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Hintergrund
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Die
vorliegende Erfindung betrifft im allgemeinen hämatopoetische Wachstumsfaktoren
und Polynukleotide, die solche Faktoren kodieren. Die vorliegende
Erfindung betrifft insbesondere menschlichen pluripotente Granulozytenkolonien
stimulierenden Faktor (hpG-CSF).
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Das
menschliche blutbildende (hämatopoetische)
System ersetzt eine Vielzahl von weißen Blutzellen (neutrophile
Leukozyten, Makrophagen und basophile Leukozyten/Mastzellen), roten
Blutzellen (Erythrozyten) und gerinselbildenden Zellen (Megakaryozyten/Blutplättchen).
Beim hämatopoetischen
System des durchschnittlichen Mannes ist geschätzt worden, daß dieses
jedes Jahr Granulozyten und Erythrozyten in der Größenordnung
von 4,5 × 1011 produziert, was einem jährlichen
Ersatz des gesamten Körpergewichtes
gleichkommt. Dexter et al., BioEssays, 2, 154–158 (1985).
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Man
nimmt an, daß geringe
Mengen von gewissen hämatopoetischen
Wachstumsfaktoren für
die Differenzierung einer kleinen Anzahl von Vorläufer-"Stammzellen" in die Vielzahl
von Blutzelllinien, für
die ungeheure Proliferation dieser Linien und für die letztendliche Differenzierung
von reifen Blutzellen aus diesen Linien verantwortlich sind. Da
die hämatopoetischen
Wachstumsfaktoren in extrem kleinen Mengen vorhanden sind, hat sich
der Nachweis und die Identifizierung dieser Faktoren auf eine Reihe
von Tests gestützt,
die bis jetzt nur zwischen den unterschiedlichen Faktoren auf der
Grundlage von stimulativen Wirkungen auf kultivierte Zellen unter
künstlichen
Bedingungen unterscheiden. Als Ergebnis ist eine große Anzahl
von Namen geprägt
worden, um eine viel kleinere Anzahl von Faktoren zu bezeichnen.
Als ein Beispiel für
die daraus folgende Verwirrung sind die Ausdrücke IL-3, BPA, Multi-CSF, HCGF,
MCGF und PSF alles Akronyme, von denen man nunmehr annimmt, daß sie einen
einzigen hämatopoetischen
Wachstumsfaktor bei Ratten betreffen. Metcalf, Science, 229, 16–22 (1985).
Siehe auch, Burgess, et al. J. Biol. Chem., 252, 1988 (1977), Das,
et al. Blood, 58, 600 (1980), Ihle, et al., J. Immunol., 129, 2431
(1982), Nicola, et al., J. Biol. Chem., 258, 9017 (1983), Metcalf,
et al., Int. J. Cancer, 30, 773 (1982), und Burgess, et al. Int.
J. Cancer, 26,647 (1980), die verschiedene wachstumsregulierende
Glykoproteine bei Ratten betreffen.
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Die
Anwendung von rekombinanten genetischen Techniken hat etwas Ordnung
in dieses Chaos gebracht. Zum Beispiel sind die Aminosäure- und
DNA-Sequenzen für
menschliches Erythropoietin, das die Produktion von Erythrozyten
erregt, erhalten worden (siehe Lin, Veröffentlichte PCT-Anmeldung Nr.
85/02 610, veröffentlicht
20. Juni 1980). Rekombinante Verfahren sind auch auf die Isolierung
von cDNA für
einen menschlichen Granulozyten-Makrophagen-Kolonien
erregenden Faktor angewendet worden. Siehe Lee, et al., Proc. Natl.
Acad. Sci. (USA), 82, 4360–4364
(1985) und Wong, et al., Science, 228, 810–814 (1985). Siehe auch Yokota
et al. Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 81, 1070 (1984), Fung, et al.,
Nature, 307, 233 (1984), und Gough, et al., Nature, 309, 763 (1984),
welche die Klonierung von Rattengenen betreffen, sowie Kawasaki,
et al., Science, 230, 291 (1985), die menschliches M-CSF betrifft.
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Es
ist gezeigt worden, daß ein
menschlicher hämatopoetischer
Wachstumsfaktor, menschlicher pluripotente Kolonien stimulierender
Faktor (hpCSF) oder Pluripoietin genannt, im Kulturmedium einer
menschlichen Harnblasenkarzinomzelllinie vorhanden ist, die mit
5637 bezeichnet und unter restriktiven Bedingungen bei der American
Type Culture Collection, Rockville, Maryland als A. T. C. C. Hinterlegungsnummer
HTB-9 hinterlegt ist. Es ist berichtet worden, daß der hpCSF,
der aus dieser Zellinie gereinigt erhalten worden ist, die Proliferation
und Differenzierung von pluripotenten Vorläuferzellen erregt, was in Tests,
die Vorläuferzellen
für menschliches
Knochenmark verwenden, zur Produktion aller hauptsächlichen
Blutzellarten führt.
Welte et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 82, 1526–1530 (1985).
Die Reinigung von hpCSF verwendete: (NH4)2SO2-Fällung; Anionen-Austauschchromatographie
(DEAE-Cellulose, DE52); Gelfiltration (AcA54-Säule); und C18-Umkehrphasen-Hochauflösungsflüssigkeitschromatographie.
Es wurde berichtet, daß ein
als hpCSF identifiziertes Protein, das im zweiten der zwei Aktivitätspeaks
in den C18-Umkehrphasen-HPLC-Fraktionen eluiert
wird, ein Molekulargewicht (MW) von 18.000 besitzt, bestimmt durch
Natriumdodecylsulfat-(SDS)-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE),
unter Verwendung von Silberanfärbung.
Von hpCSF wurde früher
berichtet, das er einen isoelektrischen Punkt von 5,5 besitzt [Welte,
et al., J. Cell. Biochem., Supp 9A, 116 ((985)) und eine hohe Differenzierungsaktivität für die myelomonozytische
Leukämiezelllinie
WEHI-3B D+ bei Mäusen [Welte, et al., UCLA Symposia
on Molecular und Cellular Biology, Gale, et al., Hrg., New Series,
28 (1985)). Vorstudien zeigen, daß der als hpCSF identifizierte
Faktor vorwiegend Granulozytkolonien erregende Aktivität während der
ersten sieben Tage in einem menschlichen CFU-GM-Test besitzt.
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Ein
anderer Faktor, als menschliches CSF-β bezeichnet, ist ebenfalls aus
der menschlichen Harnblasenkarzinomzelllinie 5637 isoliert und als
ein Konkurrent des 125I-markierten Granulozytkolonien
erregenden Faktors bei Ratten (G-CSF) bei der Bindung an WEHI-3B
D+-Zellen
in einer dosisabhängigen
Beziehung, die mit derjenigen von nicht-markiertem Ratten-G-CSF identisch ist,
beschrieben worden [Nicola, et al., Nature, 314, 625–628 (1985)].
Es ist früher
berichtet worden, daß diese
dosisabhängige
Beziehung einzigartig für nicht-markierten
Ratten-G-CSF ist und Faktoren wie M-CSF, GM-CSF oder Multi-CSF ihn
nicht besitzen [Nicola, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 81,
3765–3769
(1984)]. CSF-β und
G-CSF sind unter den CSFs auch in der Weise einzigartig, daß sie eine
hochgradige Fähigkeit
besitzen, die Differenzierung von WEHI-3B D+-Zellen
zu induzieren. Nicola, et al., Immunology Today, 5, 76–80 (1984).
Bei hohen Konzentrationen erregt G-CSF vermischte Granulozyt/Makrophagen-Kolonien
bildende Zellen [Nicola, et al., (1984) oben], was mit Vorergebnissen
konsistent ist, die das Auftreten von granulozytischen, monozytischen,
vermischten granulozytischen/monozytischen und eosinophilen Kolonien
(CFU-GEMM) nach 14tägiger
Inkubation von menschlichen Knochenmarkskulturen mit hpCSF zeigten.
CSF-β ist
auch als die Bildung von neutrophilen granulozytischen Kolonien
in Tests, die Mäuse-Knochenmarkszellen
verwenden, erregend beschrieben worden, eine Eigenschaft, die ein
Kriterium für
die Identifizierung eines Faktors als ein G-CSF gewesen ist. Auf
der Grundlage dieser Ähnlichkeiten
ist menschliches CSF-β mit
G-CSF (granulozytische Kolonien stimulierender Faktor) identifiziert
worden. Nicola et al., Nature, 314, 625–628 (1985).
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Basierend
auf ihren gemeinsamen Eigenschaften, scheint es, daß menschliches
CSF-β von
Nicola et al., oben, und der hpCSF von Welte et al., oben, derselbe
Faktor sind, den man richtigerweise als einen menschlichen pluripotente
Granulozytkolonien erregenden Faktor (hpG-CSF) bezeichnen könnte. Die Charakterisierung
und rekombinante Herstellung von hpG-CSF wäre besonders angesichts der
berichteten Fähigkeit von
Ratten-G-CSF, eine in-vitro-WEHI-3B
D+-Leukämiezellpopulation
bei "ganz normalen
Konzentrationen" vollständig zu
unterdrücken,
und der berichteten Fähigkeit
von rohen, injizierten Präparaten
von Ratten-G-CSF, etablierte verpflanzte Myeloidleukämien in
Mäusen
zu unterdrücken,
wünschenswert.
Metcalf Science, 229, 16–22
(1985). Siehe auch, Sachs, Scientific American, 284(1), 40–47 (1986).
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In
dem Maße,
in dem hpG-CSF sich als therapeutisch bedeutsam herausstellen sollte
und daher in kommerziellen Mengen zugänglich sein müßte, ist
es unwahrscheinlich, daß die
Isolierung aus Zellkulturen eine angemessene Materialquelle zur
Verfügung
stellt. Es ist z.B. beachtenswert, daß Beschränkungen im Hinblick auf die
kommerzielle Verwendung von Humantumorbank-Zellen, wie etwa der
menschlichen Harnblasenkarzinomzelllinie 5637 (A. T. C. C. HTB9)
zu bestehen scheinen, von denen bei Welte et al. (1985, oben) als Quellen
für natürliche hpCSF-Isolate
berichtet worden ist.
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Die
europäische
Patentanmeldung EP-A-0169566 offenbart die Isolierung eines menschlichen
CSF aus der Tumorzelllinie CHU-1 und dessen physikochemische Charakterisierung.
Die spätere
europäische
Patentanmeldung EP-A-0215126, die auf sieben verschiedenen Prioritätsdokumenten
beruht, von denen nur das erste dem ersten Prioritätsdatum
im vorliegenden Fall vorangeht, offenbart die weitere Charakterisierung
besagten CSFs und seine Herstellung durch rekombinante DNA-Technologie.
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Zusammenfassung
der Erfindung
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Gemäß der vorliegenden
Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung eines menschlichen
pluripotenten Granulozyten-Kolonie-stimulierenden Faktor (hpG-CSF)-Erzeugnisses,
das die in vivo granulozytopoetischen biologischen Eigenschaften
von natürlich
auftretendem hpG-CSF
aufweist, zur Verfügung
gestellt, umfassend die Schritte von:
- (a) Kultivieren
unter geeigneten Nährbedingungen
von Säugerzellen,
umfassend eine Promotor DNA, die anders ist als die hpG-CSF Promoter
DNA, wirksam verbunden mit der DNA, die für ein hpG-CSF Polypeptid kodiert,
das die ausgereifte Aminosäuresequenz
von Tabelle 7 aufweist; und
- (b) Isolieren von hpG-CSF, das von den Zellen exprimiert wurde.
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Ebenfalls
eingeschlossen sind pharmazeutische Zusammensetzungen, die wirksame
Mengen von Polypeptidprodukten hergestellt durch das Verfahren der
Erfindung zusammen mit geeigneten Verdünnungsmitteln, Adjuvantien
und/oder Trägermitteln
umfassen und nützlich
in der hpG-CSF-Therapie sind.
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Die
Polypeptidprodukte wie hergestellt durch das Verfahren der vorliegenden
Erfindung können,
allein oder in Kombination mit anderen hämatopoetischen Faktoren oder
Medikamenten bei der Behandlung von hämatopoetischen Störungen,
wie etwa aplastische Anämie,
nützlich
sein. Sie können
auch bei der Handlung von hämatopoetischen
Mangelerscheinungen nützlich
sein, die von Chemotherapie oder von Strahlungstherapie herrühren. Der
Erfolg von Knochenmarkstransplantationen z.B. kann durch Anwendung
von hpG-CSF erhöht
werden. Die Wundheilungsbehandlung bei Verbrennungen und die Behandlung
von bakteriellen Entzündungen
können
ebenfalls aus der Anwendung von hpG-CSF Nutzen ziehen. Zusätzlich kann
hpG-CSF auch bei der Behandlung von Leukämie nützlich sein, basierend auf
einer berichteten Fähigkeit,
Leukämiezellen
zu differenzieren. Welte et al., proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 82,
1526–1530
(1985) und Sachs, oben.
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Zahlreiche
Aspekte und Vorteile der Erfindung werden den Fachleuten auf diesem
Gebiet bei Betrachtung der folgenden detaillierten Beschreibung
deutlich werden, die die Praxis der Erfindung in ihren gegenwärtig bevorzugten
Ausführungsformen
veranschaulicht.
