DE3822617A1

DE3822617A1 - Verfahren zur tieftemperaturkonservierung von sperma

Info

Publication number: DE3822617A1
Application number: DE3822617A
Authority: DE
Inventors: Valentin Ivanovic Grisenko; Jurij Vladimirovic Kalugin; Jurij Stepanovic Parasuk; Seripo Nina Antonovna Lucko; Elena Nikolaevna Cernys; Valerij Fridrichovic Tarasov; Sergeij Evgenevic Galcenko
Original assignee: INST KRIOBIOLOGII I KRIOMEDICI
Current assignee: INST KRIOBIOLOGII I KRIOMEDICI
Priority date: 1988-06-22
Filing date: 1988-07-04
Publication date: 1990-01-18
Also published as: GB2219924B; US4965186A; FR2632820B1; GB8814833D0; GB2219924A; FR2632820A1

Description

Die Erfindung bezieht sich auf die Kryobiologie und Kryo medizin und insbesondere auf ein Verfahren zur Tieftempe raturkonservierung von Sperma.

Mit dem größten Erfolg läßt sich die vorliegende Erfindung zur Tiefgefrierung von männlichem Sperma verwenden, das zur klinischen Applikation bei der Behandlung von Un fruchtbarkeit dient.

Das erfindungsgemäße Verfahren eignet sich vorteilhaft z.B. für die Einrichtung von Tieftemperatur-Samenbanken zur Vorratshaltung von Sperma, wobei eine Selektion nach der Qualität der gefrorenen Zellen möglich ist. Infolge der wirksamen Behandlung verschiedener Formen der Un fruchtbarkeit mit Hilfe der extrakorporalen Befruchtung der weiblichen Eizelle ist daneben heute die Verwendung von gefrorenem Sperma sehr effektiv.

Die Erfindung kann auch auf anderen Gebieten der Kryo biologie, beispielsweise in der Landwirtschaft bei der Selektion von neuen Tierrassen in der kürzesten Zeit, Verwendung finden. Die Tieftemperaturkonservierung des Spermas von Nutzfischen, wertvollen und seltenen Arten von Fischen stellt auch eine der Maßnahmen zu ihrer schnellen Reproduktion dar. Die Tieftemperaturkonservierung von Sperma ist entsprechend in der Human- und Veterinärmedizin sowie in der Landwirtschaft und Fischzucht sowie auf zahl reichen anderen Gebieten von ständig wachsender Bedeutung.

Die umfangreiche Verwendung von gefrorenem Sperma in der klinischen Praxis hat zu der Notwendigkeit geführt, die Verfahren zur Spermakonservierung zu vervollkommnen, weil die bestehenden Verfahren keine ausreichende Kryokonser vierung von Sperma aufgrund des Auftretens von Kristalli sationsprozessen erlauben, was letzten Endes dazu führt, daß ein gewisser Teil der Spermazellen die Penetrations eigenschaften verliert. Daher wurden zur Steigerung der Überlebensrate der Spermazellen Verfahren zur Kryokonser vierung auf der Basis der Vitrifizierung entwickelt.

So ist zum Beispiel ein Verfahren zum Einfrieren von Sperma durch tropfenweises Zusetzen von wasserfreiem Glycerin zum Ejakulat bis zu einer Endkonzentration von 10% bekannt (I.K. Sherman, Improved Methods of Preservation of Human Spermatozoa by Freezing and Freeze-Drying, Fertil. and Steril. 14, No. 1 (1963)). Man bringt je 0,5 ml Sperma zusammen mit einem Gefrierschutzmittel in Glas ampullen oder Polyethylenampullen ein, verschließt diese dicht und kühlt dann das Sperma mit einer Abkühlgeschwin digkeit von 25°C/min auf -75°C und nachher mit einer Ab kühlgeschwindigkeit von 16°C/min auf -180°C ab. Die Überlebensrate der Spermien nach dem Auftauen liegt bei diesem Verfahren nicht über 60%.

Von Nachteil sind hierbei insbesondere osmotische Schädi gungen der Zellen, die durch den direkten Zusatz von Glycerin zum Ejakulat bedingt sind. Die dadurch hervor gerufenen latenten Schädigungen des Membranapparats der Zellen und besonders ihrer mikrosomalen Kappe werden im Laufe der Abkühlung verstärkt, was bei zahlreichen Zellen zu irreversiblen Schädigungen von Biostrukturen führt.

