DE4003194A1

DE4003194A1 - Verfahren und sensorelektrodensystem zur elektrochemischen bestimmung eines analyts oder einer oxidoreduktase sowie verwendung hierfuer geeigneter verbindungen

Info

Publication number: DE4003194A1
Application number: DE4003194A
Authority: DE
Inventors: Joachim Dipl Chem Dr Hoenes; Juergen Dipl Chem D Schaeffler
Original assignee: Boehringer Mannheim GmbH
Current assignee: Roche Diagnostics GmbH
Priority date: 1990-02-03
Filing date: 1990-02-03
Publication date: 1991-08-08
Also published as: PL168023B1; JP2708281B2; IL97121A; EP0441222B1; CN1026248C; PL168285B1; NO910394L; PL288920A1; CS26191A2; AU7018391A; KR940008083B1; HU910367D0; IL97121A0; EP0441222A3; BG60694B1; US5122244A; JPH04213051A; IE910343A1; NZ236931A; HUT59756A

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur elektrochemischen Bestimmung eines Analyts in Gegenwart einer Oxidoreduktase und einer reduzierbaren Substanz, welches im Verlauf der Bestimmungsreaktion anfallende Elektronen von der Oxidoreduktase auf eine Elektrode überträgt und so zu einem Signal führt, das ein Maß für den zu bestimmenden Analyt ist, wobei die reduzierbare Substanz enzymatisch reduziert und an der Elektrode oxidiert wird, bzw. ein entsprechendes Verfahren zur elektrochemischen Bestimmung einer Oxidoreduktase in Gegenwart eines Enzymsubstrates und einer wie vorstehend charakterisiert reduzierbaren Substanz.

Außerdem betrifft die Erfindung ein Sensorelektrodensystem zur elektrochemischen Bestimmung eines Analyts in einer Probe enthaltend mindestens zwei elektrisch leitfähige Mittel, die jeweils isoliert voneinander vorliegen und die mittels einer elektrisch leitfähigen Oberfläche mit der zu untersuchenden Probe in elektrischen Kontakt gebracht werden können, wobei mindestens eine der elektrisch leitfähigen Oberflächen eine Oxidoreduktase und eine reduzierbare Substanz, die Elektronen zwischen der Oxidoreduktase und der elektrisch leitfähigen Oberfläche zu übertragen in der Lage ist, kontaktiert, bzw. ein entsprechendes Sensorelektrodensystem zur Bestimmung einer Oxidoreduktase, wobei mindestens eine der elektrisch leitfähigen Oberflächen ein Oxidoreduktase-Substrat und eine wie vorstehend charakterisierte reduzierbare Substanz kontaktiert.

Schließlich betrifft die Erfindung die Verwendung bestimmter Verbindungen als Elektronenüberträger zwischen einer Oxidoreduktase und einer Elektrode in einem elektrochemischen System.

Gegenüber kolorimetrischen Methoden zur Bestimmung eines Analyts in einer Flüssigkeit, die visuell oder photometrisch ausgewertet wird, bietet eine entsprechende elektrochemische Bestimmung den Vorteil, daß die elektrochemische Reaktion direkt Strom liefert, der in eine Konzentration umgerechnet werden kann. Bei kolorimetrischen Verfahren ist dagegen der Umweg Batterie→ Strom→Licht→Restlicht (Remission oder Transmission)→ Strom→Meßwert zu gehen.

Für elektrochemische Bestimmungsverfahren ist es notwendig, den zu bestimmenden Analyten zu oxidieren oder ihn mittels chemischer oder enzymatischer Methoden in eine Substanz zu überführen, die oxidiert werden kann. Die direkte elektrochemische Oxidation eines Analyts oder einer hiervon abgeleiteten Substanz an einer Elektrodenoberfläche erfordert hohe Überspannungen, d. h. Potentiale. Dieses Verfahren ist sehr unselektiv. Viele andere Substanzen, die ebenfalls in der zu untersuchenden Probe sein können, werden hierbei ebenfalls oxidiert. Ein solches Verfahren ist deshalb praktisch nicht analytisch einsetzbar.