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Kurze Beschreibung
der Zeichnungen
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Die
Figur ist eine teilweise Restriktionsendonukleasekarte des hpG-CSF-Gens
mit Pfeilen, welche die Sequenzierungsstrategie darstellen, die
verwendet worden ist, um die genomische Sequenz zu erhalten.
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Detaillierte
Beschreibung
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DNA-Sequenzen,
die einen Teil oder die Gesamtheit der Polypeptidsequenz von hpG-CSF
kodieren, sind isoliert und charakterisiert worden.
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Die
folgenden Beispiele werden zur Veranschaulichung vorgestellt und
sind insbesondere auf Verfahren, die vor der Identifizierung von
hpG-CSF-cDNA und genomischen Klonen durchgeführt werden, auf Verfahren,
die zu einer solchen Identifizierung führen, und auf die Sequenzierung,
die Entwicklung von Expressionssystemen, basierend auf cDNA, genomischen
und künstlich
hergestellten Genen, und die Verifizierung der Expression von hpG-CSF
und Analogprodukten in solchen Systemen gerichtet.
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Genauer
gesagt, ist Beispiel 1 auf die Aminosäuresequenzierung von hpG-CSF
gerichtet. Beispiel 2 ist auf die Darstellung einer cDNA-Bibliothek
für Koloniehybridisierungs-Screening
gerichtet. Beispiel 3 betrifft die Konstruktion von Hybridisierungssonden.
Beispiel 4 betrifft das Hybridisierungs-Screening, die Identifizierung
von positiven Klonen, die DNA-Sequenzierung
eines positiven cDNA-Klons und die Erzeugung von Informationen über die
Polypeptid-Primärstruktur
(Aminosäuresequenz).
Beispiel 5 ist auf die Identifizierung und Sequenzierung eines genomischen
Klons gerichtet, der hpG-CSF kodiert. Beispiel 6 ist auf die Konstruktion eines
künstlich
hergestellten Gens gerichtet, das hpG-CSF kodiert, wobei E. coli-Präferenzcodons
verwendet werden.
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Beispiel
7 ist auf Verfahren zur Konstruktion eines E. coli-Transformationsvektors,
der hpG-CSF kodierende
DNA umfaßt,
die Verwendung des Vektors bei der prokaryontischen Expression von
hpG-CSF und die Analyse von Eigenschaften von rekombinanten Produkten
der Erfindung gerichtet. Beispiel 8 ist auf Verfahren zur Erzeugung
von Analoga von hpG-CSF gerichtet, wobei Cysteinreste mittels auf
hpG-CSF kodierender DNA durchgeführter
Mutagenese durch andere geeignete Aminosäurereste ersetzt werden. Beispiel
9 ist auf Verfahren zur Konstruktion eines Vektors, der hpG-CSF-Analoga
kodierende DNA, abgeleitet aus einem positiven cDNA-Klon, umfaßt, die
Verwendung des Vektors zur Transfektion von COS-1-Zellen und das kultivierte
Wachstum der transfizierten Zellen gerichtet. Beispiel 10 betrifft
physikalische und biologische Eigenschaften von rekombinanten Polypeptidprodukten
der Erfindung.
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Beispiel 1
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(A) Sequenzierung von
nach Literaturverfahren erhaltenem Material
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Eine
Probe (3–4 μg, 85–90% rein
von SDS, Silberanfärbungs-PAGE)
von hpG-CSF wurde vom Sloan Kettering Institute, New York, New York,
erhalten, isoliert und gereinigt gemäß Welte et al., Proc. Natl.
Acad. Sci. (USA), 82, 1526–1530
(1985).
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Die
N-terminale Aminosäuresequenz
dieser Probe von hpG-CSF wurde in einem Durchlauf Nr. 1 durch Mikrosequenzanalyse
unter Verwendung eines AB407A-Gasphasensequenzers (Applied Biosystems,
Foster City, California) bestimmt, um die in Tabelle I unten dargestellte Sequenzinformation
zu erhalten. In den Tabellen I bis IV werden Einzelbuchstabencodes
verwendet, wobei "X" einen Rest bezeichnet,
der nicht unzweideutig bestimmt wurde, und Reste in Klammern nur
alternativ oder provisorisch zugeordnet wurden.
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In
jedem Zyklus des Durchlaufs, für
den Resultate in Tabelle I berichtet sind, war ein hoher Hintergrund vorhanden,
was anzeigt, daß die
Probe viele verunreinigende Bestandteile aufweist, vermutlich in
Form chemischer Reste aus der Reinigung. Die Sequenz wurde nur zu
Vergleichszwecken aufbewahrt.
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In
Durchlauf Nr. 2 wurde eine zweite Probe (5–6 μg, 95% rein) vom Sloan Kettering
erhalten, wie für Durchlauf
Nr. 1, und wie für
Durchlauf Nr. 1 wurde ein Sequenzierungsverfahren durchgeführt. Diese
Probe stammte aus derselben Materialpartie, die verwendet wurde,
um 4 von Welte et al., Proc. Natl.
Acad. Sci. (USA), 82 1526–1530
(1985), zu erzeugen. Die Resultate sind in Tabelle II angegeben.
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Obgleich
mehr Reste identifiziert wurden, lieferte Durchlauf Nr. 2 keine
hinreichend lange, unzweideutige Sequenz, aus der eine vernünftige Anzahl
von Sonden konstruiert werden könnte,
um nach hpG-CFS-DNA zu suchen. Es wurde berechnet, daß wenigstens
1536 Sonden erforderlich gewesen wären, um, basierend auf der
Sequenz von Tabelle II, die Isolierung von cDNA in Angriff zu nehmen.
Man nahm an, daß wieder
die Verunreinigung der Probe das Problem war.
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Demgemäß wurde
eine dritte Probe (3–5 μg, 40% rein)
vom Sloan Kettering erhalten, wie oben. Dieses Präparat wurde
nach Abtrennung durch SDS-PAGE in einem Versuch weiterer Reinigung
elektrotransferiert. Die Sequenzanalyse dieser Probe lieferte keine
Daten.
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(B) Sequenzierung von
nach verbesserten Verfahren erhaltenen Materialien
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Um
eine genügende
Menge an reinem Material zu erhalten, um in geeigneter Weise eine
definitive Aminosäuresequenzanalyse
durchzuführen,
wurden Zellen einer Harnblasenkarzinomzelllinie 5637 (Subklon 1A6),
wie im Sloan Kettering erzeugt, von Dr. E. Platzer erhalten. Die
Zellen wurden anfangs in Kolben in Iscove-Medium (GIBCO, Grand Island,
New York) kultiviert, um zu konfluieren. Nach Konfluenz wurden die
Kulturen trypsinisiert und in Rollflaschen (1-1/2 Kolben/Flasche)
eingeimpft, die jede 25 ml vorkonditioniertes Iscove-Medium unter
5% CO2 enthielten. Die Zellen wurden über Nacht
bei 37°C
bei 0,3 UPM gezüchtet.
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Cytodex-1®-Perlen
(Pharmacia, Uppsala, Schweden) wurden gewaschen und unter Verwendung
der folgenden Verfahren sterilisiert. 8 g Perlen wurden in eine
Flasche gegeben und 400 ml PBS hinzugefügt. Die Perlen wurden durch
sanftes Verwirbeln für
3 Stunden suspendiert. Nachdem man die Perlen absitzen ließ, wurde
PBS abgezogen, die Perlen wurden in PBS gespült und frisches PBS wurde zugesetzt.
Die Perlen wurden für
15 Minuten autoklaviert. Vor Verwendung wurden die Perlen in Iscove-Medium
plus 10% Kalbsfötusserum
(FCS) gewaschen, bevor frisches Medium plus 10% FCS hinzugefügt wurde,
um behandelte Perlen zu erhalten.
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Nachdem
bis auf 30 ml das gesamte Medium aus jeder Rollflasche entfernt
worden war, wurden 30 ml frisches Medium plus 10% FCS und 40 ml
behandelte Perlen zu den Flaschen zugegeben. Die Flaschen wurden
mit 5% CO2 begast und alle Blasen wurden
durch Absaugen entfernt. Die Flaschen wurden in Rollgestelle bei
3 UPM für
1/2 Stunden gelegt, bevor die Geschwindigkeit auf 0,3 UPM verringert
wurde. Nach 3 Stunden wurde ein zusätzlicher Kolben trypsinisiert
und jeder Rollflasche, die Perlen enthielt, zugesetzt.
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Bei
40% bis 50% Konfluenz wurden die Rollflaschenkulturen mit 50 ml
PBS gewaschen und für
10 Minuten gerollt, bevor das PBS entfernt wurde. Die Zellen wurden
für 48
Stunden in Medium A (Iscove-Medium, das 0,2% FCS, 10–8 M
Hydrocortison, 2 mM Glutamin, 100 Einheiten/ml Penicillin und 100 μg/ml Streptomycin enthält] kultiviert.
Als nächstes
wurde der Kulturüberstand
durch Zentrifugation bei 3000 UPM für 15 Minuten abgeerntet und
bei –70°C gelagert.
Die Kulturen wurden wieder mit Medium A, das 10% FCS enthielt, versorgt und
für 48
Stunden kultiviert. Nach Verwerfen des Mediums wurden die Zellen
mit PBS wie oben gewaschen und für
48 Stunden in Medium A kultiviert. Der Überstand wurde erneut abgeerntet
und wie zuvor beschrieben behandelt.
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Annähernd 30
Liter Medium, konditioniert mit 1A6-Zellen, wurden auf etwa 2 Liter
auf einer Millipore-Pellicon-Einheit konzentriert, ausgerüstet mit
zwei Kassetten, mit 10.000 MW-Schnitten
bei einer Filtratrate von etwa 200 ml/min und einer Retentatrate
von etwa 1000 ml/min. Das Konzentrat wurde mit etwa 10 Litern 50
mM Tris (pH 7,8) unter Verwendung derselben Vorrichtung und derselben
Durchflußraten
diafiltriert. Das diafiltrierte Konzentrat wurde mit 40 ml/min auf
eine 1 Liter-DE-Zellulose-Säule
geladen, äquilibriert
in 50 mM Tris (pH 7,8). Nach Beladen wurde die Säule mit derselben Rate mit
1 Liter 50 mM Tris (pH 7,8) und dann mit 2 Litern 50 mM Tris (pH
7,8) mit 50 mM NaCl gewaschen. Die Säule wurde dann aufeinanderfolgend
mit sechs 1 Liter-Lösungen
von 50 mM Tris (pH 7,5) eluiert, die die folgenden Konzentrationen
an NaCl enthielten: 75 mM; 100 mM; 125 mM; 150 mM; 200 mM; und 300
mM. Fraktionen (50 ml) wurden gesammelt und aktive Fraktionen wurden
gepoolt und auf einer Amicon-Ultrafiltrationsrührzelleinheit, ausgerüstet mit
einer YM5-Membran, auf 65 ml konzentriert. Dieses Konzentrat wurde
auf eine 2 Liter-AcA54-Gelfiltrationssäule, äquilibriert in PBS, geladen.
Die Säule
wurde bei 80 ml/h betrieben und 10 ml-Fraktionen wurden gesammelt.
Aktive Fraktionen wurden gepoolt und direkt auf eine C4-Hochauflösungsflüssigkeitschromatographie(HPLC)-Säule geladen.
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Proben,
die im Volumen von 125 ml bis 850 ml variierten und 1–8 mg Protein
enthielten, von dem etwa 10% hpG-CSF war, wurden bei einer Durchflußrate, die
von 1 ml bis 4 ml pro Minute variierte, auf die Säule geladen.
Nach Beladen und einer Anfangswaschung mit 0,1 M Ammoniumacetat
(pH 6,0–7,0)
in 80% 2-Propanol bei einer Durchflußrate von 1/ml/min, wurden
1 ml-Fraktionen gesammelt und bei 220 nm, 260 nm und 280 nm auf
Proteine überprüft.
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Als
Ergebnis der Reinigung wurden von anderen proteinhaltigen Fraktionen
klar Fraktionen getrennt, die hpG-CSF enthielten (als Fraktion 72
und 73 von 80). HpG-CSF wurde bei einer Reinheit von etwa 85 ± 5% und
bei einer Ausbeute von etwa 50% isoliert (150–300 μg). Aus diesem gereinigten Material
wurden 9 μg
in Durchlauf Nr. 4 verwendet, einer Aminosäuresequenzanalyse, in der die
Proteinprobe auf eine TFA-aktivierte Glasfaserscheibe ohne Polybrene
aufgebracht wurde. Die Sequenzanalyse wurde mit einem AB 470A-Sequenzer
gemäß den Verfahren
von Hewick et al., J. Biol. Chem., 256, 7990–7997 (1981) und Lai, Anal.
Chim. Acta, 163, 243–248
(1984) durchgeführt.
Die Ergebnisse von Durchlauf Nr. 4 erscheinen in Tabelle III.
