DE3852827T3 - Test von einer körperflüssigkeit zur messung von knochenresorption. - Google Patents

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  • Hintergrund der Erfindung
  • Osteoporose ist die bekannteste Knochenerkrankung beim Menschen. Primäre Osteoporose mit erhöhter Anfälligkeit für Brüche resultiert aus einem progressiven Nettoverlust an Skelettknochenmasse. Es wird angenommen, dass in den Vereinigten Staaten 15 bis 20 Mio. Menschen betroffen sind. Ihre Basis ist ein altersabhängiges Ungleichgewicht beim Knochenwiederaufbau, d.h. in den Geschwindigkeiten der Synthese und des Abbaues von Knochengewebe. Etwa 1,2 Mio. Osteoporose-bezogene Brüche treten jedes Jahr bei Älteren auf, umfassend etwa 538 000 Kompressionsfrakturen des Rückgrates, etwa 227 000 Hüftbrüche und eine wesentliche Anzahl von früh gebrochenen, peripheren Knochen. 12 bis 20% der Hüftbrüche sind fatal aufgrund der Tatsache, dass sie schweres Trauma und Blutungen auslösen, und die Hälfte der überlebenden Patienten benötigen eine häusliche Krankenpflege. Die Gesamtkosten von Osteoporose-bezogenen Verletzungen betragen gegenwärtig zumindest 7 Mrd. Dollar pro Jahr (Barnes, O.M., Science, 236, 914 (1987)). Osteoporose ist besonders bei Frauen nach der Menopause besonders üblich, welche durchschnittlich 15% ihrer Knochenmasse in den 10 Jahren nach der Menopause verlieren. Diese Krankheit tritt auch bei Männern auf, wenn sie älter werden, und bei jungen, amenorrhoischen, weiblichen Sportlern. Trotz der hauptsächlichen und anwachsenden sozialen und ökonomischen Konsequenzen der Osteoporose ist kein Verfahren zur Messung der Geschwindigkeit der Knochenresorption bei Patienten oder normalen Subjekten verfügbar. Eine Hauptschwierigkeit bei der Überwachung der Krankheit ist das Fehlen eines spezifischen Tests zur Messung der Geschwindigkeiten der Knochenresorption.
  • Methoden zur Bestimmung der Knochenmasse beziehen sich oft auf die Messung des gesamten Körperkalziums durch Neutronenaktivierungsanalyse oder der Mineralmasse in einem gegebenen Knochen durch Photonenabsorptionstechniken. Diese Messungen können nur Langzeiteindrücke vermitteln, ob die Knochenmasse abnehmend ist. Das Messen des Kalziumhaushaltes durch Vergleichen der Aufnahme mit der Abgabe ist langwierig, unzuverlässig und kann nur indirekt deutlich machen, ob Knochenmineral über den langen Zeitraum verloren wird. Andere gegenwärtig verfügbare Verfahren zur Bestimmung von abnehmender Knochenmasse und verändertem Knochenmetabolismus umfassen die quantitative Abtast-Radiometrie an ausgewählten Knochenstellen (Rist, Calcaneus, usw.) und die Histomorphometrie von iliakaler Crista-Biopsie. Die erstere stellt eine rohe Messung des Knochenmineralgehaltes an einer spezifischen Stelle in einem einzelnen Knochen zur Verfügung. Die Histomorphometrie gibt einen halbquantitativen Nachweis des Gleichgewichtes zwischen neu abgeschiedenen Knochenverschmelzungslinien und resorbierenden Oberflächen.
  • Ein Urintest für den gesamten Körperausstoß an abgebautem Knochen in 24 Std. würde bedeutend geeigneter sein. Mineralstudien (z.B. Kalziumhaushalt) können dies nicht zuverlässig oder leicht durchführen. Da die Knochenresorption den Abbau des Minerals und der organischen Matrix umfasst, würde ein spezifischer, biochemischer Marker für neu abgebaute Knochenprodukte in Körperfluiden der ideale Index sein. Zahlreiche potentielle, organische Indizes wurden getestet. Beispielsweise wird Hydroxyprolin, eine Aminosäure, welche weitestgehend auf Kollagen und das Hauptstrukturprotein im Knochen und allen anderen Bindegeweben beschränkt ist, im Urin ausgeschieden. Von seiner Ausscheidungsgeschwindigkeit ist es bekannt, dass sie unter bestimmten Bedingungen, insbesondere Paget-Krankheit, einer metabolitischen Knochenstörung, in welcher der Knochenumsatz stark vergrößert ist, ansteigt. Aus diesem Grund wurde Urin-Hydroxyprolin extensiv als ein Aminosäuremarker für den Kollagenabbau verwendet. Singer, F.R., et al. (1978) in: Metabolic Bone Disease, Vol. II, (Hrsg. Avioli, L.V. und Krane, S.M.) Seiten 489-575, Academic Press, New York.
  • Goverde (U.S.-Patent Nr. 3 600 132) offenbart ein Verfahren zur Bestimmung von Hydroxyprolin in Körperfluiden, wie Serum, Urin, Lumbarfluid und anderen interzellulären Fluiden, um Abweichungen im Kollagenmetabolismus zu zeigen. Insbesondere stellt dieser Erfinder fest, dass bei pathologischen Zuständen, wie Paget-Krankheit, Marfan-Syndrom, Osteogenesis imperfecta, neoplastischem Wachstum in Kollagengeweben und in verschiedenen Formen von Zwergenwuchs, ein erhöhter Kollagenanabolismus oder -katabolismus bestimmt werden kann, wie er durch den Hydroxyprolingehalt in den biologischen Fluiden gemessen wird. Dieser Erfinder misst Hydroxyprolin durch Oxidieren desselben zu einer Pyrrolverbindung mit Wasserstoffperoxid und N-Chlor-p-toluolsulfonamid, gefolgt von einer kolorimetrischen Bestimmung in p-Dimethylaminobenzaldehyd.
  • Im Fall von Paget-Krankheit kommt das erhöhte Urin-Hydroxyprolin möglicherweise hauptsächlich von dem Knochenabbau, jedoch kann Hydroxyprolin allgemein nicht als ein spezifischer Index verwendet werden. Der größte Teil des Hydroxyprolins im Urin kann von der Synthese von neuem Kollagen (bemerkenswerte Mengen des neu gebildeten Proteins werden abgebaut und ausgeschieden, ohne jemals in das Gewebe eingebaut zu werden) und von dem Umsatz von bestimmten Blutproteinen ebenso wie anderen Proteinen stammen, welche Hydroxyprolin enthalten. Des weiteren werden etwa 80% des freien Hydroxyprolins, welches von dem Proteinabbau stammt, in der Leber metabolisiert und erscheinen niemals im Urin. Kiviriko, K.I. (1970) Int. Rev. Connect. Tissue Res. 5,93 und Weiss, P.H. und Klein, L. (1969) J. Clin. Invest. 48,1.
  • Hydroxylysin und seine Glycosidderivate, beide eigentümlich für kollagenartige Proteine, wurden als genauer als Marker für den Kollagenabbau befunden als Hydroxyprolin. Jedoch sind auch Hydroxylysin und seine Glycoside aus denselben Gründen, wie oben für Hydroxyprolin beschrieben, möglicherweise in gleicher Weise nicht-spezifische Marker der Knochenresorption. Krane, S.M. und Simon L.S. (1981) Develop. Biochem. 22, 185.
