger Gene (oder codierender Sequenzen) zwei Verfahren verwendet werden: Die Polymerisation kann direkt an einem vorher linearisierten Klonierungs-Expressionsvektor geschehen, oder man kann genauso gut wählen, nacheinander zur Polymerisation, dann zur Ligierung der Polymere an den Klonierungs- und Expressions-Vektor zu schreiten.
In den beiden Fällen schreitet man dann zur Transformation oder zur Transfektion kompetenter Bakterienzellen (oder Zellen in Kultur). Dieser Schritt bewirkt das Klonieren stochastischer Gene in lebenden Zellen, wo sie unbestimmt vermehrt und exprimiert werden.
Selbstverständlich könnte man außer den Vorgehensweisen, die eben beschrieben wurden, gleichermaßen jedes andere für die Synthese in stochastischer Weise hergestellter Sequenzen geeignete Verfahren verwenden. Insbesondere könnte man zur Polymerisation von einsträngigen, durch chemische Synthese erhaltenen DNS- oder RNS-Oligomeren auf biochemischem Weg schreiten, dann diese DNS- oder RNS-Segmente mittels an sich bekannter Verfahren zur Herstellung von Kopien doppelsträngiger DNS (c DNS) im Hinblick auf die Klonierung der Gene behandeln.
Abtrennung oder Auswahl modifizierter Wirtszellen-Stämme
Der spätere Schritt des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht darin, die transformierten oder transfizierten Zellen mittels Abtrennung oder Auswahl im Hinblick darauf durchzusehen, eine oder mehrere Zellen zu isolieren, deren transformierende oder transfizierende DNS zur Synthese eines Transkriptions(RNS)- oder Übersetzungs(Protein)-Produkts, das eine gewünschte Eigenschaft besitzt, führt. Diese Eigenschaften können beispielsweise enzymatische, funktionelle oder strukturelle sein.
Eine der bemerkenswertesten Besonderheiten des erfindungsgemäßen Verfahrens ist, die gleichzeitige Abtrennung oder Auswahl eines nutzbaren Produkts (RNS oder Protein) und seines produzierenden Gens zu erlauben. Zur Vermehrung kann die DNS, die wie beschrieben synthetisiert und kloniert wurde, im Hinblick darauf ausgewählt oder abgetrennt werden, mit nutzbaren biochemischen Eigenschaften ausgestattete DNS-Sequenzen, die ein Produkt an sich darstellen, zu isolieren.
Nun werden, in Form nicht beschränkender Beispiele, bevorzugte Vorgehensweisen für die Abtrennung oder Auswahl transformierter Zellstämme sowie neuer Proteine, die im Hinblick auf industrielle oder medizinische Anwendungen einen Nutzen aufweisen, beschrieben.
Eine dieser Vorgehensweisen ergibt sich aus dem Gedanken, eine Reihe von in an sich bekannter Weise erhaltenen polyklonalen oder monoklonalen Antikörpern, die gegen ein Protein oder einen anderen Molekültyp von biochemischem oder medizinischem Interesse gerichtet ist, wobei dieses Molekül immunogen ist oder immunogen gemacht werden kann, herzustellen und diese Antikörper als Sonde zu verwenden, um unter sehr zahlreichen, durch stochastische Gene transformierten Klonen diejenigen zu identifizieren, die mit diesen Antikörpern reagieren. Diese Reaktion ergibt sich aus der Strukturhomologie, die zwischen dem mit dem stochastischen Gen synthetisierten Polypeptid und dem Ausgangsmolekül vorliegt. Man kann so zahlreiche neue Proteine isolieren, die sich wie Epitope oder antigene Determinanten des Ausgangsmoleküls verhalten. Derartige neue Proteine sind in der Lage, die Wirkung des Ausgangsmoleküls zu simulieren, zu stimulieren, zu modulieren oder zu blockieren. Man wird verstehen, daß diese Art der Auswahl oder der Abtrennung an sich fähig ist, sehr zahlreiche pharmakologische und biomedizinische Anwendungen zu haben. Diese erste Vorgehensweise wird nun in Form eines nicht beschränkenden Beispiels, bezogen auf einen bestimmten Fall, beschrieben:
Der EGF (Epidermal Growth Factor) ist ein kleines Protein, das im Blut vorkommt und dessen Rolle darin besteht, das Wachstum der Epithelzellen zu stimulieren. Diese Wirkung wird durch die Wechselwirkung des EGF mit einem spezifischen Rezeptor, der sich in der Membran der Epithelzellen befindet, erhalten.
Man stellt gegen den EGF gerichtete Antikörper her, indem man dem Tier an KLH (keyhole limpet hemocyanin) gekoppelten EGF injiziert, um die Immunogenität des EGF zu erhöhen. Die Anti-EGF-Antikörper der immunisierten Tiere werden gereinigt, beispielsweise mittels Durchgang durch eine Affinitätssäule, deren Ligand der EGF oder ein Synthesepeptid, das einem EGF-Fragment entspricht, ist. Die gereinigten Anti-EGF-Antikörper werden als Sonde für die Abtrennung einer großen Anzahl lysierter Bakterienklone in Chloroform auf festem Träger verwendet. Die Anti-EGF-Antikörper binden an stochastische Peptide oder Proteine, deren Epitope denjenigen des Ausgangsantigens ähneln. Die diese Peptide oder Proteine enthaltenden Klone werden nach Inkubation der festen Träger mit dem radioaktiven Protein A oder nach Inkubation mit einem radioaktiven Anti-Antikörper-Antikörper durch Autoradiographie deutlich gemacht.
Diese Schritte identifizieren die Klone, von denen jeder ein Protein (und sein Gen), das mit dem Antikörper aus der Abtrennung reagiert, enthält. Man kann so Abtrennungen aus einer sehr großen Anzahl von Bakterienzellstämmen oder von Virenscheiben vornehmen, und es ist möglich, extrem kleine Mengen, beispielsweise in der Größenordnung von 1 ng, von hergestelltem Protein aufzufinden. Nun schreitet man zur Kultur der identifizierten Klone, dann zur Reinigung der aufgefundenen Proteine mittels konventioneller Mittel. Die gereinigten Proteine werden in vitro in Kulturen von Epithelzellen getestet, um festzustellen, ob sie die Wirkung des EGF auf diese Kulturen hemmen, simulieren oder modulieren. Bestimmte der auf diese Weise erhaltenen Proteine sind dazu geeignet, für die chemotherapeutische Behandlung von Epitheliomen verwendet zu werden. Die Ak tivität der so erhaltenen Proteine kann verbessert werden durch Mutation der für die Proteine codierenden DNS in einer Weise, die der oben beschriebenen analog ist. Eine Variante dieser Vorgehensweise besteht darin, stochastische Peptide, Polypeptide oder Proteine, die als Impfstoffe verwendet werden können oder, allgemeiner, dazu verwendet werden können, eine Immunität gegen ein pathogenes Mittel zu verleihen oder um andere Wirkungen auf das Immunsystem auszuüben, beispielsweise eine Toleranz zu erzeugen oder die Hypersensibilität hinsichtlich eines gegebenen Antigens zu verringern, insbesondere infolge der Kombination dieser Peptide, Polypeptide oder Proteine mit den gegen dieses Antigen gerichteten Antikörpern, zu reinigen. Man wird verstehen, daß man also diese Peptide, Polypeptide oder Proteine genauso gut in vitro wie in vivo verwenden kann.