Üblicherweise wird daher der oxidierbare Analyt oder die von dem Analyt abgeleitete oxidierbare Substanz mit einer entsprechenden Oxidoreduktase und einer reduzierbaren Substanz, deren reduzierte Form an der Elektrode wieder oxidiert werden kann, umgesetzt. Hierbei wird der oxidierbare Analyt bzw. die von dem Analyt abgeleitete oxidierbare Substanz von dem Enzym selektiv oxidiert. Das dadurch reduzierte Enzym wird durch die anwesende reduzierbare Substanz oxidiert und die reduzierte reduzierbare Substanz an der Elektrode oxidiert. Die reduzierbare Substanz dient folglich als Überträger der Elektronen von dem Enzym auf die Elektrode. Bedingung ist deshalb, daß die reduzierbare Substanz so gewählt ist, daß sie von dem Enzym und von der Elektrode schnell und spezifisch umgesetzt wird.

P. W. Carr et al. beschreiben in "Theory and applications of enzyme electrodes in analytical and clinical chemistry", Verlag Wiley, New York (1980), Seite 197-310, die Umsetzung von Glucose mit Sauerstoff als reduzierbarer Substanz unter Enzymkatalyse durch Glucoseoxidase und Nachweis des gebildeten Wasserstoffperoxids an einer Elektrode. Nachteilig hierbei sind Nebenreaktionen des Wasserstoffperoxids, das selbst ein starkes Oxidationsmittel ist und Nebenreaktionen an der Elektrodenoberfläche wegen des verwendeten hohen positiven Potentials. Dieses Verfahren erfordert deshalb spezielle Vortrennungen zum Ausschluß störender Bestandteile in den zu untersuchenden Proben. Nachteilig ist ferner der Sauerstoffbedarf. Speziell bei hohen Glucosekonzentrationen wird die Sauerstoffdiffusion aus der Luft in die Probe und innerhalb der Probe geschwindigkeitsbestimmend und verfälscht so unter Umständen die Ergebnisse der Methode.

In EP-A-01 25 137 wird ein Sensorelektrodensystem zur Bestimmung einer Komponente einer Mischung von Substanzen beschrieben, das mindestens zwei elektrisch leitfähige Mittel aufweist, die jeweils voneinander isoliert vorliegen und die mittels einer elektrisch leitfähigen Oberfläche mit der zu untersuchenden Probe in elektrischen Kontakt gebracht werden können, wobei eine der elektrisch leitfähigen Oberflächen eine Oxidoreduktase und eine sogenannte "Mediatorverbindung", die Elektronen zwischen diesem Enzym und der elektrisch leitfähigen Oberfläche überträgt, kontaktiert. Als Mediatorverbindung wird eine organometallische Substanz eingesetzt, die mindestens zwei organische Ringe aufweist, von denen jeder mindestens zwei konjugierte Doppelbindungen besitzt und wobei ein Metallatom seine Elektronen mit jedem dieser Ringe teilt. Als bevorzugte Mediatorverbindungen werden ebenso wie in EP-A-00 78 636 Ferrocen oder Ferrocenderivate eingesetzt. Zu beachten ist hierbei, daß solche Verbindungen erst oxidiert werden müssen, beispielsweise zu einem Ferrociniumion, bevor sie zur Übernahme von Elektronen von der Oxidoreduktase bereit sind. Dies führt zu sogenannten "Anlaufströmen", die bereits ohne Anwesenheit eines Analyts auftreten, was bei einem amperometrischen Verfahren, bei dem der auftretende Strom ein Maß für die Menge des zu bestimmenden Analyts ist, natürlich störend wirkt. Weiter ist die Schwerlöslichkeit solcher metallorganischen Verbindungen nachteilig, da dies zur Bevorzugung von Sauerstoff, beispielsweise bei Einsatz von Oxidasen, wie Glucoseoxidase als Oxidoreduktase führt und damit speziell bei niedrigen Enzymsubstratkonzentrationen zu einem geringen Strom und zu einer Sauerstoffabhängigkeit führt. Schwerlöslichkeit und/oder Einsatz geringer Konzentrationen sind bei diesen in reduzierter Form eingesetzten Elektronenüberträgern Voraussetzung für noch akzeptable Anlaufströme.