  • Zusätzlich zu Aminosäuren, welche einzigartig für Kollagen sind, bildeten verschiedene, nicht kollagenartige Proteine der Knochenmatrix, wie Osteokalzin, oder deren Abbauprodukte, die Basis von Immunoassays, welche auf die Messung des Knochenmetabolismus abzielten. Price, P.A. et al. (1980) J. Clin. Invest. 66, 878, und Gundberg, C.M. et al. (1984) Meth. Enzymol. 107,516. Jedoch ist es nun klar, dass vom Knochen abgeleitete, nicht kollagenartige Proteine, obwohl möglicherweise ein nützlicher Index der knochenmetabolischen Aktivität, von sich aus nur unwahrscheinlich quantitative Messungen der Knochenresorption ermöglichen dürften. Die Konzentration von Osteokalzin im Serum schwankt beispielsweise ziemlich stark, sowohl normal als auch bei metabolischer Knochenerkrankung. Seine Konzentration in Zuständen erhöhten Skelettumsatzes ist erhöht, wobei es jedoch unklar ist, ob dies von der erhöhten Synthese oder dem Abbau von Knochen herstammt. Krane, S.M., et al. (1981) Develop. Biochem. 22, 185, Price, P.A. et al. (1980) J. Clin. Invest. 66, 878, und Gundberg, C.M. et al. (1984) Meth. Enzymol. 107, 516.
  • Kollagenvernetzung
  • Die Polymere der meisten genetischen Typen von Wirbeltierkollagen erfordern die Bildung von Aldehyd-vermittelten Vernetzungen für normale Funktion. Kollagenaldehyde werden von wenig spezifischen Lysin- oder Hydroxylysin-Seitenketten durch die Wirkung von Lysyloxidase abgeleitet. Verschiedene di-, tri- und tetrafunktionelle vernetzende Aminosäuren werden durch die spontanen intra- und intermolekularen Reaktionen dieser Aldehyde innerhalb der neu gebildeten Kollagenpolymere gebildet; der Typ des vernetzenden Restes variiert spezifisch mit dem Gewebetyp (siehe Eyre, D.R. et al. (1984) Ann. Rev. Biochem. 53: 717–748). Zwei Basiswege der Vernetzung können für die gestreiften (67 nm Wiederholung), fibrillaren Kollagene unterschieden werden, wobei einer auf Lysinaldehyden und der andere auf Hydroxylysinaldehyden basiert. Der Lysinaldehyd-Weg dominiert in der Haut der Erwachsenen, in der Cornea, in der Sclera und Rattenschwanzsehne und tritt auch häufig in anderen weichen Bindegeweben auf. Der Hydroxylysinaldehyd-Weg dominiert in Knochen, Knorpeln, Bändern, den meisten Sehnen und den meisten inneren Bindegeweben des Körpers, Eyre, D.R. et al. (1974), siehe oben. Der eingeschlagene Weg wird davon bestimmt, ob Lysin-Reste in den Telopeptid-Stellen hydroxyliert sind, worin die Aldehyd-Reste später durch Lysyloxidase gebildet werden (Barnes, M.J. et al. (1974), Biochem. J. 139, 461). Die chemische(n) Strukturen) der reifen vernetzenden Aminosäuren auf dem Lysinaldehyd-Weg ist (sind) unbekannt, wobei jedoch Hydroxypyridinium-Reste als reife Produkte auf dem Hydroxylysinaldehyd-Weg identifiziert wurden. Auf beiden Wegen und in den meisten Geweben verschwinden die zwischenliegenden, Borhydrid-reduzierbaren Vernetzungsreste, wenn neu gebildetes Kollagen reift, was nahe legt, dass sie relativ kurzlebige Zwischenprodukte sind (Bailey, A.J. et al. (1971) FEBS Lett. 16, 86). Ausnahmen sind Knochen und Dentin, in welchen die reduzierbaren Reste in einer bemerkenswerten Konzentration über die Lebensdauer bestehen, teilweise offensichtlich deshalb, weil die schnelle Mineralisierung der neu gebildeten Kollagenfibrillen weitere spontane Vernetzungsinteraktionen verhindert (Eyre, D.R. (1981) in: The Chemistry and Biology of Mineralized Connective Tissues (Herausg.: Veis, A.) Seiten 51–55, Elsevier, New York und Walters, C. et al. (1983) Calc. Tiss. Intl. 35: 401–405).
  • Zwei chemische Formen der 3-Hydroxypyridinium-Vernetzungsstelle wurden identifiziert (Formel I und II). Beide Verbindungen sind natürlich fluoreszierend mit denselben charakteristischen Anregungs- und Emissionsspektren (Fujimoto, D. et al. (1977) Biochem. Biophys. Res. Commun. 76, 1124 und Eyre, D.R. (1981) Develop.
  • Biochem. 22, 50). Diese Aminosäuren können aufgelöst werden und direkt in Gewebehydrolysaten mit einer guten Empfindlichkeit unter Verwendung von Umkehrphasen-HPLC und Fluoreszenzdetektionen untersucht werden. Eyre, D.R. et al. (1984) Analyt. Biochem. 137: 380–388.
  • Figure 00050001
  • Von wachsenden Tieren wurde berichtet, dass diese reifen Vernetzungsstellen in einer unmineralisierten Fraktion von Knochenkollagen stärker konzentriert werden können als in dem mineralisierten Kollagen (Banes, A.J., et al. (1983) Biochem. Biophys. Res. Commun. 113, 1975). Jedoch unterstützen andere Studien an jungen Rindern oder Knochen von erwachsenen Menschen dieses Konzept nicht. Eyre, D.R. (1985) in: The Chemistry and Biology of Mineralized Tissues (Herausg.: Butler, W.T.) Seite 105, Ebsco Media Inc., Birmingham, Alabama.
  • Das Vorhandensein von Kollagen-Hydroxypyridinium-Vernetzungsstellen im menschlichen Urin wurde zuerst von Gunja-Smith and Boucek (Gunja-Smith, Z. und Boucek, R.J. (1981) Biochem. J. 197: 759–762) berichtet, wobei langdauernde Isolationsverfahren für Peptide und konventionelle Aminosäureanalyse verwendet wurden. Zu diesem Zeitpunkt war ihnen nur die HP-Form der Vernetzung bekannt. Robins (Robins, S.P. (1982) Biochem. J. 207: 617–620) hat von einem Enzymgekoppelten Immunoassay berichtet, um HP in Urin zu messen, wobei polyklonale Antikörper gegen die freie Aminosäure, konjugiert an Rinderserumalbumin, erzeugt wurden. Mit diesem Versuch wird beabsichtigt, einen Index für die Beobachtung von erhöhter Gelenkzerstörung zur Verfügung zu stellen, welche bei arthritischen Erkrankungen auftritt und welche gemäß Robins auf der Erkenntnis beruht, dass Pyridinolin sehr viel stärker in Knorpel- als in Knochenkollagen vorherrscht. In neueren Arbeiten, welche Enzym-gekoppelte Immunoassays verwenden, berichtet Robins, dass Lysylpyridinolin gegenüber Antiserum gegen Pyridinolin, welches kovalent an das Rinderserumalbumin gebunden ist, nicht reaktiv ist (Robins et al. (1986) Ann. Rheum. Diseases 45, 969–973). Robins Urin-Index für die Knorpelzerstörung basiert auf der Entdeckung, dass Hydroxylysylpyridinolin, welches primär vom Knorpel abgeleitet ist, im Urin in Konzentrationen gefunden wird, welche proportional zu der Geschwindigkeit der Gelenkknorpelresorption sind. Im Prinzip könnte dieser Index zur Messung des Gesamtkörper-Knorpelverlustes herangezogen werden; jedoch würde keine Information über Knochenresorption verfügbar sein. Tatsächlich scheint es wahrscheinlicher, dass Robins Versuche vor allem den erhöhten Knochenwiederaufbau, welcher bei rheumatoider Arthritis auftritt, eher als eine Knorpelzerstörung gemessen haben.
