DE3854951T3 - Verfahren für Immunochromatographie mit Kolloidteilchen - Google Patents

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Description

  • TECHNISCHER HINTERGRUND
  • Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein Assayvorrichtungen und insbesondere solche Vorrichtungen, die chromatographische Verfahren anwenden, um spezifische Bindungsassays durchzuführen. Gemäß einem Aspekt der vorliegenden Erfindung werden Verfahren bereitgestellt, die mit kolloidalen Partikeln markierte spezifische Bindungsmaterialien verwenden, welche in Anwesenheit eines den chromatographischen Transport erleichternden Agens chromatographisch transportiert werden, wobei das Agens ein meta-lösliches Protein umfasst, das chemisch behandelt wurde, um es hydrophiler zu machen als in seiner natürlichen Form, wobei die Markierung zur Erzeugung visuell nachweisbarer Signale befähigt ist. Gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung werden Verfahren und Vorrichtungen bereitgestellt, die mit kollodialen Partikeln markierte spezifische Bindungsmaterialien verwenden, welche in Anwesenheit eines meta-löslichen Proteins, das als den chromatographischen Transport erleichterndes Agens wirkt, auf einem chromatographischen Medium antrocknen gelassen werden, und die zur schnellen Wiederauflösung in Anwesenheit eines geeigneten Lösungsmittels wie etwa der Probe oder einem chromatographischen Transportlösungsmittel fähig sind.
  • Immunologische Assays sind erwiesenermaßen bei einer Vielzahl von klinischen Anwendungen von großem Wert. Solche Assays beruhen auf spezifischen Bindungsreaktionen zwischen Immunoglobulinen (Antikörpern) und Substanzen, die spezifische antigene Determinanten (Antigene) aufweisen. Die Antikörper binden selektiv an Ligandenmaterialien, die das Antigen aufweisen, für das sie spezifisch reaktiv sind, und sie sind in der Lage, den Liganden von anderen Substanzen zu unterscheiden, der ähnliche Charakteristiken aufweist.
  • Da die Ergebnisse von immunologischen und anderen spezifischen Bindungsreaktionen oft nicht direkt beobachtbar sind, sind verschiedene Verfahren zu deren indirekter Beobachtung bereitgestellt worden. Solche Verfahren umfassen die Markierung eines der Glieder des spezifischen Bindungspaares mit einem Radioisotop, mit einem Chromophor, mit einem Fluorophor oder einer enzymatischen Markierung. Radiomarkierungen, Chromophore und Fluorophore können mittels der Verwendung von Strahlungsdetektoren, Spektrophotometern oder mit dem bloßem Auge nachgewiesen werden. Wenn die Glieder eines spezifischen Bindungspaares mit einer Enzymmarkierung bezeichnet sind, kann ihre Anwesenheit mittels enzymatischer Aktivierung eines Reaktionssystems nachgewiesen werden, wobei eine Verbindung, wie etwa ein Farbstoff aktiviert wird, um ein nachweisbares Signal zu erzeugen.
  • Es gibt drei gut bekannte Sorten von immunologischen spezifischen Bindungsassays. Bei konkurrierenden Bindungsassays konkurrieren markierte Reagenzien und unmarkierte Analytverbindungen um Bindungszentren auf einem Bindungsmaterial. Nach einer Inkubationszeitdauer werden ungebundene Substanzen weggewaschen, und die Menge an markiertem Reagenz, das an das Zentrum gebunden ist, wird mit Vergleichsmengen zur Bestimmung der Analytkonzentration in der Probenlösung verglichen. Eine zweite Sorte von immunologischem Assay ist als Sandwichassay bekannt und umfaßt allgemein das In-Kontakt-Bringen einer Analytprobenlösung mit einer Oberfläche, die ein erstes Bindungsmaterial aufweist, das für den Analyten immunologisch spezifisch ist. Nach einem Waschschritt wird eine Lösung, die ein markiertes zweites Bindungsmaterial umfaßt, das gegenüber dem Analyten, der nachgewiesen werden soll, spezifisch reaktiv ist, dann dem Assay zugesetzt. Das markierte zweite Bindungsmaterial bindet an allen Analyten, der seinerseits an das erste Bindungsmaterial gebunden ist. Das Assaysystem wird dann einem Waschschritt unterworfen, um alles markierte zweite Bindungsmaterial zu entfernen, das nicht an den Analyten binden konnte. Die verbleibende Menge an markiertem Material kann dann bestimmt werden und ist eine Anzeige für die Menge an Analyt, der in der Probe vorhanden ist. Obwohl der Ausdruck Sandwichassay oft verwendet wird, um immunologische Assays zu bezeichnen, bei denen das erste und das markierte Reagenzmaterial beides Antikörper oder beides Antigene sind, so daß das "Sandwich" die Form Antikörper/Antigen/markierter Antikörper aufweist, umfaßt eine breitere Definition des Ausdrucks Sandwich-Typ-Assay ebenfalls andere Sorten von Drei-Komponenten-Assays, einschließlich solchen, die manchmal als "indirekte Sandwiches" bezeichnet werden, welche von der Form Antigen/Antikörper/markierter (anti-Immunoglobulin) Antikörper sein können.
  • Ein dritter Typ des immunologischen Assays ist das Agglutinationsassay, daß beispielhaft durch gutbekannte Assays auf Blutantigene und Serumtypen vertreten wird. Die immunologische Reaktivität zwischen Antikörpern innerhalb des Serums und Antigenen, die von den Oberflächen der roten Blutkörperchen angeboten werden, wird durch die Ausbildung eines dreidimensionalen vernetzten Netzwerkes von Antigen (roten Blutkörperchen) und Antikörpern angezeigt. Die Agglutination der Mischung aus Serum/roten Blutkörperchen führt zu der Ausbildung eines makroskopischen Pellets im Reagenzgefäß, das mit dem bloßem Auge beobachtet werden kann.
  • Diese verschiedenen Immunoassyverfahren wurden ursprünglich als "Flüssigphasenassays" in Vorrichtungen wie Reagenzgläsern durchgeführt, in denen die Antigen/Antikörperkonjugate zentrifugiert und ausgefällt wurden. Neuerdings sind Verfahren entwickelt worden, bei denen Antikörper oder Antigene auf die Oberfläche von Mikrotitervertiefungen aufgezogen werden, und die Reaktionen in Lösung in solchen Vertiefungen durchgeführt werden. Es sind ebenfalls Verfahren entwickelt worden, um "Festphasenassays" durchzuführen, bei denen die immunologischen Reaktionen in Lösung an festen Substraten durch geführt werden, einschließlich solchen, welche poröse oder faserige Materialien sind. Im Rahmen solcher Verfahren werden poröse Trägermaterialien in Streifen oder in anderen Formen zugeschnitten, auf denen die Antikörper oder Antigene mittels Adsorption, Absorption oder kovalenter Bindung immobilisiert werden. Probenmaterialien, die einen Analyten enthalten, welcher gegenüber dem immobilisierten Glied des Bindungspaares spezifisch reaktiv ist, werden auf das – Trägermaterial aufgegeben, wo der Analyt über die Reaktion mit seinem korrespondierenden Bindungspaarglied immobilisiert wird. Die nicht abreagierten Probenmaterialien, werden dann mittels eines Waschschrittes entfernt, nach dem, im Falle eines Assays vom Sandwichtyp, ein markiertes Reagenz auf das Trägermaterial aufgegeben wird, das zur Reaktion mit und zur Immobilisierung durch den immobilisierten Analyten befähigt ist. Das Trägermaterial wird dann gewaschen, damit die Anwesenheit des markierten Reagenzes, und damit des Analyten, nachgewiesen werden kann.
  • Abwandlungen solcher "Festphasenassays" sind bekannt, bei denen einer oder mehrere Probenbestandteile oder Reagenzien mittels chromatographischen Lösungsmitteltransportes bewegt wird. Das U.S. Patent Nr. 4 168 146 von Grubb, et al. offenbart poröse Teststreifen, auf denen Antikörper immobilisiert sind. Die Streifen werden dann mit abgemessenen Mengen von wässerigen Lösungen in Kontakt gebracht, die den Antigenanalyten enthalten. Die Antigenmoleküle innerhalb der Testlösung wandern auf Grund der Kapillarwirkung durch den Teststreifen, da aber die gebundenen Antikörper die Wanderung der Antigene, für die sie spezifisch sind, verzögern, ist das Ausmaß der Wanderung der Antigenmoleküle über einen festgelegten Zeitraum eine Funktion der Antigenkonzentration in der Testlösung. Die Antigen enthaltenden Bereiche der diagnostischen Vorrichtung, werden dann durch die Zugabe von Enzym oder von mit fluoreszentem Chromophor markierten Antikörper angezeigt.
  • Das U.S. Patent Nr. 4 517 288 von Giegel, et al. offenbart Verfahren zur Durchführung von Festphasenimmunoassays auf inerten porösen Materialien. Das Patent offenbart die immunologische Immobilisierung eines Bindungsmaterials innerhalb einer besonderen Zone des porösen Materials und das Aufbringen der Probe auf die Zone, die das immebilisierte Bindungsmaterial enthält. Ein enzymmarkiertes Indikatormaterial, das an den Analyten bindet, wird dann auf die Zone aufgebracht, wobei es in einer Menge, die zu der Menge an Analyt in der Zone in Beziehung steht, immobilisiert wird. Es wird dann ein Lösungsmittel in der Mitte der Zone aufgebracht, um ungebundenes markiertes Indikatormaterial chromatographisch von der Zone zu entfernen, so daß die Menge von markiertem Indikator, die in der Zone verbleibt, gemessen werden kann.
  • Für die vorliegende Erfindung von Interesse sind die Offenbarungen der U.S. Patente mit den Nrn. 4 094 647, 4 235 601 und 4 361 537 von Deutsch, et al., die immunologische und andere Sorten von spezifischen Bindungsassays betreffen, bei denen die Reagenzien durch chromatographischen Lösungsmitteltransport transportiert werden. Gemäß einer Ausführungsform umfaßt ein radiomarkiertes konkurrierendes Bindungsassaykit einen Streifen, der zum Transport einer Entwicklungsflüssigkeit mittels Kapillarität befähigt ist, wobei er einen ersten Bereich zur Aufnahme einer Probe, einen zweiten Bereich, der mit einem ersten Reagenz imprägniert ist, das dazu befähigt ist, von der Entwicklerflüssigkeit transportiert zu werden, und einen dritten Bereich umfaßt, der mit einem zweiten Reagenz imprägniert ist. Zusätzlich umfassen die Vorrichtungen einen Meßbereich und ein verzögerndes Element, welches entweder das zweite Reagenz oder das Material des Streifens sein kann. Das erste Reagenz ist zur Reaktion mit einem Glied der Gruppe befähigt, die aus (1) der Probe, (2) der Probe und dem zweiten Reagenz oder (3) dem dritten Reagenz in Konkurrenz mit der Probe besteht, unter Ausbildung eines Produktes in einer Menge, die von der zu bestimmenden Eigenschaft abhängt. Eine Probe wird mit dem ersten Bereich in Kontakt gebracht, und der Streifen wird dann in die Entwicklerflüssigkeit eingetaucht, um den Transport der Probe auszulösen und dem ersten Reagenz zu ermöglichen, das Reaktionsprodukt auszubilden. Das verzögernde Element verlangsamt den Transport entweder des Produktes oder des ersten Reagenzes (dem wandernden Reagenz), um die beiden räumlich von einander zu trennen, und die Menge des wandernden Elementes wird dann im Meßbereich gemessen.
  • Die Patente von Deutsch, et al. betreffen Verfahren, bei denen die Reagenzien, die sich auf dem chromatographischen Material befinden, mit dem Probenmaterial und anderen Reagenzien im Laufe des chromatographischen Transportes vermischt werden. Ein solches Vermischen ist für konkurrierende Bindungsassays nicht schädlich und kann sogar wünschenswert sein. Es kann jedoch für Bindungsassays vom Sandwichtyp unerwünscht sein, bei denen es notwendig ist, den Kontakt zwischen nicht-Analyt-Probenmaterialien und markierten spezifischen Bindungsreagenzien zu unterbinden.
  • Für die vorliegende Erfindung von Interesse ist die Offenbarung des U.S. Patents Nr. 4 452 901 von Gordon, welche die Verwendung von porösen Nitrozelluloseträgern zur Immobilisierung von Proteinen betrifft. Es wird offenbart, daß solche Nitrozelluloseblätter bei Immunoassayverfahren verwendet werden können, wenn die verbleibenden Bindungskapazitäten der Nitrozelluloseblätter gesättigt werden, indem sie einer Blockierungsbehandlung mit einer oder mehreren Sorten von Proteinen unterzogen werden, welche von den immobilisierten verschieden sind und nicht zu irgendeinem der später in dem Assay verwendeten Antikörper kreuzreaktiv sind.
  • Von weiterem Interesse für den technischen Hintergrund der vorliegenden Erfindung sind die Offenbarungen von Gordon, Europäische Patentanmeldung 63 810, veröffentlicht am 3. November 1982, die Vorrichtungen zur Durchführung immunologischer Assays betreffen. Die Vorrichtungen bestehen aus einem porösen festen Träger, der ein vorgebildetes Gitter begrenzter Adsorptionsbereiche von Antigenen, Antikörpern oder beiden enthält, in denen die verbleibenden Adsorptionszentren auf dem Substrat mittels proteinblockierenden Agenzien, wie etwa Rinderserumalbumin gesättigt werden. Die porösen festen Träger sind aus einer Vielzahl von natürlichen und synthetischen Polymeren und Derivaten ausgewählt, aber vorzugsweise werden Nitrozelluloseblätter von 0,1 mm Dicke mit einer Porengröße zwischen ungefähr 0,15 μm und ungefähr 15 μm verwendet. Die Antigene oder Antikörper werden auf den porösen festen Träger mittels direktem Kontakt aufgetragen, gefolgt von der Inkubation mit blockierenden Agenzien. Die Assays zum Nachweis unbekannter Antigene oder Antikörper werden dann durchgeführt, indem markierte Antikörper verwendet werden, welche ebenfalls anti-Immunoglobulin Antikörper sein können.
  • Für die vorliegende Anmeldung ebenfalls von besonderem Interesse ist die Offenbarung von Gordon, et al. in EP-A-0 262 328, welche Vorrichtungen zur Durchführung spezifischer Bindungsassays betrifft, die den sequenziellen chromatographischen Transport von Analyt- und Reagenzmaterialien verwenden. Wasch- und Zugabeschritte werden inhärent durchgeführt, und der flüssige "Mikrokreislauf" kann derart programmiert werden, daß eine Vielzahl von Mehrfachschrittverfahren durchgeführt werden und daß das vorzeitige Vermischen von Probenmaterialien und Reagenzien vermieden wird. Bevorzugte Blockierungslösungen für die Behandlung des Streifenmaterials umfassen 1%ig LB-Gelatine (Inotech, Wohlen, Schweiz) in TBS-Lösung, umfassend (0,15M NaCl, 0,02 Tris-HCl, pH 7,6) oder 3% Rinderserumalbumin (BSA) Lösung in physiologischer Kochsalzlösung.
  • Insbesondere betrifft die Anmeldung von Gordon, et al. die den sequenziellen Transport zum Gegenstand hat, Vorrichtungen, welche einen Teststreifen für den Nachweis eines Analyten in einer Probe umfassen, die einen Längenabschnitt chromatographischen Materials umfassen, der die Kapazität zum schnellen chromatographischen Lösungmitteltransport nicht-immobilisierter Reagenzien und reaktiver Probenbestandteile mittels eines ausgewählten chromatographischen Lösungsmittels aufweist. Der Streifen umfaßt ein erstes Ende, an dem der chromatographische Transport einsetzt, ein zweites Ende, an dem der chromatographische Transport endet, und eine Mehrzahl von Bereichen, die zwischen den beiden Enden liegen. Die Bereiche umfassen einen ersten Bereich (der mit einem ersten Reagenz imprägniert ist, das in dem Lösungsmittel beweglich ist und zur Reaktion mit und zur Immobilisierung gegen den Lösungsmitteltransport durch den Analyten, wenn der Analyt in immobilisierter Form vorliegt, befähigt ist), einen zweiten Bereich (zur Aufnahme der Probe, von der angenommen wird, daß sie einen Analyten enthält) und einen dritten Bereich (der sich stromabwärts des ersten Bereiches befindet, und der mit einem zweiten Reagenz imprägniert ist, das gegen den Lösungsmitteltransport immobilisiert ist, und das zur selektiven Reaktion mit dem Analyten befähigt ist, so daß der Analyt in einer immobilisierten Form in dem dritten Bereich erhalten wird. Die Vorrichtung ist desweiteren dadurch gekennzeichnet, daß nachdem die Probe in dem zweiten Bereich aufgenommen wurde und beim Eintauchen des ersten Endes in das chromatographische Lösungsmittel die relative Mobilität des Analyten und des ersten Reagenzes oder das Ortsverhältnis zwischen dem zweiten und dem dritten Bereich derart ist, daß der Analyt indem dritten Bereich angeordnet und gegen Lösungsmitteltransport immobilisiert ist, bevor das erste Reagenz den dritten Bereich erreicht, wodurch interferierende Probenbestandteile und nicht-Analytbestandteile der Probe, die mit den ersten Reagenz reaktiv sind, aus dem dritten Bereich durch chromatographischen Lösungsmittelstransport vor dem Transport des ersten Reagenzes zu dem dritten Bereich hin entfernt werden. Die Anwesenheit des ersten Reagenzes, das in dem dritten Bereich immobilisiert ist, kann mittels eines Enzyms, eines Radioisotops oder mittels anderer Markierungen nachgewiesen werden. Die Vorrichtung ist insbesondere zur Verwendung mit enzymmarkierten Reagenzien wie Enzymsubstraten und Indikatorfarbstoffreagenzien geeignet, da diese auf verschiedenen Bereichen des Streifens eingebaut und zu dem dritten Bereich in einer geeigneten Reihenfolge durch den chromatographischen Transport hintransportiert werden können.
  • Von Interesse für die vorliegende Erfindung sind solche Literaturstellen, welche die Verwendung von Dispersionen kolloidaler Partikel in Immunologischen Assayverfahren betreffen. Frens offenbart in Nature, 241, 20–23 (1973) Verfahren für die Herstellung von monodispersen Goldsolen verschiedener Partikelgrößen mittels der Reduktion von Goldchlorid mit wässerigem Natriumcitrat. Eine Veränderung in der Konzentration des Natriumcitrats während der Agglomerierung der Partikel kann verwendet werden; um die Partikelgröße des resultierenden Sols zu verändern. Es sind Sole aus monodispersen Goldpartikeln offenbart, die Partikelgrößen aufweisen, welche von 16 nm bis ungefähr 150 nm aufweisen und die Farben aufweisen, die von orange bis rot bis hin zu violett in dem genannten Bereich aufweisen.
  • Romano et al., Immunochemistry, 11, Seite 521–22 (1974) offenbart die Markierung von Immunoglobulinen mit kolloidalen Goldpartikeln zur Verwendung bei der Sichtbarmachung von Antigenen von humanen roten Blutkörperchen mittels der Elektronenmikroskopie. Das Gold,sol welches einen durchschnittlichen Partikeldurchmesser von ungefähr 3 nm aufweist, hat eine Tendenz zum Ausflocken, aber es wird durch die Anwesenheit entweder von Pferdeserum oder BSA stabilisiert.
  • Geoghegan, et al., J. Immuno. Meth., 34, 11–21 (1980) offenbart das Beschichten von kolloidalen Goldpartikeln mit Immunoglobulinen zur Verwendung bei passiven Agglutinationsverfahren. Die Literaturstelle (auf Seite 14) offenbart die Resuspension von zentrifugierten Mischungen von goldmarkierten Immunoglobulinen mit 0,01 M phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) (pH 7,2), enthaltend 1%ig Polyethylenglycol (PEG). Die Literaturstelle verweist ebenfalls darauf, daß obwohl die Goldproteinkomplexe während des Zentrifugierens nicht aggregieren, es oft vorkommt, daß sie in Gegenwart irgend eines reihenmäßig verdünnten Proteins auf einer Mikrotiterplatte einer nicht-spezifischen Aggregation unterworfen sind.
