DE3733986A1 - Means and process for manufacturing biosensors on the basis of an oscillating quartz crystal, and use thereof for determining antigens and affinity ligands - Google Patents

Means and process for manufacturing biosensors on the basis of an oscillating quartz crystal, and use thereof for determining antigens and affinity ligands

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Abstract

Means and process for applying a thin plastic film onto a piezoelectric oscillating quartz crystal by means of a polymer insoluble in an aqueous medium are described. Coating is effected either from an organic solution or with the aid of a vinyl monomer plasma. Owing to the polymer coating, antibodies or biomolecules can be bound either adsorptively or covalently. These immobilised biomolecules can then bind antigens or ligands; the resulting increase in mass of the oscillating quartz crystal can be measured quantitatively in the ng range on the basis of the change in oscillation frequency. Immunoassays and the determination of ligands for affinity chromatography are thus made possible.

Description

Ende der 50er Jahre wurde erstmals die Verwendung eines Radio­ immunoassays durch Yalow und Berson beschrieben. Das Prinzip des Immunassays besteht in der spezifischen Erkennung eines Antigens in einem Substanzgemisch durch einen entsprechenden Antikörper (Ak). Bei dem zu Anfang entwickelten Radioimmuno­ assay (RIA) wurden Ak mit radioaktiv markierten Antigenen (Ag) und Proben-Ag zusammen inkubiert, wobei Proben-Ag und markiertes Ag um die freien Stellen am Ak konkurrieren (kompetitiver Test). Nach Erreichen des Gleichgewichtes wird der Ak-Ag Komplex von dem noch übriggebliebenen Ag abgetrennt; die im Ag-Ak Komplex danach gemessene Radioaktivität ist ein Maß für die Menge des vorhandenen Proben-Ag und kann sehr genau (bis zu 10-14 Mol/l) mittels Eichkurven ermittelt werden.The use of a radio immunoassay by Yalow and Berson was first described in the late 1950s. The principle of the immunoassay consists in the specific recognition of an antigen in a mixture of substances by means of an appropriate antibody (Ak). In the initially developed radioimmunoassay (RIA), Ak was incubated together with radioactively labeled antigens (Ag) and sample Ag, with sample Ag and labeled Ag competing for the vacant sites on the Ak (competitive test). After reaching equilibrium, the Ak-Ag complex is separated from the remaining Ag; The radioactivity measured afterwards in the Ag-Ak complex is a measure of the amount of sample Ag present and can be determined very precisely (up to 10 -14 mol / l) using calibration curves.

Die Abtrennung des Ak-Ag-Komplexes wird in der Praxis durch Ver­ wendung von Plastikröhrchen (tubes) oder Beads vorgenommen, wobei der Ak vor dem eigentlichen Test auf der Plastikoberfläche des Tubes oder Beads adsorptiv oder chemisch gebunden wird (coated-tube-Technik). Anschließend werden dann markiertes Ag und Proben-Ag entweder gleichzeitig oder nacheinander in dem Tube inkubiert. Nach der Inkubation werden die überschüssigen Ag-Lösungen von dem Plastikträger abgesaugt, der Ak-Ag Komplex bleibt dabei auf der Plastikoberfläche haften. Diese Technik des coated-Tubes oder Beads hat sich heutzutage in der Praxis durchgesetzt. Für Routinetests werden weltweit Systeme angeboten, die die Inkubation und anschließende Messung der Radioaktivi­ tät vollautomatisch durchführen. Gemessen werden beim RIA vor­ zugsweise Gamma-Strahlen des Jod-Isotops 125, mit dem die Ag markiert werden.The separation of the Ak-Ag complex is in practice by Ver made of plastic tubes or beads, the Ak before the actual test on the plastic surface of the tube or beads is adsorptively or chemically bound (coated tube technique). Then marked Ag and sample Ag either simultaneously or sequentially in the Incubated tube. After the incubation, the excess Ag solutions extracted from the plastic carrier, the Ak-Ag complex sticks to the plastic surface. This technique The coated tube or beads has come into practice these days enforced. Systems are offered worldwide for routine tests,  the incubation and subsequent measurement of the radioactive Carry out the operation fully automatically. Measurements are taken at the RIA preferably gamma rays of the iodine isotope 125, with which the Ag be marked.

Als Plastikmaterial für die Tubes oder Beads wird vornehmlich Polystyrol, Polyäthylen oder Polycarbonat verwendet. Der Herstellungsprozeß der Plastikmaterialien bedarf eines großen technischen Aufwandes, da die Oberflächenbeschaffenheit der Kunststoffe von Charge zu Charge immer gleichbleibend homo­ gen sein muß. Diese Voraussetzungen für einen praktikablen Immun­ assay sind jedoch angesichts der verschiedenen Einflüsse beim Extrudieren der Plastikmaterialien (Temperatur, Viskosität, Schmelzbedingungen, Abkühlbedingungen etc.) nur schwer zu ge­ währleisten.It is mainly used as a plastic material for the tubes or beads Polystyrene, polyethylene or polycarbonate is used. The manufacturing process of plastic materials needs one great technical effort, since the surface quality of plastics from batch to batch always homo constant must be sufficient. These requirements for a practicable immune system However, given the different influences, assay are Extrusion of plastic materials (temperature, viscosity, Melting conditions, cooling conditions etc.) difficult to achieve ensure.