  • Es besteht daher ein Bedarf für ein Verfahren, welches ermöglicht, die Geschwindigkeit der Gesamtkörper-Knochenresorption bei Menschen zu messen. Die nützlichste derartige Methode würde eine sein, welche auf Körperfluide, insbesondere Urin, angewandt werden könnte. Die Methode sollte empfindlich sein, d.h. quantifizierbar bis hinunter zu einem Picomol, und schnell die 24-Stunden-Knochenresorptionsraten messen, so dass der Fortschritt von verschiedenen Therapien (z.B. Östrogen) bestimmt werden kann.
  • Ein Verfahren zur Bestimmung der absoluten Geschwindigkeit der Knochenresorption umfasst die quantitative Bestimmung der Konzentration von Peptidfragmenten, welche 3-Hydroxypyridinium-Vernetzungsstellen aufweisen, abgeleitet von der Knochenkollagenresorption in einem Körperfluid (z.B. Urin, Gelenksflüssigkeit, Serum). Folglich ermöglicht die Erfindung ein Verfahren zur Bestimmung der Geschwindigkeit der Knochenresorption, wobei das Verfahren die quantitative Bestimmung der Konzentration eines Peptidfragmentes in einem Körperfluid umfasst, welches von der Knochenkollagenresorption stammt und eine 3-Hydroxypyridinium-Vernetzungsstelle aufweist, die Lysylpyridinolin und/oder Hydroxylysylpyridinolin ist. Die Schritte der quantitativen Bestimmung bestehen im Kontaktieren des Körperfluids mit einem immunologischen Bindungspartner, welcher spezifisch für ein Peptidfragment ist, welches 3-Hydroxypyridinium-Vernetzungsstellen aufweist, welche von der Knochenkollagenresorption abgeleitet sind. Das Körperfluid wird gegebenenfalls vor dem Schritt des Kontaktierens gereinigt. Dieser Reinigungsschritt ist aus einer Anzahl von Standardverfahren gewählt, umfassend die Patronenadsorption und -elution, die Molekularsieb-Chromatographie, die Dialyse, der Ionenaustausch, die Aluminiumoxid-Chromatographie, die Hydroxyapatit-Chromatographie und Kombinationen davon.
  • Peptidfragmente, welche von Knochenkollagen abgeleitet sind, enthalten 3-Hydroxypyridinium-Vernetzungsstellen, insbesondere Lysylpyridinolin-Vernetzungsstellen und Hydroxylysylpyridinolin-Vernetzungsstellen.
  • Derartige Fragmente haben eine 3-Hydroxypyridinium-Vernetzungsstelle, welche von der aminoterminalen Telopeptid-Domaine von Knochen-Typ-I-Kollagen abgeleitet ist, und die folgende Aminosäuresequenz.
  • Figure 00070001
  • Hydroxylysylpyridinolin oder Lysylpyridinolin ist und Gln Glutamin oder vollständig zyklisierte Pyrrolidoncarbonsäure ist. Dieses Fragment ist der Gegenstand von Anspruch 1.
  • Ein anderes Fragment, welches 3-Hydroxypyridinium-Vernetzungsstellen enthält, ist von der carboxyterminalen Telopeptid-Domaine des Knochen-Typ-I-Kollagens abgeleitet und ist durch die folgende Formel dargestellt:
    Figure 00070002
    worin
    Figure 00080001
    Hydroxylysyl- oder Lysylpyridinolin ist. Dieses Fragment ist nicht Teil der Erfindung.
  • Die Erfindung umfasst ein Hybridom, welches monoklonale Antikörper produziert, welche spezifisch für das erste der oben genannten Peptidfragmente sind, abgeleitet von Knochenkollagen mit 3-Hydroxypyridinium-Vernetzungsstellen. Die Erfindung stellt daher monoklonale Antikörper zur Verfügung, welche durch das Hybridom produziert werden, einschließlich dieser Antikörper, die sodann an einen detektierbaren Marker gekoppelt werden. Beispiele von detektierbaren Markern umfassen Enzyme, Chromophore, Fluorophore, Coenzyme, Enzyminhibitoren, chemilumineszierende Materialien, paramagnetische Metalle, Spinmarkierungen und Radionukleotide.
  • Die Erfindung umfasst auch einen Testkit, welcher für die quantitative Bestimmung der Menge an Peptidfragmenten mit 3-Hydroxypyridinium-Vernetzungsstellen, welche von einer Knochenkollagenresorption abgeleitet sind, welche in einem Körperfluid vorgefunden werden, verwendbar ist und den monoklonalen Antikörper umfasst, welcher für das erste der oben genannten Peptidfragmente, welche von Knochenkollagen abgeleitet sind und 3-Hydroxypyridinium-Vernetzungsstellen enthalten, spezifisch ist. Die monoklonalen Antikörper dieses Testkits können an die oben beschriebenen, detektierbaren Marker gebunden werden.
  • Kurze Beschreibung der Zeichnungen
  • 1 ist ein Graph von Hydroxypyridinium-Resten in Knochenkollagen relativ zum Alter.
  • 2 ist ein Graph des Verhältnisses von Hydroxylysylpyridinolin (HP) zu Lysylpyridinolin (LP) relativ zum Alter.
  • 3a ist ein typisches Umkehrphasen-HPLC-natürliche-Fluoreszenz-Elutionsprofil der aminoterminalen Telopeptide, welches die Stelle des Hauptpeptidfragmentes enthaltend 3-Hydroxypyridinium-Vernetzungsstellen zeigt.
  • 3b ist ein typisches Umkehrphasen-HPLC-natürliche-Fluoreszenz-Elutionsprofil der carboxyterminalen Telopeptide, welches die Stelle des Hauptpeptidfragmentes enthaltend 3-Hydroxypyridinium-Vernetzungsstellen zeigt.
  • 4A ist ein typisches Umkehrphasen-HPLC-Elutionsprofil der natürlichen Fluoreszenz für ein Hydrolysat von Peptidfragmenten aus normalem, menschlichem Urin.
  • 4B ist ein typisches Umkehrphasen-HPLC-Elutionsprofil der natürlichen Fluoreszenz für ein Hydrolysat von Peptidfragmenten aus Urin eines an Paget-Krankheit leidenden Patienten.
  • Detaillierte Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen
  • Diese Erfindung basiert auf der Entdeckung, dass sowohl Lysylpyridinolin (LP)- als auch Hydroxylysylpyridinolin (HP)-Peptidfragmente, welche von reabsorbierten Knochenkollagen abgeleitet sind, in den Urin abgegeben werden, ohne metabolisiert zu werden. Die Erfindung basiert auch auf der Entdeckung, dass keine anderen Bindegewebe signifikante Mengen an LP enthalten und dass das Verhältnis von HP zu LP in reifem Knochenkollagen über die Lebensdauer eines Menschen relativ konstant bleibt.
  • 1 vergleicht die Konzentration von HP und LP sowohl in menschlichem kortikalem Knochen als auch Spongiosa in Bezug auf das Alter. Es wird beobachtet, dass die Konzentration von HP- und LP-Vernetzungsstellen in Knochenkollagen ein Maximum im Alter von 10 bis 15 Jahren erreicht und während des Lebens des Erwachsenen im Wesentlichen konstant bleibt. Darüber hinaus zeigt das Verhältnis von HP zu LP, welches in 2 gezeigt ist, geringe Änderungen während des Lebens und bleibt mit etwa 3,5 bis 1 konstant. Diese Basisdaten demonstrieren, dass die 3-Hydroxypyridinium-Vernetzungsstellen in Knochenkollagen relativ konstant bleiben und dass daher Körperfluide, welche von dem Knochenkollagenabbau abgeleitet sind, 3-Hydroxypyridinium-vernetzte Peptidfragmente in Konzentrationen pro portional zu der absoluten Geschwindigkeit der Knochenresorption enthalten werden.