Genauer hat, beispielsweise in dem Ensemble neuer Proteine, die mit dem Antikörper gegen ein gegebenes Antigen X reagieren, jedes mindestens ein Epitop mit X gemeinsam, also hat das Ensemble ein Ensemble von Epitopen mit X gemeinsam. Dies erlaubt es, das Ensemble oder ein Unter-Ensemble als Impfstoff zu verwenden, um Immunität gegen X zu verleihen. Es ist beispielsweise leicht, eines oder mehrere der Capsid-Proteine des Hepatitis B-Virus zu reinigen. Diese Proteine werden in ein Tier, beispielsweise ein Kaninchen, injiziert, und man sammelt die dem Ausgangsantigen entsprechenden Antikörper durch Reinigen auf einer Affinitätssäule. Man verwendet diese Antikörper in der oben beschriebenen Weise, um die Klone zu identifizieren, die ein Protein mit einem Epitop, das einem oder mehreren der Epitope des ursprünglichen Antigens ähnlich ist, herstellen. Nach der Reinigung verwendet man diese Proteine als Antigen (sei es isoliert, sei es in Kombination) mit dem Ziel, einen Schutz gegen Hepatitis B zu verleihen. Die spätere Herstellung des Impfstoffs erfordert nicht mehr die Zuhilfenahme des ursprünglichen pathogenen Mittels.
Es ist zu bemerken, daß bei der Beschreibung der vorausgehenden Vorgehensweisen eine gewisse Anzahl von Arten, zur Auswahl und zur Abtrennung zu schreiten, beschrieben wurde. Alle diese Vorgehensweisen beinhalten die Reini gung eines bestimmten Proteins ausgehend von einem transformierten Stamm. Diese Protein-Reinigungen können in Übereinstimmung mit den üblichen Verfahren ausgeführt werden und stützen sich insbesondere auf die Techniken der Gelchromatographie, der Ionenaustausch-Chromatographie und auf die Affinitätschromatographie. Übrigens können die aus in stochastischer Weise hergestellten Genen hervorgegangenen Proteine in Form von Hybrid-Proteinen kloniert worden sein, die beispielsweise eine Sequenz des Enzyms β-Galactosidase, die die Affinitätschromatographie an Anti-β-Galactosidase-Antikörpern erlaubt und die nachfolgende Abspaltung des Hybrid-Teils erlaubt (das heißt erlaubt, den neuen Teil des Bakterienteils abzutrennen), enthalten. Nun werden das Prinzip und die Durchführung der Auswahl der Peptide oder Polypeptide und der entsprechenden Gene, die diese Peptide oder Polypeptide exprimieren, gemäß einem zweiten Verfahren zur Abtrennung oder Auswahl, das sich auf das Auffinden der Fähigkeit dieser Pepitde oder Polypeptide, eine spezifische Reaktion zu katalysieren, stützt, beschrieben.
In Form eines konkreten, nicht beschränkenden Beispiels wird nun die Durchführung der Abtrennung oder der Auswahl in dem speziellen Fall von Proteinen, die fähig sind, die Spaltung von Lactose zu katalysieren, was normalerweise eine Funktion ist, die von dem Enzym β-Galactosidase (β-gal) erfüllt wird, beschrieben.
Wie oben beschrieben, besteht der erste Schritt des Verfahrens darin, ein sehr großes Ensemble von Expressionvektoren, von denen jeder ein neues unterschiedliches Protein exprimiert, zu erzeugen. Konkret kann man beispielsweise den Expressionsvektor pUC8 mit Klonierung stochastischer DNS-Sequenzen an der Pst I-Restriktionsstelle wählen.
Die so erhaltenen Plasmide werden dann in einen E. Coli-Stamm eingeführt, aus dessen Genom man mittels konventioneller genetischer Verfahren das natürliche Gen für die β-Galactosidase, Z, und ein zweites Gen EBG, ohne Beziehung zu dem ersten, aber fähig zur Umwandlung in die β-gal-Funktion, entfernt hat. Derartige Wirtszellen (Z^–, EBG^–) sind von alleine nicht in der Lage, die Hydrolyse von Lactose zu katalysieren und, folglich, die Lactose als Kohlenstoffquelle für das Wachstum zu nutzen. Dies erlaubt es, diesen Wirtsstamm zur Abtrennung oder Auswahl der β-gal-Funktion zu verwenden.
Ein biologisches Testverfahren, das für die Untersuchung transformierter E. Coli-Stämme, die neue, die β-gal-Funktion exprimierende Gene aufweisen, geeignet ist, besteht in der Kultur auf diese Weise transformierter Bakterien in Petrischalen, die das Medium X-gal enthalten. In diesem Fall wird jede Bakterienkolonie, die eine β-gal-Funktion exprimiert, in Form einer blauen Kolonie sichtbar gemacht. Durch Verwendung eines derartigen biologischen Tests kann man selbst eine geringe katalytische Aktivität nachweisen. Die spezifische Aktivität der charakteristischsten Enzyme stellt sich zwischen 10 und 10000 Produktmolekülen pro Sekunde ein.
Unter der Annahme, daß ein von einem stochastischen Gen synthetisiertes Protein eine geringe spezifische Aktivität, in der Größenordnung von 1 Molekül pro 100 Sekunden, zeigt, wäre es immer noch möglich, eine solche katalytische Aktivität nachzuweisen. In einer das Medium X-gal enthaltenden Petrischale, in Anwesenheit des nicht metabolisierbaren Induktors IPTG (Isopropyl-D-thiogalactosidase), erfordert die Sichtbarmachung eines blauen Bereichs die Spaltung von etwa 10¹⁰ bis 10¹¹ Molekülen X-gal pro Quadratmillimeter. Eine Bakterienkolonie, die ein schwaches Enzym exprimiert und eine Oberfläche von 1 mm² einnimmt, enthält etwa 10⁷ bis 10⁸ Zellen. Wenn jede Zelle eine einzige Kopie des schwachen Enzyms aufweist, muß jede Zelle zwischen 10000 und 100 Spaltungen von X-gal katalysieren, um nachgewiesen werden zu können, was etwa 2,7 bis 270 Stunden dauert. Unter der Voraussetzung, daß man, unter selektiven Bedingungen, mit einer Amplifikation der Kopienzahl der Plasmide pro Zelle, beispielsweise 5 bis 20 Kopien pro Zelle, und sogar 100 bis 1000, rechnen kann, und unter Berücksichtigung der Tatsache, daß bis zu 10% der Proteine der Zelle durch das neue Gen spezifiziert werden können, wäre die zum Nachweis einer blauen Kolonie im Fall von 100 Enzym-Molekülen schwacher spezifischer Aktivität pro Zelle erforderliche Zeitdauer in der Größenordnung von 0,27 Stunden bis 2,7 Stunden.