Ein weiterer wichtiger Punkt für die Praxis ist die Haftung des Ak auf der Kunststoffoberfläche. Für kommerzielle coated-Tubes oder Beads wird heute ausschließlich die physikalische Adsorp­ tion herangezogen; der Ak haftet dabei an der Plastikoberfläche durch reine hydrophobe Wechselwirkungskräfte. Diese Inkubations­ technik hat zunächst verfahrenstechnische Vorteile insofern, als gängige und billige Kunststoffe wie Polystyrol, Polyäthylen etc. verwendet werden können, zudem ist das Inkubationsverfahren recht simpel, da die Ak-Lösung lediglich für eine ausreichende Zeitdauer mit dem Plastik in Kontakt bleiben muß ohne irgend­ welche zusätzlichen chemischen oder physikalischen Manipulationen. Nach der Inkubation wird die überstehende Ak-Lösung einfach ab­ gesaugt.Another important point in practice is the liability of the Ak on the plastic surface. For commercial coated tubes or beads today becomes exclusively the physical adsorp tion used; the Ak adheres to the plastic surface through pure hydrophobic interaction forces. This incubation technology initially has procedural advantages in that common and cheap plastics such as polystyrene, polyethylene etc. can also be used, the incubation process quite simple, since the Ak solution is only sufficient Time must remain in contact with the plastic without any what additional chemical or physical manipulations. After the incubation, the excess Ak solution is simply removed sucked.

Vom analytischen und biochemischen Standpunkt jedoch hat diese Art der physikalischen Adsorption auf hydrophoben Oberflächen den Nachteil, daß diese Oberflächen auch starke Adsorptivwirkung auf alle anderen Begleitproteine, die in der Probenlösung vor­ handen sind, haben. Da es sich bei den meisten Ag um Proteine handelt, kommt es somit ungewollt bei der Verwendung der hydro­ phoben Plastikmaterialien zu unspezifischen Adsorptionen, die die Testergebnisse erheblich stören können. Man verfährt daher in praxi so, daß nach der Ak-Ag Bildung desorbierend wirkende Detergenzien (Tween 20 z. B.) zugegeben werden, um unspezifisch gebundene Ag zu desorbieren oder man blockiert nach der Inkuba­ tion des Ak die noch vorhandenen freien Adsorptionsstellen auf dem Kunststoff mit einem inerten Protein (z. B. Serum Albumin). Ein weiterer nachteiliger Aspekt der physikalischen Adsorption auf hydrophoben Oberflächen ist die relativ geringe Bindungs­ kapazität. Man hat verschiedentlich versucht, diesem Manko durch eine chemische Kupplung entgegenzuwirken, indem man bei­ spielsweise Ak an Carboxylgruppen-haltige Copolymere chemisch gekoppelt hat. Diese Verfahren, die zwar sehr viel stabilere Bindungen zwischen Träger und Ak ermöglichen, sind jedoch für die Praxis zu aufwendig, da hierfür die teilweise komplizierten Kupplungstechniken, wie sie aus der Peptidchemie bekannt sind, benutzt wurden. Auch chemische Bindungen über Glutaraldehyde haben sich nicht in der Praxis durchsetzen können.From an analytical and biochemical point of view, however, this has Type of physical adsorption on hydrophobic surfaces the disadvantage that these surfaces also strong adsorptive on all other accompanying proteins present in the sample solution are available. Since most Ag is protein acts, it happens unintentionally when using the hydro phobic plastic materials to unspecific adsorptions that can significantly disrupt the test results. So you proceed in practice so that after the Ak-Ag formation it has a desorbing effect  Detergents (Tween 20 for example) are added to be non-specific to desorb bound Ag or one blocks after the Incuba tion of the Ak the remaining free adsorption sites the plastic with an inert protein (e.g. serum albumin). Another disadvantageous aspect of physical adsorption on hydrophobic surfaces is the relatively low bond capacity. This shortcoming has been tried several times to counteract by a chemical coupling by at for example, chemically on copolymers containing carboxyl groups has coupled. These procedures, although much more stable Allow bonds between carrier and Ak are, however, for the practice is too complex, because the sometimes complicated Coupling techniques as they are known from peptide chemistry, were used. Also chemical bonds via glutaraldehydes have not been able to assert themselves in practice.

Um den schwierigen und mit gesundheitstechnischen Auflagen be­ hafteten Umgang mit radioaktiven Substanzen zu umgehen, wurden Anfang der 70er Jahre in Weiterentwicklung der Immunassay-Technik Testsysteme entwickelt, die sich statt des radioaktiven labels eines Enzymes oder Fluorochromes als Marker bedienen und eine dem RIA vergleichbare Empfindlichkeit aufweisen.To the difficult and with health-technical requirements to deal with radioactive substances At the beginning of the 70s further development of the immunassay technique Test systems developed that are instead of radioactive labels use an enzyme or fluorochrome as a marker and one sensitivity comparable to that of the RIA.