  • Da LP die einzige 3-Hydroxypyridinium-Vernetzungsstelle in Knochenkollagen ist, basiert das Verfahren zur Bestimmung der absoluten Geschwindigkeit der Knochenresorption in seiner einfachsten Form auf der quantitativen Bestimmung der Konzentration der Peptidfragmente enthaltend 3-Hydroxypyridinium-Vernetzungsstellen und vorzugsweise Lysylpyridinolin (LP)-Vernetzungsstellen in einem Körperfluid. Wie in dieser Beschreibung und in den angeschlossenen Patentansprüchen verwendet, ist mit quantitativer Bestimmung die Messung der Konzentration von Peptidfragmenten enthaltend 3-Hydroxypyridinium-Vernetzungsstellen in einem Aliquot eines Körperfluids gemeint. Geeignete Körperfluide umfassen Urin, Serum und Gelenksflüssigkeit. Das bevorzugte Körperfluid ist Urin.
  • Da die Konzentration von Urin-Peptiden abnehmen wird, wenn das Volumen des Urins ansteigt, ist es des weiteren bevorzugt, dass, wenn Urin das ausgewählte Körperfluid ist, das untersuchte Aliquot aus einer vereinigten Menge an Urin stammt, welcher über einen festen Zeitraum, beispielsweise 24 Std., gesammelt wird. Auf diese Weise wird die absolute Geschwindigkeit der Knochenresorption für einen Zeitraum von 24 Std. berechnet. Alternativ können Urin-Peptide als ein Verhältnis relativ zu einer Markersubstanz, welche im Urin gefunden wird, wie beispielsweise Kreatinin, gemessen werden. Auf diese Weise würde der Urin-Index der Knochenresorption unabhängig von dem Urinvolumen bleiben.
  • Monoklonale oder polyklonale Antikörper können produziert werden, welche spezifisch für die Peptidfragmente enthaltend Lysylpyridinolin-Vernetzungsstellen sind, welche im Urin gefunden werden. Peptidfragmente können aus dem Urin von jedem Patienten isoliert werden; es ist jedoch bevorzugt, dass diese Peptide von Patienten mit Paget-Krankheit oder Hyperparathyroidismus aufgrund der hohen Konzentration von Peptidfragmenten, welche bei diesen Patienten gefunden werden, isoliert werden.
  • ISOLATION VON URINPEPTIDEN
  • Urin von Patienten mit aktiver Paget-Krankheit wird in Dialyseschläuchen mit reduzierter Porosität (>3 500 SpectroporeTM) bei 4°C für 48 Std. dialysiert, um den Großteil an gelösten Stoffen abzutrennen. Unter diesen Bedingungen werden die interes sierenden Peptide größtenteils zurückgehalten. Das gefriergetrocknete Nicht-Diffusat wird dann aus einer Säule (90 cm × 2,5 cm) aus Bio-GelTM P2 (200 – 400 mesh) in 10% Essigsäure bei Raumtemperatur eluiert (200 mg Aliquots). Ein Bereich des Effluenten, welcher die vernetzten Peptide vereinigt, wird durch Messen der Fluoreszenz von gesammelten Fraktionen bei 297 nm Anregung/395 nm Emisson definiert und dieser Zusammenschluss wird gefriergetrocknet. Eine weitere Auflösung dieses Materials wird auf einer Säule aus Bio-GelTM P4 (200 – 400 mesh, 90 cm × 2,5 cm), eluiert in 10% Essigsäure, erhalten. Zwei benachbarte Zusammenschlüsse von Fraktionen werden durch Beobachten der Fluoreszenz des oben genannten Eluenten definiert. Die frühere Fraktion ist an Peptidfragmenten angereichert, welche zwei Aminosäuresequenzen aufweisen, welche von der carboxyterminalen Telopeptid-Domaine der αI(I)-Kette von Knochen-Typ-I-Kollagen, gebunden an eine dritte Sequenz, welche von dem tripel-helikalen Körper des Knochen-Typ-I-Kollagens abgeleitet ist, abgeleitet sind. Diese drei Peptidsequenzen sind mit 3-Hydroxypyridinium vernetzt. Die überlappende, spätere Fraktion ist an Peptidfragmenten angereichert, welche eine Aminosäuresequenz aufweisen, welche von der aminoterminalen Telopeptid-Domaine von Knochen-Typ-I-Kollagen, gebunden über 3-Hydroxypyridinium-Vernetzungsstellen, abgeleitet ist. Einzelne Peptide werden dann von jeder der zwei oben erhaltenen Fraktionen durch Ionenaustauscher-HPLC auf einer TSK DEAE-5-PW-Säule (Bio RadTM 7,5 cm × 7,5 mm) durch Eluieren mit einem Gradienten von NaCl (0–0,2 M) in 0,02 M Tris-HCl, pH 7,5, enthaltend 10% (v/v) Acetonitril, aufgelöst. Die auf dem aminoterminalen Telopeptid basierenden und auf dem carboxyterminalen Telopeptid basierenden vernetzten Peptide eluieren in einer Serie von 3 bis 4 Fluoreszenz-Peaks zwischen 0,08 M und 0,15 M NaCl. Die auf dem carboxyterminalen Telopeptid basierenden, vernetzten Peptide eluieren zuerst als eine Serie von Fluoreszenz-Peaks und die größeren und kleineren, auf aminoterminalem Telopeptid basierenden, vernetzten Peptide eluieren gegen das Ende des Gradienten als charakteristische Peaks. Jeder von diesen wird gesammelt, gefriergetrocknet und auf einer C-18-Umkehrphasen-HPLC-Säule (Vydac 218TP54, 25 cm × 4,6 mm), eluiert mit einem Gradienten (0 – 10%) Acetonitril:n-Propanol (3:1 v/v) in 0,01 M Trifluoressigsäure, chromatographiert. Etwa 100 bis 500 μg einzelner Peptidfragmente enthaltend 3-Hydroxypyridinium-Vernetzungsstellen können mit diesem Verfahren aus einer einzigen 24-Std.-Sammlung von Paget-Urin isoliert werden. Aminosäure-Zusammensetzungen der größeren isolierten Peptide bestätigten die Reinheit und die Molekülgrößen durch die Gesamtzahl-Stöchiometrie der rückgewonnenen Aminosäuren. Die aminoterminale Sequenzanalyse durch Edman-Abbau bestätigte die Basis-Kernstrukturen, welche von den Sequenzen der bekannten Vernet zungsstellen in Typ-I-Kollagen und aus den übereinstimmenden Aminosäure-Zusammensetzungen angenommen wurden. Die aminoterminale Telopeptidsequenz der α2(I)-Kette wurde von der Sequenzanalyse wahrscheinlich aufgrund der bekannten Zyklisierung des aminoterminalen Glutamins zu Pyrrolidoncarbonsäure abgeblockt. Ein typisches Elutionsprofil von aminoterminalen Telopeptiden, welches mit dem oben genannten Verfahren erhalten wurde, ist in 3a gezeigt. Das erhaltene größere Peptidfragment hatte die Aminosäure-Zusammensetzung: (Asx)2(Glx)2(Gly)5Val-Tyr-Ser-Thr, worin Asx die Aminosäure Asp oder Asn ist und Glx die Aminosäure Gln oder Glu ist. Die Sequenz dieses Peptids ist durch die Formel III unten dargestellt. Normaler Urin enthält geringere Mengen des durch die Formel III dargestellten Peptidfragmentes als Urin von Patienten mit Paget-Krankheit. FORMEL III
    Figure 00120001
    die HP- oder LP-vernetzenden Aminosäuren darstellt und Gln Glutamin oder eine vollständig zyklisierte Pyrrolidoncarbonsäure bedeutet.