Folglich ist die Abtrennung einer großen Anzahl unabhängiger Bakterienkolonien, von denen jede ein neues unterschiedliches Gen exprimiert, perfekt zu verwirklichen, wenn man als Auswahlkriterium die Fähigkeit nimmt, die β-gal-Funktion zu exprimieren. Man kann auf diese Weise die Abtrennung von etwa 2000 Kolonien in einer gewöhnlichen Petrischale mit 10 cm Durchmesser durchführen. Folglich kann man auf einer X-gal-Agarplatte von 1 m² 20 Millionen Kolonien abtrennen.
Es muß angemerkt werden, daß die auf den X-gal-Petrischalen in blau erscheinenden Bakterienkolonien falsch-positiv sein könnten aufgrund einer Mutation in dem Bakteriengenom, die ihm die Fähigkeit verleiht, die Lactose zu metabolisieren, oder aus anderen Gründen als denjenigen, die sich aus der katalytischen Aktivität des von den Zellen der Kolonie exprimierten neuen Proteins ergeben. Solche fälschlich Positiven können direkt ausgeschlossen werden, indem man die DNS der Expressionsvektoren, die von positiven Kolonien stammen, reinigt und die E. Coli-Wirtszellen Z^–, EBG^– erneut transformiert. Wenn die β-gal-Aktivität von dem neuen Protein stammt, das von dem neuen Gen in dem Expressionsvektor codiert wird, müßten alle mit diesem Vektor transformierten Zellen die β-gal-Funktion aufweisen. Wenn dagegen die blaue Kolonie zu Beginn von einer Mutation in dem Genom der Wirtszelle stammt, handelt es sich um ein von der Transformation unabhängiges Ausnahmeereignis, und die Anzahl der Zellen des neuen transformierten E. Coli-Stamms, der als Wirt dient, die in der Lage sind, die β-gal-Funktion zu exprimieren, müßte klein oder Null sein.
Man wird insbesondere auf der Leistung der gleichzeitigen Reinigung in Masse der Expressionsvektoren für alle die positiven (blauen) Klone, gefolgt von der erneuten Transformation natürlicher Bakterien, bestehen. Nehmen wir an, daß man eine Trennung im Hinblick darauf, Proteine mit einer katalytischen Funktion auszuwählen, ausführen will, und daß die Wahrscheinlichkeit, daß ein neues Peptid oder Polypeptid diese Funktion, zumindest schwach, erfüllt, 10^–6 ist, während die Wahrscheinlichkeit, daß der E. Coli-Wirtmikrobenstamm einer Mutation unterworfen wird, die zur Wirkung hat, daß er zur Erfüllung dieser Funktion fähig wird, 10^–5 ist, kann man ausrechnen, daß bei 20 Millionen der Trennung unterzogenen, transformierten Bakterien 20 positive Klone, im Durchschnitt, den neuen Genen in den Expressionsvektoren, die jede enthält, zuzuschreiben sein werden, während 200 positive Klone von Hintergundmutationen stammen werden. Die Reinigung in Masse der Expressionsvektoren der Gesamtheit der 220 positiven Bakterienklone und die erneute Transformation der natürlichen Bakterien mit den zusammengenommenen Expressionsvektoren wird eine große Anzahl positiver Klone hervorbringen, die gebildet werden von all den mit den 20 Expressionsvektoren, die die neuen Proteine mit der gewünschten Funktion codieren, transformierten Bakterien, und eine sehr kleine Anzahl von Bakterienklonen, die von Hintergrundmutationen stammen, die 200 Expressionsvektoren enthalten, die ohne Interesse bleibt. Eine kleine Anzahl von Reinigungszyklen von Expressionsvektoren in den positiven Bakterienkolonien, sowie die erneute Transformation, erlaubt das Auffinden der sehr seltenen Expressionsvektoren, die bezüglich einer gewünschten katalytischen Aktivität echt positiv sind, trotz eines sehr erhöhten Störuntergrunds von Mutationen der Wirtszellen für diese Funktion.
In der Folge von Arbeitsgängen zur Abtrennung dieser Spezies kann man das neue Protein dank der Durchführung üblicher Techniken reinigen. Die Herstellung dieses Proteins in großer Menge wird dank der Tatsache ermöglicht, daß die Identifizierung des nützlichen Proteins begleitet wird von der gleichzeitigen Identifizierung des dieses Protein codierenden Gens. Folglich kann man den Expressionsvektor selbst verwenden, oder man kann auch das neue Gen in einen Expressionsvektor übertragen, der zur Synthese und Isolierung in großer Menge geeigneter ist.
Man kann Abtrennarten dieser Art auf jede enzymatische Funktion, für die ein geeigneter biologischer Test existiert, anwenden. Derartige Abtrennungen erfordern nicht, daß die enzymatische Funktion, die man sucht, für die Wirtszelle vorteilhaft ist. Man kann eine Abtrennung nicht nur bezüglich einer enzymatischen Funktion, sondern gleichermaßen für jede andere gewünschte Eigenschaft, für die man einen geeigneten biologischen Test aufstellen kann, ausführen. Man kann also selbst in dem einfachen Fall der in einer Petrischale mit X-gal-Medium sichtbar gemachten β-gal-Funktion, die Auftrennung einer Anzahl neuer Gene in der Größenordnung von 100 Millionen oder selbst einer Milliarde nach einer katalytischen Aktivität oder einer anderen gewünschten Eigenschaft ausführen.
Auswahl modifizierter Wirtszellen
Andererseits kann man Auswahltechniken für jede Eigenschaft, eine katalytische oder eine andere, deren Anwesenheit oder Abwesenheit essentiell gemacht werden kann für das Überleben der Wirtszellen, die die Expressionsvektoren enthalten, die die neuen Gene codieren, oder die für die Auswahl von Viren nützlich sein können, die das neue Gen codieren und exprimieren, verwenden. Anhand eines konkreten, nicht beschränkenden Beispiels werden wir nun zurückkommen auf die Beschreibung der Art der Auswahl in Verbindung mit der β-Galactosidase-Funktion. Ein geeigneter Stamm Z^–EBG^– von E. Coli kann nicht wachsen, indem er die Lactose als einzige Kohlenstoffquelle verwendet. So kann man nach der Durchführung des ersten, oben beschriebenen Schritts eine sehr große Anzahl von Wirten, die mit den Expressionsvektoren, die die neuen Gene codieren, transformiert wurden, kultivieren, wobei die Kultur unter selektiven Bedingungen ausgeführt wird, entweder indem die Konzentration der anderen Kohlenstoffquellen fortschreitend verringert wird, oder indem von Anfang an nur die Lactose verwendet wird. Im Laufe einer derartigen Selektion erlaubt die Mutagenese in vivo mittels Rekombination oder durch explizite Wiedergewinnung von Expressionsvektoren und Mutagenese ihrer neuen Gene mittels verschiedener Mutagene in vitro, oder durch jede andere übliche Technik, adaptive Verbesserungen der Fähigkeit zur Erfüllung der gewünschten katalytischen Funktion. Wenn gleichzeitig Selektionstechniken und bequeme biologische Testtechniken existieren, wie in dem Fall des vorliegenden Beispiels, kann man zu Beginn Selektionstechniken verwenden, um die Repräsentierung von Wirtsbakterien, die die β-gal-Funktion exprimieren, zu steigern, dann auf einer Petrischale im X-gal- Medium eine Sichtung ausführen, um positive Zellen wirkungsvoll zu identifizieren. In Abwesenheit passender biologischer Testverfahren stellt die Anwendung immer strengerer Selektionsbedingungen den einfachsten Weg dar, einen Typ oder eine kleine Anzahl von Typen unterschiedlicher Wirtszellen, deren Expressionsvektoren die Proteine codieren, die die gewählte Reaktion katalysieren, zu reinigen.