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In
Durchlauf Nr. 4 wurde über
31 Zyklen hinaus (entsprechend Rest 31 in Tabelle III) keine weitere
signifikante Sequenzinformation erhalten. Um eine längere unzweideutige
Sequenz zu erhalten, in einem Durchlauf Nr. 5, wurden 14 μg hpG-CSF,
gereinigt aus konditioniertem Medium, mit 10 μl β-Mercaptoethanol für 1 Stunde
bei 45°C
reduziert, anschließend
gründlich
unter einem Vakuum getrocknet. Der Proteinrest wurde dann in 5%iger
Ameisensäure
wieder aufgenommen, bevor er auf eine polybrenisierte Glasfaserscheibe
aufgebracht wurde. Die Sequenzanalyse wurde durchgeführt, wie
für Durchlauf
Nr. 4 oben. Die Ergebnisse von Durchlauf Nr. 5 sind in Tabelle IV
angegeben.
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Die
in Tabelle IV angegebene Aminosäuresequenz
war hinreichend lang (44 Reste) und unzweideutig, um Sonden für das Erhalten
von hpG-CSF-cDNA zu konstruieren, wie unten beschrieben.
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Beispiel 2
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Unter
den Standardverfahren zum Isolieren von interessierenden cDNA-Sequenzen
ist die Herstellung von plasmidgetragenen cDNA-"Bibliotheken", abgeleitet aus reverser Transkription
von mRNA, die in Donorzellen reichlich vorhanden ist, welche auf
der Grundlage ihrer Expression eines Zielgens ausgewählt sind.
Wo wesentliche Teile der Aminosäuresequenz
des Polypeptids bekannt sind, können
markierte einzelsträngige DNA-Sondensequenzen,
die eine mutmaßlich
in der "Ziel"-cDNA vorhandene
Sequenz duplizieren, in DNA/DNA-Hybridisierungsverfahren
verwendet werden, die auf klonierten Kopien der cDNA durchgeführt werden,
die zur einzelsträngigen
Form denaturiert worden sind. Weissmann, et al., US-Patent Nr. 4,394,443; Wallace,
et al., Nucleic Acids Res., 6, 3543–3557 (1979), und Reyes, et
al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 79, 3270–3274 (1982), und Jaye, et
al., Nucleic Acids Res., 11, 2325–2335 (1983). Siehe auch US-Patent
Nr. 4,358,535 für
Falkow et al., das die DNA/DNA-Hybridisierungsverfahren im Hinblick
auf Diagnose betrifft; und Davis et al., "A Manual for Genetic Engineering, Advanced
Bacterial Genetics",
Cold Spring Harbor Labora tory, Cold Spring Harbor, N. Y. (1980)
auf Seiten 55–58
und 174–176,
betreffend Kolonie- und Plaque-Hybridisierungstechniken.
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Die
Gesamt-RNA wurde aus annähernd
1 g Zellen aus einer Harnblasenkarzinomzelllinie 5637 (1A6) unter
Verwendung eines Guanidiniumthiocyanatverfahrens zur quantitativen
Isolierung von intakter RNA extrahiert. [Chirgwin, et al., Biochemistry,
18, 5294–5299
(1979)].
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Die
sterile wäßrige RNA-Lösung enthielt
die Gesamt-RNA aus den 1A6-Zellen. Um nur die Boten-RNA aus der
Gesamt-RNA-Lösung
zu erhalten, wurde die Lösung
durch eine Säule
gegeben, die Oligodesoxythymidylat [Oligo(dT)] (Collaborative Research,
Inc., Waltham, Massachusetts) enthielt. Polyadenylierte (Poly-A+) Schwänze,
die charakteristisch für
BotenRNA sind, bleiben auf der Säule
hängen,
während
ribosomale RNA eluiert wird. Als Ergebnis dieses Verfahrens wurden
annähernd
90 μg Polyadenylierte
Boten-RNA (Poly-A+-mRNA) isoliert. Die isolierte
Poly-A+-Boten-RNA wurde mit Methylquecksilberhydroxid
(Alpha Ventron, Danvers, Massachusetts) bei einer Endkonzentration
von 4 mM für
5 Minuten bei Raumtemperatur vor Verwendung in einer cDNA-Reaktion
vorbehandelt. Die Methylquecksilberhydroxidbehandlung denaturierte Wechselwirkungen
von Boten-RNA sowohl mit sich selbst als auch mit verunreinigenden
Molekülen,
die die Translation hemmen. Payvar, et al., J. Biol. Chem., 258,
7636–7642
(1979).
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Gemäß dem Okayama-Verfahren
[Okayama, et al., Molecular & Cellular
Biology, 2, 161–170
(1982)] wurde eine cDNA-Bank unter Verwendung der aus 1A6-Zellen
erhaltenen mRNA hergestellt. Die cDNAs wurden dann durch Inkubation
in einen Wirtsmikroorganismus E. coli K-12-Stamm HB101 zur Amplifikation
transformiert.
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Beispiel 3
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Hybridisierungssonden,
die auf der Basis der aminoterminalen Sequenz von hpG-CSF von Tabelle
IV entworfen worden waren, bestanden aus einem Satz von 24 Oligonukleotiden,
jedes 23 Basen lang und 3 Inosin-Reste enthaltend. Die Sondenoligonukleotide
wurden gemäß dem Verfahren
von Caruthers et al., Genetic Engineering, 4, 1–18 (1982) hergestellt und
mit γ-32P-ATP durch Kinasieren mit Polynukleotidkinase
markiert. Die Sondenoligonukleotide, die der Boten-RNA für die Reste
23–30
der Sequenz von Tabelle IV entsprechen, sind in Tabelle V dargestellt.
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Die
Zuweisung von Neutralität
zu den Is beruhte auf der veröffentlichten
Arbeit von Takahashi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 82, 1931–1935 (1985)
und Ohtsuka et al., J. Biol. Chem., 260, 2605–2608 (1985). Inosin kann jedoch
einen destabilisierenden Effekt haben, wenn es mit G oder T basengepaart
ist. In Takahashi et al. könnte
es scheinen, daß Inosine
eine neutrale Wirkung haben, weil sie sich im Durchschnitt als eine Gruppe
nahe der Neutralität
darstellen (z.B. drei hatten sich vorzugsweise mit C gepaart und
zwei bevorzugten es nicht, sich mit T zu paaren).
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Um
die Wirkung zu testen, wenn Is mit Gs basengepaart sind, wurden
Kontrollexperimente unter Verwendung einer N-myc Gensequenz und
eines entsprechenden Klons entworfen. Die aus dem N-myc-Gen herausgepickten
Sequenzen besaßen
denselben Gesamt-G und -C-Gehalt an den ersten zwei Positionen jedes Codons
wie dies durch die hpG-CSF-Sonden vorgeschrieben war. Die N-myc-Testsonden
hatten somit dieselbe Länge,
enthielten Is an denselben relativen Positionen und hatten potentiell
denselben mittleren Tm (62–66°C, ohne Berücksichtigung
der drei oder vier eingeschlossenen Inosin-Reste) wie die hpG-CSF-Sonden.
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Zwei
Sätze der
N-myc-Testsonden wurden gemäß dem Verfahren
von Caruthers et al., oben, konstruiert. Satz I, wie in Tabelle
VI dargestellt, schloß ein:
1, ein 23 mer, perfekt passend; 2, bei dem drei Cs an der dritten
Position durch Is ersetzt wurden, was den schlechtestmöglichen
Fall des Hinzufügens
von Is erzeugt; und 3, bei dem vier Cs an der dritten Position durch
Is ersetzt wurden. Der zweite Satz von Testsonden wurde konstruiert,
um eine mehr zufällige
Verteilung von Inosin-Basenpaaren darzustellen, die eine insgesamt
neutrale Basenpaarungswirkung ergeben könnte. Satz II, wie in Tabelle
VI dargestellt, schloß ein:
4, enthaltend zwei Is, die sich mit Cs basenpaaren und eine mit
einem G; und 5, identisch mit 4 mit der Addition von einem I:G-Basenpaar
mehr.
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Tabelle
VI N-myc
Testsonden
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Fünf Replika-Filter,
die N-myc-DNA-Sequenzen und Hühner-Wachstumshormon-DNA-Sequenzen (als eine
Negativkontrolle) enthielten, wurden in einem Vakuumofen für zwei Stunden
bei 80°C
vor der Hybridisierung gebacken. Alle Filter wurden hybridisiert,
wie in Beispiel 4 für
die hpG-CSF-Sonden beschrieben, mit der Ausnahme, daß die Hybridisierungszeit
nur 6 Stunden betrug. Die Filter wurden dreimal bei Raumtemperatur
dann einmal bei 45°C
jeweils 10 Minuten gewaschen. Die Filter wurden mit einem Geigerzähler überprüft.
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Der
Filter, der die N-myc-Sonde 3 repräsentiert, ergab ein sehr schwaches
Signal relativ zu den anderen vier mit Sonden beladenen Filtern
und wurde nicht weiter gewaschen. Nach einer 10minütigen Waschung bei
50°C ergab
der Geigerzähler
das folgende Prozentsignal, wobei Probe 1 als 100% normalisiert
wurde: Probe 2: 20%; Probe 3 (45°C):
2%; Probe 4: 92%; und Probe 5: 75%. Nach einer Waschung bei 55°C betrugen die
Prozentanteile: Probe 2: 16%; Probe 4: 100%; und Probe 5: 80%. Eine
letzte Waschung bei 60°C
ergab die folgenden Prozentanteile: Probe 2: 1,6%; Probe 4: 90%;
und Probe 5: 70%.
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Somit
wird in Gegenwart von drei Is, wie in den Sonden 2 und 4, ein bis
zu 60facher Unterschied im Signal beobachtet, wenn man sich dem
theoretischen Tm (Is nicht in die Berechnung eingeschlossen) annähert [basierend
auf einem schlimmsten Fall von I-Basenpaarung (Sonde 2) und einem
relativ neutralem I-Basenpaarungsfall (Sonde 4)].
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Die
durch die N-myc-Testhybridisierungen gewonnene Standardisierungsinformation
wurde beim Waschen und Überwachen
der hpG-CSF-Hybridisierung verwendet, wie unten angegeben, um den
Grad an Vertrauen abzuschätzen,
mit dem die Ergebnisse von weniger scharfen Waschungen akzeptiert
werden können.
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Beispiel 4
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Gemäß dem Verfahren
von Hanahan et al., J. Mol. Biol., 166, 557–580 (1983), wurden bakterienhaltige Rekombinanten
mit cDNA-Inserts, wie in Beispiel 2 hergestellt, auf 24 Nitrocellulose-Filter
(Millipore, Bedford, Massachusetts) verteilt, die auf Agarplatten
lagen. Die Platten wurden dann inkubiert, um annähernd 150.000 Kolonien zu etablieren,
die auf 24 andere Nitrocellulose-Filter replikaplattiert wurden.
Die Replikas wurden inkubiert, bis eindeutige Kolonien auftraten.
Die Bakterien auf den Filtern wurden für 10 Minuten auf Bögen von gerade
mit Natriumhydroxid (0,5 M) gesättigtem
Whatman 3 MM-Papier lysiert, dann mit Tris (1 M) für 2 Minuten übertragen,
gefolgt von Übertragung
mit Tris (0,5 M), das NaCl (1,5 M) enthält, für 10 Minuten. Wenn die Filter
nahezu trocken sind, werden sie für zwei Stunden bei 80°C in einem
Vakuumofen vor der Nukleinsäurehybridisierung
gebacken. [Wahl et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 76, 3683–3687 (1979)]
und Maniatis et al., Cell, 81, 163–182 (1976).
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Die
Filter wurden für
2 Stunden bei 65°C
in 750 ml 10 × Denhardts-Lösung, 0,2%
SDS und 6 × SSC vorhybridisiert.
Die Filter wurden in 6 × SSC
gespült,
dann zu viert in einen Beutel gegeben und für 14 Stunden in 6 × SSX und
10 × Denhardts-Lösung hybridisiert.
Es gab annähernd
15 ml Lösung
pro Beutel, die 50 × 106 cpm 32P-markierte
Sonde (Oligonukleotide) enthielt.
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Nach
der Hybridisierung wurden die Filter dreimal in 6 × SSC (1
Liter/Waschung) bei Raumtemperatur für jeweils 10 Minuten gewaschen.
Die Filter wurden dann zweimal bei 45°C für jeweils 15 Minuten, einmal
bei 50°C
für 15
Minuten und einmal bei 55°C
für 15
Minuten, unter Verwendung von 1 Liter Volumenteilen 6 × SSC gewaschen.
Die Filter wurden für
2 Stunden bei –70°C unter Verwendung
eines Verstärkungsschirms
und eines Kodak XAR-2-Films
autoradiographiert. Auf diesem Autoradiogramm gab es 40–50 nachgewiesene
positive Signale, einschließlich
fünf sehr
starker Signale.
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Die
Bereiche, die die stärksten
fünf Signale
und zusätzliche
fünf positive
enthielten, wurden von den Masterplatten abgeschabt und für ein Sekundärscreening
unter Verwendung derselben Sondenmischung unter denselben Bedingungen
replattiert. Das Waschverfahren unterschied sich, in dem die Hochtemperaturwaschungen
aus zwei bei 55°C
für jeweils
15 Minuten und dann einer bei 60°C
für 15
Minuten bestanden. Basierend auf der N-myc-Sondenstudie von Beispiel
3, wurde die letzte Waschtemperatur beim zweiten Screening erhöht, weil
die Schmelztemperatur des Aggregats für die 24 23 mere 60–68°C betrug, ähnlich derjenigen
der N-myc-Sonden. Direkt nach der zweiten Waschung bei 55°C wurden
die Filter feucht belassen und ein Autoradiogramm wurde gemacht.