Die Inkubations- und Trennverfahren bei diesen Enzymimmunoassays (EIA) sind analog den Verfahren bei der RIA Technik. Man nutzt lediglich nach der Inkubation des Ak entweder eine Farbreaktion zwischen dem an das Ag gekoppelte Enzym und einem entsprechenden Substrat aus (z. B. Peroxidase + Leukofarbstoff + H2O2 → Farbstoff + H2O), oder mißt die Fluoreszenz-Löschung oder Fluoreszenz-Polarisation eines mit dem Ag entsprechend gekoppel­ ten Fluoreszenz-Markers. Andere Nachweistechniken, die sich der Elektronen-Spin-Resonanz, Fluoreszenz-Verstärkung, Chemilumines­ zenz oder Puls-Polarographie bedienen, sind ebenfalls beschrie­ ben worden, haben jedoch keinerlei praktische Bedeutung erlangt. The incubation and separation procedures in these enzyme immunoassays (EIA) are analogous to the procedures in the RIA technique. Only after the incubation of the Ak one either uses a color reaction between the enzyme coupled to the Ag and a corresponding substrate (e.g. peroxidase + leuco dye + H 2 O 2 → dye + H 2 O), or measures the fluorescence quenching or fluorescence polarization of a fluorescence marker appropriately coupled to the Ag. Other detection techniques that use electron spin resonance, fluorescence amplification, chemiluminescence or pulse polarography have also been described, but have no practical significance.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind Mittel und Verfahren zur Bestimmung von Ag sowie die Ermittlung von Affinitätsliganden mit Hilfe eines Kunststoff-beschichteten Biosensors auf der Basis eines piezoelektrischen Quarzkristalles.The present invention relates to means and methods for the determination of Ag and the determination of affinity ligands with the help of a plastic-coated biosensor on the Base of a piezoelectric quartz crystal.

Aufgrund der Nachteile, die sich aus den herkömmlichen RIAs und EIAs bezüglich der aufwendigen Meßtechnik, der geringen Fixierkapazität der Kunststoffträger und der Probleme bei der unspezifischen Adsorption ergeben haben, wurde ein neues Ver­ fahren entwickelt, das diese Nachteile umgeht und darüber hinaus Markierungen der Ag mit Radiolabeln oder Enzymen nicht mehr er­ forderlich macht.Because of the drawbacks that come from traditional RIAs and EIAs regarding the complex measuring technology, the low Fixing capacity of the plastic carrier and the problems with unspecific adsorption, a new ver drive that evades these disadvantages and beyond The Ag labels with radio labels or enzymes no longer he makes demands.

Ein Schwingquarz dient hierbei als Detektionssystem. Schwing­ quarze weisen eine Eigenschwingung auf, die abhängig von der äußeren Geometrie des Kristalls, seiner Dichte und Dicke und somit also von seiner Masse ist. Wird nun auf diesen Schwing­ quarz ein Ak fixiert, der seinerseits mit einem Ag analog den Reaktionen bei den herkömmlichen Immunassays reagiert, so kommt es durch den gebildeten Ak-Ag Komplex zu einer Massenzunahme des gesamten Systems, die sich quantitativ durch eine Veränderung der Eigenschwingfrequenz zu niedrigeren Werten nachweisen und detektieren läßt. Bisherige Erfindungen dieser Art fixieren den Ak direkt auf die Kristalloberfläche mit den daraus resultieren­ den Nachteilen der geringen Adsorptivkapazität, der Gefahr des Ablösens des Biomoleküls sowie der unspezifischen Bindungen.A quartz crystal serves as a detection system. Swing crystals have a natural vibration, which depends on the outer geometry of the crystal, its density and thickness and is therefore of its mass. Now on this swing quartz fixes an Ak, which in turn is analogous to the Ag Reactions in conventional immunoassays react, so come it through the formed Ak-Ag complex to a mass increase of the whole system, which can be quantified by a change demonstrate the natural vibration frequency at lower values and can be detected. Previous inventions of this type fix the Ak directly on the crystal surface with the resultant the disadvantages of the low adsorptive capacity, the risk of Detachment of the biomolecule and the non-specific bonds.

Eine wesentlich bessere Haftung der Ak auf dem Quarzkristall wird nun dadurch erreicht, daß auf den Schwingquarz eine dünne (0,01-0,1 µm) Polymerschicht aufgebracht wird, die in der Lage ist, den Ak entweder adsorptiv oder kovalent zu binden.A much better adhesion of the Ak on the quartz crystal is now achieved in that a thin on the quartz crystal (0.01-0.1 µm) polymer layer is applied in the It is able to bind the Ak either adsorptively or covalently.