Man kann diese Techniken verwenden, um neue Proteine zu finden, die zusätzlich zur Fähigkeit, spezifische Reaktionen zu katalysieren, eine große Vielfalt struktureller oder funktioneller charakteristischer Eigenschaften haben. Beispielsweise kann man eine Trennung oder eine Auswahl durchführen, um neue Proteine zu finden, die sich an cis-regulatorische Stellen der DNS heften und dadurch die Expression einer Funktion der Wirtszellen blockieren, oder auch die Transkription der DNS blockieren, die Transkription stimulieren, etc.
Im Fall von E. Coli, beispielsweise, exprimiert ein durch Mutation des Repressors des Lactose-Operons entstandener Stamm (i-) in konstitutiver Weise die β-gal-Funktion aufgrund der Tatsache, daß der Lactose-Operator nicht reprimiert wird. Alle Zellen dieser Art erzeugen auf Petrischalen, die das Medium X-gal enthalten, blaue Klone. Es ist möglich, derartige Wirtsstämme mit Expressionsvektoren, die neue Proteine synthetisieren, zu transformieren und auf Petrischalen mit X-gal-Medium eine Sichtung im Hinblick darauf durchzuführen, die Klone nachzuweisen, die nicht blau sind. Bestimmte unter diesen stellen Fälle dar, in denen sich das neue Protein an den Lactose-Operator heftet und die Synthese von β-gal reprimiert. Man kann derartige Plasmide in Masse reinigen, sie retransformieren, die Klone, die keine β-gal erzeugen, isolieren und dann eine detaillierte Prüfung ausführen.
Wie es weiter oben erwähnt wurde, kann das Verfahren dazu verwendet werden, nicht nur verwertbare Proteine zu erzeugen, dann zu isolieren, sondern auch mit verwertbaren Eigenschaften ausgestattete RNS und DNS, die Produkte an sich darstellen. Dies ergibt sich offensichtlich aus der Tatsache, daß einerseits das Verfahren darin besteht, stochastische DNS-Sequenzen zu erzeugen, die in der Lage sind, direkt mit anderen zellulären oder biochemischen Bestandteilen zu Wechselwirken, und daß andererseits diese Sequenzen, in einen Expressionsvektor einkloniert, in RNS transkribiert werden, wobei diese ebenfalls zu vielfachen biochemischen Wechselwirkungen fähig sind.
Beispiel für die Durchführung des Verfahrens zur Erzeugung und Auswahl einer an sich verwertbaren DNS
Dieses Beispiel veranschaulicht die Auswahl einer verwertbaren DNS und die Reinigung, und das Studium des Wirkungsmechanismus der Regulatorproteine, die an die DNS binden.
Gesetzt den Fall einer Herstellung des Östradiol-Rezeptors, eines Proteins, das nach einem an sich bekannten Verfahren erhalten wird. In Anwesenheit von Östradiol, einem steroiden Sexualhormon, verändert dieser Rezeptor die Konformation und bindet stark an bestimmte spezifische Sequenzen der genomischen DNS, wobei er so die Transkription von Genen beeinflußt, die an der sexuellen Differenzierung und der Steuerung der Fruchtbarkeit beteiligt sind.
Durch Inkubieren eines Gemisches, bestehend aus Östradiol, seinem Rezeptor und einer großen Anzahl verschiedener stochastischer Sequenzen, die in ihren Vektor eingesetzt sind, dann Filtrieren des Gemisches durch eine Nitrozellulose-Membran, erhält man eine direkte Auswahl der stochastischen Sequenzen, die an den Komplex Östrogen-Rezeptor binden, da ja nur die an ein Protein gebundene DNS von der Membran zurückgehalten wird. Nach Waschen und Eluieren wird die von der Membran befreite DNS so, wie sie ist, zum Transformieren von Bakterien verwendet. Nach der Kultur der transformierten Bakterien reinigt man die Vektoren, die sie enthalten, von neuem, und schreitet zu einem oder mehreren Inkubations-, Filtrations- und Transformations-Zyklen, wie hierin oben beschrieben. Diese Arbeitsgänge erlauben es, stochastische DNS-Sequenzen, ausgestattet mit einer erhöhten Affinität für den Östradiol-Rezeptor-Komplex, zu isolieren. Der artige Sequenzen sind für zahlreiche diagnostische und pharmakologische Anwendungen geeignet, insbesondere für die Verabreichung synthetischer Östrogene zur Kontrolle der Fruchtbarkeit und zur Behandlung der Sterilität.
Erzeugung und Auswahl einer an sich nutzbaren RNS
Gesetzt den Fall einer großen Anzahl stochastischer DNS-Sequenzen, hergestellt, wie es beschrieben wurde, und in einen Expressionsvektor einkloniert. Es versteht sich von selbst, daß die ausgehend von diesen Sequenzen in transformierten Wirtszellen transkribierte RNS ein an sich nutzbares Produkt sein kann.
Man kann, wobei das Beispiel nicht beschränkend ist, ein stochastisches Gen, das für eine Suppressor-Transfer-RNS (t-RNS) codiert, nach dem folgenden Verfahren auswählen:
Man transformiert einen kompetenten Bakterienstamm, der eine „Nonsense"-Mutation in dem Gen arg E enthält, mittels einer großen Anzahl (≥ 10⁸) stochastischer Sequenzen. Man trägt die transformierten Bakterien auf Minimalmedium ohne Arginin, das das Antibiotikum zur Selektion des Plasmids (Ampicillin, wenn es sich um den Vektor pUC8 handelt) enthält, auf. Nur die transformierten Bakterien, die fähig geworden sind, das Arginin zu synthetisieren, werden wachsen können. Dieser Phänotyp kann sich entweder aus einer Rückmutation oder aus der Einführung eines Suppressors in die Zelle ergeben. Es ist leicht, jede transformierte Kolonie zu testen, um zu bestimmen, ob der Phänotyp arg⁺ aus der Anwesenheit des in stochastischer Weise hergestellten Gens in seinem Vektor resultiert oder nicht: man begnügt sich damit, das Plasmid dieser Kolonie herzustellen und zu prüfen, ob es jeder Zelle arg E, die es transformiert, den Phänotyp arg⁺ verleiht.