  • Surek, et al., Biochem. and Biophys. Res. Comm., 121, 284-289 (1984) offenbart die Verwendung von mit Protein A markierten kolloidalen Goldpartikeln zum Nachweis von spezifischen Antigenen, die auf Nitrozellulosemembranen immobilisiert sind. Gemäß dem Verfahren, wird ein Elektrophoresegel auf ein Nitrozellulosefilter geblottet, welches dann mit einer 2%igen Lösung von BSA in PBS behandelt wird, um nicht-spezifische Bindung auszuschließen. Das Filter wird dann mit verdünntem Antiserum oder Preimmunserum behandelt und mit PBS-BSA 'gewaschen. Der Streifen wird dann 30–60 Minuten mit Protein A inkubiert, das mit kolloidalem Gold konjugiert ist und welches die Anwesenheit der gebundenen Antikörper nachweist. Überschüssige, ungebundene kolloidale Goldpartikel werden dann mittels mehrerer kurzer Pufferwaschschritte entfernt.
  • Leuvering, offenbart im U.S. Patent Nr. 4 313 734 die Verwendung von metallischen Solpartikeln als Markierungen für die in vitro Bestimmung immunologischer Bestandteile in einem wässerigen Testmedium. Spezifisch offenbart werden Immunoassay-Testkits zum Nachweis von Antigenen oder Antikörpern, die einen oder mehrere markierte Bestandteile verwenden, die durch die Kupplung des Bestandteils an Partikel einer wässerigen Soldispersion eines Metalls, einer Metallverbindung oder von Polymerkernen, die mit einem Metall oder einer Metallverbindung beschichtet sind, und die eine Partikelgröße von wenigstens 5 nm aufweisen, erhalten wurden. Gemäß einem Beispiel wird ein Assay für humanes planzentales Laktogen (HPL) durchgeführt, bei dem Kaninchen-anti-HPL-Antikörper verwendet werden, welche mit Goldpartikeln markiert worden sind. Unmarkierte Kaninchen-anti-HPL-Antikörper werden auf die Wände einer Mikrotiterplatte aufgezogen, indem sie mit einer BSA-Lösung und Phosphatpuffer inkubiert werden, zu der Merthiolat hinzugegeben wurde. Standardlösungen von HPL werden zu den Vertiefungen hinzugegeben und 2 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Eine Lösung, die aus Kaninchen-anti-HPL-Antikörpern besteht, welche mit Goldpartikeln konjugiert sind, die Durchmesser zwischen 45 und 70 nm aufweisen, wird zu den Vertiefungen hinzugegeben und wird über Nacht bei Raumtemperatur inkubiert. Die Vertiefungen werden dann gewaschen und die Lichtabsorption wird mit einem geringvolumigen Spektrophotometer gemessen.
  • Hsu, Anal. Biochem. 142, 221–225 (1984) offenbart die Verwendung von Immunogoldmarkierungssystemen für Blottingimmunoassayverfahren, bei denen Reihenverdünnungen von gereinigtem Tabakmosaikvirus (TMV) in einem Polyacrylamidgel einer Elektrophorese unterzogen werden und dann elektrisch auf Nitrozellulosefilterbögen transferiert werden. Die Nitrozellulosebögen werden gebacken, um die Bindung zu stabilisieren und sie werden mit 5%igem Normalziegenserum oder in 0,05%ig Tween® 20 in PBS behandelt, um die nicht-spezifische Bindung von Antikörpern zu blockiere. Das Filter wird dann über Nacht bei 4°C mit Kaninchen-anti-TMV-Antikörpern, die in Blockierungslösung verdünnt sind, inkubiert, gefolgt von einem Waschschritt in PBS, und der Antigen-Antikörperkomplex wird dann nachgewiesen, indem das Filter mit goldmarkierten Ziegen-anti-Kaninchen-IgG in Blockierungslösung gesättigt wird. Gemäß dem Verfahren sind so geringe Mengen wie 8 ng des TMV Proteins bei ungefähr 30 minütigem Kontakt mit goldmarkiertem IgG nachweisbar. Die Literaturstelle offenbart ebenfalls, daß Agenzien wie Polyethylenglykol, Polyvinylpyrrolidon und Rinderserumalbumin die Stabilität der Goldmarkierungen erhöhen können. Die Verwendung von Tween® 20 zur Verhinderung nicht-spezifischer Bindung des Proteins auf Nitrozellulose wird offenbart, zusammen mit der Beobachtung, daß 0,05 Tween® 20 in PBS bei dem Färbungsverfahren verwendet werden kann, ohne die Spezifität des Gold-IgG-Komplexes zu stören. Von Normalziegenserum wird ausgesagt, daß es ein bevorzugtes Blockierungsagenz im Lichte seiner Tendenz darstellt, Goldpartikel zu adsorbieren, die von der Sonde während der Lagerung dissoziieren.
  • Moeremans, et al., Europäische Patentanmeldung Nr. 158 746 offenbart die Verwendung von kolloidalen Metallpartikeln als Markierungen bei Sandwichblot-Überschichtungsassays. Spezifische Bindungsmaterialien, die spezifisch gegenüber dem nachzuweisenden Analyten reaktiv sind, werden auf Nitrozellulosestreifen aufgebracht und getrocknet. Die Proteinbindungsstellen auf dem Streifen werden dann mittels Behandlung mit Rinderserumalbumin, Gelatine, Polyethylenglykol oder Tween® 20 blockiert. Den Analyten enthaltendes Probenmaterial wird dann auf den Streifen aufgebracht und 2 Stunden lang inkubiert. Der behandelte Streifen wird gewaschen und luftgetrocknet und 2 Stunden mit einem spezifischen Bindungsagenz inkubiert, das mit kolloidalen Metallpartikeln markiert worden ist. Gemäß einem Beispiel werden anti-Tubulinantikörper mittels mit Goldpartikeln markierten Reagenzien nachgewiesen, die eine rosa-rötliche Farbe, (Partikel von 20 nm) oder eine purpurartige Farbe (Partikel von 40 nm) hervorrufen. Von den Assays ist offenbart, daß sie eine Empfindlichkeit in der Größenordnung von 5 ng/μl aufweisen.
  • Von Interesse für die vorliegende Erfindung ist die Offenbarung von Hoye J. Chromatog., 28, 379–384 (1967), die die chromatographische Reinigung von Radiochemikalien betrifft. Die Anwendung von Papierchromatographie, Dünnschichtchromatographie und Hochspannungselektrophoreseverfahren werden offenbart, um Goldionen mit unterschiedlichem Erfolg zu bewegen, aber sie sind allgemein für den Transport kolloidaler Goldpartikel ungeeignet.
  • Die Verwendung von polymerisierten Farbstoffmaterialien in kolloidaler Form für spezifische Bindungsassays ist ebenfalls bekannt. Von Interesse für die vorliegende Anmeldung ist die Offenbarung von Hirschfeld im U.S. Patent Nr. 4 166 105, die markierte spezifische Bindungsreagenzien betrifft, die gegenüber spezifischen Antigenen reaktiv sind, und die hergestellt werden, indem fluoreszierende Farbstoffmoleküle an analytspezifische Antikörper über Polymere angebunden werden, welche reaktive funktionelle Gruppen umfassen. Ebenfalls für die vorliegende Anmeldung von Interesse ist die Offenbarung von Henry, im U.S. Patent Nr. 4 452 886, welche spezifische Bindungsreagenzien betrifft, welche Antigene oder Antikörper umfassen, die an ein wasserlösliches Polymer gebunden sind, welches im wesentlichen aus zwischen 40 und 600 Chromophoren oder Fluoreszenzgruppen enthaltenden Monomeren besteht.
  • Yost et al., offenbart in der Europäischen Patentanmeldung Nr. 298 368, welche gemäß Artikel 54(3) und (4) EPÜ Stand der Technik ist, ein Immunoassay vom Sandwichtyp, bei dem eine Serumprobe von anti-Trichinen-Antikörper mit einer gepufferten Lösung von mit kolloidalem Selen markierten Ziegen-anti-Schwein-Antikörper und mit Casein vermischt wird und mit einem Nitrozellulosestreifen in Kontakt gebracht wird, der eine einzelne Reaktionsstelle aufweist, auf der Trichinenantigen immobilisiert worden ist.
  • Mochnal et al. offenbart in der Europäischen Patentanmeldung Nr. 250 137, die nach Artikel 54(3) und (4) EPÜ Stand der Technik ist, ein Immunoassay vom Sandwichtyp, das einen Chromatographiepapierstreifen verwendet, der eine untere Bande aufweist, die mit anti-hCG-Antikörper beschichtet ist und eine Kontroll/Eichbande, die mit hCG beschichtet ist, wobei eine Vollblutprobe auf den Streifen an einer Stelle zwischen der unteren Bande und dem unteren Ende aufgetropft wird, und wobei der Streifen dann in eine gepufferte Lösung von mit kolloidalem Gold markiertem anti-hCG-Antikörper und 4%ig Rinderserumalbumin eingetaucht wird. Mochnal et al. offenbart desweiteren ein Immunoassay vom Sandwichtyp, das einen Chromatographiepapierstreifen verwendet, der eine untere Bande aufweist, die mit Rubellaantigen beschichtet ist und eine Kontroll/Eichbande, die mit human-IgG beschichtet ist, wobei ein Ende des Streifens in eine gepufferte Lösung einer Serumprobe und Rinderserumalbumin eingetaucht wird, und wobei der Streifen dann in eine gepufferte Lösung von mit kolloidalem Gold markiertem Mäuse anti-human-Antikörper und 3,8%ig Rinderserumalbumin überführt wird.
  • Zusammenfassung der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung stellt verbesserte chromatographische Assayverfahren, Kits und Vorrichtungen zur Verfügung, die auf spezifischer Bindung beruhen. Gemäß einem Aspekt der Erfindung wird ein Verfahren zur Bestimmung der Anwesenheit oder Menge einer Substanz in einer Probe bereitgestellt, wobei das Verfahren folgendes umfasst:
    • a) Bewirken eines Kontakts zwischen der Probe und einem chromatographischen Medium, wobei das Medium wenigstens eine Reaktionsstelle aufweist, die ein immobilisiertes Reagenz einschließt, das zur Bindung eines Glieds befähigt ist, das aus der Gruppe gewählt ist, die aus der Substanz und einem mittels kolloidaler Partikel markierten Material besteht, das zur Erzeugung einer nachweisbaren Antwort fähig ist,
    • b) chromatographisches Transportieren auf dem chromatographischen Medium des mittels kolloidaler Partikel markierten Materials in Gegenwart eines den chromatographischen Transport erleichternden Agens, das ein meta-lösliches Protein umfasst, das chemisch behandelt wurde, um es stärker hydrophil zu machen, als in seiner natürlichen Form, wobei das Agens die Aggregation und Inaktivierung der spezifisch bindenden Materialien und Reagenzien in Lösung verhindert und deren chromatographischen Transport fördert, wodurch wenigstens ein Teil des mittels kolloidaler Partikel markierten Materials chromatographisch zu der Reaktionsstelle transportiert wird, um an diese zu binden, und
    • c) Bestimmen der nachweisbaren Antwort, die von dem mittels kolloidaler Partikel markierten Material an der Reaktionsstelle hervorgerufen wird, als eine Anzeige für die Anwesenheit oder Menge an Substanz in der Probe.
  • In einer Ausführungsform dieses Verfahrens umfasst das chromatographische Medium eine zweite Reaktionsstelle, die ein zweites immobilisiertes Reagenz einschließt, das dasselbe wie das erste immobilisierte Reagenz sein kann, oder das von dem ersten immobilisierten Reagenz verschieden sein kann, und das zur Bindung mit dem mittels kolloidaler Partikel markierten Material fähig ist, wobei das Verfahren den folgenden Schritt umfasst:
    • d) Bestimmen der nachweisbaren Antwort, die von dem mittels kolloidaler Partikel markierten Material an der zweiten Reaktionsstelle hervorgerufen wird, als eine Anzeige für die Anwesenheit oder Menge an Substanz in der Probe.
  • Die vorliegende Erfindung bietet weiter ein Verfahren zur Bestimmung der Anwesenheit oder Menge einer Substanz in einer Probe, wobei das Verfahren folgendes umfasst:
    • a) In-Kontakt-Bringen der Probe mit einem chromatographischen Medium, wobei das Medium wenigstens zwei Reaktionsstellen aufweist, wobei die erste Reaktionsstelle eine getrocknete Lösung eines mittels kolloidaler Partikel markierten Materials einschließt, in Gegenwart eines meta-löslichen Proteins, wobei das meta-lösliche Protein die Aggregation und Inaktivierung der spezifisch bindenden Materialien und Reagenzien in Lösung verhindert und deren chromatographischen Transport fördert, und wobei die zweite Reaktionsstelle ein immobilisiertes Reagens einschließt, das zur Bindung eines Glieds fähig ist, das aus der Gruppe gewählt ist, die aus der Substanz und dem mittels kolloidaler Partikel markierten Material besteht,
    • sb) Solubilisieren des mittels kolloidaler Partikel markierten Materials und chromatographisches Transportieren wenigstens eines Teils des mittels kolloidaler Partikel markierten Materials an die zweite Reaktionsstelle zur Bindung an diese, und
    • c) Bestimmen der nachweisbaren Antwort, die von dem mittels kolloidaler Partikel markierten Material an der zweiten Reaktionsstelle hervorgerufen wird, als eine Anzeige für die Anwesenheit oder Menge an Substanz in der Probe.
  • In einer Ausführungsform des Verfahrens umfasst das chromatographische Medium eine dritte Reaktionsstelle, die ein zweites immobilisiertes Reagenz einschließt, das dasselbe wie das erste immobilisierte Reagenz sein kann, oder das von dem ersten immobilisierten Reagenz verschieden sein kann, und das zur Bindung mit dem mittels kolloidaler Partikel markierten Material fähig ist, wobei das Verfahren den folgenden Schritt umfasst:
    • d) Bestimmen der nachweisbaren Antwort, die von dem mittels kolloidaler Partikel markierten Material an der dritten Reaktionsstelle hervorgerufen wird, als eine Anzeige für die Anwesenheit oder Menge an Substanz in der Probe.
  • Die vorliegende Erfindung bietet auch eine
    Testvorrichtung zur Bestimmung der Anwesenheit oder Menge einer Substanz in einer Probe mittels einer oder mehrerer spezifischer Bindungsreaktionen, die folgendes umfasst:
    ein chromatographisches Medium mit Kapillarstruktur und der Fähigkeit zum schnellen chromatographischen Lösungsmitteltransport eines oder mehrerer nicht-immobilisierter Reagenzien und reaktiver Proben-Bestandteile mittels eines ausgewählten chromatographischen Lösungsmittels, das folgendes umfasst:
    eine erste Reaktionsstelle, die eine getrocknete Lösung eines mittels kolloidaler Partikel markierten Materials einschließt, in Gegenwart eines meta-löslichen Proteins, wobei das mittels kolloidaler Partikel markierte Material zur schnellen Solubilisierung fähig ist, und wobei das meta-lösliche Protein die Aggregation und Inaktivierung der spezifisch bindenden Materialien und Reagenzien in Lösung verhindert und deren chromatographischen Transport in dem Lösungsmittel fördert, und
    eine zweite Reaktionsstelle, die ein immobilisiertes Reagenz einschließt, das zur Bindung eines Glieds fähig ist, das aus der Gruppe gewählt ist, die aus der Substanz und dem mittels kolloidaler Partikel markierten Material besteht.
  • Außerdem bietet die vorliegende Erfindung einen
    Kit zur Verwendung in spezifischen Bindungsassays zur Bestimmung der Anwesenheit oder Menge einer Substanz in einer Probe, der folgendes umfasst:
    • (1) eine Lösung, die ein mittels kolloidaler Partikel markiertes Material in Anwesenheit eines den chromatographischen Transport erleichternden Agens umfasst, das ein meta-lösliches Protein umfasst, wobei das Agens die Aggregation und Inaktivierung spezifisch bindender Materialien und Reagenzien in Lösung verhindert und deren chromatographischen Transport fördert, und
    • (2) ein chromatographisches Medium mit Kapillarstruktur und der Fähigkeit zum chromatographischen Lösungsmitteltransport von nicht-immobilisierten Reagenzien und reaktiven Proben-Bestandteilen mittels eines ausgewählten chromatographischen Lösungsmittels, das wenigstens eine Reaktionsstelle einschließt, die ein immobilisiertes Reagenz einschließt, das zur Bindung eines Glieds fähig ist, das aus der Gruppe gewählt ist, die aus der Substanz und dem mittels kolloidaler Partikel markierten Material besteht.
  • Es ist herausgefunden worden, daß spezifische Bindungsmaterialien, die mit kolloidalen Partikeln markiert sind, wie etwa mit Gold, einem schnellen chromatographischen Transport auf einem chromatographischen Medium mittels ausgewählter Lösungsmittel und den chromatographischen Transport erleichternden Agenzien unterworfen werden können wie oben erwähnt, und daß die Verwendung der Assayverfahren mit chromatographischem Lösungsmitteltransport den Zeitraum, der für die Bindungsreaktion eines mit kolloidalen Partikeln markierten Materials mit seinem spezifischen Bindungspartner benötigt wird, im Vergleich mit herkömmlichen Verfahren wesentlich verkürzt. Es ist ebenfalls herausgefunden worden, daß die Imprägnierung eines chromatographischen Mediums mit kolloidalen Partikeln markierten spezifischen Bindungsmaterialien aus labilen Bindungsproteinen in Anwesenheit eines wässerigen Mediums, das meta-lösliche Proteine, wie Casein enthält, die schnelle Wiederauflösung solcher mit kolloidalen Partikeln markierter Protein erlaubt, die auf das chromatographische Medium in einer stabilen und geeigneten Form für den Transport entlang dem chromatographischen Medium zur Durchführung der spezifischen Bindungsassayverfahren der Erfindung aufgetrocknet worden sind.
  • Demgemäß liefert die Erfindung verbesserte spezifische Bindungsassayvorrichtungen, Kits und Verfahren zur Bestimmung der Anwesenheit oder Menge einer Substanz in einer Probe. Die Assays, welche die Markierungen aus kolloidalen Partikeln verwenden, liefern ein visuell nachweisbares Signal und erfordern nicht die Verwendung von Materialien wie Radioisotopen oder Enzymmarkierungen mit den entsprechenden Erfordernissen an Nachweisausrüstungen oder der Zugabe von Enzymkonjugaten und Indikatorfarbstoffen. Von der Erfindung werden sowohl Mittel zur Durchführung von Konkurrenzbindungs- als auch von Direktbindungsassays (Sandwichtypus) zur Verfügung gestellt. Es werden bevorzugte Assayverfahren und Kits zur Verfügung gestellt, die dem Nachweis der Anwesenheit oder Menge einer Substanz in einer Probe dienen, bei denen ein mit kolloidalen Partikeln markiertes Material und ein den chromatographischen Transport erleichterndes Agens wie oben erwähnt mit der Probe vermischt werden. Ein chromatographisches Medium, das ein oder mehrere Reaktionszentren umfaßt, die mit einem oder mehreren Reagenzien imprägniert sind, die für die Durchführung des Assays nützlich sind, wird dann mit der Mischung aus Probe, aus mit kolloidalen Partikeln markiertem Material und dem den chromatographischen Transport erleichternden Agens in Kontakt gebracht, um die Probe und das markierte Material chromatographisch entlang den chromatographischen Medium zu transportieren, und um das gewünschte Assay durchzuführen.