Für die adsorptive Bindung des Ak auf dem Schwingquarz können folgende Verfahren benutzt werden:For the adsorptive binding of the Ak on the quartz crystal the following procedures are used:

  • a) Ein in wäßrigen Lösungen unlösliches Polymer, z. B. Polystyrol, Polyäthylen, Polypropylen, Polymethylmethacrylat, Polyamid, Polyester, etc., wird in einem organischen Lösungsmittel (z. B. Benzol für Polystyrol, Dekalin für Polyäthylen, Trifluoressig­ säure für Polyester, Trifluoräthanol für Polyamid, THF für Poly­ methylmethacrylat) aufgelöst und die Lösung auf den Kristall aufgebracht. Anschließend wird das organische Lösungsmittel an der Luft und/oder im Vakuum abgedampft, so daß ein fester Polymerfilm auf der Quarzoberfläche entsteht. Durch Variation der Polymerkonzentration in der Lösung kann in einfacher Weise die Dicke der Polymerschicht den elektronischen Erfordernissen des Schwingquarzes angepaßt werden.
    Diese Polymerschicht eignet sich nun für die physikalische Adsorption des Ak analog der coated-tube-Technik bei den her­ kömmlichen Immunoassays. Um die Bindungskapazität der Quarz­ oberfläche zu erhöhen, kann vorzugsweise folgender Verfahrens­ schritt herangezogen werden: Nach dem Aufbringen der Kunststoff­ schicht auf den Kristall, wird dieser in eine vorteilhafterweise abgekühlte Lösung gebracht, die - in der Regel ein Nichtlöse­ mittel für das coating-Polymer - als Fällmitel für das Poly­ mere fungiert. Mit Hilfe dieser Manipulation ist es möglich, die Kristallisation des Polymeren auf der Quarzoberfläche zu verhindern - in jedem Fall bei den Polymeren, deren Glastempera­ tur oberhalb der Raumtemperatur liegt - und so zu einer amorphen Polymerschicht zu kommen, deren Bindungskapazität wesentlich höher liegt als bei einem teilkristallinen Material. So läßt sich z. B. eine in Trifluoräthanol aufgebrachte Polyamid-Schicht in einfacher Weise in einer Eiswasserlösung ausfällen. In ähnlicher Weise kann auch mit Polystyrol, das in z. B. Methanol ausgefällt werden kann, oder Polymethylmethacrylat, das in Äthanol ausgefällt werden kann, verfahren werden.    a) A polymer insoluble in aqueous solutions, e.g. B. polystyrene, polyethylene, polypropylene, polymethyl methacrylate, polyamide, polyester, etc., is dissolved in an organic solvent (e.g. benzene for polystyrene, decalin for polyethylene, trifluoroacetic acid for polyester, trifluoroethanol for polyamide, THF for poly methyl methacrylate) and applied the solution to the crystal. The organic solvent is then evaporated in air and / or in vacuo so that a solid polymer film is formed on the quartz surface. By varying the polymer concentration in the solution, the thickness of the polymer layer can be easily adapted to the electronic requirements of the quartz crystal.
    This polymer layer is now suitable for the physical adsorption of the Ak analogous to the coated tube technique in conventional immunoassays. In order to increase the binding capacity of the quartz surface, the following process step can preferably be used: after the plastic layer has been applied to the crystal, it is brought into an advantageously cooled solution which, as a rule, is a non-solvent for the coating polymer. acts as a precipitant for the polymer. With the help of this manipulation, it is possible to prevent the crystallization of the polymer on the quartz surface - in any case for the polymers whose glass temperature is above room temperature - and thus to obtain an amorphous polymer layer whose binding capacity is significantly higher than that of one semi-crystalline material. So z. B. a polyamide layer applied in trifluoroethane in a simple manner in an ice water solution. Similarly, polystyrene, which is used in e.g. B. methanol can be precipitated, or polymethyl methacrylate, which can be precipitated in ethanol.
  • b) Neben dem Coating-Verfahren, das ausschließlich für die Ad­ sorption geeignet ist, lassen sich auch solche Polymeren heran­ ziehen, die über eine funktionelle kupplungsfähige Seitengruppe verfügen, über die der Ak kovalent gebunden werden kann. Polymere solcher Art sind z. B. Polyglycidylmethacrylat, Poly­ glycidylacrylat, Polyacrolein sowie Copolymere aus diesen funktionellen Kunststoffen und solchen Polymeren, die für die reine Adsorption benutzt werden. Mit Hilfe der kupplungsfähi­ gen Seitengruppen - vorzugsweise werden Polymere mit Oxiran­ struktur, wie z. B. Polyglycidylmethacrylat, eingesetzt - kann die Bindung zu dem Ak durch einfache Inkubation bewerkstelligt werden. Zusätzliche Kupplungsreagenzien sind dabei nicht erforderlich. Der verfahrenstechnische Ablauf der Präpa­ ration des Immunoassays reduziert sich damit auf den Aufwand einer coated-tube Präparation. Die Beschichtung der Piezo­ kristalle geschieht in analoger Weise wie es unter Punkt a) be­ schrieben ist: Polymer oder Copolymer werden in einem geeig­ neten organischen Lösungsmittel gelöst und anschließend auf den Quarz aufgebracht. Glycidylacrylate lassen sich vorzugs­ weise aus einer Dioxanlösung aufbringen; das gleiche Lösungs­ mittel kann auch z. B. für ein Glycidylmethacrylat/Styrol-Co­ polymer verwendet werden. Die Kupplungsmechanismen des Ak an die beschichtete Kristalloberfläche laufen analog ab wie bei den bekannten Aktivierungsverfahren für die Affinitätschromatogra­ phie. Vorzugsweise wird demnach die Kupplung in einem neutralen bis schwach basischen Milieu bei mittlerer Ionenstärke des Kupplungspuffers vorgenommen.b) In addition to the coating process, which is exclusively for the Ad Sorption is suitable, such polymers can also be used pull that over a functional clutchable side group have, through which the Ab can be covalently bound. Polymers of this type are e.g. B. polyglycidyl methacrylate, poly glycidyl acrylate, polyacrolein and copolymers of these functional plastics and such polymers that are used for pure adsorption can be used. With the help of the clutch side groups - polymers with oxirane are preferred structure, such as B. polyglycidyl methacrylate used - can binds to the Ak by simple incubation  will. Additional coupling reagents are included not mandatory. The procedural process of the prep ration of the immunoassay is thus reduced to the effort a coated-tube preparation. The coating of the piezo crystals occurs in an analogous manner to that described in point a) is written: polymer or copolymer are suitable in one dissolved organic solvent and then on applied the quartz. Glycidyl acrylates can be preferred apply wisely from a dioxane solution; the same solution medium z. B. for a glycidyl methacrylate / styrene co polymer can be used. The clutch mechanisms of the Ak an the coated crystal surface is analogous to that of the known activation methods for affinity chromatography phie. Accordingly, the clutch is preferably in a neutral to weakly basic milieu with medium ionic strength of Coupling buffer made.