Auswahl von Proteinen, die in der Lage sind, eine Reaktionsfolge zu katalysieren
Es wird nun eine andere Art von Auswahl beschrieben werden, die für unabhängige Anwendungen geeignet ist, auf der Grundlage des Prinzips der gleichzeitigen, parallelen, Auswahl einer bestimmten Anzahl neuer Proteine, die in der Lage sind, eine Folge untereinander verbundener Reaktionen zu katalysieren.
Der Grundgedanke dieses Verfahrens ist der folgende: wenn ein Ensemble chemischer Ausgangsverbindungen gegeben ist, die als „Ziegel" oder Bauelemente betrachtet werden, von denen ausgehend man die Synthese einer oder mehrerer gewünschter chemischer Verbindungen mittels einer Folge katalysierter chemischer Reaktionen durchführen will, gibt es eine sehr große Anzahl von Reaktionswegen, wobei die einen die anderen vollständig oder zum Teil ersetzen können, die in thermodynamischer Hinsicht alle möglich sind, und die von dem Ensemble der „Ziegel" oder Bausteine zu der gewünschten chemischen Zielverbindung führen. Eine wirkungsvolle Synthese einer Zielverbindung wird gefördert, wenn jeder Schritt mindestens eines der Reaktionswege, die von dem Ensemble der „Bausteine" zu der Zielverbindung führen, aus Reaktionen besteht, von denen jede katalysiert ist. Dennoch ist es relativ weniger wichtig, unter den zahlreichen, vollständig oder teilweise unabhängigen Reaktionswegen diejenigen zu bestimmen, die von der Katalyse profitieren. In der vorangehenden Beschreibung wurde gezeigt, wie es möglich war, eine sehr große Anzahl an Wirtszellen, von denen jede ein neues, unterschiedliches Protein exprimiert, zu erhalten.
Jedes dieser neuen Proteine ist dazu geeignet, irgendeine der möglichen Reaktionen in dem Ensemble aller möglichen Reaktionen, die von dem Ensemble von Bausteinen zu der Zielverbindung führen, zu katalysieren. Wenn eine genügend große Anzahl stochastischer Proteine in einem Reaktionsgemisch, das die Verbindungen, die die Bausteine bilden, enthält, vorhanden ist, dergestalt, daß eine genügend erhöhte Anzahl der möglichen Reaktionen katalysiert wird, besteht eine hohe Wahrscheinlichkeit, daß von einem Unter-Ensemble der neuen Proteine eine Folge von Reaktionen katalysiert wird, die untereinander verbunden sind, um von dem Ensemble von Bausteinen zu der Zielverbindung zu führen. Es ist offensichtlich, daß sich das Verfahren auf die Katalyse nicht nur einer, sondern mehrerer Zielverbindungen gleichzeitig, erstrecken kann.
Stützt man sich auf das eben dargelegte Prinzip, kann man in der folgenden Weise vorgehen, um parallel ein Ensemble neuer Proteine, die eine gewünschte Folge chemischer Reaktionen katalysieren, auszuwählen:

1. Spezifizieren des gewünschten Ensembles von Verbindungen, die die „Bausteine" bilden, indem bevorzugt eine vernünftig erhöhte Anzahl verschiedener chemischer Spezies verwendet wird, um die Anzahl möglicher, gleichzeitig verlaufender Wege, die zu der gewünschten chemischen Zielverbindung führen, zu erhöhen.
2. Zugeben einer sehr großen Anzahl neuer, stochastischer Proteine, die ausgehend von den transformierten oder transfizierten Zellen, die diese Proteine synthetisieren, isoliert wurden, zu einem geeigneten Volumen einer Reaktionsmedium-Lösung. Durchführen eines Tests zur Bestimmung, ob die Zielverbindung gebildet wurde. Wenn das der Fall ist, Bestätigen, daß diese Bildung die Anwesenheit des Gemisches der neuen Proteine erfordert. Wenn das der Fall ist, muß dieses Gemisch ein Unter-Ensemble von Proteinen enthalten, die eine oder mehrere Reaktionsfolgen, die von dem Ensemble von „Bausteinen" zu der Zielverbindung führen, katalysieren. Reinigen des Unter-Ensembles, das zur Katalyse der Folge von Reaktionen, die zu dem Zielprodukt führen, erforderlich ist, durch Abtrennen des Anfangsbestands an Klonen, die das Ensemble neuer stochastischer Proteine synthetisieren.

Genauer wird anhand eines nicht beschränkenden Beispiels die Auswahl eines Ensembles neuer Proteine beschrieben, die dazu geeignet sind, die Synthese eines kleinen spezifischen Peptids, nämlich eine Pentapeptids, ausgehend von einem Ensemble von Bausteinen, das von kleineren Peptiden und Aminosäuren gebildet wird, zu katalysieren. Jedes Peptid ist aus einer linearen Folge von 20 verschiedenen Arten von Aminosäuren, die von ihrem Amino-Ende zu ihrem Carboxy-Ende ausgerichtet ist, aufgebaut. Jedes Peptid kann in einem Schritt durch Kondensation von Enden von zwei kleineren Peptiden (oder von zwei Aminosäuren) oder durch Hydrolyse eines größeren Peptids gebildet werden. Ein M Reste aufweisendes Peptid kann daher von einer Anzahl von M -1 Kondensationsreaktionen gebildet werden. Die Anzahl an Reaktionen, R, durch die ein Ensemble von Peptiden mit einer Länge von 1, 2, 3, ... M Resten ineinander umgewandelt werden kann, ist größer als die Anzahl an molekularen Spezies T. Dies wird ausgedrückt als R/T ≅ M-2. So führt, ausgehend von einem gegebenen Ensemble von Peptiden, eine große Anzahl unabhängiger oder teilweise unabhängiger Reaktionswege zur Synthese eines spezifischen Ziel-Pentapeptids. Man kann ein Pentapeptid wählen, dessen Anwesenheit dank eines Tests, der mittels üblicher Techniken, beispielsweise durch HPLC-Analyse (Hochdruckflüssigkeitschromatographie), Papierchromatographie, etc., ausgeführt wird, bequem nachgewiesen werden kann. Die Bildung der Peptidbindung erfordert im verdünnten wässrigen Medium Energie, aber wenn die an den Kondensationsreaktionen teilnehmenden Peptide genügend konzentriert sind, ist es eher die Bildung der Peptidbindung als die Hydrolyse, die thermodynamisch begünstigt ist und die in Anwesenheit eines geeigneten Enzymkatalysators, beispielsweise Pepsin oder Trypsin, eintritt, ohne die Anwesenheit von ATP oder anderen hochenergetischen Verbindungen zu erfordern. Man kann ein derartiges Reaktionsgemisch von Peptiden kleiner Größe, deren Aminosäuren mittels radioaktiver Markierungssubstanzen des Typs ³H, ¹⁴C, ³⁵S radioaktiv markiert sind, verwenden, um das Ensemble von Bausteinen mit genügend erhöhter Konzentration, um zu den Kondensationsreaktionen zu führen, aufzubauen.