Der Vergleich dieses Autoradiogramms mit einem zweiten Autoradiogramm,
das für
einen ähnlichen
Zeitraum nach einer letzten Waschung bei 60°C gemacht wurde, zeigte, daß nur zwei
der 10 getesteten Klone keinen wesentlichen Verlust im Signal beim
Ansteigen von 55 bis 60°C
erlitten. Es wurde später
gezeigt, daß diese
zwei Klone nahezu identische Länge
und Restriktionsendonukleasenmuster aufwiesen. Ein als Ppo2 bezeichneter
Klon wurde für
die Sequenzierung ausgewählt.
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Die
Sequenzierung des rekombinanten hpG-CSF-cDNA-Klons Ppo2, erhalten
mit dem obigen Verfahren, wurde mit dem Didesoxy-Verfahren von Sanger
et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 74, 5463–5467 (1977), durchgeführt. Der
einzelsträngige
DNA-Phage M-13 wurde als ein Klonierungsvektor verwendet, um einzelsträngige DNA-Matrizen
aus den doppelsträngigen
cDNA-Klonen zu liefern. Das Verfahren nach Sanger et al. erbrachte
die in Tabelle VII dargestellte Sequenz, begleitet von ihrer Aminosäuretranslation
und einem komplementären
Strang in der Polypeptid-Kodierungsregion.
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Folgende
Merkmale der Sequenz von Tabelle VII sind bemerkenswert. Am 5'-Ende der Sequenz
sind Basen gezeigt, die denjenigen des PolyG-cDNA-Linkers entsprechen.
Dort treten dann etwa fünf
Basen (bezeichnet mit "N") auf, die wegen
der vorangehenden Mehrfach-Gs mit dem Verfahren von Sanger et al.
nicht ohne weiteres unzweideutig bestimmt werden konnten. Die Sequenz
danach zeigt eine Reihe von 12 Codons, die einen Teil einer mutmaßlichen
Leader-Sequenz für
das Polypeptid kodieren. Basierend auf der Übereinstimmung mit der aminoterminalen
Sequenz von natürlichen
Isolaten von hpCSF, beschrieben in Beispiel 1, wird der Anfangs-Threonin-Rest
der mutmaßlichen "reifen" Form von hpG-CSF
mit +1 bezeichnet. Reifer hpG-CSF ergibt sich danach als 174 Reste
einschließend,
wie angegeben. Auf die "Stop"-Codons (den OP-Codon,
TGA) folgen annähernd
856 Basen einer untranslatierten 3'-Sequenz und Mehrfach-As des PolyA-"Schwanzes". Einmalig auftretende HgiAi- und ApaI-Restriktionsendonukleasenerkennungsstellen,
sowie zwei StuI-Stellen (unten
im Hinblick auf die Konstruktion von prokaryontischen und eukaryontischen
Expressionssystemen diskutiert) sind ebenfalls in Tabelle VII bezeichnet.
Wegen des Fehlens von Asparagin-Resten im
Polypeptid gibt es keine sichtbaren Stellen für N-Glycosylierung. Die unterstrichenen
sechs Basen nahe dem Ende der 3'-untranslatierten
Sequenz stellen eine potentielle Polyadenylierungsstelle dar.
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Es
ist bemerkenswert, daß jeder
der zwei zusätzlichen
cDNA-Klone, die mit den oben beschriebenen Hybridisierungsverfahren
aus einer Gesamtheit von 450.000 Klonen heraus identifiziert worden
waren, keine DNA enthielten, welche die gesamte Leader-Sequenz von
der Transkriptionsinitiationsstelle aufwärts kodiert. In der Tat endeten
alle drei hpG-CFS-Klone in der 5'-Region
an exakt derselben Stelle, was anzeigt, daß die Sekundärstruktur
der transkribierten mRNA die cDNA-Bildung über diese Stelle hinaus stark
behindert. In praktischer Hinsicht könnte daher ein cDNA-Expressionsscreening,
wie etwa bei Okayama et al., Mol. and Cell. Biol., 3, 280–289 (1983)
und tatsächlich
bei Wong et al., Science, 228, 810–814 (1985), verwendet, um GM-CSF
zu isolieren, nicht ohne weiteres auf die Isolierung von hpCSF-DNA
angewendet werden, da solche Isolierungssysteme normalerweise auf
dem Vorhandensein eines cDNA-Transkripts in voller Länge in den
getesteten Klonen beruhen.
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Die
obige Sequenz ist nicht ohne weiteres für das Sicherstellen direkter
Expression von hpG-CSF
in einem mikrobiellen Wirt zugänglich.
Um solch eine Expression sicherzustellen, sollte die hpG-CSF-Kodierungsregion
mit einem Anfangs-ATG-Codon versehen werden und die Sequenz sollte
in einen Transformationsvektor an einer Stelle inseriert werden,
die unter Kontrolle einer geeigneten Promotor/Regulator-DNA-Sequenz
steht.
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Beispiel 5
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In
diesem Beispiel wurde cDNA, die hpG-CFS, wie im vorangehenden Beispiel
isoliert, kodierte, verwendet, um einen genomischen Klon zu screenen.
Eine Lambdaphagen-Genombibliothek
aus fötaler
menschlicher Leber [hergestellt gemäß dem Verfahren von Lawn et
al., Cell, 15, 1157–1174
(1978) und von T. Maniatis erhalten] wurde unter Verwendung einer
einzelstranggebrochenen translatierten Sonde gescreent, die aus zwei
hpG-CSF-cDNA-Fragmenten
besteht, die durch Verdauung mit HgiAI und StuI isoliert worden waren HgiAI bis StuI, 649 bp; StuI bis StuI, 639 bp). Eine Gesamtheit
von annähernd
500.000 Phagen wurde auf 12 (15 cm) Petrischalen plattiert und die
Plaques abgehoben und unter Verwendung des Benton/Davison-Verfahrens [Benton
et al., Science, 196, 180 (1977)] zur Sonde hybridisiert. Eine Gesamtheit
von 12 positiven Klonen wurde beobachtet. Drei Klone (1–3), welche
die stärksten
Signale bei Autoradiographie in einem Sekundärscreening lieferten, wurden
in 1 Liter-Kulturen gezüchtet
und durch Restriktionsenzymverdauung und Southern-Transfer unter Verwendung
eines radioaktiv markierten 24meren Oligonukleotids (kinasiert mit γ-32P-ATP) 5'CTGCACTGTCCAGAGTGCACTGTG3' kartiert. Die Kartierungsergebnisse
zeigten, daß die
Isolate 1 und 3 identisch waren und 2 enthielt 2.000 zusätzliche
Basen 5' zum hpG-CSF-Gen.
Daher wurde Klon 2 für
die weitere Charakterisierung verwendet. DNA aus Klon 2 wurde mit
R1 verdaut um ein 8.500 bp langes, hpG-CSF enthaltenes Fragment
freizusetzen, das anschließend
in pBR322 subkloniert und weiter durch Restriktionsendonukleaseverdauungen,
Southern-Transfer, M13-Subklonierung und Sequenzierung kartiert
wurde. Die erhaltene Sequenz ist, wie in Tabelle VIII dargestellt.
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Eine
Restriktionsendonukleasenkarte (annähernd 3,4 Kb) von genomischer
DNA, die das hpGCSF-Gen enthält,
ist detailliert in 1 dargestellt. Die in 1 gezeigten
Restriktionsendonukleasen sind: NcoI,
N; PstI, P; BamHI,B; ApaI,
A; XhoI, X; und Kpn, K. Die Pfeile unter der Karte stellen
die Sequenzierungsstrategie dar, die verwendet wurde, um die genomische
Sequenz zu erhalten. Die eingerahmten Regionen sind diejenigen,
die im cDNA-Klon gefunden wurden, wobei die Rahmen mit gestrichelten
offenen Enden Sequenzen darstellen, die nicht im cDNA-Klon vorhanden
sind, aber durch Sondierung von mRNA-Transfer identifiziert wurden.
Identifizierung von Kodierungssequenzen, die für Exon'1 vorgeschlagen werden, wurden mit Northern-Transfer-Analyse
durchgeführt.
Eine 24mere Oligonukleotid-Sonde 5'CAGCAGCTGCAGGGCCATCAGCTT3',
die die vorhergesagten Spleißverbindungen
für die
Exons 1 und 2 überspannt,
wurde in einem Northern-Transfer-Format
zu hpG-CSF-mRNA hybridisiert. Der resultierende Transfer zeigt eine
mRNA mit derselben Größe (1650
bp) wie diejenige, die man mit einer Exon 2-Oligonukleotidsonde sieht. Diese Daten,
kombiniert mit der Fähigkeit
zu direkter Expression von hpG-CFS aus dem pSVGM-Ppo1-Vektor (Beispiel
9) unter Verwendung des in Tabelle VIII dargestellten Met-Initiationskodons,
definieren die in Exon 1 enthaltenen Kodierungssequenzen. Die Exons
2–5 werden
von den im cDNA-Klon (Ppo2) des hpG-Csf-Gens (Tabelle VII) erhaltenen
Kodierungssequenzen definiert.
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Beispiel 6
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Das
Beispiel betrifft die Herstellung eines künstlich hergestellten Gens,
das hpG-CSF kodiert und E. coli-Präferenzcodons einschließt.
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Kurz
gesagt, war die verwendete Vorschrift im allgemeinen so, wie sie
in der Offenbarung der PCT-Veröffentlichung
Nr. WO83/04053 (Alton et al.) derselben Anmelderin dargestellt ist,
die hier durch Bezugnahme eingeschlossen wird. Die Gene wurden für den anfänglichen
Zusammenbau von Teiloligonukleotiden zu mehrfachen Duplizes konstruiert,
die selbst zu drei diskreten Abschnitten zusammengebaut wurden. Diese
Abschnitte waren auf schnelle Amplifikation hin konstruiert und
konnten nach Entfernung des Amplifikationssystems sequentiell oder
durch eine mehrfache Fragmentligation in einem geeigneten Expressionsvektor zusammengebaut
werden.
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Die
Konstruktion der Abschnitte I, II und III ist in Tabelle IX bis
XIV dargestellt. Bei der Konstruktion von Abschnitt I, wie dargestellt
in den Tabellen IX und X, wurden Oligonukleotide 1–14 zu 7
Duplizes (1 und 8; 2 und 9; 3 und 10; 4 und 11; 5 und 12; 6 und
13; und 7 und 14) zusammengebaut. Die 7 Duplizes wurden dann ligiert,
um Abschnitt I, wie in Tabelle X gezeigt, zu bilden. Man kann in
Tabelle X auch noch bemerken, daß Abschnitt I stromaufwärts ein
kohäsives XbaI-Ende und stromabwärts ein
kohäsives BamHI-Ende einschließt, die
für die
Ligation mit Amplifikations- und Expressionsvektoren und für die Ligation
mit Abschnitt II nützlich sind.
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Tabelle
IX EChpG-CSFDNA
ABSCHNITT I
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Tabelle
X EChpG-CSFDNA
ABSCHNITT 1
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Wie
in Tabellen XI und XII dargestellt, werden bei der Konstruktion
von Abschnitt II die Oligonukleotide 15–30 zu 8 Duplizes (15 und 23;
16 und 24; 17 und 25; 18 und 26; 19 und 27; 20 und 28; 21 und 29;
und 22 und 30) zusammengebaut. Diese 8 Duplizes werden dann ligiert,
um Abschnitt II, wie in Tabelle XII gezeigt, zu bilden. Wie weiter
in Tabelle XII gezeigt, besitzt Abschnitt II stromaufwärts ein
kohäsives BamHI-Ende und stromabwärts ein kohäsives EcoRI-Ende, die für die Ligation
mit einem Amplifikationsvektor und für die Ligation mit Abschnitt
I nützlich
sind. Nahe seinem stromabwärtsliegende
Ende schließt
Abschnitt II auch noch eine stromabwärtige SstI-Stelle ein, die bei der eventuellen
Ligation der Abschnitte II und III nützlich ist.
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Tabelle
XI EChpG-CSFDNA
ABSCHNITT II
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Schließlich wird
Abschnitt III so konstruiert, wie in den Tabellen XIII und XIV dargestellt.
Für diese
Konstruktion werden die Oligonukleotide 31–42 zu 6 Duplizes (31 und 37;
32 und 38; 33 und 39; 34 und 409; 35 und 41; und 36 und 42) zusammengebaut.
Die 6 Duplizes werden dann ligiert, um Abschnitt III, wie in Tabelle XIV
dargestellt, zu bilden. Wie ebenfalls in Tabelle XIV gezeigt, schließt Abschnitt
III stromaufwärts
ein kohäsives BamHI-Ende und stromabwärts ein
kohäsives EcoRI-Ende ein, die für die Ligation
in einen Amplifikationsvektor und zumindest im Fall des EcoRI-Endes in einen Expressionsvektor
nützlich
sind. Zusätzlich
besitzt Abschnitt III stromaufwärts
eine SstI-Stelle, die bei der
eventuellen Ligation der Abschnitte II und III nützlich ist.