Insgesamt sind für elektrochemische Bestimmungsverfahren die aus dem Stand der Technik bekannten Elektronenüberträger dadurch charakterisiert, daß sie in Anwesenheit des zu bestimmenden Analyts durch eine Oxidoreduktase reduziert und an einer Elektrode zu der Ausgangsverbindung rückoxidiert werden. Wenn die Konzentration der als Elektronenüberträger fungierenden reduzierbaren Substanz wesentlich kleiner als die Konzentration des zu bestimmenden Analyts ist, können nur kinetische Methoden durchgeführt werden. Für Endpunktbestimmungen ist es nötig, daß die als Elektronenüberträger fungierende reduzierbare Substanz gegenüber dem zu bestimmenden Analyt im Überschuß gelöst vorliegt, damit der zu bestimmende Analyt vollständig umgesetzt wird. Es wird hierbei eine dem zu bestimmenden Analyt proportionale Menge an reduzierbarer Substanz umgesetzt. Vorteile gegenüber der kinetischen Messung sind insbesondere der erweiterte Linearitätsbereich der Strom/Konzentrationsbeziehung bei amperometrischen Verfahren und die bessere Konkurrenzfähigkeit der höher konzentrierten reduzierbaren Substanz gegenüber Sauerstoff bei Einsatz von Oxidasen als Oxidoreduktasen. Nachteilig ist jedoch die Notwendigkeit, zum vollständigen Umsatz eine reduzierbare Substanz, d. h. ein Oxidationsmittel als Elektronenüberträger mit einem Potential deutlich über dem des Enzymsubstrates einzusetzen und zusätzlich bei der elektrochemischen Bestimmung in Gegenwart eines Überschusses an Oxidationsmittel zu arbeiten, was das nötige Potential noch weiter erhöht. Hohe Arbeitspotentiale begünstigen jedoch unspezifische Elektrodenreaktionen insbesondere dann, wenn Proben mit einer Vielzahl von Bestandteilen außer dem zu bestimmenden Analyt untersucht werden sollen.

Insofern liegen für die elektrochemische Bestimmung eines Analyts über eine enzymatische Redoxreaktion noch keine zufriedenstellende Lösungen vor. Es mangelt an universell verwendbaren als Elektronenüberträger fungierenden reduzierbaren Substanzen, die sowohl eine schnelle Reaktion mit Oxidoreduktasen, als auch eine ungehemmte Reaktion an Elektrodenoberflächen bei niedrigem Potential aufweisen.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es, dieses Problem zu lösen. Insbesondere sollten reduzierbare Substanzen gefunden werden, die als Elektronenüberträger zwischen einer Oxidoreduktase und einer Elektrode in einem elektrochemischen System fungieren können und die folgende Eigenschaften aufweisen: Sie sollten in oxidierter Form gelagert und eingesetzt werden können, um so Anlaufströme zu vermeiden und Endpunktbestimmungen mit einem Überschuß an reduzierbarer Substanz durchführen zu können. Das Erfordernis einer hohen Lagerstabilität versteht sich von selbst, da nur so kommerziell erfolgreiche Verfahren und Vorrichtungen zu entwickeln sind. Die zu findenden reduzierbaren Substanzen sollten mit Oxidoreduktasen eine schnelle Reaktion eingehen können, bei Einsatz von Oxidasen gegenüber Sauerstoff konkurrenzfähig sein und gegenüber auch der höchsten zu bestimmenden Analytkonzentration im Überschuß eingesetzt werden können. Hierfür ist u. a. eine gute Löslichkeit der Substanz erforderlich. Um spezifische, störungsfreie Bestimmungen durchführen zu können, sollten die als Elektronenüberträger fungierenden reduzierbaren Substanzen insbesondere im Hinblick auf den Einsatz für die elektrochemische Bestimmung von Analyten in Körperflüssigkeiten möglichst wenig nicht enzymatische Reduktion durch reduzierend wirkende Substanzen in Körperflüssigkeiten eingehen. Sie sollten außerdem an der Elektrodenoberfläche schnell oxidiert werden und in der reduzierten Form eine geringe Sauerstoffempfindlichkeit aufweisen. Außerdem sollte insbesondere bei einem möglichst niedrigen Potential für die Oxidation an der Elektrode gearbeitet werden können.