  • Die Erfindung liefert ebenfalls Assayverfahren und Vorrichtungen, bei denen markierte Materialien einschließlich von mit kolloidalen Partikeln markierten Materialien in Gegenwart eines meta-löslichen Proteins auf eine Reaktionsstelle imprägniert und aufgetrocknet werden, die sich auf einem chromatographischen Substratmaterial befindet. Die chromatographischen Medien der Vorrichtungen können eine oder mehrere zusätzliche Reaktionsstellen umfassen, an denen chemische Reaktionen selbst nicht stattfinden, aber an denen zusätzliche Materialien abgelegt oder immobilisiert sein können, oder an denen Analytsubstanzen, die Probenmaterialien enthalten, abgelegt sein können. Das chromatographische Medium wird mit einem chromatographischen Lösungsmittel in Kontakt gebracht, das die mit kolloidalen Partikeln markierten spezifischen Bindungsmaterialien als auch die Probensubstanz und die anderen wahlweise enthaltenen Materialien und Reagenzien auflöst und entlang des Mediums transportiert. Die Affinität des immobilisierten spezifischen Bindungsreagenzes ist derart, daß es wirksam das markierte Material aus dem fließenden Material herauszufangen vermag, derart, daß der markierte Bindungsbestandteil in dem Bereich angereichert wird.
  • Ein wichtiger Vorteil wird von der vorliegenden Erfindung insofern zur Verfügung gestellt, als daß die Bindungsaffinität des immobilisierten Reagenzes derart sein kann, daß es zum Einfangen einer markierten Komponente in dem fließenden chromatographischen Strom derart befähigt ist, daß die markierte Bindungskomponente in der Einfangzone angereichert wird und eindeutig von dem Hintergrundstrom von nicht konzentriertem mit kolloidalen Partikeln markiertem Material unterscheidbar ist.
  • KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
  • 1a, 2a, 3a, 4a, und 5a sind Frontansichten, von fünf verschiedenen Formen von Testvorrichtungen der vorliegenden Erfindung;
  • 1b, 2b, 3b, 4b, und 5b sind Querschnittsansichten der Testvorrichtungen, die in den 1a, 2a, 3a, 4a, und 5a jeweils gezeigt sind, und die entlang der Linien 1b-1b, 2b-2b, 3b-3b, 4b-4b und 5b-5b genommen sind;
  • 1c, 2c, und 3c sind Querschnittsansichten der Testvorrichtungen, die jeweils in den 1a, 2a und 3a, gezeigt sind, die sich im Kontakt mit einem Volumen an Probenmaterial und Indikatorlösung befinden;
  • 4c und 5c sind Querschnittsansichten der Testvorrichtungen, die jeweils in den 4a und 5a gezeigt sind, in Kontakt mit einem Volumen an chromatographischem Lösungsmittel; und
  • 6 ist eine Querschnittsansicht der Testvorrichtung nach 4a, die entlang der Linien 6-6 aufgenommen ist.
  • EINGEHENDE BESCHREIBUNG
  • Die vorliegende Erfindung liefert verbesserte immunologische und andere auf spezifischer Bindung beruhende chromatographische Assayverfahren, Kits und Vorrichtungen.
  • Mit kolloidalen Partikeln markierte spezifische Bindungsmaterialien sind hoch anfällig für Aggregation und sie sind daher allgemein zum schnellen und wirksamen Transport entlang chromatographischen Medien gemäß Assayverfahren, die auf chromatographischem Lösungsmitteltransport beruhen, unfähig. Die Erfindung beruht auf der Entdeckung, daß spezifische Bindungsmaterialien, die mit kolloidalen Partikeln markiert sind und insbesondere mit kolloidalen Partikeln, die größer als ungefähr 1 nm im Durchmesser sind, die der Aggregation besonders leicht unterliegen, einem schnellen chromatographischen Transport mittels ausgewählter Lösungsmittel und den chromatographischen Transport erleichternden Agenzien auf einem chromatographischen Medium unterworfen werden können, wie oben beschrieben. Obwohl die Materialien, die mit kolloidalen Partikeln markiert sind und insbesondere solche, die einen geringeren als einen Durchmesser von ungefähr 1 nm aufweisen, zum chromatographischen Transport ohne die Anwesenheit des den chromatographischen Transport erleichternden Agens gemäß der vorliegenden Erfindung fähig sind, hilft die Verwendung solcher Agenzien beim schnellen chromatographischen Transport aller mit kolloidalen Partikeln markierter Reagenzien der Erfindung. Als verwandte Entdeckung ist herausgefunden worden, daß der chromatographische Lösungsmitteltransport von mit kolloidalen Partikeln markierten Materialien den Zeitraum, der für die Bindungsreaktion solcher Materialien mit ihren spezifischen Bindungspartnern benötigt wird, verglichen mit herkömmlichen Verfahren, wesentlich verkürzt. Während herkömmliche Immunoassayverfahren, wie die von Leuvering, im U.S. Patent Nr. 4 313 734 die Inkubation von mit kolloidalen Partikeln markiertem spezifischen Bindungsmaterialien von 1 Stunde bis über die Nacht lang (16 Stunden) lehren liefern die chromatographischen Verfahren der vorliegenden Erfindung allgemein die schnelle Vervollständigung des Transportes und der spezifischen Bindungsreaktionen in weniger als ungefähr 5 vorzugsweise weniger als ungefähr 2 Minuten.
  • Es ist darüberhinaus entdeckt worden, daß mit kolloidalen Partikeln markierte spezifische Bindungsmaterialien aus labilen Proteinen, die auf ein chromatographisches Medium in der Anwesenheit ausgewählter meta-löslicher Proteinmaterialien imprägniert und aufgetrocknet sind, schnell durch die Zugabe von geeigneten Lösungsmitteln gelöst werden und entlang dem chromatographischen Medium bei den Assayverfahren der Erfindung transportiert werden können. Als eine Folge dieser Entdeckung werden Vorrichtungen für auf spezifischer Bindung beruhende Assays zur Verfügung gestellt, bei denen mit kolloidalen Partikeln markierte spezifische Bindungsmaterialien in trockener stabiler Form in die Vorrichtung eingebaut werden und nur das Probenmaterial und ein chromatographisches Lösungsmittel zur Durchführung eines Assays zugegeben werden muß.
  • Gemäß der Erfindung können Kits hergestellt werden und spezifische Bindungsassayverfahren können für die Analyse eines Substrates in einer Probe gemäß einem Verfahren durchgeführt werden, das eine Lösung verwendet, die ein mit kolloidalen Partikeln markiertes Material in der Anwesenheit eines den chromatographischen Transport erleichternden Agens umfaßt wie oben erwähnt. Das Verfahren verwendet ebenfalls ein chromatographisches Medium, das Kapillarität aufweist und die Fähigkeit zum chromatographischen Lösungsmitteltransport von nicht immobilisierten Reagenzien und von reaktiven Probenbestandteilen mittels eines ausgewählten chromatographischen Lösungsmittels, wobei das chromatographische Medium eine Reaktionsstelle einschließt, einschließlich eines immobilisierten Reagenzes, das zur Bindung eines Glieds befähigt ist, das aus der Gruppe gewählt ist, die aus der zu analysierenden Substanz und dem mit kolloidalen Partikeln markierten Material besteht. Das Verfahren umfaßt (a) das In-Kontakt-Bringen der Probe, die analysiert werden soll, mit dem chromatographischen Medium, (b) das chromatographische Transportieren von mit kolloidalen Partikeln markiertem Material in der Anwesenheit eines den chromatographischen Transport erleichternden Agens auf dem chromatographischen Medium wie oben erwähnt, wobei wenigstens ein Teil des mit kolloidalen Partikeln markierten Materials chromatographisch zu der Reaktionsstelle transportiert wird, um an diese zu binden und (c) das Bestimmen der nachweisbaren Antwort, die von dem kolloidalen Material an der Reaktionsstelle als Anzeige für die Anwesenheit oder Menge der Substanz in der Probe hervorgerufen wird.
  • Gemäß den bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung kann die Affinität des immobilisierten Reagenzes und die Konzentrationen der Reagenzien und des Probenmaterials von einem Fachmann derart ausgewählt werden, daß das mit kolloidalen Partikeln markierte Material an der Reaktionsstelle angereichert wird und gegenüber den Hintergrundstrom von nicht angereichertem mit kolloidalen Partikeln markiertem Material nachgewiesen werden kann. Wo dies nicht der Fall ist, kann das chromatographische Medium einem Wasch- oder Spülschritt unterzogen werden, um das nicht gebundene markierte Material zu entfernen. Solche Waschschritte können ebenfalls inherent gemäß den Verfahren der Europäischen Patentanmeldung Nr. 262 328 ausgeführt werden.
  • Es ist ebenfalls offensichtlich, daß die Probe, die analysiert werden soll, das mit kolloidalen Partikeln markierte Material, das den chromatographischen Transport erleichternde Agens, das chromatographische Lösungsmittel und andere Lösungsmittel und Reagenzien miteinander gemäß verschiedenen möglichen Kombinationen vor ihrem In-Kontakt-Bringen mit dem chromatographischen Medium vermischt werden können, und daß diese Mischungen und verschiedene Bestandteile mit dem chromatographischen Medium in verschiedenen Reihenfolgen in Kontakt gebracht werden können, wie dies für den Fachmann offensichtlich ist. Es ist ferner offensichtlich, daß das chromatographische Lösungsmittel durch die Probe oder durch die Lösung, die das mit kolloidalen Partikeln markierte Material enthält, ersetzt werden kann, wo diese Materialien zum Transport des mit kolloidalen Partikeln markierten Materials zu der Reaktionsstelle hin, an der das Reagenz immobilisiert ist, befähigt sind. Es ist ebenfalls offensichtlich, daß das chromatographische Lösungsmittel inhärent gemäß den Verfahren nach der Europäischen Patentanmeldung Nr. 263 328 verwendet werden kann, um nicht abreagierte markierte Materialien und andere nicht-immobilisierte Probenbestandteile von der Reaktionsstelle, an der das Reagenz immobilisiert ist, herunter zu waschen. Wenn das markierte Material mit dem chromatographischen Medium an der Reaktionsstelle in Kontakt gebracht wird, an der das Reagenz angeordnet ist, kann der chromatographische Lösungsmitteltransport verwendet werden, um die Bindungsreaktion zwischen dem mit kolloidalen Partikeln markierten Material und anderen spezifischen Bindungsreagenzien zu beschleunigen, sowie auch um nicht immobilisiertes markiertes Material aus dem Bereich herauszuwaschen.
  • Eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung ist diejenige, bei der die Indikatorlösung zusätzlich ein den chromatographischen Transport erleichterndes Agens umfaßt und bei der die Indikatorlösung und die Probe vermischt und mit dem chromatographischen Medium in Kontakt gebracht werden, um den chromatographischen Transport der Analytsubstanz und des markierten spezifischen Bindungsmaterials sicher zu stellen.
  • Gemäß anderen Ausführungsformen, können das Probenmaterial und das mit kolloidalen Partikeln markierte Material mit einer oder mehreren Reaktionsstellen auf der Assayvorrichtung stromaufwärts der Reaktionsstelle, an der das Reagenz immobilisiert ist, in Kontakt gebracht werden, und das chromatographische Medium wird mit dem chromatographischen Lösungsmittel in Kontakt gebracht, um die Probe und das markierte Material in der Anwesenheit eines den chromatographischen Transport erleichternden Agens an die Reaktionsstelle zu transportieren, an der das zweite Reagenz immobilisiert ist.
  • Es können Assays vom Sandwichtyp gemäß dem Verfahren durchgeführt werden, bei dem das mit kolloidalen Partikeln markierte Material zur Teilnahme an einer spezifischen Bindungsreaktion mit der Analytsubstanz befähigt ist. Konkurenzbindungsassayverfahren können ebenfalls durchgeführt werden, wobei das mit kolloidalen Partikeln markierte Material zur Teilnahme an einer spezifischen Bindungsreaktion mit dem immobilisierten Reagenz befähigt ist. Es können Kits hergestellt werden, und das Verfahren kann ebenfalls durchgeführt werden, wenn das chromatographische Medium eine zweite Reaktionsstelle umfaßt, die mit einem zweiten Reagenz imprägniert ist, das immobilisiert ist, um dem Lösungsmitteltransport entgegen zu wirken, und das zur selektiven Reaktion mit dem mit kolloidalen Partikeln markierten Material befähigt ist, um letzteres an der zweiten Reaktionsstelle in eine immobilisierte Form zu überführen, wo es nachgewiesen werden kann. Bei Assays vom Sandwichtyp wirkt die Anwesenheit von mit kolloidalen Partikeln markiertem Material an der zweiten Reaktionsstelle als Kontrolle und bestätigt die Reaktivität des ersten Reagenz. Bei Konkurenzbindungsassays zeigt die Anwesenheit von mit kolloidalen Partikeln markiertem Material an der zweiten Reaktionsstelle das Ausmaß der Konkurrenz zwischen der Analytsubstanz und dem immobilisierten Reagenz an.
  • Andere Verfahren und Vorrichtungen werden gemäß der Erfindung zur Verfügung gestellt, bei denen eine getrocknete Lösung eines meta-löslichen Proteins und eines mit kolloidalen Partikeln markierten spezifisch bindenden Materials auf dem chromatographischen Medium einer Assayvorrichtung eingebaut ist, wobei solche trockenen Formen zur schnellen Wiederauflösung und zum chromatographischen Transport entlang dem Medium mittels ausgewählten chromatographischen Lösungsmitteln befähigt sind. Solche auf spezifischer Bindung beruhende Assayvorrichtungen umfassen ein chromatographisches Medium, das Kapillarität aufweist, und das die Fähigkeit zum chromatographischen Lösungsmitteltransport von einem oder mehreren nicht immobilisierten Reagenzien und reaktiven Probenbestandteilen mittels eines ausgewählten chromatographischen Lösungsmittels aufweist. Die Vorrichtungen umfassen eine erste Reaktionsstelle, die mit der oben genannten getrockneten Lösung eines markierten Materials in der Anwesenheit eines meta-löslichen Proteins imrägniert ist, wobei das markierte Material zur schnellen Wiederauflösung und zum chromatographischen Transport in dem Lösungsmittel befähigt ist, und die Vorrichtungen umfassen eine zweite Reaktionsstelle, an der ein Reagenz immobilisiert ist, das zur Bindung mit einem Glied befähigt ist, das aus der Gruppe gewählt ist, die aus der Analytsubstanz und dem mit kolloidalen Partikeln markierten Material besteht. Die Vorrichtung kann verwendet werden, indem (a) die Probe mit dem chromatographischen Medium in Kontakt gebracht wird, (b) das mit kolloidalen Partikeln markierte Material aufgelöst wird, und indem wenigstens ein Anteil des mit kolloidalen Partikeln markierten Materials chromatographisch zu der zweiten Reaktionsstelle transportiert wird, um an diese zu binden, und (c) indem die nachweisbare Antwort bestimmt wird, die von dem mit kolloidalen Partikeln markierten Material an der zweiten Reaktionsstelle als Anzeige für die Anwesenheit oder Menge der Substanz in der Probe hervorgerufen wird.
  • Es ist offensichtlich, daß die zu analysierende Probe mit dem chromatographischen Lösungsmittel vermischt werden kann und daß das chromatographische Medium mit der Mischung der beiden in Kontakt gebracht werden kann. Es ist desweiteren offensichtlich, daß das chromatographische Lösungsmittel durch die Probe ersetzt werden kann, wobei die Probe zum Auflösen des immobilisierten ersten Reagenzes befähigt ist und sich selbst und das mit kolloidalen Partikeln markierte erste Reagenz zu dem zweiten Bereich hin chromatographisch zu transportieren vermag, an dem das zweite Reagenz angeordnet ist.
  • Eine bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist diejenige, bei der das chromatographische Lösungsmittel durch die Probe ersetzt ist, welche zur Auflösung des getrockneten mit kolloidalen Partikeln markierten Materials und zum Transport der Analytsubstanz und des mit kolloidalen Partikeln markierten Materials zu der zweiten Reaktionszone hin befähigt ist, die das immobilisierte Reagenz enthält.
  • Es können Assays vom Sandwichtyp gemäß dem Verfahren durchgeführt werden, bei dem das mit kolloidalen Partikeln markierte Material zur Teilnahme an einer spezifischen Bindungsreaktion mit der Analytsubstanz befähigt ist. Konkurrenzbindungsassayverfahren können ebenfalls durchgeführt werden, bei denen das mit kolloidalen Partikeln markierte Material zur Teilnahme an einer spezifischen Bindungsreaktion mit dem immobilisierten Reagenz befähigt ist. Es können Vorrichtungen hergestellt werden, und es können auch Verfahren durchgeführt werden, bei denen das chromatographische Medium eine dritte Reaktionsstelle umfaßt, die mit einem zweiten Reagenz imprägniert ist, das entgegen dem Lösungsmitteltransport immobilisiert ist und das zur selektiven Reaktion mit dem mit kolloidalen Partikeln markierten Material befähigt ist, um das mit kolloidalen Partikeln markierte Material an der dritten Reaktionsstelle, an der es nachgewiesen werden kann, in eine immobilisierte Form zu überführen. Bei Assays vom Sandwichtyp dient die Anwesenheit von mit kolloidalen Partikeln markiertem Material an der dritten Reaktionsstelle als Kontrolle und bestätigt die Reaktivität des markierten Materials. Bei Konkurrenzbindungsassays zeigt die Anwesenheit von mit kolloidalen Partikeln markiertem Material an der dritten Reaktionsstelle das Ausmaß der Konkurrenz zwischen der Analytsubstanz und den markierten Reagenz an.
  • Das Assayverfahren der Erfindung kann ebenfalls mit kolloidalen Partikeln markierte spezifische Bindungsmaterialien, die aus labilen Proteinen bestehen, verwenden, wobei die Proteinmaterialien mit einem meta-löslichen Protein in einem stabilen Zustand als getrocknete Lösung dem chromatographischen Medium der Vorrichtung der Erfindung gelagert werden und durch die Aufgabe eines geeigneten Lösungsmittels schnell löslich gemacht werden können. Das Verfahren zur Herstellung eines solchen chromatographischen Mediums umfaßt das Trocknen des mit kolloidalen Partikeln markierten spezifischen Bindungsmaterials aus labilem Protein vorzugsweise unter einem Luftstrom, auf einem chromatographischen Medium in Anwesenheit eines wässerigen Mediums, das ein meta-löslichen Protein umfaßt. Das erhaltene Produkt umfaßt ein chromatographisches Medium, auf dem ein mit kolloidalen Partikeln markiertes spezifisches Bindungsmaterial, das aus labilem Protein besteht, in Gegenwart eines wässerigen Mediums, welches ein meta-löslichen Protein enthält, aufimprägniert und aufgetrocknet ist. Das chromatographische Medium ist vorzugsweise Papier oder Nitrozellulose. Das chromatographische Medium kann in verschiedenen Formen, wie etwa Streifen vorliegen. Die wässerige Lösung, die das meta-löslichen Protein, vorzugsweise Casein, enthält, kann wahlweise andere den chromatographischen Transport erleichternde Agenzien wie Polyethylenglykol, Gelatine, Rinderserumalbumin und Detergenzien umfassen.
  • "Mix and Run" – Assayvorrichtungen (Sandwichtyp)
  • Gemäß einem Aspekt der vorliegenden Erfindung können spezifische Bindungsassays gemäß "Mix and Run"-Vorgehensweisen durchgeführt werden, bei denen eine Indikatorlösung, die ein mit kolloidalen Partikeln markiertes erstes spezifisches Bindungsreagenz, das in einem den chromatographischen Transport erleichternden Agens gelöst ist wie oben erwähnt, umfaßt, mit der Analytsubstanz, die die Probe enthält, vermischt wird. Die Assayvorrichtungen gemäß der Erfindung werden dann in die Mischung aus Probe und Indikatorlösung eingetaucht, welche chromatographisch zu einem ersten Bereich hin transportiert wird, wo ein zweites Reagenz immobilisiert worden ist. Gemäß einer Ausführungsform eines Assayverfahren, vom Sandwichtyp sind das erste und das zweite Reagenz zur spezifischen Bindung mit dem Analyten befähigt. Bei dieser Ausführungsform bindet das markierte erste Reagenz an den Analyten, nach dem die beiden vermischt wurden. Das Konjugat aus dem markierten ersten Reagenz und dem Analyten wird dann der Immobilisierungsreaktion mit dem zweiten Reagenz unterworfen, wodurch indem ersten Bereich ein visuell nachweisbares Signal erzeugt wird. In Abwesenheit von Analyt bindet das markierte erste Reagenz nicht an den Bereich, und es wird dort kein Signal erzeugt. Es können alternative Assayverfahren vom Sandwichtyp durchgeführt werden, bei denen ein drittes Reagenz, das spezifisch gegenüber dem markierten ersten Reagenz reaktiv ist, in einem zweiten Bereich immobilisiert ist, um eine Kontrolle sicher zu stellen. Es werden noch andere Assayverfahren vom Konkurrenztypus und Vorrichtungen zur Verfüngung gestellt, bei denen das immobilisierte zweite Reagenz spezifisch gegenüber sowohl dem Analyten als auch dem markierten ersten Reagenz reaktiv ist, welche um die Bindung mit dem immobilisierten Reagenz konkurrieren.