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Tabelle
XIII EChpG-CSFDNA
ABSCHNITT III
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Das
durch Abschnitt I gebildete XbaI-bis-BamHI-Fragment wird in einen
M13mp11-Phagenvektor
ligiert, geöffnet
mit XbaI und BamHI. Der Vektor wird dann erneut durch
Verdauung mit BamHI und EcoRI geöffnet, gefolgt von Ligation
mit dem BamHI-bis-EcoRI-Fragment,
das durch Abschnitt II gebildet ist. In dieser Stufe haben sich
die Abschnitte I und II in richtiger Orientierung miteinander verbunden.
Als nächstes
wird ein anderer M13mp11-Vektor
durch BamHI- und EcoRI-Verdauung geöffnet und dann mit dem BamHI-bis-EcoRI-Fragment
ligiert, das durch Abschnitt III gebildet ist.
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Der
Vektor, der die Abschnitte I und II enthält, wird mit XbaI und SstI
verdaut. In ähnlicher
Weise wird der Vektor, der Abschnitt III enthält, mit SstI und EcoRI
verdaut. Die beiden kleineren der zwei Fragmente, die aus jeder
Verdauung hervorgehen, werden in ein Plasmid pCFM1156 ligiert, das
zuvor mit XbaI und EcoRI geöffnet wird. Das Produkt dieser
Reaktion ist ein Expressionsplasmid, das eine kontinuierliche DNA-Sequenz enthält, wie
sie in Tabelle XV dargestellt ist, die das gesamte hpG-CSF-Polypeptid
mit einem aminoterminalen Methionin-Codon (ATG) für E. coli-Translationsinitiation
kodiert.
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Obwohl
jeder geeignete Vektor verwendet werden kann, um diese DNA zu exprimieren,
kann das Expressionsplasmid pCFM1156 leicht aus einem Plasmid pCFM
836 konstruiert werden, dessen Konstruktion in der veröffentlichten
europäischen
Patentanmeldung Nr. 136 490 beschrieben ist. pCFM836 wird zunächst mit NdeI geschnitten und dann
mit PolI mit glatten Enden
versehen, so daß beide
existierenden NdeI-Stellen
zerstört
werden. Als nächstes
wird der Vektor mit ClaI und SacII verdaut, um einen existierenden
Polylinker vor Ligation mit einem Ersatz-Polylinker zu entfernen,
wie in Tabelle XVI dargestellt. Dieser Ersatz-Polylinker kann gemäß dem Verfahren von Alton et
al., oben, konstruiert werden. Die Steuerung der Expression im Expressionsplasmid
pCFM1156 erfolgt mit Hilfe eines Lambda-PL-Promotors, der selbst
unter Kontrolle eines C1857-Repressor-Gens
stehen kann (wie im E. coli-Stamm
K12ΔHtrp
zur Verfügung
gestellt).
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Beispiel 7
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Dieses
Beispiel betrifft die E. coli-Expression eines hpG-CSF-Polypeptids
mittels einer DNA-Sequenz, die
[Met–1]hpCSF
kodiert. Die verwendete Sequenz war teilweise synthetisch und teilweise
von cDNA abgeleitet. Die synthetische Sequenz verwendete E. coli-Präferenzcodons.
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Plasmid
Ppo2, welches das hpG-CSF-Gen, das in Tabelle VII dargestellt ist,
enthält,
wurde mit HgiAI und StuI verdaut, was ein annähernd 645
Basenpaare langes Fragment zur Verfügung stellte, welches das Gen
für reifen
hpCSF (wie in Tabelle VII dargestellt) zur Verfügung stellt mit sieben der
Leadersequenz-Restcodons am 5'-Ende
und etwa 100 Basenpaaren der nicht-kodierenden 3'-Region. HgiAI-Verdauung
ließ ein vier
Basenpaare langes kohäsives
5'-Ende übrig, das
identisch mit demjenigen von PstI ist,
und StuI ließ ein glattes
Ende übrig.
Dies ermöglichte
leichte Insertion des Fragments in M13 mp8 (Rf), geschnitten mit PstI und mit dem glatte Enden
bildenden Restriktionsenzym HincII.
Bei Amplifikation in M13 wurde die hpG-CSF-DNA durch Verdauung mit ApaI und BamHI herausgeschnitten, die an der ApaI-Stelle, die Codons für die Reste
+3 bis +5 von hpCSF überspannend,
bzw. an einer BamHI-Stelle, "stromabwärts" der HincII-Stelle im M13 mp8-Restriktionspolylinker,
schneiden. Um E. coli-Expression des hpG-CSF-Polypeptids zu ermöglichen,
wurde ein synthetisches Fragment hergestellt, wie in Tabelle XVII
unten dargestellt.
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Wie
man aus der Analyse von Tabelle XVII feststellen kann, schließt der Linker
ein kohäsives ApaI-Ende, Codons, die die
anfänglichen
drei Reste des Aminoendes von hpG-CSF spezifizieren (und die Thr1, Pro2, Leu3 spezifizierenden Codons "wiederherstellen", die bei der ApaI-Verdauung der oben beschriebenen M13-DNA
abgebaut wurden, und Codons verwenden, die vorzugsweise in E. coli
exprimiert werden), ein translationinitiierendes ATG, eine Sequenz
aus 24 Basenpaaren, die eine Ribosom-Bindungsstelle zur Verfügung stellt,
und ein kohäsives XbaI-Ende ein.
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Der
für E.
coli-Expression verwendete Expressionsvektor war derjenige, der
als pCFM536 in der europäischen
Patentanmeldung Nr. 136 490, veröffentlicht
am 10. April 1985, von Morris beschrieben worden ist. (Siehe auch
A. T. C. C. 39934, E. coli JM103, der pCFM536 enthält). Kurz
gesagt, wurde Plasmid pCFM536 mit XbaI und BamHI verdaut. Das hpG-CSF-Fragment (ApaI/BamHI)
und der oben beschriebene Linker XbaI/ApaI wurden dann dort hinein
ligiert, um ein als Plasmid p536Ppo2 bezeichnetes
Plasmid zu bilden.
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Plasmid p536Ppo2 wurde in eine phagenresistente
Variante des E. coli AM7-Stammes transformiert, der zuvor mit Plasmid
pMW1 (A. T. C. C. Nr. 39933), das ein CI857-Gen
enthält,
transformiert worden war. Die Transformation wurde auf der Basis
des antibiotischen (amp) Resistenz-Markergens verifiziert, das auf
dem pCFM536-Vorläuferplasmid
vorlag. Zellkulturen in LB-Brühe
(Ampicillin 50 μg
1 ml) wurden bei 28°C
gehalten und bei Zellwachstum in Kultur auf A600 = 0,5 wurde hpCSF-Expression
durch Anheben der Kulturtemperatur auf 42°C für 3 Stunden induziert. Der
endgültige
O. D. der Kultur betrug A600 = 1,2.
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Das
Expressionsniveau von hpG-CSF durch transformierte Zellen wurde
auf einem SDS-Polyacrylamidgel,
angefärbt
mit blauem Coomassie-Farbstoff, auf 3–5% des gesamten Zellproteins
geschätzt.
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Die
Zellen wurden durch Zentrifugation bei 3500 g für 10 Minuten in einem JS-4.2-Rotor
abgeerntet. Zellen bei 25% (w/v) in Wasser wurden durch dreimaliges
Hindurchgeben durch eine French-Press-Zelle bei 10.000 psi zerbrochen.
Die gebrochene Zellsuspension wurde bei 10.000 g für 15 Minuten
in einem JA-20-Rotor zentrifugiert. Das Pellet wurde in Wasser wieder
in Suspension gebracht und bei etwa 5 mg/ml Gesamtprotein in 1%
Laurinsäure,
50 mM Tris, pH 8,7 löslich
gemacht. Das löslich
gemachte Pelletmaterial wurde bei 15.000 g für 10 Minuten zentrifugiert
und zum Überstand
wurde CuSO4 bis 20 mM zugegeben. Nach einer Stunde
wurde diese Probe zur Reinigung gemäß den Verfahren von Beispiel
1(B) auf eine C4-HPLC-Säule geladen,
wobei Anpassungen für
das Volumen und die Konzentration vorgenommen wurden.
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Ein
zweites Reinigungsverfahren wurde entwickelt, um größere Mengen
hpG-CSF, formuliert in einem nicht-organische Verbindungen enthaltenden
Puffer, zu liefern. Dieses Material ist für in-vivo-Studien geeignet. 150
g Zellpaste wurden in etwa 600 ml 1 mM DTT wieder in Suspension
gebracht und 4mal durch einen Manton Gualin Homogenizer bei etwa
7000 PSI hindurchgegeben. Die gebrochene Zellsuspension wurde bei 10.000
g für 30
Minuten zentrifugiert und das Pellet wurde in 400 ml 1% Desoxycholat
(DOC), 5 mM EDTA, 5 mM DTT und 50 mM Tris, pH 9 wieder in Suspension
gebracht. Diese Suspension wurde bei Raumtemperatur für 30 Minuten
vermischt und bei 10.000 g für
30 Minuten zentrifugiert. Das Pellet wurde in etwa 400 ml Wasser wieder
in Suspension gebracht und bei 10.000 g für 30 Minuten zentrifugiert.
Das Pellet wurde in 100 ml 2% Sarkosyl und 50 mM bei pH8 löslich gemacht.
CuSO4 wurde auf 20 μM zugegeben und die Mischung
wurde 16 Stunden bei Raumtemperatur gerührt und dann bei 20.000 g für 30 Minuten
zentrifugiert. Zum Überstand wurden
300 ml Aceton zugegeben. Diese Mischung wurde für 20 Minuten auf Eis gegeben
und dann bei 5000 g für
30 Minuten zentrifugiert. Das Pellet wurde in 250 ml 6 M Guanidin
und 40 mM Natriumacetat bei pH 4 aufgelöst und über eine 1200 ml G-25-Säule gegeben, äquilibriert
und betrieben in 20 mM Natriumacetat bei pH 5,4. Der hpG-CSF-Peak
(etwa 400 ml) wurde gepoolt und auf eine 15 ml CM-Cellulose-Säule gegeben, äquilibriert
in 20 mM Natriumacetat bei pH 5,4. Nach Beladen wurde die Säule mit
60 ml 20 mM Natriumacetat bei pH 5,4 und mit 25 mM Natriumchlorid
gewaschen und dann wurde die Säule
mit 200 ml 20 mM Natriumacetat bei pH 5,4 und mit 37 mM Natriumchlorid
eluiert. 150 ml dieses Eluats wurden auf 10 ml konzentriert und auf
eine 300 ml G-75-Säule
aufgebracht, äquilibriert
und betrieben in 20 mM Natriumacetat und 100 mM Natriumchlorid pH
5,4. Die Peakfraktionen, die 35 ml umfassen, wurden gepoolt und
filtersterilisiert. Die endgültige Konzentration
von hpG-CSF betrug
1,5 mg/ml, ist mehr als 95% rein, wie durch Analyse auf einem Gel
bestimmt, und enthielt weniger als 0,5 ng Pyrogen pro 0,5 mg hpG-CSF.
Das Pyrogen-Niveau wurde unter Verwendung eines Limulus-Amebocyte-Lysat(LAL)-Testsatzes
(M. A. Bioproducts, Walkersville, Maryland) bestimmt.
-
Beispiel 8
-
Dieses
Beispiel betrifft die Verwendung rekombinanter Verfahren zur Erzeugung
von Analoga von hpG-CSF, in denen Cysteinreste, die an den Positionen
17, 36, 42, 64 und 74 vorhanden sind, individuell durch einen geeigneten
Aminosäurerest
ersetzt sind.
-
Ortsgerichtete
Mutageneseverfahren nach Souza et al., Veröffentlichte PCT-Anmeldung Nr. WO85/00817,
veröffentlicht
am 28. Februar 1985, wurden auf [Met–1]-Kodierungs-DNA
von Plasmid p536Ppo2 durchgeführt,
wie unten beschrieben, unter Verwendung synthetischer Oligonukleotide,
die in ihre Größe zwischen
20 und 23 Basen variierten, wie in Tabelle XVIII unten dargestellt.
Oligonukleotid Nr. 1 ermöglichte
die Bildung eines Gens, das [Ser17]hpG-CSF kodiert; Oligonukleotid
Nr. 2 ermöglicht
die Bildung von [Ser36]hpG-CSF usw.
-
-
Die
auf Cys zu Ser ortsgerichteten Mutageneserestriktionen wurden unter
Verwendung von M13 mp10 durchgeführt,
das ein XbaI-BamHI-hpG-CSF-Fragment enthielt, isoliert
aus p536Ppo2, als Matrize. DNA aus jedem M13 mp10-Klon, der eine
Cys-Ser-Substitution enthielt, wurden mit XbaI und BamHI
behandelt. Das resultierende Fragment wurde in den Expressionsvektor
pCFM746 kloniert und die Expressionsprodukte wurden wie in Beispiel
7 isoliert.
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Das
Plasmid pCFM746 kann durch Schneiden eines Plasmid pCFM736 (dessen
Konstruktion aus hinterlegten und öffentlich zugänglichen
Materialien bei Morris, Veröffentlichte
PCT-Anmeldung Nr.