Bekannt ist daneben ein Verfahren zur Tieftemperaturkon servierung von Sperma mit einem Gefrierschutzmittel in Form von Granalien durch Auftropfen des Spermas in kleine runde Aushöhlungen auf Trockeneis (I. Barkay, H. Zucker man, Cryopreservation and Pooling of Spermatozoa, Treatment of Male Infertility, Berlin, Heidelberg-New York, 1982, p. 263-281). Das Einfrieren von 0,1 bis 0,15 ml großen Proben verläuft in diesem Falle sehr schnell innerhalb von etwa 60 s. Das Einfrieren des Spermas in Granalien wird in einem besonderen, mit einem einstell baren bzw. regelbaren Thermostaten versehenen Gerät durchgeführt, mit dem die Tieftemperaturgefrierung kontrolliert wird. Die Überlebensrate des Spermas erreicht in diesem Falle 70 bis 75%.

Der Nachteil dieses Verfahrens besteht darin, daß das Ein frieren des Spermas von Kristallisationsprozessen beglei tet und das Sperma in Form von Kügelchen eingefroren wird. Bei den einzufrierenden Spermaproben tritt dabei ein Tem peraturgradient auf, der durch unterschiedliche Abkühlge schwindigkeit der Zellen in der Mitte der Aushöhlung und der Zellen in unmittelbarer Nähe ihrer Wände hervorgerufen wird; ferner ist ein Einfrieren von Sperma in Granalien unter aseptischen Bedingungen nicht durchführbar.

Bekannt ist ferner ein Verfahren zur Tieftemperaturkonser vierung von Sperma (SU-A-11 03 837), bei dem man dem Sperma Glycerin als Gefrierschutzmittel langsam zusetzt, bis seine Endkonzentration 10% erreicht, worauf in sterile Röhrchen von 0,5 ml abgefüllt wird, die dicht verschlossen werden. Das Einfrieren erfolgt dabei in zwei Stufen: Das Sperma wird zunächst mit einer Abkühlgeschwindigkeit von 0,5 bis 1,0°C/min auf 4 bis 5°C abgekühlt und 30 bis 60 min lang bei dieser Temperatur gehalten und dann mit einer Abkühlgeschwindigkeit von 20 bis 25°C/min auf -180 bis -190°C abgekühlt. Das eingefrorene Sperma wird an schließend in flüssigem Stickstoff gelagert. Das Auftauen erfolgt im Wasserbad bei 36°C. Die Überlebensrate des Spermas beträgt bei diesem Verfahren 66%.

Der Nachteil auch dieses Verfahrens besteht darin, daß die Tieftemperaturkonservierung von Spermien von Kristallisa tionsprozessen begleitet wird, also keine Vitrifizierung erzielbar ist. Der positive Einfluß des Gefrierschutz mittels wird bei diesem Verfahren zugleich durch negative Erscheinungen aufgrund der direkten Einführung von Glycerin in einer Konzentration von 10 Masse-% in das Ejakulat zunichtegemacht. Dies führt zu einer Schädigung der Cytoplasmamembranen der Spermien und damit zu einer Herabsetzung ihrer Gefrierbeständigkeit. Der direkte Zu satz von wasserfreiem Glycerin zum Sperma bewirkt daneben starke osmotische Veränderungen im Ejakulat. Die starke Dehydratisierung der Zellen ruft dabei eine teilweise De naturierung von Eiweißmolekülen und eine Strukturänderung der Zellorganellen hervor. Die lange Verweildauer in einer Glycerinlösung hoher Konzentration führt ferner zu toxi schen Wirkungen dieses Gefrierschutzmittels.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Tieftemperaturkonservierung von Sperma anzugeben, bei dem die Abkühlung des Spermas mit einer Geschwindigkeit erfolgt, die zur Vitrifizierung des Hauptteils von extra und intracellulärem Wasser unter Herabsetzung der intensi ven Schädigungswirkung der Rekristallisation auf die Bio strukturen des Spermas beim Auftauen ausreicht.

Die Aufgabe wird anspruchsgemäß gelöst. Die Unteransprüche betreffen vorteilhafte Ausführungsformen des Verfahrens.