  • Unter Bezugnahme auf die Zeichnungen, zeigen die 1a, 1b und 1c eine Testvorrichtung (10) zum Nachweis eines Analyten in einer flüssigen Probe, die einen Abschnitt einer gewissen Länge eines chromatographischen Substratmaterials (11) umfaßt, das ein erstes Ende (14) aufweist, an dem der chromatographische Transport einsetzt und ein zweites Ende (15) an dem der chromatographische Transport aufhört, und einen ersten Bereich (13), der mit einem zweiten Reagenz imprägniert ist, das entgegen dem Lösungsmitteltransport immobilisiert ist und das zur selektiven Reaktion mit dem Analyten befähigt ist, so daß der Analyt in eine immobilisierte Form überführt zu werden vermag. Die Vorrichtung umfaßt desweiteren einen inerten Trägerstreifen (12), an dem das Stück einer gewissen Länge chromatographischen Materials (11) angebracht ist.
  • Gemäß einem Verfahren zur Verwendung der Vorrichtung (10) wird eine Menge der zu testenden Probe mit einer Indikatorlösung vermischt, die ein mit kolloidalen Partikeln markiertes erstes Reagenz und ein den chromatographischen Transport erleichterndes Agens wie oben beschrieben umfaßt. Die Menge und die Konzentration des den chromatographischen Transport erleichternden Agens in der Indikatorlösung, die zu der Probe zugegeben wird, ist derart ausgewählt, daß sie die Aggregation verhindert und für einen schnellen chromatographischen Transport des mit kolloidalen Partikeln markierten spezifischen Bindungsreagenzes sorgt. Bei "Mix and Run"-Assays vom Sandwichtyp reagiert das markierte erste Reagenz derart, daß es spezifisch an den Analyten bindet. Die Testvorrichtung (10) wird dann an ihrem ersten Ende (14) in einen Behälter (16) eingetaucht, der die Mischung aus Probe und Indikatorlösung (17) enthält und die Probe/Indikatorlösungsmischung, die das erste markierte Reagenz/Analyt-Konjugat enthält, schreitet durch das chromatographische Material (11) bis zum ersten Bereich (13) hinfort. Das zweite spezifisch bindende Reagenz, das in dem ersten Bereich (13) immobilisiert ist, ist ebenfalls spezifisch gegenüber dem Analyten reaktiv und reagiert mit dem Analyten oder mit dem erstes Reagenz/Analyt-Konjugat, um dieselben in dem ersten Bereich (13) zu immobilisieren. Der chromatographische Lösungsmitteltransport ist jedoch derart, daß das markierte erste Reagenz, das nicht an den Analyten konjugiert ist, zusammen mit anderen Probenmaterialien und mit Materialien aus der Indikatorlösung, die nicht in dem ersten Bereich (13) immobilisiert werden, von diesem Bereich wegtransportiert wird. Der chromatographische Lösungsmitteltransport hält an, bis die Probe/Indikatorlösungsmischung erschöpft ist, oder bis die Probe/Indikatorlösungsmittelfront das zweite Ende (15) der Vorrichtung erreicht.
  • Der in einer Probe vorhandene Analyt bindet an das markierte erste Reagenz und wird chromatographisch zum ersten Bereich (13) hin transportiert, wo er durch eine spezifische Bindungsreaktion mit einem zweiten Reagenz immobilisiert wird. Wenn ausreichend Analyt in einer Probe vorhanden ist, ist die Anzahl kolloidaler Partikel, die in dem ersten Bereich (13) immobilisiert werden, derart, daß ein visuell nachweisbares Signal hervorgerufen wird. Natürlich wird, wenn kein Analyt in der Probe vorhanden ist, weder Analyt noch markiertes erstes Reagenz in dem ersten Bereich immobilisiert, und es wird kein Signal erzeugt.
  • "Mix and Run" – Assayvorrichtungen (Konkurrenztyp)
  • Die Vorrichtung (10) gemäß 1 kann ebenfalls abgewandelt werden, um spezifische Bindungsassays vom Konkurrenztyp durchzuführen. Insbesondere kann das mit kolloidalen Partikeln markierte erste Reagenz ausgewählt sein, um mit dem Analyten um die Bindung an das immobilisierte zweite Reagenz zu konkurrieren. Unter Bezugnahme auf die Zeichnung zeigt die 1 eine Testvorrichtung zur Durchführung von "Mix and Run" – Assays vom Konkurrenztyp. Die Vorrichtung selbst und die Art des immobilisierten zweiten Reagenzes sind bei dem Assay vom Konkurrenztyp dieselben wie bei dem Assay vom Sandwichtyp. Der einzige Unterschied bei den Assaykits liegt in der Art des mit kolloidalen Partikeln markierten ersten Reagenzmaterials. Bei den Assaykits gemäß der Erfindung vom Sandwichtyp ist das erste markierte Reagenz spezifisch gegenüber dem Analyten reaktiv, während bei Assays vom Konkurrenz-Typ das markierte erste Reagenz ein zu spezifischer Bindung befähigtes Analogon des zu untersuchenden Analyten ist und spezifisch gegenüber dem immobilisierten zweiten Reagenz in Konkurrenz mit dem Analyten reaktiv ist.
  • Gemäß einer Vorgehensweise zur Verwendung der Vorrichtung (10) wird eine Menge der zu testenden Probe mit einer Indikatorlösung vermischt, die ein mit kolloidalen Partikeln markiertes erstes Reagenz in Anwesenheit eines den chromatographischen Transport erleichternden Agens wie oben erwähnt umfaßt. Die Testvorrichtung (10) wird dann an ihrem ersten Ende (14) in einen Behälter (16) eingetaucht, der mit der Mischung aus Probe und Indikatorlösung (17) gefüllt ist. Die Proben/Indikatorlösungsmischung, die das markierte erste Reagenz und den Analyt enthält, schreitet durch das chromatographische Substratmaterial (11) hinweg zum ersten Bereich (13) hin fort. Das markierte erste Reagenz und der Analyt konkurrieren dann um die Bindung an das zweite spezifische Bindungsreagenz, das in dem ersten Bereich (13) immobilisiert ist. Der chromatographische Lösungsmitteltransport ist jedoch derart, daß Analyt und mit kolloidalen Partikeln markiertes erstes Reagenzmaterial, die nicht spezifisch an das immobilisierte zweite Reagenz binden, aus dem ersten Bereich (13) durch das chromatographische Lösungmittel entfernt werden. Der chromatographische Lösungsmitteltransport dauert an, bis die Menge an Probe/Indikatorlösung erschöpft ist, oder bis die Lösungsfront das zweite Ende (15) der Vorrichtung erreicht.
  • Die Menge an Analyt, die in der Probe vorhanden ist, bestimmt die Menge an markiertem ersten Reagenz, daß an den ersten Bereich (13) bindet. Die Menge und/oder die Bindungsaffinität des markierten ersten Reagenzes kann eingestellt werden, um die Menge an in der Probe vorhandenem Analyt zu bestimmen.
  • Alternatives "Mix and Run" Sandwichassay
  • Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung werden Assayvorrichtungen und Kits zur Durchführung von Assays vom Sandwichtyp bereitgestellt, welche eine Kontrollfunktion umfassen und welche ein positives oder negatives Signal zum Nachweis eines besonderen Analyten liefern. Unter Bezugnahme auf die Zeichnung zeigt die 2 eine Testvorrichtung (20), die eine bestimmte Länge eines chromatographischen Substratmaterials (21) umfaßt, die ein erstes Ende (25) aufweist, an dem der chromatographische Lösungsmitteltransport einsetzt, und ein zweites Ende (26) an dem der chromatographische Lösungsmitteltransport endet. Die Vorrichtung umfaßt ebenfalls einen ersten Bereich (23), der abgetrennt und in zwei oder mehrere Flächenbereiche aufgetrennt sein kann, und der mit einem zweiten Reagenz imprägniert ist, das entgegen dem Lösungsmitteltransport immobilisiert ist und das zur selektiven Reaktion mit dem Analyten befähigt ist, so daß der Analyt in eine immobilisierte Form überführt wird. Die Vorrichtung (20) umfaßt ebenfalls einen zweiten Bereich (24), der mit einem dritten Reagenz imprägniert ist, das entgegen dem Lösungsmitteltransport immobilisiert ist, und das zur selektiven Reaktion mit dem mit kolloidalen Partikeln markierten ersten Reagenz befähigt ist.
  • Der erste und der zweite Bereich (23) und (24) können derart geformt sein, daß sie ein Signal von unterscheidbarer Form liefern, wenn einer, aber nicht der andere, oder wenn beide ein immobilisiertes Reagenz umfassen. Zum Beispiel sind die Formen des ersten und des zweiten Reakionsbereiches (23) und (24) in 2 derart, daß wenn die Markierung in dem zweiten Bereich (24) immobilisiert wird, nur ein Minuszeichen (–) angezeigt wird. Wenn auf der anderen Seite die Markierung sowohl in dem ersten Bereich (23) als auch in dem zweiten Bereich (24) immobilisiert wird, wird ein Pluszeichen (+) angezeigt.
  • Es wird bevorzugt, daß der erste Bereich, der mit einem Reagenz imprägniert ist, das spezifisch gegenüber dem nachzuweisenden Analyten reaktiv ist, im wesentlichen senkrecht zur Richtung des chromatographischen Flusses angeordnet ist. Der Grund dafür ist, daß der Analyt und in folgedessen das markierte spezifische Bindungsreagenz dazu neigen, eher an dem vorderen als an dem hinteren Rand des Bereiches immobilisiert zu werden. Wenn ein länglicher Bereich in seiner größeren Ausdehnung parallel zur Richtung des chromatographischen Flusses angeordnet ist, fängt der vordere Anteil des Bereiches, die Mehrheit des Analyten ein, was dazu führt, daß das hintere Ende nur wenig Analyt einfängt und daß das resultierende sichtbare Signal eine Form hat, die leicht mißverstanden werden kann. Wenn der erste Bereich rechtwinkelig zur Richtung des chromatographischen Flusses angeordnet wird, wird ein stärkeres und unterscheidungskräftigeres positives Nachweissignal erzeugt.
  • Gemäß einem Verfahren zur Verwendung der Vorrichtung (20) wird eine Menge der zu testenden Probe mit einer Indikatorlösung vermischt, die ein mit kolloidalen Partikeln markiertes erstes Reagenz in Anwesenheit eines den chromatographischen Transport erleichternden Agens wie oben erwähnt umfaßt. Die Testvorrichtung (20) wird dann an ihrem ersten Ende (25) in einen Behälter (27) eingetaucht, der eine Mischung von Probe und Indikatorlösung (28) enthält und die Probe/Indikatorlösung, die das markierte erste Reagenz/Analyt-Konjugat enthält, schreitet durch das chromatographische Material (21) zu dem ersten (23) und dem zweiten (24) Bereich hin fort. Das immobilisierte zweite Reagenzmaterial in dem ersten Bereich (23) ist gegenüber dem Analyten spezifisch reaktiv und es immobilisiert den Analyten, wie auch jegliches Analyt/markiertes erstes Reagenz – Konjugat. Zusätzlich ist das immobilisierte dritte Reagenzmaterial in dem zweiten Bereich (24) gegenüber dem markierten ersten Reagenz spezifisch reaktiv und immobilisiert das erste Reagenz, wie auch jegliches Analyt/markiertes erstes Reagenz – Konjugat.
  • Wenn in der Probe Analyt vorhanden ist, bildet sich in der Mischung aus der Indikatorlösung und der Probe ein Analyt/markiertes erstes Reagenz – Konjugat, und das Konjugat wird sowohl in dem ersten (23) als auch in dem zweiten (24) Bereich immobilisiert und infolge dessen wird gemäß einer Ausführungsform ein Pluszeichen (+) und ein positives Signal erzeugt. Wenn kein Analyt oder weniger als eine Schwellenwertmenge in der Probe vorhanden ist, reagiert das erste Reagenz mit dem dritten Reagenz in dem zweiten Bereich (24) und wird in diesem Bereich immobilisiert, wobei ein visuelles Signal erzeugt wird. Da kein Analyt vorhanden ist, wird in dem ersten Bereich (23) nichts immobilisiert, und es wird kein Signal erzeugt und infolgedessen erscheint nur ein Minuszeichen (–), wodurch die Abwesenheit von Analyt angezeigt wird. Die Anwesenheit des Signals in dem zweiten Bereich (24), nicht aber in dem ersten (23), zeigt zusätzlich zur Anzeige der Abwesenheit von Analyt die Mobilität des ersten markierten Reagenzes an und dient als Kontrolle bezüglich der Nützlichkeit der Assayvorrichtung.
  • Alternatives "Mix and Run" Assay (Konkurrenztyp)
  • Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung werden Assayvorrichtungen und Kits zur Durchführung eines "Mix and Run"-Assays vom Konkurrenztyp zur Verfügung gestellt, welche einen ersten Bereich umfassen, der mit einem zweiten Reagenz imrägniert ist, das spezifisch gegenüber dem nachzuweisenden Analyten und dem mit kolloidalen Partikeln markierten ersten Reagenz reaktiv ist, und welche einen oderer mehreren zweite Bereiche umfassen, die mit einem dritten Reagenz imprägniert sind, das gegenüber dem markierten ersten Reagenz, nicht aber gegenüber dem Analyten spezifisch reaktiv ist.
  • Unter Bezugnahme auf die Zeichnung zeigen die 3a, 3b und 3c eine Testvorrichtung (30) zum Nachweis eines Analyten in einer Probenflüssigkeit (40). Die Vorrichtung (30) umfaßt eine bestimmte Länge eines chromatographischen Substratmaterials (31) mit einem ersten Ende (33), an dem der chromatographische Lösungsmitteltransport einsetzt und mit einem zweiten Ende (34) (welches nicht notwendigerweise das zweite physikalische Ende des Streifens ist), an dem der chromatographische Lösungsmitteltransport endet. Die Vorrichtung (30) umfaßt desweiteren einen ersten Bereich (35), der mit einem zweiten Reagenz imprägniert ist, das entgegen dem Lösungsmitteltransport immobilisiert ist und das zur selektiven Reaktion mit einem Glied der Gruppe befähigt ist, die aus dem Anaylten und einem mit kolloidalen Partikeln markierten ersten Reagenz besteht. Stromabwärts des ersten Bereiches (35) befindet sich der zweite Bereich (36), der wahlweise mehr als einen Flächenbereich umfassen kann, und welcher mit einem dritten Reagenz imprägniert ist, das entgegen dem Lösungsmitteltransport immobilisiert ist, und das gegenüber dem markierten ersten Reagenz, nicht aber gegenüber dem Analyten spezifisch reaktiv ist. Die Vorrichtung umfaßt ebenfalls eine rechte Lösungsmittelbarrierenvorrichtung (37) und eine linke Lösungsmittelbarrierenvorrichtung (38), die den chromatographischen Materialfluß vom ersten Ende (33) zu dem ersten Bereich (35) und dem zweiten Bereich (36) hin konzentrieren. Die Lösungsmittelbarrierenvorrichtung (37) und (38) verlängern desweiteren das chromatographische Substratmaterial (31), indem sie einen ausgedehnten chromatographischen Transportweg zum zweiten Ende (34) hin zur Verfügung stellen.
  • Gemäß einem Verfahren zur Verwendung der Vorrichtung (30) wird eine Menge der zu testenden Probe mit einer Indikatorlösung vermischt, die ein mit kolloidalen Partikeln markiertes erstes Reagenz in Anwesenheit eines den chromatographischen Transport erleichternden Agens wie oben erwähnt umfaßt. Das erste Reagenz ist ein spezifisch bindendes Analogon des zu untersuchenden Analyten und es ist spezifisch gegenüber dem immobilisierten zweiten Reagenz in dem ersten Bereich (35) reaktiv. Die Testvorrichtung (30) wird dann an ihrem ersten Ende (33) in einen Behälter (39) getaucht, der mit der Mischung (40) aus Probe und Indikatorlösung gefüllt ist. Die Probe/Indikatorlösungs-Mischung, die das markierte erste Reagenz und den Analyten enthält, schreitet entlang dem chromatographischen Material (31) zu dem ersten Bereich (35) hin fort. Das mit kolloidalen Partikeln markierte erste Reagenz und der Analyt konkurrieren dann um die Bindung mit dem zweiten spezifisch bindenden Reagenz, das in dem ersten Bereich (35) immobilisiert ist. Der chromatographische Lösungsmitteltransport verläuft jedoch derart, daß Analyt und markiertes erstes Reagenzmaterial, die nicht spezifisch an das immobilisierte zweite Reagenz binden, aus dem ersten Bereich (35) durch das chromatographische Lösungsmittel entfernt und in Richtung auf das zweite Ende hin (34) und zum zweiten Bereich oder zu den zweiten Bereichen (36) hin transportiert werden. Das markierte erste Reagenz, das ein von der Maus abgeleiteter Antikörper gegen das zweite Reagenz sein kann, wenn der nachzuweisende Analyt ein humaner Antikörper gegen das zweite Reagenz ist, reagiert dann mit dem dritten Reagenz (das aus anti-Maus-IgG-Antikörpern bestehen kann), welches in dem zweiten Bereich (36) immobilisiert ist, und welches gegenüber dem markierten ersten Reagenz, nicht aber gegenüber dem Analyten spezifisch reaktiv ist. Das dritte Reagenz reagiert mit dem markierten ersten Reagenz, wodurch es in dem zweiten Bereich (36) immobilisiert wird und ein nachweisbares Signal erzeugt. Die Vorrichtung kann wahlweise zusätzliche "zweite Bereiche" umfassen, so daß wenn ein Überschuß an markiertem ersten Reagenz mit Probenmaterial vermischt wird und wenn markiertes erstes Reagenz teilweise oder völlig aus der Bindung an den ersten Bereich (35) verdrängt wird, dann das Ausmaß der Verdrängung aus dem Ausmaß an Bindung an die zweiten Bereiche (36) ermittelt werden kann. Der chromatographische Lösungsmitteltransport hält an und die Probe/Indikatorlösung schreitet entlang der Vorrichtung fort, bis die Menge an Proben/Indikatorlösung erschöpft ist, oder bis die Lösungsfront um die rechte (37) und die linke (38) Lösungsmittelbarriere herum fortschreitet und das zweite Ende (34) der Vorrichtung erreicht.
  • Vorrichtungen, die mit markierten spezifischen Bindungsmaterial vorimprägniert sind
  • Ein alternativer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft Vorrichtungen für Assays, die auf spezifischer Bindung beruhen, bei denen eine Lösung von mit kolloidalen Partikeln markierten spezifischen Bindungsreagenzien, die zu chromatographischem Lösungsmitteltransport befähigt sind und ein meta-lösliches Protein auf die chromatographischen Substratmaterialien der Vorrichtungen aufimprägniert und aufgetrocknet werden. Es ist überraschend herausgefunden worden, daß das Trocknen der mit kolloidalen Partikeln markierten spezifischen Bindungsreagenzmaterialien in Anwesenheit von meta-löslichen Proteinen, wie etwa Casein, nicht nur für den schnellen chromatographischen Lösungsmitteltransport von markierten Materialien sorgt, sondern auch für die schnelle Wiederauflösung solcher markierter Materialien, die auf die chromatographischen Substratmaterialien aufimprägniert und aufgetrocknet sind. Die markierten Reagenzien, die derart wiederaufgelöst werden, sind zum wirksamen Transport mittels herkömmlicher chromatographischer Lösungsmittelsysteme und zur Reaktion in den spezifischen Bindungsassays befähigt.