WO85/00829, veröffentlicht
am 28. Februar 1985, beschrieben ist) mit ClaI und BamHI,
um einen existierenden Polylinker zu entfernen und den folgenden
Polylinker einzusetzen, konstruiert werden.
-
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In
einem Reinigungsverfahren für
Cys-zu-Ser-Analoga gemäß der vorliegenden
Erfindung wurden etwa 10–15
g Zellpaste in 40 ml 1 mM DTT wieder suspendiert und dreimal durch
eine Französische
Druckzelle bei 10.000 psi hindurchgegeben. Die gebrochene Zellsuspension
wurde bei 1000 g für
30 Minuten zentrifugiert. Das Pellet wurde erneut in 1% DOC, 5 mM
EDTA, 5 mM DTT, 50 mM Tris, pH 9, suspendiert und man ließ es 30
Minuten bei Raumtemperatur durchmischen. Die Mischung wurde bei
10.000 g für
30 Minuten zentrifugiert, erneut in 40 ml H2O
suspendiert und noch einmal bei 10.000 g für 30 Minuten zentrifugiert.
Das Pellet wurde in 10 ml 2% Sarkosyl, 50 mM DTT, 50 mM Tris, pH
8, gelöst.
Nach Vermischen für
eine Stunde wurde die Mischung durch Zentrifugation bei 20.000 g
für 30
Minuten geklärt
und dann auf eine 300 ml G-75-Säule, äquilibriert
und betrieben in 1% Sarkosyl, 50 mM Tris, pH 8, aufgebracht. Fraktionen,
die das Analogon enthalten, wurden gepoolt und man ließ sie durch
Stehenlassen an der Luft für
wenigstens einen Tag an der Luft oxidieren. Die endgültigen Konzentrationen
variierten von 0,5–5
mg/ml.
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Beispiel 9
-
In
diesem Beispiel wurde ein Säugetierzell-Expressionssystem
konstruiert, um in Erfahrung zu bringen, ob ein aktives Polypeptidprodukt
von hpG-CSF-DNA in Säugetierzellen
(COS-1, A. T. C. C. CRL-1650) exprimiert und durch diese zugeschnitten
werden kann. Dieses System wurde konstruiert, um Ausscheidung eines
Polypeptidanalogons von hpG-CSF über
Expressi on und sekretorische Verarbeitung einer teilweise synthetischen,
teilweise von cDNA abgeleiteten Konstruktion zu liefern, die [Ala1]hpG-CSF kodiert, dem ein Leader-Polypeptid
vorangeht, das die Sequenz von Resten hat, die bei Wong et al.,
Science, 228, 810–815
(1985) und Lee, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 82, 4360–4364 (1985),
menschlichem GM-CSF zugeschrieben wird.
-
Der
Expressionsvektor, der für
Vorstudien zur Expression von Polypeptidprodukten der Erfindung
verwendet wurde, war ein "Shuttle"-Vektor, der sowohl
pBR322 als auch SV40-DNA
einschloß,
und konstruiert worden war, um autonome Replikation sowohl in E.
coli- als auch Säugetierzellen
zu ermöglichen,
wobei die Säugetierzellexpression
inserierter exogener DNA unter der Kontrolle einer viralen Promotor/Regulator-DNA-Sequenz
stand. Dieser Vektor, als pSVDM-19 bezeichnet, enthalten in E. coli
HB101, wurde am 23. August 1985 bei der American Type Culture Collection,
12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland, hinterlegt und erhielt
die Zugangsnummer A. T. C. C. 53241.
-
Die
spezifischen Manipulationen, die mit der Konstruktion des Expressionsvektors
verbunden waren, waren wie folgt. Eine leaderkodierende DNA-Sequenz
wurde synthetisiert, wie in Tabelle XX unten dargestellt.
-
-
Wie
in Tabelle XX gezeigt, schloß die
Sequenz kohäsive HindIII- und ApaI-Enden und Codons für 17 Aminosäurereste ein, die dem "Leader" von menschlichem
GM-CSF zugeschrieben werden. Es folgen Codons, die einen Alaninrest,
einen Prolinrest und einen Leucinrest spezifizieren. Die Prolin-
und Leucinreste duplizieren die an den Positionen +2 und +3 von
hpG-CSF vorhandenen Aminosäuren,
während
der Alaninrest für
den anfänglichen
aminoterminalen (+1) Rest von GM-CSF statt von hpG-CSF duplikativ
ist. Der Ersatz von Threonin durch Alanin wurde so konstruiert,
um die richtige Wirtszell-"Abarbeitung" des GM-CSF-Leaders durch zelluläre Mechanismen
zu erleichtern, die normalerweise bei der sekretorischen GM-CSF-Verarbeitung betroffen
sind.
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Plasmid
pSVDM-19 wurde mit KpnI verdaut
und die Stelle wurde mit Klenow-Enzym zu einem glatten Ende gemacht.
Danach wurde die DNA mit HindIII geschnitten.
Das resultierende große
Fragment wurde mit dem HindIII/PvuII-Fragment, das in Tabelle
VII dargestellt ist (isoliert aus Plasmid Ppo2 als das zweitgrößte Fragment,
das aus der HindIII-Verdauung
und der Teilverdauung mit PvuII stammt),
kombiniert und ligiert, um Plasmid pSV-Ppo1 zu bilden. Das künstlich
hergestellte GM-CSF-Leader-Sequenzfragment von Tabelle VIII wurde
dann in pSV-Ppo1 ligiert (im Anschluß an dessen Schneiden mit HindIII und ApaI), um Plasmid pSVGM-Ppo1 zu liefern.
-
Calciumphosphat-Präzipitate
(1–5 μg) von Plasmid-pSVGM-Ppo1-DNA
wurde in 60 mm-Doppelplatten
von COS-1-Zellen transformiert, wie sie im wesentlichen bei Wigler
et al., Cell, 14, 725–731
(1978), beschrieben sind. Als Kontrolle wurde Plasmid pSVDM-19 ebenfalls
in COS-1-Zellen transformiert. Gewebekulturüberstände wurden 5 Tage nach Transfektion
abgeerntet und auf hpG-CSF-Aktivität getestet. Die Ausbeuten an
[Ala1]hpG-CSF aus dem Kulturüberstand
lagen in der Größenordnung
von 1 bis 2,5 μg/ml.
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Im
Anschluß an
die erfolgreiche Expression des mit der Kodierung für [Ala1]hpG-CSF-Produkt
versehene Plasmid pSVGM-Ppo1 in COS-1-Zellen, wurde ein anderer
Vektor konstruiert, der die menschliche GM-CSF-Leader-Sequenz einschließt, aber
ein Codon für
einen Threonin-Rest aufweist (das natürlicherweise an Position 1
von hpG-CSF auftritt), das das Codon für Alanin an dieser Position
ersetzt. Kurz gesagt, wurde ein Oligonukleotid synthetisiert (5'CAGCATCTCTACACCTCTGGG)
für ortsgerichtete
Mutagenese (SDM). Das HindIII-
bis BamHI-hpG-CSF-Fragment
in pSVGM-Ppo1 wurde für
die SDM in M13 mp10 ligiert. Das neu synthetisierte hpG-CSF-Gen,
das ein Thr-Codon in Position 1 enthielt, wurde durch Schneiden
mit HindIII und EcoRI isoliert. Das Fragment wurde dann
in pSVDM-19 kloniert, hergestellt durch Schneiden mit denselben
zwei Restriktionsendonukleasen. Der resultierende Vektor pSVGM-Ppo(Thr)
wurde in COS-Zellen transformiert und die Ausbeuten an hpG-CSF,
gemessen in den Kulturüberständen, variierten
von 1 bis 5 μg/ml.
-
Schließlich wurde
die genomische Sequenz, deren Isolierung in Beispiel 5 beschrieben
ist, verwendet, um einen Expressionsvektor für Säugetierzellexpression von hpG-CSF
zu bilden. Genauer gesagt, wurde pSVDM-19 mit KpnI und HindIII
verdaut und das große
Fragment in einer Vier-Wege-Ligation mit einem synthetischen Linker
mit kohäsiven HindIII- und NcoI-Enden
verwendet, wie in Tabelle XXI gezeigt. Ein NcoI-BamHI-Fragment,
das das aus pBR322 isolierte Exon 1 enthielt (8500 hpG-CSF), ein
genomischer Subklon und ein BamHI-KpnI-Fragment, das die aus pBR322 isolierten
Exons 2–5
enthielt (8500 hpG-CSF genomischer Subklon). Der resultierende Säugetier-Expressionsvektor
pSV/ghG-CSF produzierte 1 bis 2,5 μg/ml hpG-CSF aus transformierten
COS-Zellen.
-
-
Beispiel 10
-
Dieses
Beispiel betrifft physikalische und biologische Eigenschaften von
rekombinanten Polypeptiden.
-
1. Molekulargewicht
-
Rekombinante
hpG-CSF-Produkte aus E. coli-Expression wie in Beispiel 7 besaßen ein
scheinbares Molekulargewicht von 18,8 kD, wenn dieses in reduzierender
SDS-PAGE bestimmt wurde (wie man auch aus der abgeleiteten Aminosäureanalyse
von Tabelle VII vorhergesagt hätte),
wohingegen natürliche
Isolate, die wie in Beispiel 1 beschrieben gereinigt worden waren,
ein scheinbares Molekulargewicht von 19,6 kD besaßen. Das
Vorhandensein von N-Glykanen, die mit den natürlichen Isolaten verknüpft waren,
konnte effektiv auf der Grundlage des Fehlens von Asparaginresten
in der Primärsequenz
von hpG-CSF in Tabelle VII ausgeschlossen werden und daher wurde
ein Verfahren erdacht, um zu bestimmen, ob O-Glykane für die Molekulargewichtsunterschiede
zwischen natürlichen
Isolaten und den nicht-glykolisierten
rekombinanten Produkten verantwortlich waren. Annähernd 5 μg des natürlichen
Isolatmaterials wurden mit Neuraminidase (Calbiochem, LaJolla, California)
behandelt, eine 0,5 μg
Probe wurde entnommen und das restliche Material wurde mit 4 mU O-Glykanase
(endo-x-n-Acetylgalaktoseaminidase, Genzyme, Boston, Massachusetts)
bei 37°C
inkubiert. Aliquote Teile wurden nach 1/2, 2 und 4 Stunden Inkubation
entnommen. Diese Proben wurden Seite an Seite mit den von E. coli
abgeleiteten rekombinanten Material SDS-PAGE unterworfen. Nach Neuraminidase-Behandlung
verschob sich das scheinbare Molekulargewicht des Isolats von 19,6
kD zu 19,2 kD, was die Entfernung eines Sailinsäurerestes nahelegt. Nach 2
Stunden Behandlung mit O-Glykanase, verschob sich das Molekulargewicht
zu 18,8 kD – identisch
dem scheinbaren Molekulargewicht des von E. coli abgeleiteten Materials.
Die Empfindlichkeit der Kohlehydratstruktur gegenüber Neuraminidase
und O-Glykanase legt die folgende Struktur für die Kohlehydratkomponente
nahe: N-Acetylneuraminsäure-α(2–6)(Galactose β)(1–3)-N-acetylgalactoseamin-R,
wobei R Serin oder Threonin ist.
-
2. 3H-Thymidin-Aufnahme
-
Proliferationsinduktion
von menschlichen Knochenmarkszellen wurde auf der Grundlage erhöhten Einbaus
von 3H-Thymidin untersucht. Menschliches
Knochenmark von gesunden Spendern wurde einem Dichteschnitt mit
Ficoll-Hypaque (1,077 g/ml, Pharmacia) unterworfen und Zellen mit
niedriger Dichte wurde in Iscove-Medium (GIBCO) suspendiert, das
10% fötales
Rinderserum und Glutamin-Pen-Strep enthielt. Anschließend wurden
für 2 × 104 menschliche Knochenmarkszellen entweder
mit Kontrollmedium oder mit dem rekombinanten E. coli-Material von
Beispiel 7 in Platten mit 96 Näpfen
mit flachem Boden bei 37°C
in 5% CO2 in Luft für zwei Tage inkubiert. Die
Proben wurden doppelt getestet und die Konzentration schwankte über einen
10.000fachen Bereich. Die Kulturen wurden dann für 4 Stunden mit 0,5 μ Ci/Napf 3H-Thymidin pulsiert (New England Nuclear,
Boston, Massachusetts). Die 3H-Thymidin-Aufnahme
wurde gemessen, wie bei Ventua et al., Blood, 61, 781 (1983), beschrieben.
In diesem Test können
menschliche hpG-CSF-Isolate den Einbau von 3H-Thymidin in menschliche
Knochenmarkszellen induzieren, bei Niveaus, die annähernd 4–10 mal
höher liegen
als Kontrollüberstände. Das
von E. coli abgeleitete hpG-CSF-Material von Beispiel 6 hatte ähnliche
Eigenschaften.
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Eine
zweite Studie zur Proliferation von menschlichem Knochenmarkszellen
wurde unter Verwendung von Kulturmedium von transfizierten COS-1-Zellen,
wie in Beispiel 9 hergestellt, durchgeführt und lieferte ähnliche
Resultate, was anzeigt, daß kodierte
Polypeptidprodukte in der Tat im Kulturmedium als aktive Materialien ausgeschieden
wurden.