Das erfindungsgemäße Verfahren zur Tieftemperaturkonser vierung von Sperma beruht auf der Einführung eines Ge frierschutzmittels in das Sperma und der Abkühlung mit einem Kühlmittel auf die Kühlmitteltemperatur und ist da durch gekennzeichnet, daß

- dem Sperma ein Salzpuffer und ein Antischockmittel zugesetzt werden, die zusammen mit dem Gefrierschutz mittel das Kryokonservierungsmittel bilden,
- das Gefrierschutzmittel in einer Konzentration einge setzt wird, die zur Erzielung einer nicht kristallinen Phase beim Einfrieren des Spermas im Kryokonservierungs mittel ausreicht, und
- die Abkühlung des Spermas im Kryokonservierungsmittel in einem pulverförmigen Material hoher Wärmeleitfähigkeit, das auf die Kühlmitteltemperatur vorgekühlt ist, vorge nommen wird.

Das erfindungsgemäße Verfahren macht es möglich, die morphofunktionelle Haltbarkeit von Spermien durch Vitri fizierung zu erhöhen, was die Erzielung einer hohen Überlebensrate (85%) ermöglicht. Dies wird insbesondere durch die Verwendung eines pulverförmigen Materials hoher Wärmeleitfähigkeit, bei der Abkühlung des Spermas erzielt, das die Bildung einer wärmeisolierenden Schicht aus Kälte mitteldämpfen um das abzukühlende Objekt (Leidenfrostsches Phänomen) wegen fehlenden unmittelbaren Kontakts mit dem Kältemittel ausschließt. Die bedeutende, dadurch bedingte Zunahme der Abkühlgeschwindigkeit reicht zur Vitrifizie rung aus und gestattet es, die Konzentration des Gefrier schutzmittels auf einen Wert herabzusetzen, der den Ver fahrenserfolg weiter begünstigt.

Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren kann man entsprechend eine Kristallisation der wäßrigen Phase des einzufrie renden Spermas vermeiden und somit alle dazu beitragenden externen Faktoren ausschließen.

Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht zugleich eine Vereinfachung der Tieftemperaturkonservierung durch Ver minderung der Zahl der Arbeitsschritte und kürzere Aus führungszeiten. Gleichzeitig trägt die Erfindung durch Verkürzung des Gesamtzyklus der Tieftemperaturkonservie rung zu einer Erhöhung der Arbeitsproduktivität und damit zu einer Verringerung der Verfahrenskosten bei.

Nach einer vorteilhaften Ausführungsform der Erfindung wird pulverförmiges Aluminiumoxid (Al₂O₃) als Material hoher Wärmeleitfähigkeit verwendet. Dadurch wird eine Vitrifikation der Spermien im erfindungsgemäß verwendeten Kryokonservierungsmittel bei einer Abkühlgeschwindigkeit erzielt, die zum Einfrieren ohne Kristallisation aus reicht. Das ist auch durch die relativ kleine Größe der Spermazellen gegenüber anderen einzufrierenden Objekten, insbesondere Embryonen, und folglich durch eine kleinere Menge von freiem Wasser in den einzufrierenden Spermien bedingt.

Das Gefrierschutzmittel wird zweckmäßigerweise in einer Konzentration von 1,5 bis 2,5 Masse-% verwendet. Bei die sen Konzentrationen zeigt das Gefrierschutzmittel keine toxischen und osmotischen Effekte, wobei diese Konzentra tion per se unter den gewählten Abkühlungsbedingungen für eine Vitrifizierung nicht ausreichend wären.

Gemäß einer günstigen Ausführungsform der Erfindung ent hält das Kryokonservierungsmittel einen biologisch wirk samen Stoff.

Biologisch wirksame Stoffe dienen bei der Kryokonservie rung von Sperma zur Steigerung der Überlebensrate der Zellen durch Schutz der cytoplasmatischen Zellmembranen gegen Temperaturschock und Lösungseffekte während der Phasenumwandlung von Wasser in Eis.

Als biologisch wirksamer Stoff wird zweckmäßigerweise Cholinchlorid verwendet.

Cholinchlorid, das dank des hohen energetischen Potentials der Stickstoffgruppierung, dem Vorhandensein von drei Methylgruppen und einer Hydroxygruppe als Methylierungs mittel in biologischen Prozessen dient, besitzt eine hohe Basizität, die eine aktive Hydratation dieses Stoffs auslöst, was zu einer Erhöhung der Gefrierschutzeigen schaften des Kryokonservierungsmittels führt. Die Methyl gruppen wirken auf die native Struktur der Biomembranen stabilisierend, wodurch ihre Kryoresistenz verstärkt wird.

Es ist zweckmäßig, Cholinchlorid in einer Konzentration von 2 Masse-% zu verwenden.