Man kann beispielsweise in der folgenden Weise vorgehen: man löst etwa 15 mg jeder Aminosäure und jedes kleinen Peptids mit 2 bis 4 Aminosäuren, die zum Aufbau des Ensembles von Bausteinen ausgewählt wurden, in einem Volumen von 0,25 ml bis 1,0 ml Phosphatpuffer mit 0,1 M, pH 7,6, auf. Man reinigt eine große Anzahl neuer Proteine, die, wie oben beschrieben, ausgehend von ihrem bakteriellen oder anderen Wirt erzeugt und isoliert wurden. Man löst das Gemisch dieser neuen Proteine bis zu einer endgültigen Gesamtkonzentration in der Größenordnung von 0,8 bis 1,0 mg/ml in demselben Puffer auf. Man fügt 0,25 ml bis 0,5 ml des Gemisches von Proteinen zu dem Gemisch von Bausteinen zu. Man inkubiert 1 bis 40 Stunden lang bei einer Temperatur von 25°C bis 40°C. Man entnimmt in regelmäßigen Intervallen aliquote Teile von 8 μl, wovon der erste, vor dem Zusatz des Gemisches neuer Proteine, als „Vergleichs-Bezugsprobe" zählt. Man unterwirft die Proben einer chromatographischen Analyse, wobei man als Lösungsmittel ein Gemisch aus n-Butanol-Essigsäure-Pyridin-Wasser (30:6:20:24, volumenmäßig) verwendet. Man trocknet das Chromatogramm und entwickelt es in Ninhydrin oder man autoradiographiert es (mit oder ohne Verstärkerschirm). Aufgrund der Tatsache, daß die Verbindungen, die die Bauelemente bilden, radioaktiv markiert sind, ist die Zielverbindung radioaktiv und hat eine spezifische erhöhte Aktivität, die ihren Nachweis in einer Menge von 1 bis 10 ng erlaubt. Anstelle der Analyse mittels gewöhnlicher Chromatographie kann man eine Analyse mittels HPLC (Hochdruckflüssigkeitschromatographie) durchführen, die schneller und einfacher durchzuführen ist. Allgemein kann man die üblichen Analysenverfahren verwenden. Auf diese Weise kann man eine Ausbeute an Zielverbindungen unterhalb einem Gewichtsteil pro Million Gewichtsteilen, bezogen auf die Ausgangsverbindungen oder Ausgangs-"Baumaterialien", nachweisen.
In dem Fall, wo das Pentapeptid unter den oben beschriebenen Bedingungen gebildet wird, wo aber seine Bildung nicht stattfindet, wenn man einen Auszug verwendet, der gereingt wurde wie oben, aber ausgehend von mit dem Expressionsvektor, der nicht mit der stochastischen Insertion versehen war, transformierten Zellen erhalten wurde, ergibt sich die Bildung des Pentapeptids nicht aus der Anwesenheit der Bakterienverunreinigungen und erfordert also die Anwesenheit eines Unter-Ensembles neuer Proteine in dem Reaktionsgemisch.
Der folgende Schritt besteht in der Abtrennung des besonderen Unter-Ensembles von Zellen, die die Expressionsvektoren der neuen Proteine, die die Folge von Reaktionen, die zu dem Ziel-Pentapeptid führen, katalysieren, enthalten. Wenn beispielsweise die Anzahl von Reaktionen, die diese Sequenzen bilden, gleich 5 ist, gibt es etwa fünf neue Proteine, die die nötigen Reaktionen katalysieren. In dem Fall, in dem die Bakterien-"Klonbank", die die Expressionsvektoren, die die neuen Gene codieren, enthält, eine Anzahl unterschiedlicher neuer Gene in der Größenordnung von 1 Million enthält, führt man die Isolierung in Masse aller dieser Expressionsvektoren und die Retransformation von 100 verschiedenen Ensembles von 10⁸ Bakterien mit einem ausreichend kleinen Verhältnis von Vektoren zu Bakterien aus, dass im Mittel jedes Ensemble von Bakterien nur durch etwa die Hälfte der Anzahl der Ausgangsgene, das heißt etwa 500000, transformiert wird. Folglich ist die Wahrscheinlichkeit, daß irgendeines dieser 100 Ensembles von Bakterien das Ensemble der fünf neuen kritischen Proteine enthält, gleich (1/2)⁵ = 1/32. Unter den 100 Ausgangsensembles von Bakterien enthalten etwa drei die fünf kritischen Transformanten. In jedem dieser Ensembles ist die vorliegende Gesamtmenge neuer Gene nicht größer als 500000 anstelle von 1 Million. Durch aufeinanderfolgende Wiederholungen, deren Gesamtzahl in dem vorliegenden Fall 20 beträgt, dieses Verfahrens kann man die fünf kritischen neuen Gene isolieren. Danach erlaubt die Mutagenese und die Auswahl dieses Ensembles von fünf stochastischen Genen die Suche nach verbesserten katalytischen Wirkungen. In dem Fall, in dem es notwendig ist, eine Folge von Reaktionen, die eine Anzahl von Reaktionen in der Größenordnung von 20 aufweist, zu katalysieren, und dass 20 Gene, die neue Proteine codieren, parallel isoliert werden müssen, genügt es, die Multiplizität der Transformationen dergestalt einzustellen, daß jedes Ensemble von 10⁸ Bakterien 80% der 10⁶ stochastischen Gene erhält, indem 200 Ensembles dieser Art verwendet werden. Die Wahrscheinlichkeit, daß sich die 20 neuen Proteine in einem gegebenen Ensemble von Bakterien befinden, beträgt 0,8²⁰, das heißt etwa 0,015. Folglich enthalten zwei unter den 200 Ensembles die 20 neuen Gene, die notwendig sind, um die Bildung der Zielverbindung zu katalysieren. Die Anzahl von notwendigen Wiederholungen von Zyklen zur Isolierung der 20 neuen Gene ist in der Größenordnung von 30.
Die Prinzipien und die Arbeitsweisen, die oben angegeben wurden, lassen sich verallgemeinern vom Fall der Peptide auf zahlreiche Gebiete der Chemie, auf denen man Reaktionen im wässrigen Milieu unter pH-, Temperatur- und Konzentrations-Bedingungen der Lösungen, die die allgemeinen enzymatischen Wirkungen erlauben, ausführen kann. In jedem Fall ist es notwendig, über ein Testverfahren zum Nachweis der Bildung der gewünschten Zielverbindung oder -verbindungen verfügen zu können. Es ist auch erforderlich, eine ausreichend erhöhte Anzahl von „Bausteinen" zu wählen, um die Anzahl von Reaktionsfolgen, die zu der Zielverbindung führen, zu erhöhen.