  • Die auf carboxyterminalem Telopeptid basierenden, vernetzten Peptide, welche durch die Umkehrphasen-HPLC, wie oben beschrieben, aufgelöst wurden, sind in 3b gezeigt. Wie aus dieser Figur ersehen werden kann, werden diese Peptide weiter in eine Serie von carboxyterminalen Telopeptiden aufgelöst, welche jeweils die 3-Hydroxypyridinium-Vernetzungsstellen enthalten. Das Hauptpeptid, welches in 3b gezeigt ist, wurde, wie oben beschrieben, analysiert und es wurde gefunden, dass es die folgende Aminosäurezusammensetzung aufweist:
    (Asp)5(Glu)4(Gly)10(His)2(Arg)2(Hyp)2(Ala)5. Die Sequenz dieses Peptids ist durch die Formel IV unten dargestellt. Es wird angenommen, dass die anderen, auf carboxyterminalem Telopeptid basierenden, vernetzten Peptide, welche als die kleineren Peaks in 3b erscheinen, Hinzufügungen oder Weglassungen von Aminosäuren zu der in der Formel IV gezeigten Struktur darstellen. FORMEL IV
    Figure 00130001
    die HP- oder LP-vernetzenden Aminosäuren darstellt und Gln Glutamin oder eine vollständig zyklisierte Pyrrolidoncarbonsäure darstellt. Dieses Fragment ist nicht Teil der Erfindung.
  • Äquivalente der durch die obigen Strukturen dargestellten Peptide umfassen jene Fälle, worin einige Abänderungen in der Urin-Peptidstruktur auftreten. Beispiele von Abwandlungen umfassen Aminosäure-Additionen an die N- und C-Termini der Formeln III und IV ebenso wie einige terminale Aminosäure-Entfernungen. Kleinere Peptidfragmente des durch die Formel IV dargestellten Moleküls, welche von der Knochenreadsorption abgeleitet sind, sind insbesondere in Urin evident. Diese werden in den kleineren Peaks der Carboxytelopeptid-Fraktion, welche in 3b dargestellt ist, gefunden und können durch die Aminosäure-Zusammensetzung und Sequenzanalyse identifiziert werden. Es wird angenommen, dass Antikörper, welche gegen die Haptene produziert werden welche durch die Formeln III und IV dargestellt sind mit den Urin-Peptiden mit geringfügig abgeänderter Struktur reagieren werden. In einigen Situationen kann es wünschenswert sein, Patienten-spezifische Antikörper für die von der Knochenresorption abgeleiteten Urin-Peptide zu bilden. In diesen Fällen wird dasselbe Verfahren, wie oben beschrieben, angewandt, um Urin-Peptide zu isolieren, deren Struktur geringfügig von jener, welche durch die Formeln III und IV dargestellt ist, abweichen kann.
  • IMMUNOLOGISCHES VERFAHREN FÜR DIE INDEXIERUNG DER KNOCHENRESORPTION
  • Immunologische Bindungspartner, welche fähig sind, spezifisch an Peptidfragmente, welche von Knochenkollagen abgeleitet sind, welche aus einem physiologischen Fluid erhalten wurden, zu binden, können durch bekannte Verfahren hergestellt werden. Das bevorzugte Verfahren zur Isolierung dieser Peptidfragmente ist oben beschrieben. Mit immunologischen Bindungspartnern, wie sie hier verwendet werden, sind Antikörper und Antikörperfragmente gemeint.
  • Sowohl monoklonale als auch polyklonale Antikörper, welche spezifisch die durch die Formeln III und IV dargestellten Peptide und ihre Äquivalente binden, können durch bekannte Verfahren hergestellt werden. Vergleiche beispielsweise Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Campbell, A.M. (1986) Vol. 13 Elsevier, hier durch eine Referenz eingeschlossen. Es ist möglich, Antikörper gegen die obigen Peptide oder ihre Äquivalente, wie isoliert, herzustellen. Da jedoch die Molekulargewichte dieser Peptidfragmente weniger als 5000 betragen, ist es bevorzugt, dass das Hapten an ein Trägermolekül konjugiert wird. Geeignete Trägermoleküle umfassen Rinderserumalbumin, Ovalbumin, Thyroglobulin und Schlüsselloch-Schnecken-Hämocyanin (KLH), wobei sie jedoch nicht auf diese beschränkt sind. Bevorzugte Träger sind Thyroglobulin und KLH.
  • Es ist bekannt, dass die Orientierung des Haptens, wie es an das Trägerprotein gebunden ist, von kritischer Bedeutung für die Spezifität des Antiserums ist. Des weiteren sind nicht alle Hapten-Protein-Konjugate gleichermaßen erfolgreiche Immunogene. Die Auswahl eines Protokolls für die Bindung des spezifischen Haptens an das Trägerprotein hängt daher von der Aminosäuresequenz der ausgewählten Urin-Peptidfragmente ab. Für das durch die Formel III dargestellte Urin-Peptidfragment würde ein bevorzugtes Protokoll die Kopplung dieses Haptens an Schlüsselloch-Schnecken-Hämocyanin (KLH) oder an einen anderen geeigneten Träger mit Carbodiimid umfassen. Dies würde sicherstellen, dass der größte Teil des Haptens durch den Gly-Carboxyterminus konjugiert werden würde, wodurch das bevorzugte Epitop, nämlich Tyr und die 3-Hydroxypyridinium-Vernetzungsstelle, für immunstimu lierte Wirbeltier-Antikörper-produzierende Zellen (d.h. B-Lymphozyten) präsentiert würde.
  • Andere Urin-Peptidfragmente können in Abhängigkeit von der Quelle verschiedene Bindungsprotokolle erfordern. Dementsprechend kann eine Anzahl von Bindungsmitteln geeignet verwendet werden. Diese umfassen Carbodiimide, Glutaraldehyd, gemischte Anhydride ebenso wie sowohl homo-bifunktionelle als auch hetero-bifunktionelle Reagenzien (siehe beispielsweise den Pierce 1986–87 Katalog, Pierce Chemical Co., Rockford, IL), wobei sie jedoch nicht auf diese beschränkt sind. Bevorzugte Bindungsmittel umfassen Carbodiimide und hetero-bifunktionelle Reagenzien, wie etwa m-Maleimidobenzyl-N-hydroxysuccinimidester (MBS).
  • Verfahren zum Binden des Haptens an das Trägermolekül sind bekannt. Siehe beispielsweise Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Chard, T. (1987) Vol. 6, Partz Elsevier, N.Y., das hier durch eine Referenz eingeschlossen ist.