  • c) Durch Elektronenstöße im kalten Plasma von Glimm- und Corona- Enladungen können organische Substanzen umgewandelt werden. Diese Methode wird seit geraumer Zeit in der präparativen Chemie, z. B. für Isomerisierungs-, Eliminierungs-, Dimerisierungs, Fragmentierungsreaktionen etc. eingesetzt. Unter einem Plasma versteht man ein teilweise ionisiertes Gas.
    Für den vorliegenden Zweck wird ein Plasma aus Vinylmonomeren erzeugt, das sich auf dem Schwingquarz als dünne Polymerschicht niederschlägt. Dazu kann beispielsweise ein mit zwei Elektroden bestücktes Vakuumgefäß mit Gaseinleitungsvorrichtung benutzt werden, das von einer Gleichspannungsquelle oder einem nieder­ frequenten Wechselstrom gespeist wird. Je nach Stromstärke kommt es zu einer selbstständigen Elektronenerzeugung, oder man ver­ wendet zusätzliche Anregungsquellen in Form von UV oder anderen Strahlen. Andere Formen der Plasmaerzeugung lassen sich durch eine außen am Reaktorgefäß angebrachte Induktionsspule, die von einem Hochfrequenzgenerator gespeist wird, realisieren.
    Für die Beschichtung der Kristalle kommen grundsätzlich sämtliche verdampfbaren Vinylmonomeren wie z. B. N-Vinylpyrrolidon, Hydroxy­ äthylmethacrylat, Vinylacetat, Methylmethacrylat, Acrylsäure, Styrol, Glycidylmethacrylat in Frage. Vorteilhaft können auch Vinylmonomermischungen verwendet werden, so daß eine Copolymer­ beschichtung bestehend aus einer hydrophilen Inertkomponente (z. B. Vinylpyrrolidon) und einem kupplungsfähigen Monomeren (z. B. Glycidylacrylat) gebildet wird. Durch diese Auswahl von funktionellen und hydrophilen Monomeren lassen sich über­ raschenderweise hohe Kapazitäten - bedingt durch die chemische Bindung - und geringe unspezifische Adsorptiveigenschaften kombinieren.
    Die Beschichtungsbedingungen lassen sich in breitem Rahmen durch Variation des Druckes, der Elektronenenergie, der Mono­ merkonzentration und der Verweilzeit beeinflussen und so für die Anwendung im Bereich des Immunassays optimieren.    c) Organic substances can be converted by electron collisions in the cold plasma of glow and corona discharges. This method has been used for some time in preparative chemistry, e.g. B. for isomerization, elimination, dimerization, fragmentation reactions etc. used. A plasma is a partially ionized gas.
    For the present purpose, a plasma is generated from vinyl monomers, which is deposited on the quartz crystal as a thin polymer layer. For this purpose, for example, a vacuum vessel fitted with two electrodes and having a gas introduction device can be used, which is fed by a direct voltage source or a low-frequency alternating current. Depending on the current intensity, there is an independent generation of electrons, or additional excitation sources in the form of UV or other rays are used. Other forms of plasma generation can be realized by an induction coil attached to the outside of the reactor vessel, which is fed by a high-frequency generator.
    In principle, all vaporizable vinyl monomers such as e.g. B. N-vinyl pyrrolidone, hydroxy ethyl methacrylate, vinyl acetate, methyl methacrylate, acrylic acid, styrene, glycidyl methacrylate in question. Vinyl monomer mixtures can also advantageously be used, so that a copolymer coating consisting of a hydrophilic inert component (e.g. vinyl pyrrolidone) and a couplable monomer (e.g. glycidyl acrylate) is formed. This selection of functional and hydrophilic monomers allows surprisingly high capacities - due to the chemical bond - and low non-specific adsorptive properties to be combined.
    The coating conditions can be influenced in a wide range by varying the pressure, the electron energy, the monomer concentration and the residence time and thus optimized for use in the field of immunoassays.
  • c) Analog Verfahren a) läßt sich die coating-Prozedur ebenfalls mit Isocyanat-haltigen Präpolymeren durchführen.
    Vorteilhaft werden dabei Diole oder Diamine mit Di- oder Tri­ isocyanaten umgesetzt. Als Polyhydroxyverbindungen eignen sich gesättigte und ungesättigte Glykole wie beispielsweise Buten­ diol; als Diisocyanate kommen z. B. Toluylen-2,4-diisocyanat, Hexamethylendiisocyanat, Phenylen-1,4-diisocyanat in Frage. Die Polyaddition wird dabei so gesteuert, daß ein ausreichender Restanteil von Isocyanatgruppen verbleibt. Dies wird dadurch erreicht, daß pro Hydroxy- oder Amingruppe ein Mol Diisocyanat eingesetzt wird. Über diese verbleibende Isocyanatgruppe wird nach dem Beschichten des Quarzes die kovalente Bindung zu dem Ak herbeigeführt.
    Zur Beschleunigung der Polyaddition können die bekannten basi­ schen Katalysatoren (z. B. Triethylendiamin) oder Metall­ katalysatoren (z. B. Zinn-octoat), wie sie allgemein für die Urethanbildung benutzt werden, herangezogen werden.    c) Analogous to process a), the coating procedure can also be carried out with prepolymers containing isocyanate.
    Diols or diamines are advantageously reacted with di- or tri-isocyanates. Suitable polyhydroxy compounds are saturated and unsaturated glycols such as butene diol; come as diisocyanates such. B. tolylene-2,4-diisocyanate, hexamethylene diisocyanate, phenylene-1,4-diisocyanate in question. The polyaddition is controlled so that a sufficient residual proportion of isocyanate groups remains. This is achieved by using one mole of diisocyanate per hydroxyl or amine group. The covalent bond to the Ak is established via this remaining isocyanate group after coating the quartz.
    The known basic catalysts (e.g. triethylenediamine) or metal catalysts (e.g. tin octoate), as are generally used for urethane formation, can be used to accelerate the polyaddition.