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3. WEHI-3B D+ Differentiationsinduktion
-
Die
Fähigkeit
von rekombinanten, von E. coli abgeleiteten Materialien, Differentiation
der myelomonozytischen Ratten-Leukämiezelllinie WEHI-3B D+ zu induzieren, wurde in halbfestem Agarmedium
getestet, wie bei Metcalf, Int. J. Cancer, 25, 225 (1980), beschrieben.
Das rekombinante hpG-CSF-Produkt und Medienkontrollansätze wurden
mit 60 WEHI-3B D+ Zellen/Loch bei 37°C in 5% CO2 in Luft für 7 Tage inkubiert. Die Proben wurden
in Platten mit 24 Näpfen
mit flachem Boden inkubiert und die Konzentration schwankte über einen 2000fachen
Bereich. Die Kolonien wurden als undifferenziert, teilweise differenziert
und vollständig
differenziert klassifiziert und Koloniezellzählungen wurden mikroskopisch
durchgeführt.
Es stellte sich heraus, daß das rekombinante
E. coli-Material Differentiation induzierte.
-
4. CFU-GM-, BFU-E- und
CFU-GEMM-Tests
-
Es
wurde festgestellt, daß die
natürlichen
Isolate von pluripotentem menschlichen G-CSF (hpG-CSF) und der rekombinante
pluripotente G-CSF (rhpG-CSF) menschliche Knochenmarkszellen dazu
veranlassen, zu wuchern und sich zu differenzieren. Diese Aktivitäten wurden
in CFU-GM-[Broxmeyer, et al., Exp. Hematol., 5, 87, (1971)], BFU-E-
und CFU-GEMM-Tests
[Lu et al., Blood, 61, 250 (1983)] unter Verwendung nicht-haftender
Knochenmarkszellen niedriger Dichte aus gesunden menschlichen Freiwilligen
gemessen. Ein Vergleich der biologischen CFU-GM-, BFU-E- und CFU-GEMM-Aktivitäten unter
Verwendung von entweder 500 Einheiten hpG-CSF oder rhpg-CSF sind
in Tabelle XXII unten dargestellt.
-
Alle
Kolonietests wurden mit nicht-haftenden Knochenmarkszellen niedriger
Dichte durchgeführt. Menschliche
Knochenmarkszellen wurden einem Dichteschnitt mit Ficoll-Hypaque (Dichte,
1,077 g/cm3; Pharmacia) unterworfen. Die
Zellen mit niedriger Dichte wurden dann in Iscoves modifiziertem
Dulbecco-Medium erneut suspendiert, das fötales Kalbsserum enthielt,
und zum Anhaften auf Falcon-Gewebekulturscheiben (Nr. 3003, Becton
Dickenson, Cockeysville, Md.) für
1-1/2 Stunden bei 37°C
gegeben.
-
-
Die
Mediumkontrolle bestand aus Iscoves modifiziertem Dulbecco-Medium
plus 10% FCS, 0,2 mM Hämin
und 1 Einheit rekombinantes Erythropoietin.
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Für den CFU-GM-Test
wurden Zielzellen bei 1 × 105 in 1 ml 0,3% Agar-Kulturmedium plattiert,
das ergänztes
McCoy-5A-Medium und 10% wärmeinaktiviertes
fötales
Kalbsserum einschloß.
Die Kulturen wurden auf Kolonien (größer als 40 Zellen pro Aggregat)
und Morphologie bewertet, durchgeführt am Tage 7 der Kultur. Die
Anzahl der Kolonien ist als der mittlere ±SEM dargestellt, wie er aus
Vierfachplatten bestimmt ist.
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Für die BFU-E-
und CFU-GEMM-Tests wurden Zellen (1 × 105)
zugesetzt zu einer 1 ml-Mischung
von Iscoves modifiziertem Dulbecco-Medium (Gibco), 0,8% Methylcellulose,
30% fötales
Kalbsserum, 0,05 mM 2-Mercaptoethanol, 0,2 mM Hämin und 1 Einheit rekombinantes
Erythropoietin. Die Scheiben wurden in einer angefeuchteten Atmosphäre von 5%
CO2 und 5% O2 inkubiert.
Niedrige Sauerstoffspannung wurde durch Verwendung eines Oxyreducers
von Reming Bioinstruments (Syracuse, N. Y.) erreicht. Die Kolonien
wurden nach 14 Tagen Inkubation bewertet. Die Anzahl der Kolonien
ist als mittlerer ±SEM
dargestellt, bestimmt von Doppelplatten.
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Es
stellte sich heraus, daß alle
im CFU-GM-Test gebildeten Kolonien positiv auf Chloracetatesterase und
negativ auf nicht-spezifische Esterase (α-Naphthylacetatesterase) waren,
was mit den Kolonien konsistent ist, die von der Art granulozytisch
sind. Es wurde festgestellt, daß sowohl
natürlicher
hpG-CSF als auch rhpG-CSF eine spezifische Aktivität eines
annähernd
1 × 108 U/mg reinen Proteins besitzen, wenn sie
durch Reihenverdünnung
in einen CFU-GEMM-Test untersucht werden. Die BFU-E- und CFU-GEMM-Daten
in Tabelle XXII sind repräsentativ
für drei
separate Experimente und ähnlich
denjenigen Daten, die früher
für natürlichen hpG-CSF
berichtet worden sind. Es ist wichtig anzumerken, daß der rhpG-CSF
extrem rein und wegen seiner Produktion in E. coli frei von anderen
potentiellen Säugetier-Wachstumsfaktoren
ist. Somit ist rhpG-CSF in der Lage, gemischte Koloniebildung (CFU-GEMM) und BFU-E zu
unterstützen,
wenn er in Gegenwart rekombinanten Erythropoietins zugesetzt wird.
-
5. Zellbindungstests
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Es
ist früher
berichtet worden, daß WEHI-3B(D+)-Zellen und menschliche Leukämiezellen
aus frisch diagnostizierten Leukämien 125I-markierten Ratten-G-CSF binden werden
und daß diese
Bindung bei Zugabe von unmarkiertem G-CSF oder menschlichem CSF-β konkurrieren
kann. Die Fähigkeit
von natürlichem hpG-CSF
und rhpG-CSF, um die Bindung von 125I-hpG-CSF an menschliche
oder Ratten-Leukämiezellen
zu konkurrieren, wurde untersucht. Hochgereinigtes natürliches
hpG-CSF (> 95% rein;
1 μg) wurde
iodiert [Tejedor, et al., Anal. Biochem., 127, 143 (1982)] und von
den Reaktanten durch Gelfiltration und Ionenaustauschchromatographie
abgetrennt. Die spezifische Aktivität des natürlichen 125I-hpG-CSF
betrug annähernd μCi/μg Protein.
Ratten-WEHI-3B(D+) und zwei menschliche
Myeloidleukämiezellpräparate aus
peripherem Blut (ANLL, eines klassifiziert als M4, das andere als
M5B) wurden auf ihre Fähigkeit
getestet, 125I-hpG-CSF zu binden.
-
Die
Myeloidleukämiezellen
aus peripherem Blut von Ratten und Menschen (frisch erhalten) wurden dreimal
mit PBS/1% BSA gewaschen. WEHI-3B(D+)-Zellen
(5 × 106) oder frische Leukämiezellen (3 × 106) wurden doppelt in PBS/1% BSA (100 μl) in Gegenwart
und Abwesenheit verschiedener Konzentrationen (Volumenteil: 10 μl) von unmarkiertem
hpG-CSF, rhpG-CSF oder GM-CSF und in Gegenwart von 125I-hpG-CSF
(annähernd
100.000 cpm oder 1 ng) bei 0°C
für 90
Minuten (Gesamtvolumen: 120 μl)
inkubiert. Die Zellen wurden dann erneut suspendiert und über 200 μl eiskaltes
FCS in ein 350 μl-Kunststoffzentrifugenröhrchen geschichtet und
zentrifugiert (1000 g; 1 Minute). Das Pellet wurde durch Abschneiden
des Röhrchenendes
gesammelt und das Pellet und der Überstand separat in einem Gammazähler (Packard)
gezählt.
-
Die
spezifische Bindung (cpm) wurde als Gesamtbindung in Abwesenheit
eines Konkurrenten (Mittelwert von Doppelmessungen) minus Bindung
(cpm) in Gegenwart eines 100fachen Überschußes von unmarkiertem hpG-CSF
(nicht-spezifische Bindung) bestimmt. Die nichtspezifische Bindung
betrug maximal 2503 cpm für
WEHI-3B(D+)-Zellen, 1072 cpm für ANLL (M4)-Zellen
und 1125 cpm für
ANLL (M5B)-Zellen. Die Experimente 1 und 2 wurden an unterschiedlichen
Tagen unter Verwendung desselben Präparates von 125I-hpG-CSF
durchgeführt
und zeigen interne Konsistenz in der prozentuellen Hemmung, notiert
für 2000
Einheiten hpG-CSF. Die erhaltenen Daten sind in Tabelle XXIII unten
berichtet.
-
-
Wie
in Tabelle XXIII gezeigt, zeigte eine 125I-hpG-CSF
Bindung an die WEHI-3B(D+)-Leukämiezellen. Die
Bindung wurde in dosisabhängiger
Weise durch unmarkierten und natürlichen
hpg-CSF oder rhpG-CSF, aber nicht durch GM-CSF gehemmt. Zusätzlich wurde
Bindung von natürlichem
hpG-CSF an menschliche myelomonozytische Leukämiezellen (ANLL, M4) beobachtet.
Die Bindung dieser Zellen ist vergleichbar mit der Reaktion gegenüber natürlichem
hpG-CSF in flüssigen
Kulturen durch Differentiation in reife Makrophagen, beurteilt durch
Morphologie. Die Abwesenheit einer Bindung von natürlichem 125I-hpG-CSF an monozytische Leukämiezellen
von einem anderen Patienten (ANLL, M5B) legt nahe, daß gewisse
Leukämien
Rezeptoren für
hpG-CSF unterschiedlich exprimieren oder diese ganz fehlen. Die
Fähigkeit
von rhpG-CSF, um die Bindung von natürlichem 125I-hpG-CSF
zu konkurrieren, ähnlich
zu natürlichem
hpG-CSF, legt nahe, daß die
Rezeptoren beide Formen gleich gut erkennen.
-
Diese
Studien, die die Bindung von natürlichem 125I-markiertem hpG-CSF an Leukämiezellen
bestätigen,
sind in Kultur vergleichbar mit der Fähigkeit von natürlichem
hpG-CSF, granulozytische und monozytische Differentiation von Knochenmarkszellen
von geringer Dichte zu induzieren, die von einem Patienten mit einer akuten
promyetozytischen Leukämie
(M3) und einem zweiten Patienten mit einer akuten myeloblastischen Leukämie (M2)
erhalten wurden. Zellen von jedem Patienten wurden für 4 Tage
im Medium allein oder in Gegenwart von 1 × 105 Einheiten
rhpG-CSF kultiviert. Zellen aus den M3-Kontrollkulturen, die im
Medium allein inkubiert worden waren, waren von der Art her immer
noch promyelozytisch; während
Zellen, die in Gegenwart von rhpG-CSF kultiviert worden waren, reife
Zellen des Myeloidtyps zeigten, einschließlich einem Metamyelozyten,
Riesenbandform und segmentierte Neutrophile und Monozyten. Die tatsächlichen
Unterschiede für
diesen Patienten, auf 100 für
die Kontrolle bewerteten Zellen, 100% Promyelozyten, und für die rhpG-CSF
behandelten Zellen, 22% Blasten plus Promyelozyten, 7% Myelozyten,
35% Metamyelozyten, 20% Bandformen plus segmentierte Neutrophilen,
14% Monozyten und 2% Makrophagen. Bemerkenswert ist die Tatsache,
daß einer der
polymorphonuklearen Granulozyten immer noch ein hervorstechendes
Auer-Stäbchen
enthielt, was nahelegte, daß zumindest
diese Zelle eine differenzierte Zelle repräsentierte, die zum Leukämieklon
gehörte.
Zellen aus dem zweiten Patienten mit einer myeloblastischen Leukämie (M2)
wurden ebenfalls für
4 Tage in Gegenwart oder Abwesenheit von rhpG-CFS kultiviert. Visuelle
Analyse von M2-Zellen, kultiviert in Medium allein, erbrachte große "blastenähnliche" Zellen, von denen
einige Nukleoli besaßen.
Einige der M2-Zellen differenzierten sich nach Behandlung mit rhpG-CSF
zu reifen segmen tierten Neutrophilen, die die restlichen Auer-Stäbchen im
Zentrum neutrophil zeigten, was nahelegte, daß die Differentiation in einer
Zelle, die zum Leukämieklon
gehörte,
aufgetreten war. Die tatsächliche
Differenzierung von 100 morphologisch bewerteten Zellen ergab, daß die Kontrollzellen
aus 100% Blasten bestanden. Die rhpG-CSF behandelten Zellen bestanden aus
43% Blasten, 1% Myelozyten, 15% Metamyelozyten, 28% Bandformen plus
segmentierte Neutrophile, 2% Promonozyten und 11% Monozyten. Die
Leukämiezellen
wurden auch bei anderen Konzentrationen von rhpG-CSF (5 × 103, 1 × 104, 2,5 × 104 und 5 × 104 U/ml, Daten nicht gezeigt) auf Differentiation
untersucht. Selbst bei der niedrigsten getesteten Konzentration
von rhpG-CSF (5 × 103 U/ml) gab es signifikante Differentiation (über Myelozyten
hinaus differenzierte Zellen) der M3-(50%) und M2-Leukämiezellen
(37%).