  • Es können entweder monoklonale oder polyklonale Antikörper für das Hapten-Trägermolekül-Immunogen hergestellt werden. Jedoch ist es bevorzugt, dass monoklonale Antikörper MAb hergestellt werden. Aus diesem Grund ist es bevorzugt, dass die Immunisierung in der Maus durchgeführt wird. Immunisierungsprotokolle für die Maus umfassen üblicherweise ein Adjuvans. Beispiele von geeigneten Protokollen sind von Chard, T. (1987), siehe oben, beschrieben. Milzzellen von der immunisierten Maus werden gesammelt und homogenisiert und danach mit Krebszellen in der Gegenwart von Polyethylenglykol verschmolzen, um ein verschmolzenes Zellhybrid zu bilden, welches monoklonale Antikörper bildet, welche spezifisch für Peptidfragmente sind, welche von Knochenkollagen abgeleitet sind. Beispiele von derartigen Peptidfragmenten sind durch die obigen Formeln III und IV dargestellt. Geeignete Krebszellen umfassen Myeloma-, Hepatoma-, Karzinoma- und Sarcomazellen. Detaillierte Beschreibungen dieses Verfahrens umfassend Screening-Protokolle, Protokolle für das Kultivieren von ausgewählten Hybridzellen und das Gewinnen von monoklonalen Antikörpern, welche von den ausgewählten Hybridzellen gebildet werden, werden in Galfre, G. und Milstein, C. (1981) Meth. Enzymol. 73, 1 zur Verfügung gestellt. Ein bevorzugtes vorläufiges Screening-Protokoll umfasst die Verwendung von Peptidfragmenten, welche von der Knochenkollagenresorption abgeleitet sind und 3-Hydroxypyridinium-Vernetzungsstellen enthalten, in einem Festphasen-Radioimmunoassay.
  • Immunologische Bindungspartner, insbesondere monoklonale Antikörper, welche durch die obigen Verfahren oder äquivalente Verfahren hergestellt werden, werden in verschiedenen immunometrischen Tests verwendet, um die Konzentration von Peptidfragmenten mit 3-Hydroxypyridinium-Vernetzungsstellen, die von der Knochenkollagenresorption abgeleitet sind, in Körperfluiden quantitativ zu bestimmen. Diese immunometrischen Tests umfassen einen monoklonalen Antikörper oder ein Antikörperfragment in Kopplung an einen detektierbaren Marker. Beispiele von geeigneten detektierbaren Markern umfassen Enzyme, Coenzyme, Enzyminhibitoren, Chromophore, Fluorophore, chemilumineszierende Materialien, paramagnetische Metalle, Spinmarkierungen und Radionuklide, wobei sie jedoch nicht auf diese beschränkt sind. Beispiele von immunometrischen Standardverfahren, welche für die Indexierung der Knochenresorption geeignet sind, umfassen den Enzymgekoppelten Immunosorbent-Test (ELISA) (Ingvall, E. (1981) Meth. Enzymol. 70), den Radioimmunassay (RIA) und den "Sandwich"-immunradiometrischen Assay (IRMA), wobei sie jedoch nicht darauf beschränkt sind. In ihrer einfachsten Form können diese immunometrischen Verfahren verwendet werden, um die absolute Geschwindigkeit der Knochenresorption durch ein einfaches Kontaktieren eines Körperfluids mit dem immunologischen Bindungspartner, welcher spezifisch für ein Peptidfragment ist, welches 3-Hydroxypyridinium-Vernetzungsstellen, abgeleitet von der Knochenkollagenresorption, aufweist, zu bestimmen. Es ist bevorzugt, dass die oben beschriebenen, immunometrischen Tests direkt an unbehandelten Körperfluiden durchgeführt werden. Manchmal können jedoch kontaminierende Substanzen mit dem Test wechselwirken, was eine teilweise Aufreinigung des Körperfluids erfordert. Teilweise Aufreinigungsverfahren umfassen die Kartuschenadsorption und -elution, die Molekularsieb-Chromatographie, die Dialyse, den Ionenaustausch, die Aluminiumoxid-Chromatographie, die Hydroxyapatit-Chromatographie und Kombinationen davon, wobei sie jedoch nicht darauf beschränkt sind.
  • 4A zeigt das Elutionsprofil, welches durch Umkehrphasen-HPLC für natürliche Fluoreszenz für ein Hydrolysat von Peptidfragmenten aus normalem, menschlichem Urin aufgelöst wurde. Die Messung der integrierten Fläche innerhalb der Hüllkurve einer gegebenen Komponente wird verwendet, um die Konzentration dieser Komponente in der Probe zu bestimmen. Das Verhältnis von HP:LP, welches in normalem, menschlichem Urin und in Urin aus Patienten, welche an Paget-Krankheit leiden, gefunden wurde, 4B, beträgt jeweils etwa 4,5:1. Dies ist geringfügig höher als das in Knochen selbst gefundene Verhältnis von 4:1 (Eyre et al., 1984). Das in Urin gefundene, höhere Verhältnis zeigt an, dass ein Teil der HP- Fraktion im Urin von anderen Quellen als dem Knochen, wie der Nahrung oder anderen Quellen des Kollagenabbaues, stammen kann, d.h. dem Knorpelkatabolismus. Aus diesem Grund ist es bevorzugt, dass die Peptidfragmente, welche LP-Vernetzungsstellen aufweisen, welche lediglich vom Knochen abgeleitet sind, verwendet werden, um einen absoluten Index der Knochenresorption zur Verfügung zu stellen. In der Abwesenheit eines übermäßigen Knorpelabbaues, wie beispielsweise bei rheumatoider Arthritis oder in Fällen, in welchen der Knochen schnell absorbiert wird, können jedoch Peptidfragmente, welche HP-Vernetzungsstellen aufweisen oder eine Kombination von Peptidfragmenten, welche HP-Vernetzungsstellen aufweisen, zusammen mit Peptidfragmenten, welche LP-Vernetzungsstellen aufweisen, als ein Index der Knochenresorption verwendet werden.
  • Während die Erfindung in Zusammenhang mit bevorzugten Ausführungsformen beschrieben wurde, wird ein Fachmann nach dem Lesen der vorhergehenden Beschreibung in der Lage sein, zahlreiche Änderungen, Substitutionen von Äquivalenten oder Abänderungen des hierin beschriebenen Gegenstandes durchzuführen. Daher kann die Erfindung auf andere Weise, als hier speziell beschrieben, durchgeführt werden. Es ist daher beabsichtigt, dass der Schutz, welcher durch das Patent gewährt wird, nur durch die beiliegenden Patentansprüche und Äquivalente derselben beschränkt wird.

Claims (10)

  1. Peptidfragment, das von der aminoterminalen Telopeptid-Domaine von Knochen-Typ-I-Kollagen abgeleitet ist, welche durch eine 3-Hydroxypyridinium-Vernetzungsstelle vernetzt ist, umfassend die Aminosäuresequenz:
    Figure 00180001
    Hydroxylysylpyridinolin oder Lysylpyridinolin darstellt und Gln Glutamin oder vollständig zyklisierte Pyrrolidoncarbonsäure ist.
  2. Hybridom, das dazu fähig ist, monoklonale Antikörper zu erzeugen, welche spezifisch für das Peptidfragment von Anspruch 1 sind.
  3. Immunologischer Bindungspartner, der spezifisch für ein Peptidfragment ist, wie es in Anspruch 1 definiert ist.
  4. Immunologischer Bindungspartner nach Anspruch 3, der ein monoklonaler Antikörper ist.
  5. Immunologischer Bindungspartner, wie in Anspruch 3 oder 4 beansprucht, der an einen nachweisbaren Marker gekoppelt ist.
  6. Testkit für die quantitative Bestimmung der Menge eines Peptidfragments in einer Körperflüssigkeit, das aus der Knochenkollagenresorption stammt und eine 3-Hydroxypyridinium-Vernetzungsstelle aufweist, wobei der Kit einen immunologischen Bindungspartner umfasst, wie er in einem der Ansprüche 3 bis 5 definiert ist.
  7. Verwendung eines Peptidfragments, wie in Anspruch 1 beansprucht, zur Herstellung eines immunogenen Mittels.
  8. Verwendung des Peptidfragments, wie in Anspruch 1 beansprucht, als ein Standard bei der quantitativen Bestimmung der Menge des Peptidfragments in einer Körperflüssigkeit, welches aus der Knochenkollagenresorption stammt.