Diese Aufgabe wird durch die in den Patentansprüchen charakterisierte Erfindung gelöst.

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur elektrochemischen Bestimmung eines Analyts in Gegenwart einer Oxidoreduktase und einer reduzierbaren Substanz, welche im Verlauf der Bestimmungsreaktion anfallende Elektronen von der Oxidoreduktase auf eine Elektrode überträgt und so zu einem Signal führt, das ein Maß für den zu bestimmenden Analyt ist, wobei die reduzierbare Substanz enzymatisch reduziert und an der Elektrode oxidiert wird, dadurch gekennzeichnet, daß die an der Elektrode durch Oxidation entstehende Substanz von der ursprünglich eingesetzten reduzierbaren Substanz verschieden ist.

Weiter ist Gegenstand der Erfindung ein Verfahren zur elektrochemischen Bestimmung einer oxidoreduktase in Gegenwart eines entsprechenden Enzymsubstrates und einer reduzierbaren Substanz, welche Elektronen von der Oxidoreduktase auf eine Elektrode zu übertragen in der Lage ist und so zu einem Signal führt, das ein Maß für das zu bestimmende Enzym ist, wobei die reduzierbare Substanz enzymatisch reduziert und an der Elektrode oxidiert wird, dadurch gekennzeichnet, daß die an der Elektrode durch Oxidation entstehende Substanz von der ursprünglich eingesetzten reduzierbaren Substanz verschieden ist.

Gegenstand der Erfindung ist außerdem die Verwendung einer Substanz, die Elektronen von einer Oxidoreduktase unter Bildung eines elektronenreichen aromatischen Amins aufnehmen kann, als Elektronenüberträger zwischen einer Oxidoreduktase und einer Elektrode in einem elektrochemischen System.

Gegenstand der Erfindung ist weiter ein Sensorelektrodensystem zur Bestimmung eines Analyts in einer flüssigen Probe enthaltend mindestens zwei elektrisch leitfähige Mittel, die isoliert voneinander vorliegen und die jeweils mittels einer elektrisch leitfähigen Oberfläche mit der zu untersuchenden Probe in elektrischen Kontakt gebracht werden können, wobei mindestens eine der elektrisch leitfähigen Oberflächen eine Oxidoreduktase und eine reduzierbare Substanz, die Elektronen zwischen der Oxidoreduktase und der elektrisch leitfähigen Oberfläche zu übertragen in der Lage ist, kontaktiert, dadurch gekennzeichnet, daß als reduzierbare Substanz eine Verbindung eingesetzt ist, die nach Reduktion durch die Oxidoreduktase an der elektrisch leitfähigen Oberfläche zu einer Substanz oxidiert wird, die von der ursprünglich eingesetzten reduzierbaren Substanz verschieden ist.

Im übrigen ist Gegenstand der Erfindung ein Sensorelektrodensystem zur elektrochemischen Bestimmung einer Oxidoreduktase in einer flüssigen Probe, enthaltend mindestens zwei elektrisch leitfähige Mittel, die isoliert voneinander vorliegen und die jeweils mittels einer elektrisch leitfähigen Oberfläche mit der zu untersuchenden Probe in elektrischen Kontakt gebracht werden können, wobei mindestens eine der elektrisch leitfähigen Oberflächen ein Oxidoreduktase-Substrat und eine reduzierbare Substanz, die Elektronen zwischen der Oxidoreduktase und der elektrisch leitfähigen Oberfläche zu übertragen in der Lage ist, kontaktiert, dadurch gekennzeichnet, daß als reduzierbare Substanz eine Verbindung eingesetzt ist, die nach Reduktion durch die Oxidoreduktase an der elektrisch leitfähigen Oberfläche zu einer Substanz oxidiert wird, die von der ursprünglich eingesetzten reduzierbaren Substanz verschieden ist.

Schließlich ist Gegenstand der Erfindung die Verwendung einer Substanz, die Elektronen von einer Oxidoreduktase unter Bildung eines elektronenreichen aromatischen Amins aufnehmen kann, zur Herstellung eines erfindungsgemäßen Sensorelektrodenystems.