  • Die Fähigkeit zu Imprägnierung chromatographischer Substratmaterialien mit den markierten spezifischen Bindungsreagenzien, die dann wieder aufgelöst werden können, ermöglicht die Durchführung einer Vielzahl von Assayverfahren, die die Verwendung von Schritten der Zugabe von markiertem Reagenz vermeiden. Sowohl Assays vom Sandwichtyp als auch solche vom Konkurrenztyp können unter Verwendung der Kits und Streifen der vorliegenden Erfindung durchgeführt werden.
  • Sandwichassay-Vorrichtung
  • Unter Bezugnahme auf die Zeichnung zeigen die 4a, 4b und 4c eine Testvorrichtung (50) zum Nachweis eines Analyten in einer Probe, wobei ein mit kolloidalen Partikeln markiertes erstes Reagenz und ein meta-lösliches Protein auf die Vorrichtung (50) aufimprägniert und aufgetrocknet sind. Die Vorrichtung (50) umfaßt eine bestimmte Länge eines chromatographischen Substratmaterials (51) mit einem ersten Ende (54), an dem der chromatographische Lösungsmitteltransport einsetzt und mit zweiten Enden (58), an denen der chromatographische Transport endet. Die Länge des Materials (51) umfaßt einen ersten Bereich (55) und einen zweiten Bereich (56) und einen dritten Bereich (57).
  • Zwischen dem ersten Ende (54) und dem ersten Bereich (55) befindet sich eine Verzögerungsbox, die durch eine Lösungsmittelbarrierenvorrichtung (60) rechts vorne, eine Lösungsmittelbarrierenvorrichtung (61) links vorne und eine querverlaufende Lösungsmittelbarrierenvorrichtung (62) definiert wird. Die Lösungsmittelbarrierenvorrichtung (60) rechts vorne und die rechte Kante (63) des Materials definieren einen rechtsseitigen chromatographischen Lösungsmitteltransportweg und die Lösungsmittelbarrierenvorrichtung (61) links vorne und der linke Rand (64) des Materials definieren einen linksseitigen chromatographischen Lösungsmitteltransportweg. Der rechtsseitige und der linksseitige chromatographische Lösungsmitteltransportweg treffen einander stromabwärts des ersten Bereiches (55) und der Verzögerungsbox unter Ausbildung eines mittleren chromatographischen Transportweges, indem sich der zweite (56) und der dritte (57) Bereich befinden, die durch eine rechtsrückwärtige Lösungsmittelbarrierenvorrichtung (65) und eine linksrückwärtige Lösungsmittelbarrierenvorrichtung (66) definiert werden. Stromabwärts des dritten Bereiches (57), definieren die rechtsrückwärtige Lösungsmittelbarrierenvorrichtung (65) und die rechte Kante (63) und die linksrückwärtige Lösungsmittelbarrierenvorrichtung (66) und die linke Kante (64) einen chromatographischen Lösungsmitteltransportweg der zu den zweiten Enden (58) führt, an denen der chromatographische Lösungsmitteltransport endet.
  • Der erste Bereich (55) ist mit einem meta-löslichen Protein und einem mit kolloidalen Partikeln markierten ersten spezifischen Bindungsreagenz imprägniert, das in einem chromatographischen Lösungsmittel (68) mobil ist, und das zur Reaktion mit und zur Immobilisierung gegen Lösungsmitteltransport, durch den Analyten befähigt ist, wenn der Analyt in immobilisierter Form vorliegt. Der zweite Bereich (56) befindet sich stromabwärts des ersten Bereiches (55) und liefert eine geeignete Stelle zur Aufnahme der Probe, die analysiert werden soll. Der dritte Bereich (57) befindet sich stromabwärts des zweiten Bereiches (56) und ist mit einem zweiten Reagenz imprägniert, das entgegen dem Lösungsmitteltransport immobilisiert ist, und daß zur selektiven Reaktion mit dem Analyten befähigt ist, um den Analyten in eine immobilisierte Form, zu überführen. Die Vorrichtung umfaßt desweiteren einen inerten Trägerstreifen (52), an den ein Längenabschnitt von chromatographischem Substratmaterial (51) angebracht ist. Die Vorrichtung umfaßt zusätzlich eine Deckplatte (53), die wahlweise durchsichtig sein kann, und die oberhalb des Längenabschnittes des chromatographischen Materials (51) angebracht werden kann, wobei das erste Ende (54) des Materials freigelassen wird. Die Deckplatte (53) definiert eine Öffnung, die dem zweiten Bereich (56) entspricht und diesen frei läßt. Ein entfernbarer Deckel (59) deckt den zweiten Bereich (56) ab.
  • Gemäß einem Verfahren zur Verwendung der Vorrichtung (50) der 4a, 4b und 4c, wird der erste Deckel (59) von der Vorrichtung (50) entfernt, eine Probe des zu testenden Materials wird auf den zweiten Bereich (56) aufgegeben, und der entfernbare Deckel (59) wird wieder aufgesetzt. Die Vorrichtung (50) wird dann an ihrem ersten Ende (54) in einen Behälter (67) von chromatographischem Lösungsmittel (68) eingetaucht. Das chromatographische Lösungsmittel (48) schreitet dann entlang dem Längenabschnitt des chromatographischen Materials fort, wobei es entlang dem rechtsseitigen und dem linksseitigen chromatographischen Lösungsmitteltransportweg zum mittleren chromatographischen Transportweg hin schreitet. Ein Teil des Lösungsmittels wird aufwärts in Richtung auf den zweiten Bereich (56) hin transportiert, während ein anderer Teil des Lösungsmittels abwärts zum ersten Bereich (55) hin transportiert wird, wo es das erste markierte Reagenz auflöst. Ein Teil des chromatographischen Lösungsmittels (68) von dem ersten Ende (54) tritt zwischen der rechtsvorwärtigen Lösungsmittelbarrierenvorrichtung (60) und der linksvorwärtigen Lösungsmittelbarrierenvorrichtung (61) hindurch in die Verzögerungsbox hinein. Das chromatographische Lösungsmittel fließt um die querverlaufende Lösungsmittelbarrierenvorrichtung (62) herum, die dessen Fluß verzögert, bevor es zum ersten Bereich (55) hin transportiert wird. Das markierte erste Reagenz im ersten Bereich ist bereits von dem Lösungsmittel aus dem rechts- und linksseitigen Lösungsmitteltransportweg aufgelöst worden, und das Lösungsmittel, das durch die Verzögerungsbox fortschreitet, beginnt, das erste Reagenz zu dem zweiten Bereich (56) hin zu transportieren, sobald es das aufgelöste erste Reagenz erreicht. Das chromatographische Lösungsmittel (68), das durch den rechtsseitigen und den linksseitigen Lösungsmitteltransportweg hindurch transportiert worden ist gerät dann mit der Probe in Kontakt, die auf den zweiten Bereich (56) aufgegeben worden ist und transportiert die Probe zu dem dritten Bereich (57). Dort reagiert das immobilisierte zweite Reagenzmaterial selektiv mit dem Analyt, der in der Probe vorhanden ist, wobei dieser immobilisiert wird. Nicht-Analytkomponenten der Proben werden von dem dritten Bereich (57) wegtransportiert. Das markierte erste Reagenz wird dann zu dem dritten Bereich (57) hintransportiert, wo es entgegen dem chromatographischen Lösungsmitteltransport durch den Analyten immobilisiert wird, sofern der Analyt in immobilisierter Form vorliegt. Der chromatographische Lösungsmitteltransport der an Analyt verarmten Probe und des ersten Reagenzes hält an, bis das chromatographische Lösungsmittel (68) das zweite Ende (58) des Materials erreicht hat.
  • Eine Vielzahl von Assayvorrichtungen von Sandwichtyp, die mit kolloidalen Partikeln markierte getrocknete Reagenzien umfassen, können gemäß der Erfindung hergestellt werden. Es ist oft wünschenswert, verfrühten Kontakt des Analyten und der Probenmaterialien mit den Reagenzien und den Kontakt der Reagenzien untereinander zu vermeiden. Daher können die relative Mobilität der Probenbestandteile und der verschiedenen Reagenzien oder das topologische Verhältnis zwischen den Bereichen derart ausgewählt werden, daß die Reagenzien und die Probenbestandteile sich nur zu den gewünschten Zeitpunkten und an den gewünschten Stellen vermischen. Die Europäische Patentanmeldung Nr. 262 328 offenbart verschiedene Verfahren und Vorrichtungen zur Durchführung chromatographischer Lösungsmitteltransportassays, bei denen es erwünscht ist, den Kontakt eines markierten ersten Reagenzmaterials (wie etwa eines antihuman-Immunglobulin-Antikörpers) mit Probenmaterial (wie etwa Serum) vor dem Zeitpunkt zu vermeiden, zu dem der Analyt-Antikörper entgegen dem Lösungsmitteltransport in einem Reaktionsbereich immobilisiert ist, und zu dem andere nicht-Analyt-Antikörper, die in der Serumprobe enthalten sind, von dem dritten Bereich durch chromatographischen Lösungsmitteltransport entfernt worden sind. Die Verwendung von Beschleunigungs- und Verzögerungswegen, kann ebenfalls insbesondere zur Verhinderung des Eintrocknens der Probenmaterialien oder anderer Reagenzien verwendet werden.
  • Konkurrenzassayvorrichtung
  • Die Assayvorrichtungen der vorliegenden Erfindung, die auflösbare spezifische Bindungsreagenzien umfassen, sind ebenfalls für die Durchführung von Assays vom Konkurrenzbindungstyp geeignet. Gemäß solchen Verfahren wird, wie in einem Assay vom Sandwichtyp, das immobilisierte zweite Reagenz ausgewählt, so daß es spezifisch an den interessierenden Analyten bindet. Das markierte erste Reagenz ist jedoch so ausgewählt, daß es ein spezifisches Bindungsanalogon des Analyten darstellt, das konkurrierend an das immobilisierte zweite Reagenz bindet. Bei der Durchführung von Assays vom Konkurrenztyp gemäß der Erfindung ist es allgemein nicht nötig, daß der Analyt und das mit kolloidalen Partikeln markierte Reagenz an dem Kontakt miteinander vor ihrem In-Kontakt-Bringen mit dem immobilisierten zweiten Reagenz gehindert werden. Daher kann die Vorrichtung so ausgelegt werden, daß die den Analyt enthaltende Probe und das markierte erste Reagenz vermischt werden. Natürlich kann die Vorrichtung, wenn es denn erwünscht ist, so ausgelegt werden, daß der Kontakt der Probe und der markierten ersten Reagenzien verhindert wird, bis zu dem Zeitpunkt, zu dem sie mit dem immobilisierten zweiten Reagenz in Kontakt geraten sind.
  • Unter Bezugnahme auf die Zeichnung zeigen die 5a, 5b und 5c eine Testvorrichtung (70) zur Durchführung konkurrierender Bindungsassays zum Nachweis eines Analyten in einer Probe, bei denen ein mit kolloidalen Partikeln markiertes erstes Reagenz in Anwesenheit eines meta-löslichen Proteins auf die Vorrichtung (70) aufimprägniert und aufgetrocknet wird. Die Vorrichtung (70) umfaßt einen Längenabschnitt eines chromatographischen Substratmaterials (71) mit einem ersten Ende (74), an dem der chromatographische Transport einsetzt und einem zweiten Ende (77), an dem der chromatographische Lösungsmitteltransport endet. Der Längenabschnitt des Materials (71) umfaßt einen ersten Bereich (75) und einen zweiten Bereich (76). Der erste Bereich ist mit einem markierten ersten Reagenz in Anwesenheit eines anti-Aggregationspuffers imprägniert, der ein meta-lösliches Protein enthält. Der zweite Bereich (76) befindet sich stromabwärts des ersten Bereiches (75) und ist mit einem zweiten Reagenz imprägniert, das zur selektiven Bindungsreaktion sowohl mit dem Analyten als auch mit dem ersten markierten Reagenz fähig ist, so daß der Analyt und das markierte erste Reagenz in eine immobilisierte Form überführt werden. Die Vorrichtung umfaßt desweiteren einen inerten Trägerstreifen (72), an dem ein Längenabschnitt von chromatographischem Substratmaterial (71) angebracht ist. Die Vorrichtung umfaßt zusätzlich eine Deckplatte (73), die oberhalb des Längenabschnittes des chromatographischen Substratmaterials (71) angebracht wird, und die das erste Ende (74) des Materials offen läßt. Die Deckplatte (73) definiert eine Öffnung, die dem ersten Bereich (75) entspricht und diesen freiläßt, welcher mit einem entfernbaren Deckel (78) bedeckt wird.
  • Gemäß einer Vorgehensweise zur Verwendung der Vorrichtung (70) nach den 5a, 5b und 5c wird der Deckel (78) von der Vorrichtung (70) entfernt und eine zu testende Materialprobe wird auf den ersten Bereich (75) aufgegeben, und der Deckel (78) wird wieder aufgesetzt. Die Vorrichtung (70) wird dann an ihrem ersten Ende (74) in einen Behälter (79) eingetaucht, der chromatographisches Lösungsmittel (80) enthält. Das chromatographische Lösungsmittel (80) schreitet dann entlang dem Längenabschnitt des chromatographischen Substratmaterials (71) fort, wobei es das markierte erste Reagenz, daß auf den ersten Bereich (75) aufimprägniert ist, und die Probe, die dort aufgebracht wurde, zu dem zweiten Bereich (76) hin tranportiert. Dort konkurrieren der Analyt und das markierte erste Reagenz, um die Bindung an das immobilisierte zweite Reagenz dem gegenüber sie beide spezifisch reaktiv sind. Nicht Analytbestandteile, wie auch ungebundener Analyt und erstes Reagenzmaterial werden von dem zweiten Bereich (76) mittels des chromatographischen Lösungsmitteltransportes wegtransportiert, wobei der chromatographische Lösungsmitteltransport anhält, bis das chromatographische Lösungsmittel erschöpft ist, oder bis die Lösungsmittelfront das zweite Ende (77) des Materials erreicht. Nach Beendigung des chromatographischen Lösungsmitteltransportes kann der zweite Bereich (76) direkt betrachtet werden, um die Anwesenheit von mit kolloidalen Partikeln markiertem ersten Reagenz, das an dieser Stelle immobilisiert wurde, zu bestimmen. Die Anwesenheit von markiertem ersten Reagenz an dieser Stelle kann zu der Anwesenheit von Analyt in der Probe in Beziehung gesetzt werden.
  • Beschreibung der kolloidalen Partikel
  • Die vorliegende Erfindung ist auf Mittel gerichtet, um die chromatographischen Transporteigenschaften von kolloidalen Partikeln, die in spezifischen Bindungsassays verwendet werden, zu verbessern. Die kolloidalen Partikel, die im Zusammenhang mit den Verfahren, Kits und Vorrichtungen der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, sind solche, wie sie allgemein bei spezifischen Bindungsassays verwendet werden können. Insbesondere gut bekannt ist die Verwendung kolloidaler Metallpartikel und besonders kolloidalen Goldes zur Durchführung von Immunoassays. Andere kolloidale Partikel, wie polymerisierte Farbstoffpartikel, die ebenfalls als Markierungen in spezifischen Assayverfahren, wie etwa denjenigen von Hirschfeld, U.S. Patent Nr. 4 166 105 und Henry, U.S. Patent Nr. 4 452 886 verwendet werden können, können nun ebenfalls in spezifischen Bindungsassays verwendet werden, die den chromatographischen Transport anwenden. Insbesondere bevorzugte Markierungen aus kolloidalen Partikeln zur Verwendung mit der vorliegenden Erfindung umfassen nicht metallische Partikel wie Selen, Tellur und Schwefel, wobei Selen besonders bevorzugt wird.
  • Die kolloidalen Partikel, die als Markierungen gemäß der Erfindung geeignet sind, umfassen solche, die an spezifische Bindungsreagenzien konjugiert werden können, ohne daß die Aktivität solcher Reagenzien oder anderer Reagenzien oder Analyten beeinträchtigt wird. Die Partikel müssen nachweisbar sein und vorzugsweise ein visuell nachweisbares Signal erzeugen, wenn sie in relativ niedrigen Konzentrationen vorhanden sind. Partikel, deren Größe von ungefähr 1 nm (Nanometer) bis ungefähr 200 nm im Durchmesser reicht, sind allgemein geeignet, obwohl sowohl größere als auch kleinere Partikel ebenfalls zur Verwendung gemäß der Erfindung geeignet sind. Die Verfahren der Erfindung sind insbesondere bei Partikeln nützlich, die größer als ungefähr 1 nm im Durchmesser sind, und die im Hinblick auf die Aggregation besonders empfindlich sind. Partikel, die größer als ungefähr 200 nm sind, neigen dazu, eine verminderte Mobilität aufzuzeigen, und sie können sogar in Anwesenheit des den chromatographischen Transport erleichternden Agens der vorliegenden Erfindung zum Ausfallen aus der Suspension neigen. Partikel, die wesentlich größer sind, weisen auch eine durch die Porengröße des chromatographischen Transportmaterials eingeschränkte Transportfähigkeit auf. Partikel, die kleiner als ungefähr 1 nm sind, neigen dazu, überlegene chromatographische Mobilität gegenüber größeren Partikeln aufzuweisen, und in einigen Fällen benötigen sie nicht die Verwendung der den chromatographischen Transport erleichternden Agenzien der vorliegenden Erfindung. Nicht desto trotz neigen die Partikel, die kleiner als ungefähr 1 nm sind zur Lieferung schwächerer Signale und sind daher zur Verwendung in Assayverfahren weniger geeignet.
  • Kolloidale Metallpartikel sind als Markierungen gemäß der vorliegenden Erfindung besonders geeignet und umfassen solche Partikel, die Metalle oder Metallverbindungen umfassen, einschließlich Metalloxiden, Metallhydroxyden oder Metallsalzen. Solche Partikel schwanken allgemein im Durchmesser von ungefähr 1 nm bis ungefähr 200 nm, wobei Partikel mit einem Durchmesserbereich zwischen ungefähr 40 nm bis ungefähr 80 nm besonders bevorzugt werden. Die Partikel können reines Metall oder Metallverbindungen umfassen, aber sie können ebenfalls Polymerkerne umfassen, die mit Metall oder mit Metallverbindungen beschichtet sind. Von solchen Partikeln ist offenbart, daß sie Eigenschaften aufweisen, die denjenigen der Partikel ähnlich sind, die reines Metall oder Metallverbindungen umfassen. Geeignete Metalle und Metallverbindungen umfassen solche, die aus der Gruppe gewählt sind, die aus den Metallen Platin, Gold, Silber und Kupfer besteht und aus den Metallverbindungen Silberjodid, Silberbromid, Kupferhydroxid, Eisenoxid, Eisenhydroxid oder hydratisiertem Oxid, Alluminiumhydroxid oder hydratisiertem Oxid, Chromhydroxid oder hydratisiertem Hydroxid, Bleisulfid, Quecksilbersulfid, Bariumsulfat und Titandioxid. Bevorzugte Metallpartikel umfassen solche, die aus Gold, Silber oder Eisenoxid bestehen.
  • Die kolloidalen Metallpartikel können gemäß den in der Technik allgemein bekannten Verfahren hergestellt werden. Insbesondere Frens, Nature, 241, 20 (1973), dessen Offenbarung hiermit durch Bezugnahme in die Anmeldung aufgenommen wird, offenbart Verfahren für die Herstellung von Goldsolpartikel verschiedener Größen. Die Goldpartikel können nach Verfahren hergestellt werden, bei denen eine Lösung von Goldchlorid zum Sieden erhitzt wird und dann mit einer Lösung von Natriumcitrat vermischt wird, um das Goldchlorid zu reduzieren. Kurz nach der Vermischung der beiden Lösungen wird die siedende Lösung tiefblau, was das Einsetzen der Kernbildung anzeigt. Kurz darauf wechselt die blaue Farbe zu rot hin, was die Ausbildung monodisperser Partikel anzeigt. Die Reduktion des Goldchlorids ist nach nur wenigen weiteren Minuten Siedens vollständig. Die resultierenden Partikelgrößen können durch Veränderung der Konzentration der Natriumcitratlösung beeinflußt werden. Partikel, die andere Metalle und Metallverbindungen wie auch solche Partikel, die Polymerkerne umfassen, können nach ähnlichen Verfahrensweisen erhalten werden. Die Farben der visuell nachweisbaren Signale der Markierungen aus Metallpartikeln hängt von der Art und der Partikelgröße der Metallpartikel ab. Zum Beispiel erzeugen kolloidale Goldpartikel Farben, die von orange bis rot bis hin zu violett reichen, in Abhängigkeit von der Partikelgröße des Sols.