  9. Immunologischer Bindungspartner, wie in einem der Ansprüche 3 bis 5 beansprucht, zur Verwendung als ein diagnostisches Mittel.
  10. Immunogene Zusammensetzung, umfassend ein Peptidfragment, wie es in Anspruch 1 definiert ist.
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Families Citing this family (71)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5320970A (en) * 1987-11-06 1994-06-14 Washington Research Foundation Detection of collagen degradation in vivo
US4973666A (en) * 1987-11-06 1990-11-27 Washington Research Foundation Peptide fragments containing HP and LP cross-links
US6027903A (en) * 1987-11-06 2000-02-22 Washington Research Foundation Kit for detecting analyte indicative of type I collagen resorption in vivo
US5300434A (en) * 1987-11-06 1994-04-05 Washington Research Foundation Hybridoma cell line producing an antibody to type-I collagen amino-terminal telopeptide
US5702909A (en) * 1987-11-06 1997-12-30 Washington Research Foundation Methods of detecting collagen type II degradation in vivo
US6153732A (en) * 1987-11-06 2000-11-28 Washington Research Foundation Kit for detecting analyte indicative of type II collagen resorption in vivo
US5962639A (en) * 1987-11-06 1999-10-05 Washington Research Foundation Synthetic peptides corresponding to telopeptide sequences of cross-linked type I collagen metabolites
US5283197A (en) * 1988-06-25 1994-02-01 The Rowett Research Institute Method of monitoring collagen degradation
GB8815174D0 (en) * 1988-06-25 1988-08-03 Rowett Research Inst Method of monitoring collagen degradation
GB8929366D0 (en) * 1989-12-30 1990-02-28 Rowett Research Inst Method to detect connective tissue disorder in humans and animals
US5217903A (en) * 1990-05-15 1993-06-08 Trustees Of Boston University Measuring connective tissue breakdown products in body fluids
US5176655A (en) * 1990-11-08 1993-01-05 Mbo Laboratories, Inc. Disposable medical needle and catheter placement assembly having full safety enclosure means
US6121002A (en) * 1990-12-26 2000-09-19 The Rowett Research Institute Method to detect bone and other connective tissue disorders in humans and animals
GB9105893D0 (en) * 1991-03-20 1991-05-08 Orion Yhtymae Oy Bone resorption assay based on a peptide liberated during collagen degradation
US5362852A (en) * 1991-09-27 1994-11-08 Pfizer Inc. Modified peptide derivatives conjugated at 2-hydroxyethylamine moieties
US6175016B1 (en) * 1992-01-31 2001-01-16 Novartis Ag Pyridine derivatives
GB9202139D0 (en) * 1992-01-31 1992-03-18 Sandoz Ltd Improvements in or relating to organic compounds
JP3113440B2 (ja) * 1992-03-25 2000-11-27 日本臓器製薬株式会社 ピリジニウム誘導体
US5620861A (en) * 1992-07-31 1997-04-15 Metra Biosystems, Inc. Method and kit for pyridinium crosslink assay
DE69332655T2 (de) * 1992-07-31 2003-11-27 Metra Biosystems Inc Verfahren und testsatz für pyridinium-crosslink-assay
AU2481992A (en) * 1992-08-28 1994-03-29 Rowett Research Institute, The Method to monitor drug therapy and assess metastasis
US5350855A (en) * 1992-09-30 1994-09-27 Metra Biosystems, Inc. Derivatized D-acyl pyridinium reagent
US6132976A (en) * 1992-12-04 2000-10-17 Shriners Hospitals For Children Immunoassays for the measurement of collagen denaturation and cleavage in cartilage
US5736344A (en) * 1992-12-17 1998-04-07 Metra Biosystems, Inc. Serum pyridinium crosslinks assay
DE69333641T2 (de) * 1992-12-28 2005-11-03 Baylink, David Jeston, Redlands Methode zur messung der knochenresorption
US5541295A (en) * 1993-02-12 1996-07-30 The Board Of Governors For Higher Education State Of Rhode Island And Providence Plantations Detection of type II collagen and its peptides
DK104093D0 (da) * 1993-09-17 1993-09-17 Osteometer A S Fremgangsmaade til bestemmelse af collagen-fragmenter i legemsvaesker, test-kit og midler til udoevelse af fremgangsmaaden og anvendelse af fremgangsmaaden til diagnosticering af lidelser associeret til collagen-metabolismen
US6110689A (en) 1994-01-21 2000-08-29 Osteometer A/S Method of assaying collagen fragments in body fluids, a test kit and means for carrying out the method and use of the method to diagnose the presence of disorders associated with the metabolism of collagen
US5516699A (en) * 1994-02-16 1996-05-14 Institute Of Molecular Biology, Inc. Pyridinoline crosslinks as markers of periodontal and peri-implant disease activity
GB9506050D0 (en) * 1995-03-24 1995-05-10 Osteometer A S Assaying collagen fragments in body fluids
US5589346A (en) * 1994-06-21 1996-12-31 Bioquant, Inc. Method of monitoring markers of bone metabolism
JP3242792B2 (ja) * 1994-08-05 2001-12-25 日本臓器製薬株式会社 ナフチリジニウム誘導体
JPH10507266A (ja) * 1994-10-17 1998-07-14 オステオミーター・ビオ・テク・エー／エス 体液中のコラーゲンの断片化パターンの評価とコラーゲンの代謝に関連する疾患の診断
US5763272A (en) * 1994-12-23 1998-06-09 Boehringer Mannheim Gmbh Hybridoma for producing antibody for collagen I
US5661039A (en) * 1995-03-01 1997-08-26 Metra Biosystems, Inc. Perspiration assay for bone resorption
US5750647A (en) * 1995-05-19 1998-05-12 Washington Research Foundation Synthetic peptide analogs of NTx
US6107047A (en) * 1996-03-21 2000-08-22 Osteometer Biotech A/S Assaying protein fragments in body fluids
GB9617616D0 (en) 1996-08-22 1996-10-02 Osteometer Biotech As Assaying protein fragments in body fluids
EP0829724A1 (de) * 1996-09-17 1998-03-18 Nederlandse Organisatie Voor Toegepast-Natuurwetenschappelijk Onderzoek Tno Verfahren zum Nachweis von Kollagenabbau
ES2160985T3 (es) 1996-12-09 2001-11-16 Osteometer Biotech As Ensayos de tipo sandwich para fragmentos de colageno.