Geringere Konzentrationen an Cholinchlorid bewirken keine Steigerung der Gefrierschutzwirkung des Kryokonservie rungsmittels, während höhere Konzentrationen dieser bio logisch wirksamen Verbindung zu einer hydrophoben Wech selwirkung mit Biomakromolekülen führen, wodurch sich keine Stabilisierung, sondern Veränderungen von Membran strukturen ergeben.

Die Erfindung wird im folgenden anhand von Ausführungsbei spielen näher erläutert.

Zur Durchführung des Verfahrens bringt man in flüssigen Stickstoff als Kühlmittel ein metallisches Gefäß ein, das mit einem pulverförmigen Material hoher Wärmeleitfähigkeit gefüllt ist und in das ein Behälter mit dem verdünnten Sperma eingetaucht wird.

Das Verfahren wird wie folgt durchgeführt:

Das verdünnte Sperma vermischt man mit einem Kryokonser vierungsmittel, das eine wäßrige Lösung darstellt, die Glucose, Natriumcitrat als Salzpuffer, Hühnereidotter als Antischockmittel, Cholinchloridlösung als biologisch wirk samen Stoff und Glycerin als Gefrierschutzmittel enthält. Nach Äquilibrierung wird das verdünnte Sperma im Behälter aus Folie für Lebensmittel abgefüllt, die zugewalzt und dann in ein pulverförmiges, auf die Temperatur von flüssi gem Stickstoff als Kühlmittel vorgekühltes Material hoher Wärmeleitfähigkeit eingetaucht und danach schnell zur Aufbewahrung in flüssigen Stickstoff übertragen werden. Das Auftauen erfolgt im Wasserbad.

Beispiel 1

Man bringt 2 ml Sperma zwecks Verdünnung für 25 bis 30 min in einen Thermostat bei 37°C ein und setzt dann im Verhältnis von 1:1 ein Medium zu, das 4,0 g Glucose, 1,2 g Natriumcitrat, 26,0 ml Hühnereidotter, 2,0 ml 20%ige Cholinchloridlösung und 3,0 ml Glycerin, Rest Wasser, ent hält, wobei die Endkonzentration des Glycerins 1,5 Masse-% beträgt. Das verdünnte Sperma wird 45 min so belassen und dann in Mengen von je 0,5 ml in Behälter aus Folie für Le bensmittel von 0,3 mm Stärke abgefüllt, wobei die freien Enden zugewalzt werden. Das Einfrieren erfolgt durch Ein tauchen der Behälter in eine Einfrierkammer, die ein me tallisches, mit pulverförmigem Al₂O₃ gefülltes Gefäß dar stellt, das in flüssigem Stickstoff eingetaucht ist, und 5 bis 10 s Halten dieser Behälter im Al₂O₃-Pulver, wonach sie zur Aufbewahrung in flüssigen Stickstoff übertragen werden.

Das Auftauen wird 3 Wochen nach der Kryokonservierung durch Eintauchen der Behälter in ein Wasserbad von 40°C durchgeführt. Nach dem Auftauen betragen der pH-Wert 7,5, die Gesamtzahl der Spermien 52 Mio pro ml, die Beweglich keit 66%, der Anteil der aktiv beweglichen Formen 51,8% und der Anteil der normalen Formen 72%.

Die Überlebensrate wurde nach der Formel

ermittelt; sie betrug 82,2%.

Beispiel 2

Es wird wie in Beispiel 1 verfahren, wobei 4,0 ml Glycerin eingesetzt werden und die Endkonzentration des Glycerins 2,0 Masse-% beträgt.

Das Auftauen wird 3 Wochen nach der Kryokonservierung durch Eintauchen der Behälter in ein Wasserbad von 40°C durchgeführt. Nach dem Auftauen betragen der pH-Wert 7,5, die Gesamtzahl der Spermien 52 Mio pro ml, die Beweglich keit 66%, der Anteil der aktiv beweglichen Formen 53,1% und der Anteil der normalen Formen 72%.

Die wie in Beispiel 1 ermittelte Überlebensrate betrug 84,2%.

Beispiel 3

Es wird wie in Beispiel 1 verfahren, wobei 5,0 ml Glycerin eingesetzt werden und die Endkonzentration des Glycerins 2,5 Masse-% beträgt.

Das Auftauen erfolgt 3 Wochen nach der Kryokonservierung durch Eintauchen der Behälter in ein Wasserbad von 40°C. Nach dem Auftauen betragen der pH-Wert 7,5, die Gesamtzahl der Spermien 52 Mio pro ml, die Beweglichkeit 66%, der Anteil der aktiv beweglichen Formen 54,7% und der Anteil der normalen Formen 72%.