  • Konjugation der Bindungsreagenzien mit den kolloidalen Partikeln
  • Die spezifischen Bindungsreagenzien der Erfindung können mit Markierungen aus kolloidalen Partikeln konjugiert werden, wobei Verfahren angewendet werden, die in der Technik allgemein bekannt sind. Gemäß einer allgemeinen Vorgehensweise werden proteinhaltige spezifische Bindungsreagenzien und kolloidale Partikel schnell miteinander vermischt und in einer Lösung inkubiert, zu der ein Agens, wie Rinderserumalbumin oder Polyethylenglykol zugegeben wird. Die Suspension wird zuerst bei geringer Geschwindigkeit zentrifugiert, um alle großen Aggregate zu entfernen und dann bei hoher Geschwindigkeit, um ein Pellet aus Reagenz/kolloidales Partikel-Konjugat zu erzeugen, bevor der Überstand abgesaugt und entfernt wird. Das Pellet wird dann in einer Lösung resuspendiert, die ein den chromatographischen Transport erleichterndes Agens gemäß der Erfindung enthält.
  • Die Markierungen aus kolloidalen Partikeln müssen nicht direkt mit den spezifischen Bindungsreagenzien konjugiert sein, sondern sie können auch mit anderen Reagenzien beschichtet oder vorbehandelt sein. Leuvering, offenbart im U.S. Patent Nr. 4 313 734 Verfahren, durch die metallische Solpartikel mit inerten Polymeren- und Copolymerenbeschichtungen beschichtet werden können. Das metallische Sol kann mit dem Polymer in Kontakt gebracht werden, oder das Sol kann in eine Umgebung eingetragen werde, die ein oder mehrere Monomere enthält, und die Polymerisationsreaktion kann initiiert werden. Nach dem Beschichten mit dem inerten Polymer kann der immunologisch spezifisch bindende Bestandteil an das Beschichtungsmaterial mittels Adsorption oder kovalenter Bindung gekuppelt werden.
  • Beschreibung des meta-löslichen Proteins
  • Wie hierin verwendet, bezeichnet der Ausdruck meta-löslichen Protein solche Proteine, die in ihrer nativen Form hydrophob und in Wasser wenig löslich sind, die aber, wenn sie einer chemischen Behandlung wie etwa einer alkalischen Reinigungsbehandlung unterzogen wurden, hydrophiler gemacht werden können, und die daher zur Ausbildung einheitlicher Lösungen oder Dispersionen in Wasser befähigt sind. Solche chemischen Behandlungen dienen der Abspaltung hydrophober Fettsäuregruppen aus den Proteinmolekülen durch Spaltung der Esterbindungen oder anderer Bindungen. Diese Spaltung hinterläßt Carboxy- und Hydroxyreste auf dem Molekül, wodurch das Protein an diesen Stellen hydrophiler gemacht wird. Ohne daß dadurch die Erfindung auf eine einzelne Theorie eingeschränkt werden soll, wird angenommen, daß die alkalische Behandlung das meta-lösliche Protein zu einem gewissen Ausmaß detergenzartig macht, d. h., daß es sowohl hydrophobe als auch hydrophile Aspekte aufweist. Die chemische Behandlung, obwohl sie zur Durchführung der Erfindung notwendig ist, braucht keine alkalische Behandlung zu sein, aber sie kann ebenfalls mit Säuren, Detergenzien oder Lösungsmitteln wie etwa Alkohol oder Harnstoff erfolgen.
  • Die Proteine sind, wenn sie so behandelt sind, zur Funktion als starke den chromatographischen Transport erleichternde Agenzien fähig, wobei sie die Aggregation und daher die Inaktivierung der mit kolloidalen Partikeln markierten Reagenzien verhindern. Zusätzlich sorgen die behandelten meta-löslichen Proteine, wenn sie zusammen mit einem mit kolloidalen Partikeln markierten labilen Proteinmaterial auf einem chromatographischen Medium zur Erzeugung einer Testvorrichtung der vorliegenden Erfindung aufgetrocknet sind, für die stabile Lagerung, und sie verhindern die Aggregation und Inaktivierung, wenn der trockene Zustand beibehalten wird, während sie den Proteinmaterialien erlauben, schnell wieder aufgelöst zu werden und daher in chromatographischen Transportassays der vorliegenden Erfindung verwendet zu werden. Bevorzugte meta-lösliche Proteine umfassen Materialien, wie etwa Casein, Zein und einen nicht-Albuminbestandteil von Eiweißprotein, wobei Casein in Konzentrationen von 1 bis 5% besonders zur Verwendung mit der Erfindung bevorzugt ist. Bevorzugte Materialien umfassen: vitaminfreies Casein (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, Katalognr. C-3400), Zein (Sigma, Katalognr. Z-3625) und Eiweißprotein (Sigma, Katalognr. A-5253) welche sowohl das meta-lösliche Protein umfassen, daß für die Auflösung und den Transport verantwortlich ist, als auch inaktive Albuminfraktionen. Es ist bekannt, daß der Eiweißbestandteil, der für die Auflösung und den Transport verantwortlich ist, kein Eiweißalbumin ist, da das reine Albuminmaterial die Wiederauflösung und den Transport nicht fördert.
  • Beschreibung des den chromatographischen Transport erleichternden Agens
  • Wie hierin verwendet, betrifft der Ausdruck "den chromatographischen Transport erleichterndes Agens" solche Materialien,,die die Aggregation und die Inaktivierung spezifischer Bindungsmaterialien und von Reagenzien in Lösung verhindern und die desweiteren deren chromatographischen Transport fördern. Die Agenzien können Flüssigkeiten oder sie können Feststoffe sein, wobei sie im letzteren Fall vorzugsweise in einer Lösung wie etwa einer Puffersalzlösung gelöst sind. Geeignete den chromatographischen Transport erleichternde Agenzien umfassen Materialien wie Polyethylenglykol, proteinartige Materialien, wie etwa Gelatine und Rinderserumalbumin und Detergenzien, wie etwa Natriumdodecylsulfat (SDS), Natriumdeoxycholat (DOC) und Triton® X 100. Gemäß der Erfindung umfasst das den chromatographischen Transport erleichternde Agens meta-lösliche Proteinmaterialien wie z.B. Casein. Meta-lösliche Proteine können ebenfalls zur Imprägnierung und Auftrocknung von mit kolloidalen Partikeln markierten Reagenzien auf die chromatographischen Substratmaterialien verwendet werden, wobei Testvorrichtungen gemäß der Erfindung auf eine solche Weise erzeugt werden, daß die markierten Reagenzien schnell wieder aufgelöst und mittels chromatographischen Lösungsmittelstransportes transportiert werden können.
  • Wenn das den chromatographischen Transport erleichternde Agens mit dem mit kolloidalen Partikeln markierten Material vermischt werden soll, und wenn es als Bestandteil einer Indikatorlösung bei "Mix-and-Run-Kits" verwendet werden soll, umfaßt es Casein oder ein anderes behandeltes meta-lösliches Protein, in Kombination mit anderen den chromatographischen Transport erleichternden Agenzien, wie etwa PEG in Puffersalzlösung. Ein besonders bevorzugter, den chromatographischen Transport erleichternder Puffer umfaßt 2%ig Casein in Kombination mit 0,1% PEG in PBS. Die Konzentration der Bestandteile des Puffers und der Indikatorlösung werden für die Durchführung des "Mix-and-Run-Kits" der Erfindung derart ausgewählt, das für eine gegebene Probengröße ausreichende Konzentrationen der Bestandteile bereitgestellt werden, um die Aggregation und die Inaktivierung der markierten Reagenzien zu verhindern und deren chromatographischen Lösungsmitteltransport zu fördern.
  • Mit kolloidalen Partikeln markierte spezifische Bindungsreagenzien haben in der Anwesenheit von Casein enthaltenden Lösungen Rf-Werte in der Nähe von 1,0, während mit kolloidalen Partikeln markierte Materialien in Puffern, die PEG enthalten, Rf-Werte in der Nähe von 0,7 aufweisen. Die Caseinkonzentrationen in geeigneten den chromatographischen Transport erleichternden Puffern können von zwischen 0,1% (G/V) (Gewicht/Volumen) bis mehr als ungefähr 5 (G/V) reichen, wobei Konzentrationen von ungefähr 2 (G/V) bevorzugt sind. Es ist zu bemerken, daß Konzentrationen, die größer als ungefähr 5 (G/V) sind, offensichtlich bei der Verhinderung der Aggregation nicht helfen oder auch dem Puffer keine den chromatographischen Transport erleichternden Eigenschaften verleihen, während sie jedoch dazu neigen, mit der Wiederauflösung der markierten Reagenzien, die auf den Teststreifen der Erfindung aufgetrocknet sind, zu interferieren.
  • PEG-haltige Puffer haben Rf-Werte, die bei 0,7 liegen. Bevorzugte PEG-Konzentrationen in geeigneten den chromatographischen Transport erleichternden Puffern reichen von ungefähr 0,05 bis ungefähr 2%, wobei ungefähr 1% bevorzugt ist. Geeignete PEG-Polymere können eine Vielzahl von Molekulargewichten aufweisen, wobei Molekulargewichte von ungefähr 20 000 besonders bevorzugt werden.
  • Gelatine ist allgemein zur alleinigen Verwendung als den chromatographischen Transport erleichternden Agens ungeeignet, da Lösungen, die Gelatine enthalten, nur einen Rf-Wert von ungefähr 0,2 liefern. Sie kann nicht desto trotz nützlich sein, wenn sie mit anderen anti-Aggregationsmaterialien kombiniert wird, die in der Erfindung verwendet werden. Gelatine ist jedoch allgemein, wenn sie in Konzentrationen, die größer als ungefähr 2% sind ungeeignet, da sie zur Aggregationstendenz beiträgt.
  • Pufferlösungen, die zur Verwendung mit den den chromatographischen Transport erleichternden Agenzien der Erfindung geeignet sind, sollten einen pH zwischen ungefähr 5 und 9 aufweisen, und sie sollten nicht mit der Reaktivität des Analyten oder der Reagenzien oder deren chromatographischen Transport interferieren. Bevorzugte Pufferlösungen haben pH-Werte von ungefähr 7, und umfassen Puffer wie Tris und PBS.
  • Beschreibung der chromatographischen Medien
  • Chromatographische Medien, die zur Verwendung mit der vorliegenden Erfindung nützlich sind, umfassen solche chromatographischen Substratmaterialien, die eine Kapillarität und die Fähigkeit zum chromatographischen Lösungsmitteltransport von nicht immobilisierten Reagenzien und reaktiven Probenbestandteilen mittels eines ausgewählten chromatographischen Lösungsmittels aufweisen. Die chromatographischen Substratmaterialien, die mit der Erfindung verwendet werden, liegen vorzugsweise in der Form von Streifen vor, aber. es ist in Betracht gezogen, daß sie andere Formen aufweisen können, einschließlich, aber nicht beschränkt auf Partikel oder Gelmaterialien in einer chromatographischen Säule. Während eine große Vielzahl von chromatographischen Streifenmaterialien, wie etwa gewebten und nicht gewebten faserigen Materialien für die Papierchromatographie zur Verwendung mit der Erfindung geeignet sind, wird die Verwendung mikroporöser oder mikrogranulärer Dünnschichtchromatographiesubstrate besonders bevorzugt, da die Verwendung solcher Substrate die Geschwindigkeit und Auflösung der Assays gemäß der Erfindung verbessert. Die Materialien sollten vorzugsweise inert sein, und sollten allgemein nicht physikalisch oder chemisch mit irgendwelchen Bestandteilen der Probe, Reagenzien, Markierungen aus kolloidalen Partikeln, Puffern oder Reaktionsprodukten reagieren.
  • Dünnschichtchromatographiesubstratmaterialien, die für die Verwendung mit der vorlegenden Erfindung besonders geeignet sind, umfassen granuläre Dünnschichtchromatographiematerialien, wie Silica oder mikrogranuläre Zellulose. Bevorzugte nichtgranuläre mikroporöse Materialien umfassen mikroporöse Zelluloseester, zum Beispiel Ester von Zellulose mit einer aliphatischen Carbonsäure, wie einer Alkancarbonsäure, die 1 bis 7 Kohlenstoffatome aufweist, zum Beispiel Essigsäure, Propionsäure oder, eine der Buttersäuren oder Valeriansäuren. Besonders bevorzugt sind mikroporöse Materialien, die aus Nitrozellulose bestehen, wobei mit diesem Ausdruck alle Salpetersäureester von Zellulose gemeint sind. Geeignete Materialien umfassen Nitrozellulose in Kombination mit allen der genannten Carbonsäurezelluloseestern. Daher können reine Nitrozelluloseester verwendet werden, da sie aus einem Ester von Zellulose bestehen, der ungefähr 3 Nitrogruppen pro 6 Kohlenstoffatome aufweist. Am meisten bevorzugt ist das Typ SMWP Material (Millipore Corp., Bedford, Massachusetts), das eine Porengröße von 5 μm aufweist.
  • Die verschiedenen chromatographischen Substratmaterialien können als solche in geeigneten Formen, wie etwa als Filme, Streifen oder Blätter verwendet werden. Sie können ebenfalls auf ein geeignetes inertes Trägermaterial aufgezogen oder daran gebunden oder auflamminiert werden, wie etwa auf Papier, Glas, Plastik, Metall oder Stoff (ein bevorzugtes inertes Trägermaterial ist Mylar®). Ein solches Trägermaterial hat nicht nur die Auswirkung, eine strukturelle Stütze für das chromatographische Substratmaterial abzugeben, sondern es verhindert auch die Verdampfung von Reagenz- und von Lösungsmittelmaterialien während des Assayverfahrens. Die Deckplatten können ebenfalls aus solchen inerten Materialien entworfen werden. Obwohl die Deckplatten für die Durchführung der Erfindung nicht notwendig sind, verleihen sie zusätzlichen strukturellen Rückhalt und darüberhinaus verhindern sie die Verdampfung von Reagenz und Lösungsmittelmaterialien während des Assayverfahrens. Solche Deckplatten können durchsichtig sein, um das Fortschreiten des Assays zu beobachten, und sie können Eingänge für die Zugabe von Probenmaterialien, chromatographischen Lösungsmitteln oder Reagenzien umfassen.
  • Das chromatographische Medium, auf dem die Assays durchgeführt werden, kann, jedwede Form oder Größe haben, es weist jedoch vorzugsweise die Form von Streifen einer Dicke im Bereich von ungefähr 0,01 mm bis ungefähr 0,5 mm auf, und besonders bevorzugt werden ungefähr 0,1 mm. Die Streifen können in den anderen Ausmaßen breit streuen, aber sie werden vorzugsweise ziemlich klein gehalten, um die Assayentwicklungszeit zu verkürzen und den Materialverbrauch zu minimieren. Wenn die Streifen in ihrer Größe extrem klein sind, können sie an einem geeigneten Griff oder Halter angebracht werden, was die Handhabung und Beobachtung der Ergebnisse erleichtert. Streifen, die ungefähr 3 mm breit und bis zu 75 mm lang sind, haben sich als besonders geeignet bei der Herstellung der Einzeltransportwegvorrichtungen gemäß der vorliegenden Erfindung erwiesen. Die Porengröße kann innerhalb breiter Grenzen schwanken, aber sie liegt vorzugsweise zwischen ungefähr 0,05 μm und 20 μm und besonders bevorzugt bei ungefähr 5 μm. Die Porengröße ist an ihrer unteren Grenze durch die Größe der transportierten Analyten, Reagenzien und Markierungen aus kolloidalen Partikeln eingeschränkt. Wenn die Porengröße zu gering ist, werden die Assaymaterialien langsam oder überhaupt nicht transportiert. Auf der anderen Seite ist die Porengröße durch die Bindungskapazität beschränkt. Es ist allgemein wünschenswert, daß der chromatographische Transport schnell ist, wobei der Transport und das Assay innerhalb weniger als 5 Minuten vervollständigt sein sollen vorzugsweise innerhalb weniger als ungefähr 2 Minuten. Der chromatographische Transport sollte nicht so schnell sein, daß die spezifische Bindungskapazität verloren geht, weil die Reagenzien nicht die Zeit haben, um spezifisch aneinander zu binden. Die Kombination von Porengröße und Substratdicke kann infolgedessen entsprechend den Eigenschaften der chromatographischen Lösungsmittel, der spezifischen Reagenzien, der Probenmaterialien und der Markierungen aus kolloidalen Partikeln, die verwendet werden, verändert werden, um die gewünschten Eigenschaften in Bezug auf Geschwindigkeit und Auflösung zu erhalten.
  • Es ist wünschenswert, daß bei der Ausbildung der Streifenmaterialien gemäß der vorliegenden Erfindung jegliche Unregelmäßigkeiten in den Materialien oder an den Kanten der Materialien, die ungleichmäßigen Fluß durch das Material hindurch hervorrufen könnten, vermieden werden. Eine Vorrichtung zum Zuschneiden der Streifenmaterialien umfaßt die Verwendung eines Papierschneiders, mit einer rotierenden Wolframkarbidklinge. Ein bevorzugtes Mittel umfaßt jedoch die Verwendung von Laserschneidwerkzeugen, welche besonders zur Verwendung in Massenherstellungsverfahren geeignet sind.
  • Da das chromatographische Medium der Vorrichtung vorzugsweise chemisch inert ist, muß es in jedem Bereich, an dem gewünscht wird, ein spezifisches Bindungsreagenz entgegen dem Lösungsmitteltransport zu immobilisieren, aktiviert werden. Es sind verschiedene Verfahren notwendig, um das Reagenz gemäß der besonderen chemischen Natur des Substratmaterials und des zweiten Reagenzes in den immobilisierten Zustand zu überführen. Allgemein ist, wenn das Medium Nitrozellulose oder ein gemischter Nitrozelluloseester ist, keine besondere chemische Bindung für die Immobilisierung von Reagenzien notwendig. Verschiedene Verfahren können für andere Materialien und Reagenzien, angewandt werden, welche die Funktionalisierung mit Materialien, wie etwa Carbonyldiimidazol, Glutaraldehyd oder Bernsteinsäure umfassen oder etwa die Behandlung mit Materialien wie Cyanogenbromid. Andere geeignete Reaktionen umfassen die Behandlung mit Schiffbasen und Borhydrid zur Reduktion von Aldehydgruppen, Carbonylgruppen und Aminogruppen. DNA, RNA und gewisse Antigene können entgegen dem Lösungsmitteltransport mittels Anbacken an dem chromatographischen Material immobilisiert werden. Das Anbacken kann bei Temperaturen durchgeführt werden, die von ungefähr 60°C bis ungefähr 120°C reichen während Zeiträumen, die von ungefähr 5 Minuten bis hin zu ungefähr 12 Stunden schwanken, vorzugsweise aber ungefähr bei 80°C für ungefähr 2 Stunden.
  • Lösungsmitteltransportbarrieren
  • Verschiedene Mittel sind bekannt, um den nacheinander abfolgenden Transport von Reagenzien und Probenmaterialien zu erzielen, wie er in der Europäischen Patentanmeldung Nr. 262 328 offenbart ist.