Das konkrete Ensemble, das von der Synthese eines Ziel-Pentapeptids vorgegeben wird, kann in der folgenden Weise verallgemeinert werden:
Das Verfahren, wie es beschrieben ist, erzeugt, unter anderen Produkten, in stochastischer Weise hergestellte Peptide und Proteine. Diese Peptide oder Proteine können auf katalytischem oder anderem Wege auf andere Verbindungen einwirken. Sie können gleichermaßen die Substrate darstellen, auf die sie einwirken. Man kann so die Fähigkeit, die die stochastischen Peptide oder Proteine haben, untereinander zu wechselwirken und daher die Konformation, die Struktur oder die Funktion von bestimmten unter ihnen zu modifizieren, auswählen (oder sichten). Ebenso kann man die Fähigkeit dieser Peptide und Proteine, untereinander die Hydrolyse, die Kondensation, die Transpeptidierung oder andere Modifizierungsreaktionen zu katalysieren, auswählen (oder sichten). Beispielsweise kann die Hydrolyse eines gegebenen, in stochastischer Weise hergestellten Proteins durch mindestens ein Mitglied des Ensembles der stochastischen Peptide und Proteine verfolgt und gemessen werden mittels radioaktiver Markierung des gegebenen Proteins, gefolgt von einer Inkubation mit dem Gemisch der in stochastischer Weise hergestellten Proteine in Anwesenheit von Ionen wie Mg, Ca, Zn, Fe und der Verbindungen ATP und GTP. Man mißt dann das Erscheinen radioaktiver Fragmente des markierten Proteins, wie es beschrieben wurde. Das oder die in stochastischer Weise hergestellten Proteine, die diese Reaktion kata lysieren, können dann, ebenso wie ihr Erzeugergen, durch sequentielle Verkleinerung der Transformantenklonbank, wie beschrieben, isoliert werden.
Eine Erweiterung des Verfahrens besteht in der Auswahl eines Ensembles von in stochastischer Weise hergestellten Peptiden und Polypeptiden, die in der Lage sind, eine Folge von Reaktionen zu katalysieren, die von den Ausgangsbestandteilen (Aminosäuren und kleine Peptide) zu bestimmten der Peptide oder Polypeptide des Ensembles führen. So ist es vorstellbar, ein Ensemble auszuwählen, das in der Lage ist, seine eigene Synthese zu katalysieren: ein derartiges rückbezüglich autokatalytisches Ensemble kann sich in einem Chemostaten einstellen, in dem die Reaktionsprodukte in konstanter Weise verdünnt werden, aber in dem die Konzentration der Ausgangsprodukte konstant gehalten wird. Man kann das Vorliegen eines Ensembles dieser Art nachprüfen mittels zweidimensionaler Gelchromatographie und mittels „HPLC", die die Synthese einer stabilen Verteilung von Peptiden und von Polypeptiden zeigen. Die Reaktionsvolumina hängen ab von der Zahl der verwendeten molekularen Spezies und den erforderlichen Konzentrationen zur Begünstigung der Bildung von Peptidbindungen im Vergleich zur Hydrolyse. Die Verteilung der molekularen Spezies eines autokatalytischen Ensembles neigt dazu, sich infolge des Auftauchens abgeänderter autokatalytischer Ensembles zu verändern oder abzuwandeln. Die Peptide und Polypeptide, die ein autokatalytisches Ensemble bilden, können bestimmte Elemente mit dem umfassenden Ausgangsensemble (gebildet von verfahrensgemäß codierten Peptiden und Polypeptiden) gemeinsam haben, können aber auch Peptide und Polypeptide, die von dem Ensemble von in stochastischer Weise hergestellten Genen, die das Ausgangsensemble codieren, nicht codiert werden, enthalten.
Das Ensemble der in stochastischer Weise hergestellten Gene, deren Produkte erforderlich sind, um ein derartiges autokatalytisches Ensemble zu erstellen, kann durch sequentielle Verkleinerungen der Transformantenklonbank isoliert werden, wie es beschrieben wurde. Darüber hinaus kann ein autokatalytisches Ensemble Peptide enthalten, die zu Anfang von den in stochastischer Weise hergestellten Genen codiert werden und in kontinuierlicher Weise in dem autokatalytischen Ensemble gebildet werden. Zur Isolierung dieses von Peptiden und Proteinen codierten Unter-Ensembles kann man das autokatalytische Ensemble verwenden, um durch Immunisierung im Tier polyklonale Seren zu erhalten, die eine sehr große Anzahl der Bestandteile des autokatalytischen Ensembles erkennen.
Diese Seren können dann verwendet werden, um die Bibliothek von in stochastischer Weise hergestellten Genen zu sichten, um dort die Gene zu finden, die Proteine exprimieren, die in der Lage sind, an die in den Seren vorhandenen Antikörper zu binden.
Dieses Ensemble von in stochastischer Weise hergestellten Genen exprimiert eine große Anzahl der in stochastischer Weise hergestellten, codierten Proteine, die in dem autokatalytischen Ensemble vorliegen. Der Rest der von einem solchen autokatalytischen Ensemble codierten Bestandteile kann, wie beschrieben, durch sequentielle Verkleinerung der Bibliothek von in stochastischer Weise hergestellten Genen, denen das Unter-Ensemble, das durch das immunologische Verfahren aufgefunden wurde, entzogen wurde, isoliert werden.
Die autokatalytischen Ensembles von Peptiden und Proteinen, die auf die Weise, die gerade beschrieben wurde, erhalten worden sind, sind dazu geeignet, zahlreiche praktische Anwendungen zu finden.

Claims

Verfahren zum Identifizieren eines Peptids, eines Polypeptids oder eines Proteins, das an einen Liganden bindet, aufweisend: (a) Die Herstellung eines Bestands an Peptiden, an Polypeptiden oder an Proteinen, die codiert werden von einem Bestand an mindestens 1 × 10⁸ verschiedenen Sequenzen von Polynucleotiden, die in stochastischer Weise synthetisiert wurden, und (b) die Durchsicht des Bestands an Peptiden, an Polypeptiden oder an Proteinen im Hinblick auf die Bindung an den Liganden unter Bedingungen, die das Auffinden eines oder mehrerer Peptide, Polypeptide oder Proteine, die an den Liganden gebunden sind, erlauben.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Schritt (a) außerdem die Synthese eines Bestands an Sequenzen von Polynucleotiden, die in stochastischer Weise hergestellt wurden, und die Übersetzung des Bestands an Sequenzen von Polynucleotiden zur Herstellung des Bestands an Peptiden, an Polypeptiden oder an Proteinen aufweist.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Schritt (a) außerdem die Synthese eines Bestands an Sequenzen von Polynucleotiden, die mindestens teilweise stochastisch sind und in stochastischer Weise hergestellt wurden, und die Übersetzung des Bestands an Sequenzen von Polynucleotiden zur Herstellung des Bestands an Peptiden, an Polypeptiden oder an Proteinen aufweist.