Es hat sich gezeigt, daß die Nachteile der aus dem Stand der Technik bekannten Verfahren zur elektrochemischen Bestimmung eines Analyts in Gegenwart einer Oxidoreduktase und einer reduzierbaren Substanz, die durch das erforderliche hohe Potential, insbesondere bei Verwendung eines Überschusses der als Elektronenüberträger fungierenden reduzierbaren Substanz gegenüber dem zu bestimmenden Analyt verursacht werden, größtenteils durch eine nicht reversible Reaktion vermieden werden können. Dadurch, daß an der Elektrode eine andere oxidierte Substanz gebildet wird als die, welche als reduzierbare Substanz ursprünglich eingesetzt wird, kann die elektrochemische Bestimmung bei besonders niedrigem Potential und damit ohne die Gefahr von Störreaktionen durchgeführt werden. Der Vorteil des niedrigen Potentials kann auch dann genutzt werden, wenn die als Elektronenüberträger fungierende reduzierbare Substanz im Vergleich zu dem zu bestimmenden Analyt nur in geringer Menge eingesetzt wird, nämlich dann, wenn sowohl die ursprünglich eingesetzte reduzierbare Substanz, als auch die an der Elektrode durch Oxidation entstehende Substanz von der für das elektrochemische Verfahren notwendigen Oxidoreduktase reduziert werden. Wenn sowohl die ursprünglich eingesetzte reduzierbare Substanz, als auch die an der Elektrode durch Oxidation entstehende Substanz von der Oxidoreduktase zu der gleichen Substanz reduziert wird, wirkt die ursprünglich eingesetzte reduzierbare Substanz als Vorratsform für die zwischen Elektrode und Enzym im Kreislauf geführte zweite reduzierbare Substanz, die von der ursprünglich eingesetzten reduzierbaren Substanz verschieden ist.

Die Vorteile des erfindungsgemäßen Verfahrens sind dadurch bedingt, daß als reduzierbare Substanzen solche ausgewählt werden können, bei denen durch enzymatische Reduktion eine Verbindung entsteht, die bei niederer Spannung an der Elektrode oxidiert werden kann. Bei der Oxidation an der Elektrode liegt nämlich noch keine nennenswerte Konzentration dieser neuen oxidierten Substanz vor. Bisher mußte die enzymatisch reduzierte Verbindung an der Elektrode zu der ursprünglich eingesetzten reduzierbaren Substanz zurückoxidiert werden, die schon in hoher Konzentration vorlag. Hierfür war ein erhöhtes positives Potential nötig.

In erfindungsgemäßem Sinne vorteilhaft als reduzierbare Substanzen einsetzbare Verbindungen sind solche, die die bei der Oxidation des für die eingesetzte Oxidoreduktase entsprechenden Substrats anfallenden Elektronen von dem Enzym übernimmt und dabei ein elektronenreiches aromatisches Amin bildet. Unter einem elektronenreichen aromatischen Amin wird hierbei eine Verbindung verstanden, die elektronenreicher als Anilin ist und wegen des Elektronenreichtums an der Elektrode bei niedrigem Potential oxidiert werden kann. In Frage kommen beispielsweise alle Anilinderivate, die einen oder mehrere +I oder/und +M- Substituenten, wie Hydroxy-, Alkyl-, Alkoxy-, Aryloxy-, Alkylthio-, Arylthio-, Amino-, Monoalkylamino- und Dialkylaminoreste tragen.

Alkyl-, Alkoxy-, Alkylthio-, Monoalkylamino- und Dialkylaminoreste sind Reste, in denen Alkyl einen Kohlenwasserstoffrest mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen darstellt, der seinerseits durch eine Hydroxygruppe, eine gegebenenfalls ein- oder mehrfach durch Alkyl mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen substituierte Aminogruppe, PO₃H₂, SO3H oder CO₂H substituiert sein kann. Die Säurereste PO₃H₂, SO₃H und CO₂H können als solche oder in Salzform als Ammonium-, Alkali- oder Erdalkalisalze vorliegen.

Aryloxy- und Arylthioreste sind aromatische Reste mit 6 bis 10 Kohlenstoffatomen, wobei Phenoxy- und Phenylthioreste besonders bevorzugt sind.