  • Lösungsmittelbarrieren, die den chromatographischen Fluß gemäß der Erfindung blockieren, können nach verschiedenen physikalischen oder chemischen Ätzverfahren ausgebildet werden. Spalte von weniger als 0,1 mm Breite behindern den Flüssigkeitsfluß, wie herausgefunden wurde. Ein bevorzugtes Mittel zur Ausbildung solcher Barrieren umfaßt die Verwendung von Laserätzverfahren. Ein CO2-Laser kann gemäß dem einen Verfahren verwendet werden, wobei auf Mylar® verstärkte Zellulose auf eine Trägerhalterung aufgebracht wird, welche auf einen computergesteuerten x-y Tisch aufgebracht wird, der zu sehr genauen Positionierungstoleranzen befähigt ist. Alternativ kann ein Strahlbewegungsmechanismus verwendet werden. Unter Verwendung einer Kombination geeigneter optischer Linsen und unter vorsichtiger Strahlfokussierung, kann ein Laserstrahlspot mit einem Durchmesser von ungefähr 0,13 mm (0,005 inch) auf die Nitrozellulose fokussiert werden. Unter vorsichtiger Steuerung der Lasernetzspannung kann ein schmaler Steg von Nitrozellulose ungefähr von 0,13 mm (0,005 inch) Breite entweder entfernt oder an den Mylarträger® festgeschmolzen werden. Die Verwendung eines CO2-Lasers wird besonders wird besonders bevorzugt, aufgrund des günstigen Kopplungseffektes des Laserlichtes mit der Nitrozellulose. Nicht desto trotz sind auch andere Arten von Lasern geeignet, vorausgesetzt, daß die Laserstrahlwellenlänge den gewünschten Effekt auf dem Lösungsmitteltransportmaterial hervorruft. Über die Verwendung eines sich bewegenden Strahls oder eines X-Y Führungstisches können präzise gearbeitete eingebuchtete Kanäle oder andere komplizierte Formen auf der Nitrozellulose erzeugt werden.
  • Beschreibung der spezifischen Bindungsreagenzien
  • Die spezifischen Bindungsreagenzien, die bei der vorliegenden Erfindung nützlich sind, umfassen solche Materialien, die Glieder eines spezifischen Bindungspaares sind, das aus einem Liganden und einem Rezeptor besteht. Der Ligand und der Rezeptor stehen zueinander derart in Beziehung, daß der Rezeptor spezifisch an den Liganden bindet, wobei er dazu fähig ist, den Liganden von anderen Materialien zu unterscheiden, die ähnliche Eigenschaften aufweisen. Die Verfahren, Kits und Vorrichtungen gemäß der vorliegenden Erfindung sind besonders bei der Durchführung immunologischen Assayverfahren nützlich, bei denen die spezifischen Bindungsreagenzien Antigene und Antikörper sind. Spezifische Bindungsmaterialien, wie etwa Avidin, Biotin, Strepatavidin und Antibiotin können ebenfalls mit kolloidalen Partikeln markiert werden und bei chromatographischen Lösungsmitteltransportassays gemäß der Erfindung verwendet werden. Die Verfahren, Kits und Vorrichtungen können sich ebenfalls bei der Durchführung von DNA- und RNA-Hybridisierungsassays und anderen spezifischen Bindungsassays als nützlich erweisen, wie etwa bei solchen, die Rezeptoren für Hormone oder andere biologisch aktive Agenzien umfassen.
  • Die Antikörper, die bei der Durchführung der Immunoassays der vorliegenden Erfindung nützlich sind, umfassen solche, die spezifisch mit verschiedenen Analyten reaktiv sind, deren Nachweis in biologischen Flüssigkeiten erwünscht ist. Solche Antikörper sind vorzugsweise IgG- oder IgM-Antikörper oder Mischungen dieser, welche im wesentlichen frei von Assoziationen mit Antikörpern sind, die zur Bindung mit nicht-Analytmolekülen befähigt sind. Die Antikörper können polyklonal oder monoklonal sein, und sie sind im Handel erhältlich oder sie können aus Mäuseascites, Gewebekultur oder gemäß anderen in der Technik bekannten Verfahren erhalten werden. Eine typische Beschreibung des Hybridomaverfahrens für die Herstellung von monoklonalen Antikörpern kann bei Wands, J.R., und V.R. Zurawski, in Gastroenterology 80: 225 (1981); Marshak-Rothstein, A., et al.; J. Immunol. 122: 2491 (1979); Oi, V.Y. und L.A. Herzenberg, "Immunoglobulin Producing Hybrid", Mishell, B.B. und S.M. Shiigi (eds.) Selected Methods in Cellular Immunoloay, San Francisco: W.H. Freeman Publishing, 1979; und U.S. Patent Nr. 4 515 893 von Kung, et al. gefunden werden. Die Verwendung von Mischungen monoklonaler Antikörper mit verschiedenen antigenen Spezifitäten oder von monoklonalen Antikörpern und polyklonalen Antikörpern kann wünschenswert sein. Es wird desweiteren in Betracht gezogen, daß Fragmente von Antikörpermolekülen als spezifische Bindungsreagenzien gemäß der Erfindung verwendet werden können, einschließlich halben Antikörpermolekülen und Fab, Fab' oder F (ab')2 Fragmenten, die in der Technik bekannt sind. Unbeachtet der besonderen Quelle oder der besonderen Art von Antikörpern wird es jedoch bevorzugt, daß sie allgemein frei von Verunreinigungen sind. Die Antikörper können mittels Säulenchromatographie oder mittels anderer herkömmlicher Mittel gereinigt werden, aber sie werden vorzugsweise gemäß bekannten Affinitätsreinigungsverfahren aufgereinigt.
  • Die Antigene und Haptene, die bei der Ausführung der Immunoassays der vorliegenden Erfindung nützlich sind, umfassen solche Materialien, welche sowohl natürlichen als auch synthetischen Ursprungs sind, und antigene Determinanten aufweisen, gegen die die Analytantikörper spezifisch reaktiv sind, wenn sie ihnen auf den chromatographischen Streifenmaterialien der Erfindung angeboten werden. Synthetisierte Antigene umfassen solche, welche gemäß herkömmlichen chemischen Synthesen aufgebaut wurden, wie auch solche, welche gemäß rekombinanter DNA-Verfahren aufgebaut wurden. Die Antigenmaterialien können ebenfalls mit kolloidalen Partikeln gemäß der Erfindung markiert sein und sie können in Assays vom Sandwichtyp für den Nachweis von Antikörperanalyten oder in Konkurrenzassays zum Nachweis von Antigenanalyten verwendet werden.
  • Die Verfahren und Vorrichtungen gemäß der vorliegenden Erfindung sind erwartungsgemäß bei der Durchführung einer großen Vielzahl von spezifischen Bindungsassays einschließlich Nukleinsäurehybridisierungsassays nützlich. DNA- und RNA-Hybridisierungsmaterialien, die gemäß der vorliegenden Erfindung nützlich sind, umfassen DNA- und RNA-Polynukleotidsonden, welche Basensequenzen aufweisen, die allgemein gegenüber denjenigen des Analytgenmaterials komplementär sind. Die Sonden der Erfindung haben allgemein zwischen ungefähr 25 und ungefähr 10 000 Basen, und vorzugsweise haben sie zwischen ungefähr 30 und ungefähr 5000 Basen. Die Sonden müssen zu den Basensequenzen des Analytgenmaterials nicht perfekt komplementär sein, und sie hybridisieren allgemein, vorausgesetzt daß ungefähr 70% oder mehr Homologie zwischen den Basensequenzen besteht. Die Bedingungen in Bezug auf die DNA- und RNA-Hybridisierung sind allgemein in Crosa, et al., J. Bact. 115(3), 904–911 (1973) offenbart. Die Polynukleotidsondenmaterialien können gemäß in der Technik gut bekannten Verfahren erhalten werden. Siehe zum Beispiel Kornberg, "DNA Replication", W.H. Freeman and Co., San Francisco, 670–679 (1978); Dallas, et al., J. Bacteriol. 139, 850–858 (1979) und So, et al., Nature; 277, 453–456 (1979).
  • Beschreibung der Blockierungsagenzien
  • Blockierungsagenzien, die bei der Herstellung von Vorrichtungen für die spezifische Bindung der vorliegenden Erfindung nützlich sind, sind solche Agenzien, die zur Blockierung überschüssiger Bindungsstellen auf dem chromatographischen Medium fähig sind, welche den chromatographischen Lösungsmitteltransport von Probenmaterialien oder Reagenzien der Erfindung behindern könnten. Es ist allgemein nicht notwendig, das chromatographische Substratmaterial bei der Durchführung von "Mix and Run"-Assays zu blockieren, bei denen die spezifisch bindenden Reagenzien mit dem Probenmaterial und dem chromatographischen Lösungsmittel vermischt werden. Die Blockierung überschüssiger Bindungsstellen auf dem chromatographischen Lösungsmaterial ist jedoch insbesondere nutzvoll, wenn die Probe oder irgendwelche der Reagenzien auf dem Streifen in Abwesenheit eines chromatographischen Lösungsmittels aufimprägniert sind. Bei der Herstellung von Vorrichtungen der vorliegenden Erfindung wird das chromatographische Medium mit dem Reagenz oder mit den Reagenzien imprägniert, die an der Stelle oder an den gewünschten Stellen immobilisiert werden sollen. Sobald das Reagenz oder die Reagenzien in den gewünschten Bereichen immobilisiert worden sind, wird der Streifen dann so weiterverarbeitet, daß die überschüssigen Bindungsstellen auf den chromatographischen Material, welche mit dem chromatographischen Lösungsmitteltransport anderer Reagenzien oder Probenmaterialien interferieren könnten, blockiert werden. Insbesondere geeignet ist die Verwendung von Blockierungslösungen, die Proteine von Quellen wie etwa Casein, Gelatine oder Vollserum umfassen. Solche Protein sind derart ausgewählt, daß sie mit den Reagenzmaterialien des Assays nicht interferieren oder kreuzreagieren. Die Blockierung der Reaktionsstellen kann vorzugsweise durch Eintauchen des chromatographischen Substratmaterials in eine Lösung von 0,2% Casein in physiologischer Kochsalzlösung und Lufttrocknen des Streifenmaterials durchgeführt werden. Andere Verfahren umfassen das Eintauchen in Lösungen von 0,1% Gelatine oder 0,1% BSA; gefolgt von der Lufttrocknung des Substratmaterials.
  • Beschreibung des chromatographischen Lösungsmittelsystems
  • Kits zur Durchführung von "Dip and Run"-Assays gemäß der Erfindung verwenden Mischungen von Probenmaterialien und Indikatorlösungen als solche zum chromatographischen Transport der mobilen Elemente des Assays. Wenn die Assayvorrichtungen nicht vom "Dip and Run"-Typ sind, und die Probenmaterialien in geringeren Mengen auf Stellen aufgegeben werden, die sich nicht am ersten Ende der Assayvorrichtungen befinden, sind chromatographische Lösungsmittel notwendig, um die verschiedenen Reagenzien und Probenbestandteile auf den Assayvorrichtungen zu transportieren.
  • Geeignete chromatographische Lösungsmittelsysteme für spezifische Bindungsassays gemäß der Erfindung sind solche, die zur Auflösung des Analyten, des den chromatographischen Transport erleichternden Agens, der mit kolloidalen Partikeln markierten Reagenzien und jedweden zusätzlichen Reagenzes und zusätzlicher Materialien befähigt sind, und die diese auf dem chromatographischen Material transportieren. Solche Lösungsmittel sollten eine ausreichende Ionenstärke aufweisen, um die elektrostatische Wechselwirkung der transportierten Materialien mit dem Streifenmaterial zu unterbinden. Ein bevorzugtes Lösungsmittel zur Verwendung im Immunoassayverfahren gemäß der Erfindung ist physiologische Kochsalzlösung mit einem pH im Neutralbereich. Proteine wie auch Detergenzien wie etwa Natriumdodecylsulfat (SDS), Triton®X-100 und Natriumdeoxycholat (DOC) können in das chromatographische Lösungsmittel in solchen Mengen beigesetzt werden, die die nicht-spezifische Bindung mit dem Streifenmaterial auf ein Minimum reduzieren, aber nicht in einem solchen Übermaß, als daß die gewünschte Bindungs- und Immobilisierungsreaktion unterbunden würde. Andere chromatographische Lösungsmittel, wie etwa Hochleistungsflüssigkeitschromatographie-(HPLC)-Lösungsmittel und Hochleistungsdünnschichtchromatographie-(HPTLC)- Lösungsmittel, welche die Auflösung von Proteinen fördern und auch die andere Reaktanten, und welche die Bindung an die Streifenmaterialien, wie etwa Nitrozellulose, minimieren, können ebenfalls verwendet werden.
  • Beispiel 1
  • Gemäß diesem Beispiel wurde Casein einem alkalischen Reinigungsbehandlungsverfahren unterzogen. Zweihundert Gramm von im wesentlichen vitaminfreiem Casein (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, Katalognr. C-3400) wurde mit 800 ml destilliertem Wasser vermischt. Ein Liter einer 2M Natriumhydroxidlösung wurde dann zugesetzt, gefolgt von 4 ml 30%igem Wasserstoffperoxid, und die Mischung wurde über Nacht bei Raumtemperatur vermischt.
  • Das Material wurde durch einen Whatman Nr. 1 Filterpapier-Filter auf einem Büchnertrichter filtriert und ungefähr 94,6 ml 100%igen Eisessigs wurden zu dem Filtrat zugesetzt, um es auf pH 7,5 zu bringen. Die Mischung wurde erneut wie zuvor filtriert und ungefähr 220 ml Essigsäure wurde zugesetzt, um den pH auf ungefähr 4,5 einzustellen. Die Mischung wurde 30 Minuten lang inkubiert, wobei während dieses Zeitraumes ein großes Faserknäuel aus der Lösung ausfiel. Der Überstand wurde bei 2800 Umdrehungen pro Minute in einem kleinen RC5C Zentrifugenglas 30 Minuten lang zentrifugiert, und das Pellet wurde zu dem Faserbausch zugesetzt, der dann mit deionisiertem Wasser gewaschen wurde.
  • Das faserartige Material wurde dann gerührt und in einem Liter 0,15M wässeriger Ammoniaklösung aufgelöst. (Für den Fall, daß das Casein nicht in Lösung geht, sollte eine konzentrierte (15M) Ammoniumhydroxidlösung zugegeben werden, bis der pH den Wert 7,5 erreicht). Das Casein wurde dann über Nacht gefriertgetrocknet und nach der vollständigen Trocknung hatte man eine Ausbeute von 136 Gramm erzeugt.
  • Beispiel 2
  • Gemäß diesem Beispiel wurde ein kolloidales Gold/Antikörper-Konjugat zur Durchführung der Verfahren der vorliegenden Erfindung hergestellt, wobei siliconisierte Glasgefäße (Sigma Silicote) während dem Verfahren verwendet wurden, in dem 200 ml von 0,01%igem Goldchlorid (HAuCl4·3H2O) (Fischer Scientific, G-54-1) zum Sieden erhitzt wurden, und wobei 2 ml einer 1%igen Natriumcitratlösung zugesetzt wurden und wobei das Sieden 5 weitere Minuten lang aufrecht erhalten wurde, bis die Farbe der Lösung von blaß-gelb nach purpurrot wechselte. Eine Lösung von Kaliumcarbonat (0,02M) wurde zu der Suspension zugesetzt, um den pH auf 7,6 einzustellen, gefolgt von der Zugabe von Ziegen-anti-human-IgG (1 mg/ml) (Kirkegaard-Perry, Gaithersburg, MD) derart, daß ungefähr 10 μg IgG pro ml an Goldsuspension (0,01 Gold) zugegeben worden waren.
  • Nach einer Minute Inkubierung bei Raumtemperatur wurden 0,1 ml einer Lösung von 30%ig Rinderserumalbumin in Wasser zu 10 ml der Goldsuspension zugesetzt. Aggregiertes Material wurde durch Zentrifugation bei 3 000 Umdrehungen pro Minute im SS34 Rotor einer Sorval RCSC Zentrifuge 10 Minuten lang entfernt. Der Überstand wurde einem zusätzlichen Zentrifugierungsschritt bei 6 000 Umdrehungen pro Minute 1 Stunde lang unterzogen. Das kolloidale Goldkonjugat in dem Pellet wurde in 2%ig Rinderserumalbumin in PBS (0,05M Kaliumphosphatpuffer, pH 7,4 in 0,9% NaCl) resuspendiert, wobei die bevorzugten Bedingungen für die flüssige Lagerung bei 4° C liegen. Das meta-lösliche Caseinpräparat, daß nach Beispiel 1 hergestellt worden war, wurde zugegeben, wobei eine Konzentration von 1% unmittelbar vor der Aufgabe auf die Membran eingestellt wurde. Das Konjugat wurde dann für verlängerte Zeiträume im trockenem Zustand gelagert, wobei kein Aktivitätsverlust nach 6 Monaten Lagerung bei 37°C im trockenem Zustand auftrat.
  • Beispiel 3
  • Gemäß diesem Beispiel wurden Immunoassayvorrichtungen vom Sandwichtyp zum Nachweis von Rubella-Antikörpern hergestellt und verwendet. Mikroporöse Nitrozellulosematerialien mit einer Dicke von ungefähr 0,1 mm und einer durchschnittlichen Porengröße von 5 μm wurden auf Mylar® und Klebstoff aufgezogen (Monokote®, Top Flite Models, Inc., Chicago, IL). Die Streifen von 1 cm × 3,5 cm wurden mit einem Hochleistungslaser geschnitten, und die Lösungsmitteltransportwege und eine Verzögerungsbox wurden mittels der Laserätzung gemäß dem allgemeinen Entwurf der Vorrichtung nach 4 gestaltet. Rubella-Antigen (Abbott Laboratories, North Chicago, Il) (0,2 μl, 2 500HA Titer) wurde auf die Streifen in einem dritten Bereich aufgegeben, wo es immobilisiert und luftgetrocknet wurde. Nicht-spezifische Bindungsstellen auf dem chromatographischen Streifenmaterial wurden dann mittels 10 minütiger Inkubierung bei Raumtemperatur mit einer 0,1%igen Lösung von LB Gelatine in Wasser (Inotech, Wohlen, Schweiz) blockiert, und die Streifen wurden unter einem Luftstrom trocknen gelassen. Ein μl von mit Goldpartikeln markiertem Ziegen-anti-human-IgG in einem anti-Aggregationspuffer der gemäß Beispiel 2 hergestellt worden war, wurde dann auf einen ersten Bereich eines jeden Streifens (Angrenzend an die Verzögerungsbox) aufgegeben und getrocknet.
  • Positive und negative Serumproben für den Rubella-Antikörper wurden dann auf die zweiten Bereiche zwischen dem ersten und dritten Bereich aufgegeben, und das erste Ende der Streifen wurde in ein chromatographisches Transportlösungsmittel eingetaucht, das TBS und 1%ig Triton®X 100 umfaßte. Die Flüssigkeitsfront wurde bis zu den zweiten Enden der Vorrichtungen fortschreiten lassen, wobei dies während eines Zeitraums von ungefähr 2,5 Minuten geschah, und wobei das Probenmaterial und das mit Gold markierte Ziegen-anti-human-IgG zu dem dritten Bereich hin transportiert wurde. Das positive Serum und die Immobilisierung des markierten ersten Reagenzes führten zur Anwesenheit eines roten Punktes in dem dritten Bereich. Die Streifen, die mit negativem Serum getestet wurden, erzeugten kein Signal in dem dritten Bereich.
  • Beispiel 4
  • In diesem Beispiel wurde eine "Mix and Run"-Immunoassayvorrichtung vom Sandwichtyp zum Nachweis von humanem chorionischem Gonadotropin (HCG) gebaut und verwendet. Die Vorrichtung, die gemäß der gleichen allgemeinen Ausgestaltung, wie die Vorrichtung nach 2 ausgelegt ist, erzeugt ein Signal, das die Anwesenheit von markiertem erstem spezifischem Reagenz in der Probe als negative Kontrollprobe bestätigt, und sie erzeugt ein zusätzliches Signal, das die Anwesenheit des HCG-Analyten anzeigt. Mikroporöses Nitrozellulosematerial mit einer Dicke von ungefähr 0,1 mm und einer mittleren Porengröße von 5 μm wurde auf Mylar® und Klebstoff aufgezogen (Monokote®), gemäß den Verfahren nach Beispiel 3.