Über den Immunassay hinaus läßt sich die Messung der Frequenz­ änderung des Schwingquarzes auch vorteilhaft für die Bestimmung von Liganden für die Affinitätschromatographie nutzen. Die Probenpräparation ist dabei identisch mit der für den Immun­ assay.
Anstelle des Ak wird jetzt ein Biomolekül (z. B. Enzym, Hormon, Blutfaktor etc.) auf den Quarz aufgebracht, der sodann mit verschiedenen Liganden (z. B. Aminosäuren, Peptiden, Cofaktoren, Hormonen, Inhibitoren, Oligonucleotiden etc.) in Kontakt ge­ bracht wird. Der Ligand, der eine besonders deutliche Frequenz­ erniedrigung hervorruft, hat entsprechend ein hohe Affinität zu dem fixierten Biomolekül und kann daher vorteilhaft als Ligand für die affinitätschromatographische Trennung dieses be­ treffenden Biomoleküls herangezogen werden. Man ist dadurch in die Lage versetzt, in einfacher und schneller Weise und da­ rüber hinaus sehr präzise Aussagen über die Spezifität eines Affinitätsliganden zu machen. Die Anwendung der Affinitätschro­ matographie wird damit sehr erleichtert.In addition to the immunoassay, the measurement of the frequency change of the quartz crystal can also be used advantageously for the determination of ligands for affinity chromatography. The sample preparation is identical to that for the immunoassay.
Instead of the Ak, a biomolecule (e.g. enzyme, hormone, blood factor, etc.) is now applied to the quartz, which then contains various ligands (e.g. amino acids, peptides, cofactors, hormones, inhibitors, oligonucleotides, etc.) Contact is made. The ligand, which causes a particularly marked reduction in frequency, accordingly has a high affinity for the fixed biomolecule and can therefore advantageously be used as a ligand for the affinity-chromatographic separation of this biomolecule. This enables you to make very precise statements about the specificity of an affinity ligand in a simple and quick manner and moreover. The use of affinity chromatography is very much easier.