US5834610A (en) * 1997-05-06 1998-11-10 Johnson; Gary M. Conversion of pyridinoline to deoxypyridinoline
US5989925A (en) * 1997-06-27 1999-11-23 Serex, Inc. Antibody to and assay for peptide linked-pyridinoline as indicator of bone resorption level
AU752227B2 (en) * 1997-07-31 2002-09-12 General Hospital Corporation, The Collagen-peptide assay method
US6117646A (en) * 1997-09-22 2000-09-12 Osteometer Biotech A/S Assaying protein fragments in body fluids
US6780609B1 (en) 1998-10-23 2004-08-24 Genome Therapeutics Corporation High bone mass gene of 1.1q13.3
US6916903B2 (en) * 1998-06-19 2005-07-12 Washington Research Foundation Collagen type III synthetic peptides for collagen resorption assays
JP4436972B2 (ja) 1998-06-19 2010-03-24 ワシントン リサーチ ファンデーション 軟骨吸収アッセイ
US6602980B1 (en) 1998-06-19 2003-08-05 Washington Research Foundation Collagen type III synthetic peptides for collagen resorption assays
US6348320B1 (en) * 1998-06-19 2002-02-19 Washington Research Foundation Cartilage resorption assays measuring type II collagen fragments
US6642007B1 (en) * 1998-11-02 2003-11-04 Pfizer Inc. Assays for measurement of type II collagen fragments in urine
FR2795823B1 (fr) * 1999-07-01 2001-11-23 Inst Nat Sante Rech Med Methodes et kits pour le diagnostic ou le suivi d'une pathologie synoviale ou osteoarticulaire comprenant l'utilisation d'un marqueur specifique de la degradation du tissu synovial
US6613537B2 (en) 2000-02-29 2003-09-02 Nippon Zoki Pharmaceutical Co., Ltd. Pyrrolopyridinium derivatives
JP2004510981A (ja) 2000-10-03 2004-04-08 ロウェット、リサーチ、インスティテュート ピロール含有生体化合物の測定方法およびピロール含有生体化合物
US7204807B2 (en) * 2001-07-24 2007-04-17 Sunlight Medical Ltd. Joint analysis using ultrasound
WO2003009758A1 (en) 2001-07-24 2003-02-06 Sunlight Medical, Ltd. Bone age assessment using ultrasound
EP1497646A4 (de) * 2001-08-31 2006-07-19 Pharmacia Corp Peptid-biomarker und identifizierungsverfahren
WO2003048396A1 (en) * 2001-12-03 2003-06-12 Seroptix, Inc. A method for identifying markers
WO2003077250A1 (fr) * 2002-03-08 2003-09-18 Sony Corporation Support d'enregistrement et dispositif de reproduction associe, procede de reproduction, appareil destine a la fabrication de ce support d'enregistrement, procede de fabrication de ce support d'enregistrement et dispositif d'enregistrement
ES2311696T3 (es) * 2002-03-13 2009-02-16 Universite De Liege Metodo para la monitorizacion de la degradacion del colageno tipo ii en el cartilago.
US7110400B2 (en) * 2002-04-10 2006-09-19 Integrated Device Technology, Inc. Random access memory architecture and serial interface with continuous packet handling capability
DE10239479A1 (de) * 2002-08-28 2004-03-04 Bayer Cropscience Ag Substituierte spirocyclische Ketoenole
JP2006520478A (ja) * 2003-01-17 2006-09-07 ダイオード・ソリューションズ・インコーポレーテッド 有機材料を用いたディスプレイ
US20060030538A1 (en) * 2004-07-21 2006-02-09 Medtronic, Inc. Methods for reducing or preventing localized fibrosis using SiRNA
WO2006020231A2 (en) * 2004-07-21 2006-02-23 Medtronic, Inc. Medical devices and methods for reducing localized fibrosis
WO2009091581A2 (en) * 2008-01-18 2009-07-23 Vatrix Medical, Inc. Diagnostic biomarkers for vascular aneurysm
WO2009153783A1 (en) * 2008-06-16 2009-12-23 Mor Research Applications Ltd. Monitoring skin metabolism products for evaluating burn injury
US8759535B2 (en) 2010-02-18 2014-06-24 High Point Pharmaceuticals, Llc Substituted fused imidazole derivatives, pharmaceutical compositions, and methods of use thereof
US20110294142A1 (en) 2010-05-27 2011-12-01 Joydeep Lahiri Multiply Fluorescently Labeled Calcium Phosphate-Protein Surfaces
US20110294151A1 (en) 2010-05-27 2011-12-01 Hongwei Hanna Rao Fluorescently Labeled Calcium Phosphate Surfaces
US9777055B2 (en) 2012-04-20 2017-10-03 Thomas Jefferson University Engineered antibody for inhibition of fibrosis
WO2023068248A1 (ja) * 2021-10-20 2023-04-27 積水メディカル株式会社 Ｉ型コラーゲン架橋ｎ－テロペプチドの免疫測定方法及び免疫測定キット、並びに抗体又はその抗体断片

Family Cites Families (22)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
NL6716836A (de) * 1967-12-11 1969-06-13
US4094646A (en) * 1977-06-02 1978-06-13 The Baltimore Spice Company Rapid method of assaying collagen in meat and meat products
DE2816841A1 (de) * 1978-04-18 1979-10-31 Max Planck Gesellschaft Radioimmunologische bestimmung von prokollagen (typ iii) und prokollagen- peptid (typ iii)
US4298593A (en) * 1979-08-21 1981-11-03 Abbott Laboratories Reagents and methods utilizing labeled Fab bound to antigens
US4371374A (en) * 1980-11-17 1983-02-01 The Rockefeller University Monitoring metabolic control in diabetic patients by measuring glycosylated amino acids and peptides in urine
DE3209149A1 (de) * 1982-03-13 1983-10-06 Hoechst Ag Verfahren zur gemeinsamen immunologischen bestimmung von prokollagen-peptid (typ iii) und prokollagen-peptid col 1 (typ iii) und verfahren zur herstellung von anti-prokollagen-peptid col 1 (typ iii)-serum
US4628027A (en) * 1982-05-19 1986-12-09 Molecular Engineering Associates, Ltd. Vitro diagnostic methods using monoclonal antibodies against connective tissue proteins
EP0128041A3 (de) * 1983-06-06 1986-12-03 David Jeston Baylink Polypeptide mit einer Skelettwachstumsfaktor-Wirksamkeit
US4731326A (en) * 1984-06-04 1988-03-15 Ortho Diagnostic Systems Inc. Disease diagnosis by detection of shed normal tissue antigens
US4774227A (en) * 1986-02-14 1988-09-27 Collagen Corporation Collagen compositions for bone repair containing autogeneic marrow
JPH0638081B2 (ja) * 1986-09-04 1994-05-18 富士薬品工業株式会社 ヒトコラーゲンペプチドの酵素免疫測定法
EP0289314B1 (de) * 1987-04-28 1994-10-12 Roche Diagnostics GmbH Verwendung von IGF-II zur Behandlung von Knochenkrankheiten
GB2205643B (en) * 1987-05-08 1991-03-13 Farmos Group Limited Type iii collagen degradation assay
US5300434A (en) * 1987-11-06 1994-04-05 Washington Research Foundation Hybridoma cell line producing an antibody to type-I collagen amino-terminal telopeptide
US5320970A (en) * 1987-11-06 1994-06-14 Washington Research Foundation Detection of collagen degradation in vivo
US4973666A (en) * 1987-11-06 1990-11-27 Washington Research Foundation Peptide fragments containing HP and LP cross-links
GB8815174D0 (en) † 1988-06-25 1988-08-03 Rowett Research Inst Method of monitoring collagen degradation
JPH04502854A (ja) * 1988-10-24 1992-05-28 カターソン，ブルース 変形性関節症の初期段階の診断、モニタリングならびに治療の方法および組成物
WO1990008195A1 (en) * 1989-01-13 1990-07-26 President And Fellows Of Harvard College Monoclonal antibody to human type ix collagen
US5055382A (en) * 1989-02-01 1991-10-08 Long John J Bleach-fix regeneration kit and use thereof in photographic processing
US5340934A (en) * 1989-11-03 1994-08-23 The United States Of Americas As Represented By The Secretary Of Health & Human Services CDNA sequences of human bone matrix proteins
GB9105893D0 (en) † 1991-03-20 1991-05-08 Orion Yhtymae Oy Bone resorption assay based on a peptide liberated during collagen degradation

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Publication number Publication date
US6509450B2 (en) 2003-01-21
EP0394296B1 (de) 1995-01-18
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US6204367B1 (en) 2001-03-20
US5834221A (en) 1998-11-10
EP0394296A1 (de) 1990-10-31
US20040009531A1 (en) 2004-01-15
HK101395A (en) 1995-06-30
US5455179A (en) 1995-10-03
DE3852827D1 (de) 1995-03-02
WO1989004491A1 (en) 1989-05-18
US5140103A (en) 1992-08-18

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