  • In einem ersten Bereich wurden die Streifen mit einem zweiten Reagenz imprägniert, das 0,35 μl an 2 mg/ml polyklonalem anti-HCG-Antikörper in gepufferter physiologischer Kochsalzlösung umfaßte, welche 1%ig Sacharose enthielt. An einem zweiten Bereich wurden die Streifen mit einem dritten Reagenz imprägniert, das 0,45 μl eines 100 μg/ml Ziegen-anti-Mäuse-IgG's in Tris-gepufferter physiologischer Kochsalzlösung umfaßte, die 1%ig Sacharose enthielt. Die beiden Bereiche wurden ungefähr 10 mm von dem ersten Ende des Streifens angebracht, und sie wurden derart angeordnet, daß der zweite Bereich die Form eines Minuszeichen (–) aufwies, und daß der erste Bereich sich auf beiden Seiten in Bezug auf den zweiten Bereich befand, so daß die beiden Bereiche zusammen eine Pluszeichen (+) ausbilden.
  • Anti-HCG-Antikörper (Abbott Laboratories, North Chicago, IL) wurden mit 1 ml einer kolloidalen Goldsuspension inkubiert, die mit Kaliumcarbonat gemäß dem Verfahren nach Beispiel 2 auf pH 6,6 eingestellt worden war, derart daß ungefähr 10 μg IgG pro ml an Goldsuspension zugegeben wurden. Die Indikatorlösung wurde dann hergestellt, die 10 ml mit kolloidalem Gold markierten anti-HCG-Antikörpern umfaßte. Die mit Goldpartikeln markierten Antikörper wurden zu 10 ml von Tris-gepufferter Kochsalzlösung enthaltend 10%ig alkalisch behandeltes Casein nach Beispiel 1 und enthaltend 1%ig PEG (M.G. 20 000) zugegeben. Die Indikatorlösung wurde dann mit 100 μl einer Urinprobe vermischt, zu der verschiedene Mengen von HCG hinzugegeben worden waren.
  • Der Teststreifen wurde dann an- seinem ersten Ende in die Mischung aus Probe und Indikatorlösung getaucht, und die Flüssigkeitsfront wurde durch die Bereiche bis hin zum zweiten Ende des Streifens hin aufsteigen lassen. Wenn die Probenlösung kein HCG-Antigen enthielt, schritten die Mischung aus Probe und Indikatorlösung durch den Streifen hinweg voran. Beim In-Kontakt-Gelangen mit dem zweiten Bereich, wo die Ziegen anti-Mäuse-IgG immobilisiert worden waren, wurden die markierten anti-HCG Antikörper mittels der selektiven immunologischen Reaktion immobilisiert. Da in der Probenlösung kein HCG vorhanden war, kam es zu keiner spezifischen Bindung mit dem zweiten Reagenz, das in dem ersten Bereich immobilisiert war. Die mit kolloidalem Gold markierten Reagenzien erzeugten daher ein visuell nachweisbares Signal in Form eines Minuszeichens (–), das die Funktionstüchtigkeit der Reagenzien, aber die Abwesenheit von HCG in der Probe anzeigte.
  • Wenn die Probenlösung HCG enthielt, bildeten die markierten anti-HCG Antikörper, die selektiv an den Analyten gebunden waren, ein markiertes Konjugat. Die Mischung aus der Probenlösung und der Indikatorlösung wurde mittels chromatographischem Transport durch die ersten und zweiten Bereiche bis zum zweiten Ende hin transportiert. Beim In-Kontakt-Gelangen des ersten Bereiches, an dem die polyklonalen anti-HCG-Antikörper immobilisiert worden waren, mit der Lösung wurde das mit Gold markierte Antikörper/HCG-Konjugat mittels einer spezifischen Bindungsreaktion des HCG-Antigens mit den anti-HCG-Antikörpern immobilisiert. Zum gleichen Zeitpunkt wurden das HCG/Antikörper-Konjugat und aller unkonjugierter markierter anti-HCG-Antikörper, die mit dem zweiten Bereich in Berührung kamen, in diesem Bereich immobilisiert, indem sie mit den Ziegen-anti-Maus-IgG-Antikörpern in Kontakt gerieten, die in diesem Bereich immobilisiert waren. Die mit kolloidalem Gold markierten Reagenzien, die so sowohl im ersten als auch im zweiten Bereich immobilisiert worden waren, erzeugten ein visuell nachweisbares Signal in der Form eines Pluszeichens (+), das die Anwesenheit von HCG in der Probe anzeigte. Die Empfindlichkeit für HCG bei diesem Konzept wurde als 25milli-IU/ml bestimmt.
  • Beispiel 5
  • Bei diesem Beispiel wurde ein "Mix and Run" Immunoassay vom Sandwichtyp zum Nachweis von A-Polysaccharid (APS) hergestellt und gemäß den Verfahren des Beispiels 4 verwendet. Gemäß diesem Beispiel wurden Nitrozellulosestreifen nach Beispiel 4 hergestellt, und sie wurden mit polyklonalen anti-APS Antikörpern behandelt, welche in dem ersten Bereich immobilisiert wurden.
  • Polyklonale anti-APS-Antikörper von Kaninchen (Abbott Laboratories, North Chicago, IL) wurden mit 1 ml einer kolloidalen Goldsuspension inkubiert, die mit Kaliumcarbonat gemäß dem Verfahren von Beispiel 2 auf pH 7,2 eingestellt worden war, derart, daß ungefähr 10 μg anti-APS-Antikörper pro ml Goldsuspension zugesetzt wurde. Eine Indikatorlösung wurde dann hergestellt, die 10 μl des mit kolloidalem Gold markierten anti-APS-Antikörpers umfaßte. Die mit kolloidalen Goldpartikeln markierten anti-APS-Antikörper wurden dann zu 10 μl von Tris-gepufferter Kochsalzlösung, die 10%ig alkalischbehandeltes Casein gemäß Beispiel 1 und 1%ig PEG enthielt, zugesetzt. Die Indikatorlösung wurde dann mit 100 μl eines Abstrichextraktionspuffers für Streptokokken vermischt, zu dem wechselnde Anteile von APS (Abbott Laboratories, North Chicago, IL) zugesetzt worden waren.
  • Der Teststreifen wurde dann mit seinem ersten Ende in die Mischung einer Probe und einer Indikatorlösung getaucht, und die Flüssigkeitsfront wurde durch den ersten Bereich hindurch bis zum zweiten Ende des Streifens hin aufsteigen lassen. Das in den Proben vorhandene APS reagierte mit und wurde an die anti-APS Antikörper in der Indikatorlösung gebunden, wobei sich ein Konjugat ausbildete. Diese Konjugate wurden dann in dem ersten Bereich mittels Reaktion zwischen dem APS und den polyklonalen anti-APS-Antikörpern, die in den Bereich immobilisiert worden waren immobilisiert. Die Anwesenheit von APS in der extrahierten Abstrichprobe wurde durch die Ausbildung einer Purpurfarbe als Folge der Anreicherung von mit kolloidalem Gold markierten Partikeln in diesem Bereich angezeigt. Die Empfindlichkeit für APS von Vorrichtungen gemäß dieser Auslegung wurde als 0,5 ng/ml APS bestimmt.
  • Beispiel 6
  • Bei diesem Beispiel wurden Immunoassayvorrichtungen vom Sandwichtyp zum Nachweis von Schweine-anti-Trichinen Antikörpern gemäß dem, allgemeinen Verfahren nach Beispiel 3 hergestellt. Nitrozelluloseassaystreifen wurden hergestellt, und sie wurden mit teilweise gereinigtem Trichinen-Antigen (United States Department of Agriculture) behandelt, das in einem Nachweisbereich immobilisiert worden war.
  • Kolloidale Selenpartikeln verschiedener Größen wurden hergestellt. Verschiedene Volumina (40, 80 und 150 μl-Anteile) an konzentriertem Selensol wurden in einzelne Reagenzgläser pipettiert, die jedes 4 ml Wasser enthielten, und der pH einer jeden Lösung wurde durch die Zugabe von 0,01M Kaliumcarbonat auf 7,2 eingestellt. Zu jedem der Reagenzgläser wurden dann 150 μl von Ziegen-anti-Schwein-Antikörper (1 mg/ml Konzentration) (Kirkegaard-Perry) zugesetzt. Die Lösungen wurden vermischt und 10 Minuten lang inkubieren lassen. Ein 0,5 ml-Anteil einer 0,5%igen Lösung von alkalisch behandeltem Casein wurde zu jeder Lösung zugesetzt, und es wurde gut gemischt. Drei Anteile a 1 ml einer jeden Selenkonjugatlösung wurden in 1 ml-Portionen auf einer TDx-Tischzentrifuge zentrifugiert, und die Pellets wurden für jedes Konjugat vereinigt, nachdem der Überstand abdekantiert worden war. Die vereinigten Pellets eines jeden Konjugates wurden in einer Lösung von 4%ig Casein in 20 μl TBS resuspendiert. 0,5 μl Anteile der mit Selenpartikeln markierten Antikörperindikatorlösungen wurden dann auf einen ersten Bereich des Streifens (angrenzend an, die Verzögerungsbox) aufgebracht und getrocknet.
  • Positive und negative Serumproben, die Trichinen-Antikörper enthielten, wurden dann auf die zweiten Bereiche der Vorrichtungen zwischen dem ersten und dritten Bereich aufgebracht, und das erste Ende der Streifen wurde in ein chromatographisches Transportlösungsmittel eingetaucht das TBS, und 1%ig Triton®X 100 umfaßte. Die Flüssigkeitsfront wurde zu den zweiten Enden der Vorrichtungen hinfortschreiten lassen, wobei ein Zeitraum von ungefähr 2,5 Minuten benötigt wurde, und wobei das Probenmaterial und die Selen-markierten anti-Schweine-Antikörper zu dem dritten Bereich hin transportiert wurden. Alle Konjugate ergaben ein sichtbares positives Signal, wobei das Konjugat, das Selenpartikel von 80 nm verwendete, die besten Ergebnisse ergab. Alle Konjugatlösungen wurden gegenüber einer negativen Kontrollprobe getestet, welche keine spezifische Bindung anzeigte.
  • Beispiel 7
  • Bei diesem Beispiel wurde eine "Mix and Run"-Immunoassayvorrichtung vom Sandwichtyp hergestellt und gemäß den allgemeinen Verfahren nach Beispiel 4 verwendet. Anstatt daß die anti-HCG-Antikörper mit Goldpartikeln inkubiert wurden, wurden die Antikörper mit kolloidalen Selenpartikeln inkubiert. Selenpartikel verschiedener Größen wurden gegenüber verschiedenen Konzentrationen von HCG getestet. Das Konjugat, das die 80 nm Partikel verwendete, ergab die besten Resultate bei einer Nachweisgrenze von 20 mIU/ml. Die Antikörper, die mit größeren oder kleineren Partikeln markiert waren, ergaben weniger empfindliche Resultate, wie dies in Tabelle 1 unten gezeigt ist. Alle Konjugatlösungen wurden gegenüber einer negativen Kontrollprobe getestet, die keinerlei spezifische Bindung anzeigte.
  • Tabelle 1
    Figure 00650001
  • Die Verwendung von mit kolloidalen Partikeln markierten Reagenzien bei chromatographischen Assayverfahren erfreut sich einer großen Anwendbarkeit und ist nicht auf die besonderen offenbarten Beispiele beschränkt. Es liegt daher durchaus innerhalb üblichen Fachkönnens die vorliegende Erfindung gemäß einer Vielzahl von Verfahren und Auslegungen auszuführen. Demgemäß soll die Erfindung nur als durch die nachfolgenden Ansprüche eingeschränkt gelten.

Claims (6)

  1. Verfahren zur Bestimmung der Anwesenheit oder Menge einer Substanz in einer Probe, wobei das Verfahren folgendes umfasst: a) Bewirken eines Kontakts zwischen der Probe und einem chromatographischen Medium, wobei das Medium wenigstens eine Reaktionsstelle aufweist, die ein immobilisiertes Reagenz einschließt, das zur Bindung eines Glieds befähigt ist, das aus der Gruppe gewählt ist, die aus der Substanz und einem mittels kolloidaler Partikel markierten Material besteht, das zur Erzeugung einer nachweisbaren Antwort fähig ist, b) chromatographisches Transportieren auf dem chromatographischen Medium des mittels kolloidaler Partikel markierten Materials in Gegenwart eines den chromatographischen Transport erleichternden Agens, das ein meta-lösliches Protein umfasst, das chemisch behandelt wurde, um es stärker hydrophil zu machen, als in seiner natürlichen Form, wobei das Agens die Aggregation und Inaktivierung der spezifisch bindenden Materialien und Reagenzien in Lösung verhindert und deren chromatographischen Transport fördert, wodurch wenigstens ein Teil des mittels kolloidaler Partikel markierten Materials chromatographisch zu der Reaktionsstelle transportiert wird, um an diese zu binden, und c) Bestimmen der nachweisbaren Antwort, die von dem mittels kolloidaler Partikel markierten Material an der Reaktionsstelle hervorgerufen wird, als eine Anzeige für die Anwesenheit oder Menge an Substanz in der Probe, unter dem Vorbehalt, dass ein Sandwich-Immunoassay, bei dem eine Serumprobe eines anti-Trichinen-Antikörpers mit einer gepufferten Lösung eines mittels kolloidalem Selen markierten Ziegen-Anti-Schwein-Antikörpers und Casein vermischt wird und mit einem Nitrozellulosestreifen in Kontakt gebracht wird, der eine einzelne Reaktionsstelle aufweist, an der Trichinen-Antigen immobilisiert ist, ausgeschlossen ist, unter dem weiteren Vorbehalt, dass ein Sandwich-Immunoassay, das einen chromatographischen Papierstreifen mit einer unteren Bande, die mit anti-hCG-Antikörper beschichtet ist, und einer Kontroll-/Eichbande, die mit hCG beschichtet ist, verwendet, wobei eine Vollblutprobe auf den Streifen an der Stelle zwischen der unteren Bande und dem unteren Ende aufgetüpfelt wird, und wobei der Streifen dann in eine gepufferte Lösung von mittels kolloidalem Gold markiertem anti-hCG-Antikörper und von 4% Rinderserumalbumin eingebracht wird, ausgeschlossen ist, und unter dem weiteren Vorbehalt, dass ein Sandwich-Immunoassay, das einen chromatographischen Papierstreifen mit einer unteren Bande, die mit Rubella-Antigen beschichtet ist und eine Kontroll-/Eichbande, die mit human-IgG beschichtet ist, verwendet, wobei ein Ende des Streifens in eine gepufferte Lösung einer Serumprobe und von Rinderserumalbumin eingebracht wird, und wobei der Streifen dann in eine gepufferte Lösung von mittels kolloidalem Gold markiertem Mäuse-anti-human-Antikörper und von 3,8% Rinderserumalbumin überführt wird, ausgeschlossen ist.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das chromatographische Medium eine zweite Reaktionsstelle umfasst, die ein zweites immobilisiertes Reagenz einschließt, das dasselbe wie das erste immobilisierte Reagenz sein kann, oder das von dem ersten immobilisierten Reagenz verschieden sein kann, und das zur Bindung mit dem mittels kolloidaler Partikel markierten Material fähig ist, wobei das Verfahren den folgenden Schritt umfasst: d) Bestimmen der nachweisbaren Antwort, die von dem mittels kolloidaler Partikel markierten Material an der zweiten Reaktionsstelle hervorgerufen wird, als eine Anzeige für die Anwesenheit oder Menge an Substanz in der Probe.
  3. Verfahren zur Bestimmung der Anwesenheit oder Menge einer Substanz in einer Probe, wobei das Verfahren folgendes umfasst: a) In-Kontakt-Bringen der Probe mit einem chromatographi schen Medium, wobei das Medium wenigstens zwei Reaktionsstellen aufweist, wobei die erste Reaktionsstelle eine getrocknete Lösung eines mittels kolloidaler Partikel markierten Materials einschließt, in Gegenwart eines meta-löslichen Proteins, wobei das meta-lösliche Protein die Aggregation und Inaktivierung der spezifisch bindenden Materialien und Reagenzien in Lösung verhindert und deren chromatographischen Transport fördert, und wobei die zweite Reaktionsstelle ein immobilisiertes Reagens einschließt, das zur Bindung eines Glieds fähig ist, das aus der Gruppe gewählt ist, die aus der Substanz und dem mittels kolloidaler Partikel markierten Material besteht, b) Solubilisieren des mittels kolloidaler Partikel markierten Materials und chromatographisches Transportieren wenigstens eines Teils des mittels kolloidaler Partikel markierten Materials an die zweite Reaktionsstelle zur Bindung an diese, und c) Bestimmen der nachweisbaren Antwort, die von dem mittels kolloidaler Partikel markierten Material an der zweiten Reaktionsstelle hervorgerufen wird, als eine Anzeige für die Anwesenheit oder Menge an Substanz in der Probe.
  4. Verfahren nach Anspruch 3, wobei das chromatographische Medium eine dritte Reaktionsstelle umfasst, die ein zweites immobilisiertes Reagenz einschließt, das dasselbe wie das erste immobilisierte Reagenz sein kann, oder das von dem ersten immobilisierten Reagenz verschieden sein kann, und das zur Bindung mit dem mittels kolloidaler Partikel markierten Material fähig ist, wobei das Verfahren den folgenden Schritt umfasst: d) Bestimmen der nachweisbaren Antwort, die von dem mittels kolloidaler Partikel markierten Material an der dritten Reaktionsstelle hervorgerufen wird, als eine Anzeige für die Anwesenheit oder Menge an Substanz in der Probe.
  5. Testvorrichtung zur Bestimmung der Anwesenheit oder Menge einer Substanz in einer Probe mittels einer oder mehrerer spezifischer Bindungsreaktionen, die folgendes umfasst: ein chromatographisches Medium mit Kapillarstruktur und der Fähigkeit zum schnellen chromatographischen Lösungsmitteltransport eines oder mehrerer nicht-immobilisierter Reagenzien und reaktiver Proben-Bestandteile mittels eines ausgewählten chromatographischen Lösungsmittels, das folgendes umfasst: eine erste Reaktionsstelle, die eine getrocknete Lösung eines mittels kolloidaler Partikel markierten Materials einschließt, in Gegenwart eines meta-löslichen Proteins, wobei das mittels kolloidaler Partikel markierte Material zur schnellen Solubilisierung fähig ist, und wobei das meta-lösliche Protein die Aggregation und Inaktivierung der spezifisch bindenden Materialien und Reagenzien in Lösung verhindert und deren chromatographischen Transport in dem Lösungsmittel fördert, und eine zweite Reaktionsstelle, die ein immobilisiertes Reagenz einschließt, das zur Bindung eines Glieds fähig ist, das aus der Gruppe gewählt ist, die aus der Substanz und dem mittels kolloidaler Partikel markierten Material besteht.
  6. Kit zur Verwendung in spezifischen Bindungsassays zur Bestimmung der Anwesenheit oder Menge einer Substanz in einer Probe, der folgendes umfasst: (1) eine Lösung, die ein mittels kolloidaler Partikel markiertes Material in Anwesenheit eines den chromatographischen Transport erleichternden Agens umfasst, das ein meta-lösliches Protein umfasst, wobei das Agens die Aggregation und Inaktivierung spezifisch bindender Materialien und Reagenzien in Lösung verhindert und deren chromatographischen Transport fördert, und (2) ein chromatographisches Medium mit Kapillarstruktur und der Fähigkeit zum chromatographischen Lösungsmitteltransport von nicht-immobilisierten Reagenzien und reaktiven Proben-Bestandteilen mittels eines ausgewählten chromatographischen Lösungsmittels, das wenigstens eine Reaktionsstelle einschließt, die ein immobilisiertes Reagenz einschließt, das zur Bindung eines Glieds fähig ist, das aus der Gruppe gewählt ist, die aus der Substanz und dem mittels kolloidaler Partikel markierten Material besteht.
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