Beispiel 1example 1

50 mg Polyamid-6, M w : ca. 25 000, werden in 25 ml Trifluoräthanol bei Raumtemperatur gelöst. Der Schwingquarz wird in diese Lösung für einige Sekunden eingetaucht und anschließend an der Luft getrocknet; die weitere Endtrocknung erfolgt im Exsikkator unter Wasserstrahlpumpenvakuum über KOH für eine Stunde. Zum getrockneten Quarz wird nach den bekannten Verfahren der coated-tube-Technik 250 µm einer anti-Thyroxin-IgG Aus­ gangslösung (4 µg/100 ml 0,05 M PBS-Puffer, pH 7,5) gege­ ben. Es wird 15 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Danach wird der Kristall 4mal mit PBS-Puffer gewaschen und im Vakuum getrocknet.
Die Frequenz des beschichteten und mit Ak inkubierten Quarzes beträgt 9,99 323 MHz.
Sodann wird der Kristall mit einer Thyroxinlösung (30 µg/100 ml PBS-Puffer) zwei Stunden inkubiert, gewaschen und im Vakuum ge­ trocknet. 50 mg polyamide-6, M w : approx. 25,000, are dissolved in 25 ml trifluoroethanol at room temperature. The quartz crystal is immersed in this solution for a few seconds and then air-dried; the further final drying takes place in the desiccator under water jet pump vacuum over KOH for one hour. 250 µm of an anti-thyroxine IgG starting solution (4 µg / 100 ml 0.05 M PBS buffer, pH 7.5) are added to the dried quartz using the known methods of the coated tube technique. It is incubated for 15 hours at room temperature. The crystal is then washed 4 times with PBS buffer and dried in vacuo.
The frequency of the coated and Ak incubated quartz is 9.99 323 MHz.
The crystal is then incubated with a thyroxine solution (30 μg / 100 ml PBS buffer) for two hours, washed and dried in vacuo.

Die gemessene Frequenzänderung beträgt danach 455 Hz; dies ent­ spricht einer Massenzunahme von 5,17 · 10-12 g Thyroxin.The measured frequency change is then 455 Hz; this corresponds to a mass increase of 5.17 · 10 -12 g thyroxine.

Beispiel 2Example 2

50 mg eines Copolymerisates bestehend aus 40 Teilen Glycidyl­ methacrylat und 20 Teilen Styrol werden in 30 ml Dioxan gelöst und anschließend auf den Quarzkristall analog Beispiel 1 auf­ gebracht. Nach dem Trocknen im Vakuum erfolgt das coaten mit dem Ak emäß Beispiel 1; die Prozedur des Immunassays erfolgt wie in Beispiel 1 beschrieben.
Die gemessene Frequenzänderung beträgt bei diesem Versuch 490 Hz, was einem Massenzuwachs von 5,58 · 10-12 g Thyroxin entspricht.50 mg of a copolymer consisting of 40 parts of glycidyl methacrylate and 20 parts of styrene are dissolved in 30 ml of dioxane and then applied to the quartz crystal as in Example 1. After drying in vacuo, coating is carried out with the Ak according to Example 1; the immunoassay procedure is as described in Example 1.
The measured frequency change in this experiment is 490 Hz, which corresponds to a mass increase of 5.58 · 10 -12 g thyroxine.

Beispiel 3Example 3

In 34,8 g Toluylen-2,4-diisocyanat werden bei 85°C unter gutem Rühren 8,8 g Buten-(2)-diol-(1,4) tropfenweise eingetragen; die Temperatur steigt dabei auf ca. 100°C an. Die Reaktion wird durch weiteres 1-2stündiges Erhitzen auf 100-110°C zu Ende geführt. Das so entstehende Harz mit einem Restgehalt Isocyanat­ gruppen wird nun im Vakuum getrocknet.
40 mg dieses Polymeren werden anschließend in 30 ml Äthylacetat gelöst und gemäß Beispiel 1 auf den Piezokristall aufgetragen. Die weiteren Prozeduren schließen sich an die Vorschriften aus Beispiel 1 an: Frequenzänderung: 523 Hz = 5,78 · 10-12 g Thyroxin.8.8 g of butene- (2) -diol- (1,4) are added dropwise to 34.8 g of toluene-2,4-diisocyanate at 85 ° C. while stirring well; the temperature rises to approx. 100 ° C. The reaction is completed by further heating at 100-110 ° C for 1-2 hours. The resulting resin with a residual isocyanate group is then dried in vacuo.
40 mg of this polymer are then dissolved in 30 ml of ethyl acetate and applied to the piezocrystal according to Example 1. The further procedures follow the instructions from Example 1: Frequency change: 523 Hz = 5.78 · 10 -12 g thyroxine.

Für alle Versuche werden Piezokristalle der Firma Kristallver­ arbeitung Neckarbischofsheim GmbH, Durchmesser 12 mm, Dicke 0,5 mm, mit einer Grundfrequenz von 10 MHz ± 10-6 verwendet. Die Quarze sind mit Gold-beschichteten Metallelektroden ver­ sehen. Andere Schwingquarze mit ähnlichen elektronischen Eigen­ schaften sind grundsätzlich auch für die in der Erfindung be­ schriebenen Zwecke geeignet. Piezo crystals from Kristallver processing Neckarbischofsheim GmbH, diameter 12 mm, thickness 0.5 mm, with a basic frequency of 10 MHz ± 10 -6 are used for all experiments. The quartz crystals are seen with gold-coated metal electrodes. Other quartz crystals with similar electronic properties are basically also suitable for the purposes described in the invention.