Verfahren nach Anspruch 2 oder nach Anspruch 3, außerdem aufweisend die Amplifikation des Bestands an Sequenzen von Polynucleotiden, die in stochastischer Weise hergestellt wurden.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Schritt (a) außerdem die Synthese eines Bestands an Sequenzen von Polynucleotiden, die in stochastischer Weise hergestellt wurden, und die Expression des Bestands an Sequenzen von Polynucleotiden zur Herstellung des Bestands an Peptiden, an Polypeptiden oder an Proteinen aufweist.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Schritt (a) außerdem die Synthese eines Bestands an Sequenzen von Polynucleotiden, die mindestens teilweise stochastisch sind und in stochastischer Weise hergestellt wurden, und die Expression des Bestands an Sequenzen von Polynucleotiden zur Herstellung des Bestands an Peptiden, an Polypeptiden oder an Proteinen aufweist.
Verfahren nach Anspruch 1, außerdem aufweisend die Isolierung der Sequenz von Polynucleotiden, die eines oder mehrere der Peptide, Polypeptide oder Proteine, die an den Liganden binden, codiert.
Verfahren nach Anspruch 1, außerdem aufweisend die Verbesserung der Bindung an den Liganden durch Mutagenese in vitro oder in vivo.
Verfahren zur Herstellung eines Peptids, eines Polypeptids oder eines Proteins, das an einen Liganden bindet, aufweisend: (a) Die Herstellung eines Bestands an Peptiden, an Polypeptiden oder an Proteinen, die codiert werden von einem Bestand an mindestens 1 × 10⁸ Sequenzen von Polynucleotiden, die in stochastischer Weise synthetisiert wurden, (b) die Durchsicht des Bestands an Peptiden, an Polypeptiden oder an Proteinen im Hinblick auf die Bindung an den Liganden unter Bedingungen, die das Auffinden eines oder mehrerer Peptide, Polypeptide oder Proteine, die an den Liganden gebunden sind, erlauben, (c) die Isolierung der Sequenz von Polynucleotiden, die eines oder mehrere der Peptide, Polypeptide oder Proteine, die an den Liganden binden, codiert und (d) die Herstellung des Peptids, des Polypeptids oder des Proteins.
Verfahren zur Isolierung einer Sequenz von Polynucleotiden, die ein Peptid, ein Polypeptid oder ein Protein, das an einen Liganden bindet, codiert, aufweisend: (a) Die Herstellung eines Bestands an Peptiden, an Polypeptiden oder an Proteinen, die codiert werden von einem Bestand an mindestens 1 × 10⁸ Sequenzen von Polynucleotiden, die in stochastischer Weise synthetisiert wurden, (b) die Durchsicht des Bestands an Peptiden, an Polypeptiden oder an Proteinen im Hinblick auf die Bindung an den Liganden unter Bedingungen, die das Auffinden eines oder mehrerer Peptide, Polypeptide oder Proteine, die an den Liganden gebunden sind, erlauben, und (c) die Isolierung der Sequenz oder der Sequenzen von Polynucleotiden, die das Peptid, das Polypeptid oder das Protein, das an einen Liganden bindet, codiert (codieren).
Verfahren zur Herstellung eines vielfältigen Bestands an Wirtszellen, aufweisend: (a) die Synthese eines vielfältigen Bestands an in stochastischer Weise hergestellten Polynucleotid-Sequenzen, wobei der Bestand minestens 1 × 10⁸ unterschiedliche Polynucleotid-Sequenzen aufweist, (b) die Insertion des vielfältigen Bestands an in stochastischer Weise hergestellten Polynucleotid-Sequenzen in einen Bestand an Vektoren, um einen vielfältigen Bestand an Vektoren, der in stochastischer Weise hergestellte Polynucleotid-Sequenzen aufweist, zu bilden, und (c) die Einführung des vielfältigen Bestands an Vektoren in Wirtszellen.
Verfahren zur Identifizierung eines Polynucleotids, das an einen Liganden bindet, aufweisend: (a) die Herstellung eines Bestands an Polynucleotiden, der mindestens 1 × 10⁸ unterschiedliche Polynucleotid-Sequenzen, die in stochastischer Weise synthetisiert wurden, aufweist, und (b) die Durchsicht des Bestands an Polynucleotiden im Hinblick auf die Bindung an den Liganden unter Bedingungen, die das Auffinden eines oder mehrerer Polynucleotide, die an den Liganden binden, erlauben.
Verfahren nach Anspruch 12, außerdem aufweisend die Amplifikation des Bestands an Polynucleotid-Sequenzen, die in stochastischer Weise hergestellt wurden.
Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass der Bestand an Polynucleotiden DNS aufweist.
Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass der Bestand an Polynucleotiden RNS aufweist.
Verfahren nach Anspruch 12, außerdem aufweisend die Isolierung einer oder mehrerer der Polynucleotid-Sequenzen, die an den Liganden binden.
Verfahren nach Anspruch 12, außerdem aufweisend die Verbesserung der vorbestimmten Eigenschaft durch Mutaganese in vitro oder in vivo.
Verfahren zur Modifizierung der Transkription oder der Replikation einer DNS-Sequenz, aufweisend: (a) die Herstellung eines Bestands an Peptiden, an Polypeptiden oder an Proteinen, die codiert werden von in stochastischer Weise synthetisierten Polynucleotid-Sequenzen, (b) die Inspektion des Bestands an Peptiden, an Polypeptiden oder an Proteinen unter Bedingungen, die die Identifizierung eines oder mehrerer Peptide, Polypeptide oder Proteine, die die Transkription oder die Replikation einer DNS-Sequenz modifizieren, erlauben, und (c) das in Kontakt bringen einer DNS-Sequenz mit einem oder mehreren der identifizierten Peptide, Polypeptide oder Proteine, die die Transkription oder die Replikation einer DNS-Sequenz modifizieren.
Verfahren zur Herstellung eines zur Gewinnung eines Impfstoffs brauchbaren Peptids, Polypeptids oder Proteins, folgende Schritte aufweisend: (a) die Herstellung, durch enzymatische Kopplung, von in stochastischer Weise hergestellten Polynucleotid-Sequenzen, (b) die Bildung einer Bibliothek von Expressionsvektoren, die solche, in stochastischer Weise hergestellte, Polynucleotid-Sequenzen enthält, (c) das Anlegen von Kulturen von Wirtszellen, die die Vektoren zur Herstellung von Peptiden, von Polypeptiden oder von Proteinen, die von den in stochastischer Weise hergestellten Polynucleotid-Sequenzen codiert werden, enthalten, (d) die Durchführung der Durchsicht oder der Auswahl von Wirtszellen dieser Art, um ein durch die Wirtszellen hergestelltes Peptid, Polypeptid oder Protein mit mindestens einem Epitop, das einer Aminosäure-Sequenz eines der Epitope eines gegebenen Antigens ähnlich ist, zu identifizieren, (e) die Isolierung einer in stochastischer Weise hergestellten Polynucleotid-Sequenz, die das identifizierte Peptid, Polypeptid oder Protein codiert und (f) die Verwendung der isolierten Sequenz zur Herstellung des Peptids, des Polypeptids oder des Proteins mit der Eigenschaft.