-
6. Immunologischer Test
-
Um
polyklonale Antikörper
für die
Zwecke eines immunologischen Tests herzustellen, war das verwendete
Antigen pluripotenter G-CSF, gereinigt aus der menschlichen Harnblasenkarzinomzelllinie
5637 (1A6), hergestellt wie in Beispiel 1(B). Dieses Material wurde
auf der Grundlage von Silbernitrotanfärbung von Polyacrylamidgelen
als 85% rein beurteilt. Sechs Wochen alte Balb/C-Mäuse wurden
mit subkutanen Injektionen von Antigenen an verschiedenen Stellen
immunisiert. Das Antigen wurde in PBS erneut suspendiert und mit gleichen
Volumenteilen von Freunds-Komplettadjuvans emulgiert. Die Dosis
war 5–7 μg Antigen
pro Maus pro Injektion. Eine Booster-Immunisierung wurde 18 Tage
später
verabreicht mit derselben Menge Antigen, das mit einem gleichen
Volumen Freundschem unvollständigem
Adjuvant emulgiert war. Vier Tage später wurde Mäuseserum entnommen, um auf
den für
menschlichen pluripotenten G-CSF spezifischen Antikörper zu
testen.
-
Dynatech
Immulon II Removawell-Streifen in Haltern (Dynatech Lab., Inc.,
Alexandria, Virginia) wurden mit hpG-CSF 5 μg/ml in 50 mM Carbonat-Bicarbonat-Puffer,
pH 9,2 beschichtet. Näpfe
wurden mit 0,25 μg
in einem Volumen von 50 μl
beschichtet. Antigen-beschichtete Platten wurden zwei Stunden bei
Zimmertemperatur inkubiert und über
Nacht bei 4°C.
Die Lösung
wurde dekantiert, und die Platten wurden 30 Minuten mit PBS inkubiert,
das 5% BSA enthielt, um die reaktive Oberfläche zu blockieren. Diese Lösung wurde
dekantiert, und die verdünnten
Prä-Immun-
oder Test-Seren wurden den Näpfen
zugegeben und für
zwei Stunden bei Zimmertemperatur inkubiert. Seren wurden mit PBS,
pH 7,0 verdünnt,
das 1% BSA enthielt. Die Serum-Lösung
wurde dekantiert, und die Platten wurden dreimal gewa schen mit Wash
Solution (KPL, Gaithersburg, Maryland). Annähernd 200,000 cpm jodiertem
Kaninchen-Anti-Mäuse-IgG
(NEN, Boston, Massachusetts) in 50 μl PBS, pH 7,0, die 1 BSA enthielt,
wurden jedem Napf zugegeben. Nach Inkubation für 1-½ Stunden bei Zimmertemperatur
wurde die Lösung
dekantiert, und die Platten wurden fünfmal mit Wash Solution gewaschen. Die
Näpfe wurden
aus dem Halter entfernt und in einem Beckman-5500-Gamma-Zähler gezählt. Hochgetiterte Mäuseseren
zeigten mehr als zwölfmal
höhere
Reaktivität
als die entsprechenden Prä-Immunseren
bei einer Verdünnung
von 1:100.
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Die
immunologischen Eigenschaften von aus E. coli abgeleitetem hpG-CSF
wurden durch Reaktivität gegenüber hochgetitertem
Mäuseserum
bestimmt, das gegenüber
aus Säugetierzellen
abgeleitetem hpG-CSF spezifisch war. 0,25 μg 90% reines, aus E. coli abgeleitetes
Protein wurde auf Immulon II Removawells in einem Volumen von 50 μl beschichtet,
und Mäuseserum
wurde wie oben beschrieben getestet.
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Hochgetiterte
Mäuseseren
zeigten 24mal höhere
Reaktivität
gegenüber
dem von E. coli abgeleiteten Material als dies die entsprechenden
Prä-Immunseren
bei einer Verdünnung
von 1:100 taten.
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7. Serinanaloga-Biotests
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[Ser17]hpG-CSF-, [Ser36]hpG-CSF-,
[Ser42]hpG-CSF-, [Ser64]hpG-CSF-
und [Ser74]hpG-CSF-Produkte, hergestellt gemäß Beispiel
9, wurden auf hpG-CSF-Aktivität
in den 3H-Thymidin-Aufnahme-, CFU-GM- und WEHI 3B D+-Tests getestet. In jedem Test besaß das [Ser17]-Analogon
eine Aktivität,
die vergleichbar mit derjenigen war, die rekombinanten Moleküle mit der
ursprünglichen
Struktur besitzen. Die restlichen Analoga besaßen größenordnungsmäßig 100mal
niedrigere Aktivität
im 3H-Thymidin-Aufnahme-Test, 250mal niedrigere Aktivität im CFU-GM-Test
und 500mal niedrigere Aktivität
im WEHI-3B D+-Test. Diese Daten unterstützen die Vermutung,
daß Cysteine
an den Positionen 36, 42, 64 und 74 wahrscheinlich für vollständige biologische
Aktivität
erforderlich sind.
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8. In-vivo-Biotest
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Alzet®-Osmosepumpen
(Alzet Corp., Palo Alto, CA; Model 2001) wurden mit Verweilkathetern
in der rechten Drosselvene verbunden und subkutan in sieben männliche
syrische Gold hamster implantiert. Vier der Pumpen enthielten einen
Puffer [20 mM Natriumacetat (pH 5,4) und 37 mM Natriumchlorid] und
1,5 mg/ml von E. coli abgeleiteten hpG-CSF, während drei Puffer allein enthielten.
Die geforderte Pumprate für
die Osmosepumpen betrug 1 Mikroliter/h für bis zu 7 Tage. Am dritten
Tag nach Implantation der Pumpen war die mittlere Granulozytenzählung der
vier behandelten Hamster 6mal höher
als diejenige der drei (Puffer-)Kontrollen und die erhöhte Granulozytenzählung wurde
wiedergespiegelt in einem vierfachen Anstieg bei den Gesamt-Lymphozyten.
Die Erythrozytenzählung
war durch Behandlung unverändert.
Diese Ergebnisse zeigten, daß das rekombinante
Material eine spezifische Produktionserhöhung und/oder Granulozytenfreisetzung
in einem Säugetier
erzeugt.
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Die
vorliegende Erfindung umfaßt
hpG-CSF-Produkte, wie etwa Polypeptidanaloga von hpG-CSF und Fragmente
von hpG-CSF. Unter Befolgung der Verfahren der oben angegebenen
veröffentlichten
Anmeldung von Alton et al. (WO/83/04053) kann man ohne weiteres
Gene konstruieren und künstlich
herstellen, die für mikrobielle
Expression von Polypeptiden kodieren, die Primärkonformationen besitzen, die
sich von den hier spezifizierten hinsichtlich der Identität oder des
Ortes eines oder mehrerer Reste unterscheiden (z.B. Substitutionen,
terminale und intermediäre
Additionen und Deletionen). Alternativ können Modifikationen von cDNA und
genomischen Genen ohne weiteres durch wohlbekannte ortsgerichtete
Mutagenesetechniken fertiggestellt und dazu verwendet werden, Analoga
und Derivate zu erzeugen. Solche Produkte würden zumindest eine der biologischen
Eigenschaften von hpG-CSF teilen, aber sich in anderen unterscheiden
können.
Als Beispiele schließen
geplante Produkte der Erfindung solche ein, die durch z.B. Deletionen
verkürzt
sind; oder solche, die stabiler gegenüber Hydrolyse sind (und daher
ausgeprägtere
oder länger
andauernde Effekte besitzen als natürlich auftretende); oder die
so geändert
worden sind, daß eine
oder mehrere potentielle Stellen für O-Glykolisierung entfernt
worden sind (was zu höheren
Aktivitäten
für in
Hefe produzierten Produkten führen
kann); oder die einen oder mehrere Cysteinreste weggelassen oder
durch z.B. Alanin- oder Serinreste ersetzt aufweisen und potentiell
leichter aus mikrobiellen Systemen in aktiver Form isoliert werden;
oder die einen oder mehrere Tyrosinreste durch Phenylalanin ersetzt
aufweisen und sich mehr oder weniger leicht an hpG-CSF-Rezeptoren auf Zielzellen
binden können.
Ebenfalls umfaßt
sind Polypeptidfragmente, die nur einen Teil der kontinuierlichen
Aminosäuresequenz
duplizieren, oder Sekundärkonformationen
innerhalb von hpG-CSF, wobei diese Fragmente eine Aktivität (z.B.
Rezeptorbindung) besitzen können
und andere nicht (z.B. koloniewachstumserregende Aktivität). Es ist
bemerkenswert, daß Aktivität für irgendeines
oder mehrere der Produkte der Erfindung nicht not wendig ist, um
therapeutische Nützlichkeit
[siehe Weiland et al., Blut, 44, 173–175 (1982)] oder Nützlichkeit
in anderen Zusammenhängen
zu besitzen, wie etwa in Tests des hpG-CSF-Antagonismus. Konkurrierende Antagonisten
können
sehr wohl nützlich
in z.B. Fällen
von Überproduktion
von hpG-CSF sein.
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Die
hier beschriebene DNA-Sequenz, die hpG-CSF-Polypeptide kodiert,
ist für
die Information wertvoll, die sie im Hinblick auf die Aminosäuresequenz
des Säugetierproteins
zur Verfügung
stellt, die bisher trotz analytischer Verarbeitung von Isolaten
von natürlich
auftretenden Produkten unzugänglich
gewesen ist. Die DNA-Sequenzen sind auch auffallend wertvoll als
Produkte, die bei der Durchführung
der mikrobiellen Synthese von hpG-CSF durch eine Vielzahl rekombinanter
Techniken nützlich
sind. Anders gesagt, sind durch die Erfindung zur Verfügung gestellte
DNA-Sequenzen dabei nützlich,
neue und nützliche
virale und zirkuläre
Plasmid-DNA-Vektoren, neue und nützliche
transformierte und transfizierte mikrobielle prokaryontische und
eukaryontische Wirtszellen (einschließlich bakterieller und Hefezellen
und in Kultur gezüchteter
Säugetierzellen) und
neue und nützliche
Verfahren für
das kultivierte Wachstum solcher mikrobiellen Wirtszellen, die zur
Expression von hpG-CSF und seiner verwandten Produkte in der Lage
sind, zu erzeugen. DNA-Sequenzen der Erfindung sind auch auffallend
geeignete Materialien zur Verwendung als markierte Sonden bei der
Isolierung von hpG-CSF und verwandtes Protein kodierender menschlicher
genomischer DNA, sowie von cDNA und genomischen DNA-Sequenzen anderer
Säugetierspezies.
Die DNA-Sequenzen können
auch bei verschiedenen alternativen Verfahren der Proteinsynthese
(z.B. in Insektenzellen) oder bei der genetischen Therapie von Menschen
und anderen Säugetieren
nützlich
sein. Man erwartet, daß die
DNA-Sequenzen der Erfindung nützlich
bei der Entwicklung transgener Säugetierspezies
sind, die als eukaryontische "Wirte" für die Herstellung von
hpG-CSF und hpg-CSF-Produkte
in Mengen dienen können.
Siehe im allgemeinen, Palmiter, et al., Science, 222(4625), 809–814 (1983).
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Anwendbar
auf hpg-CSF-Fragmente und Polypeptidanaloga sind Berichte über die
immunologische Aktivität
von synthetischen Peptiden, die im wesentlichen die in natürlich auftretenden
Proteinen, Glykoproteinen und Nukleoproteinen auftretende Aminosäuresequenz
duplizieren. Genauer gesagt, hat es sich gezeigt, daß Polypeptide
mit relativ niedrigem Molekulargewicht an Immunreaktionen teilnehmen,
die in Dauer und Ausmaß den
Immunreaktionen physiologisch signifikanter Proteine wie etwa viraler
Antigene, Polypeptidhormone und dergleichen, ähnlich sind. Eingeschlossen
in die Immunreaktion solcher Peptide ist die Provoka tion der Bildung
spezifischer Antikörper
in immunologisch aktiven Tieren. Siehe z.B. Lerner et al., Cell,
23, 309–310 (1981);
Ross et al., Nature, 294, 654–656
(1981); Walter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 77, 5197–5200 (1980);
Lerner et al., Proc Natl. Acad. Sci. (USA), 78, 3403–3407 (1981);
Walter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 78, 4882–4886 (1981);
Wong et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 78, 7412–7416 (1981);
Green et al., Cell, 28, 477–487
(1982); Nigg et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 79, 5322–5326 (1982);
Baron et al., Cell, 28, 395–404
(1982); Dreesman et al., Nature, 295, 185–160 (1982); und Lerner Scientific
American, 248, No. 2, 66–74
(1983). Siehe auch Kaiser et al., Science, 223, 249–255 (1984),
betreffend biologische und immunologische Aktivitäten synthetischer
Peptide, die annähernd
die Sekundärstrukturen
von Peptidhormonen teilen, aber nicht deren Primärstrukturkonformation teilen
müssen.