Nach den bekannten Verfahren zur Messung der Massenbelegung auf einen Schwingquarz aus der resultierenden Frequenzänderung, wird die Frequenzmessung mit einer elektronischen Quarzwaage, die aus einem Schwingquarz und einer stabilisierten und hochgenauen Os­ zillatorschaltung besteht, durchgeführt.According to the known methods for measuring the mass occupancy a quartz crystal from the resulting change in frequency the frequency measurement with an electronic quartz balance that made up a quartz crystal and a stabilized and highly accurate Os zillator circuit exists.

Nach Aufbringen der jeweiligen Polymerschicht und Fixieren des betreffenden Ak bzw. Biomolekül auf dem beschichteten Quarz wird die gegenüber dem Grundzustand (Quarz ohne Beschichtung) veränderte Frequenz gemessen (Ausgangsfrequenz). Nach der Bindung der entsprechenden Ag bzw. Liganden wird die Änderung (Abnahme) der Quarzfrequenz registriert und als Maß für die Zahl der gebundenen Moleküle ausgewertet.After applying the respective polymer layer and fixing the relevant Ak or biomolecule on the coated quartz compared to the basic state (quartz without coating) changed frequency measured (output frequency). After Binding of the corresponding Ag or ligand becomes the change (Decrease) of the quartz frequency registered and as a measure for the Number of bound molecules evaluated.

Bei einer qualitativen Messung wird nur registriert, ob eine Abnahme der Frequenz die Bindung der nachzuweisenden Moleküle (z. B. der Affinitäts-Liganden) auf der Oberfläche anzeigt. Der Ligand, der die stärkste Abnahme verursacht, ist der mit der spezifischsten Affinität zum Biomolekül.A qualitative measurement only registers whether a Decrease in the frequency of the binding of the molecules to be detected (e.g. the affinity ligand) on the surface. The ligand that causes the greatest decrease is the one with the most specific affinity for the biomolecule.

Claims (10)

1. Mittel und Verfahren zur Beschichtung eines Schwingquarzes mit Hilfe eines synthetischen Polymeren, welches Antikörper oder andere biologisch aktive Moleküle auf dem Schwingquarz adsorptiv oder chemisch binden kann.1. Means and method for coating a quartz crystal with the help of a synthetic polymer, which antibody or other biologically active molecules on the quartz crystal can bind adsorptively or chemically. 2. Mittel und Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Beschichtung aus einem synthetischen Polymeren besteht, das in wäßriger Lösung unlöslich, in organisch-chemischer Phase jedoch löslich ist.2. Means and method according to claim 1, characterized in that that the coating consists of a synthetic polymer, that is insoluble in aqueous solution, in organic chemical Phase is however soluble. 3. Mittel und Verfahren gemäß Anspruch 1 und 2, dadurch gekenn­ zeichnet, daß die Beschichtung mittels eines Copolymeren aus organisch-chemischer Phase bewerkstelligt wird.3. Means and methods according to claim 1 and 2, characterized is characterized in that the coating is characterized by a copolymer organic chemical phase is accomplished. 4. Mittel und Verfahren gemäß Anspruch 1 bis 3, dadurch gekenn­ zeichnet, daß eine Komponente des Copolymeren funktionelle kupplungsfähige Seitengruppen enthält.4. Means and methods according to claim 1 to 3, characterized records that a component of the copolymer is functional includes linkable page groups. 5. Mittel und Verfahren gemäß Anspruch 1 bis 4, dadurch gekenn­ zeichnet, daß die Polymerschicht nach dem Aufbringen auf den Quarz in einem Nicht-Lösungsmittel ausgefällt wird.5. Means and methods according to claim 1 to 4, characterized records that the polymer layer after application to the Quartz is precipitated in a non-solvent. 6. Mittel und Verfahren zur Aufbringung einer Polymerschicht auf einen Schwingquarz mit Hilfe eines Vinylmonomer-Plasmas.6. Means and methods for applying a polymer layer on a quartz crystal with the help of a vinyl monomer plasma. 7. Mittel und Verfahren gemäß Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß das Plasma aus mehreren Vinylmonomeren besteht, wobei eine Komponente eine funktionelle kupplungsfähige Seitengruppe ent­ hält. 7. Means and method according to claim 6, characterized in that that the plasma consists of several vinyl monomers, one Component a functional coupling side group ent holds.   8. Mittel und Verfahren zur Aufbringung von Polymerschichten auf einen Quarzkristall mit Hilfe von Urethanpräpolymeren.8. Means and methods for applying polymer layers a quartz crystal with the help of urethane prepolymers. 9. Mittel und Verfahren gemäß Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß das Urethanpolymer aus einer Diol- oder Diaminkomponente und einem Di- oder Triisocyanat besteht, wobei die Isocyanat­ komponente im Überschuß zugesetzt wird.9. Means and method according to claim 8, characterized in that the urethane polymer from a diol or diamine component and a di- or triisocyanate, the isocyanate component is added in excess. 10. Mittel und Verfahren gemäß Anspruch 8 und 9, dadurch gekenn­ zeichnet, daß das Urethanpräpolymer aus organisch-chemischer Lösung auf den Kristall aufgetragen wird.10. Means and methods according to claim 8 and 9, characterized records that the urethane prepolymer from organic chemical Solution is applied to the crystal.
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