Die wie in Beispiel 1 ermittelte Überlebensrate betrug 86,5%.

Um nachzuweisen, daß die Verwendung von Glycerin in einer verringerten Konzentration im erfindungsgemäßen Bereich das schnelle Einfrieren im Al₂O₃-Pulver die gestellte Auf gabe zu lösen ermöglichen, sind nachstehend in den Tabellen 1 bis 3 Versuchsergebnisse einschließlich der An gaben der angeführten Ausführungsbeispiele angeführt.

Tabelle 1

Abhängigkeit der Überlebensrate von Spermien nach Tieftemperaturkonservierung von der Zusammensetzung des Einfriermediums

Tabelle 2

Abhängigkeit der Beweglichkeit von Spermien von der Zusammensetzung des Einfriermediums

Tabelle 3

Abhängigkeit der Beweglichkeit von Spermien vom Verfahren der Tieftemperaturkonservierung

Die Tabellenangaben zeigen, daß die Beweglichkeit der auf getauten Spermien in beiden Fällen gegenüber ihrer Beweglichkeit vor dem Einfrieren herabgesetzt ist. Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht jedoch im Vergleich zum bekannten Verfahren die Erzielung von Sperma höherer Aktivität.

Die obigen Beispiele zeigen, daß die schlechtesten Ergebnisse durch Kryokonservierung von nativem Sperma erhalten werden. Der Zusatz eines kein Glycerin enthaltenden Kryokonservierungsmittels zum Sperma führt zu einer geringfügigen Erhöhung der Haltbarkeit der Zellen. Der Kryoschutz kommt dann mehr zum Ausdruck, wenn das Kryokonservierungsmittel Glycerin enthält, wobei das Gefrierschutzmaximum bei einer Glycerinkonzentration im Einfriermedium von 1,5 bis 2,5 Masse-% erreicht wird. Die Verwendung von Glycerin in einer Konzentration von 2,5 Masse-% gestattet es bei diesem Einfrierverfahren, die Überlebensrate der Spermien um 19,8% zu steigern, die einen sehr wichtigen Kennwert für die Haltbarkeit von Spermien darstellt.

Durch das Vorliegen des Glycerins in einer geringen Kon zentration und des Cholinchlorids im Kryokonservierungs mittel werden also beim Kryokonservierungsmittel Bedingun gen für eine maximale Gefrierschutzwirkung ohne irgendwel che negativen Einflüsse geschaffen.

Dies äußert sich insbesondere darin, daß die Zellen, die im erfindungsgemäß verwendeten Kryokonservierungsmittel eingefroren werden, eine signifikant höhere Lebensfähig keit gegenüber dem nativen Material aufweisen.

Claims

1. Verfahren zur Tieftemperaturkonservierung von Sperma durch Einführung eines Gefrierschutzmittels in das Sperma und Abkühlung mit einem Kühlmittel auf die Kühl mitteltemperatur, dadurch gekennzeichnet, daß

- dem Sperma ein Salzpuffer und ein Antischockmittel zugesetzt werden, die zusammen mit dem Gefrier schutzmittel das Kryokonservierungsmittel bilden,
- das Gefrierschutzmittel in einer Konzentration ein gesetzt wird, die zur Erzielung einer nicht kristal linen Phase beim Einfrieren des Spermas im Kryokon servierungsmittel ausreicht, und
- die Abkühlung des Spermas im Kryokonservierungsmittel in einem pulverförmigen Material hoher Wärmeleitfä higkeit, das auf die Kühlmitteltemperatur vorgekühlt ist, vorgenommen wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als pulverförmiges Material hoher Wärmeleitfähigkeit Aluminiumoxid (Al₂O₃) verwendet wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeich net, daß das Gefrierschutzmittel in einer Konzentration von 1,5 bis 2,5 Masse-% eingesetzt wird.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch ge kennzeichnet, daß dem Kryokonservierungsmittel ein bio logisch wirksamer Stoff zugesetzt wird.

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß als biologisch wirksamer Stoff Cholinchlorid eingesetzt wird.

6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß das Cholinchlorid in einer Konzentration von 2 Masse-% eingesetzt wird.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch ge kennzeichnet, daß ein Kryokonservierungsmittel einge setzt wird, das Hühnereidotter als Antischockmittel enthält.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch ge kennzeichnet, daß als Material hoher Wärmeleitfähigkeit Aluminiumoxid (Al₂O₃) verwendet wird.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß als Kühlmittel Flüssigstickstoff verwendet wird.