Ammoniumsalze sind solche, die das Ammoniumion NH₄+ enthalten oder solche, die ein- oder mehrfach durch Alkyl-, Aryl- oder Aralkylreste substituierte Ammoniumkationen enthalten. Alkyl in Alkyl- und Aralkylresten bedeutet einen Kohlenwasserstoffrest mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen. Aryl in Aryl- und Aralkylresten ist ein 6 bis 10 Kohlenstoffatome zählendes aromatisches Ringsystem, wobei Phenyl bevorzugt ist. Ein bevorzugter Aralkylrest ist Benzyl.

Alkalisalze sind vorzugsweise solche des Lithiums, Natriums oder Kaliums. Erdalkalisalze sind vorzugsweise solche des Magnesiums oder Calciums.

Unter Anilinderivaten werden auch Verbindungen verstanden, die eine unsubstituierte oder durch Alkyl ein- oder mehrfach substituierte Aminogruppe an einem aromatischen Ringsystem tragen, das mit einem oder mehreren aromatischen oder/und alicyclischen Ringen annelliert ist. Als aromatische Ringe kommen hierbei sowohl kohlenstoffaromatische Systeme als auch Heteroaromaten in Frage. Beispiele sind annelierte Benzol- oder Naphthalinringe oder ein annelierter Pyridinring.

Unter alicyclischen Ringen werden gesättigte oder ungesättigte Cycloaliphate mit 5 bis 7 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise 5 oder 6 Kohlenstoffatomen, verstanden.

Mögliche Alkylsubstituenten der Aminogruppe können Kohlenwasserstoffreste mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen sein, die ihrerseits durch eine Hydroxygruppe, eine gegebenenfalls ein- oder mehrfach durch Alkyl mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen substituierte Aminogruppe, PO₃H₂, SO₃H und CO₂H substituiert sein können. Die Säurereste PO₃H₂, SO₃H und CO₂H können als solche oder in Salzform als Ammonium-, Alkali- oder Erdalkalisalze vorliegen, auf die die vorstehend gegebene Definition hier ebenfalls zutrifft.

Besonders bevorzugt als reduzierbare Substanzen, die bei Elektronenübernahme von der Oxidoreduktase zu einem elektronenreichen aromatischen Amin führen, das dann an einer Elektrode bei niedrigem Potential oxidiert werden kann, sind Verbindungen aus der Gruppe der Verbindungen der allgemeinen Formel I

X-R (I)

in der
R einen elektronenreichen aromatischen Rest und
X NO oder NHOH
darstellt, und Verbindungen der allgemeinen Formel II

HO-N=Y (II)

in der
Y ein chinoides System, das nach Reduktion im aromatischen Zustand als elektronenreich bezeichnet werden kann, darstellt.

Unter einem elektronenreichen aromatischen Rest sind hierbei die oben für elektronenreiche aromatische Amine angegebenen Möglichkeiten zu verstehen.

Solche erfindungsgemäßen reduzierbaren Substanzen werden bei der Elektronenübernahme von Oxidoreduktasen zu aromatischen Aminen reduziert und bei Oxidation an einer Elektrode nicht zu den ursprünglichen reduzierbaren Substanzen oxidiert. Wie dem Fachmann bekannt ist, werden bei der elektrochemischen Oxidation der elektronenreichen aromatischen Amine Elektronen aus dem Arylrest entfernt, so daß Radikale oder chinoide Systeme resultieren. Es entstehen jedoch keine chinoiden Oxime, keine Hydroxylamine und keine Nitrosoverbindungen.

Die elektrochemisch oxidierten Verbindungen können oft ihrerseits wieder Elektronen von Oxidoreduktasen übernehmen und so zu elektronenreichen aromatischen Aminen rückreduziert werden. Es ist deshalb auch möglich, erfindungsgemäß reduzierbare Substanzen in im Vergleich zu dem zu bestimmenden Analyt geringen Konzentrationen, d. h. im Überschuß, einzusetzen. Sie wirken so als Vorratsform für die bei Elektronenübernahme von der Oxidoreduktase gebildeten elektronenreichen aromatischen Amine, welche als Elektronenüberträger zwischen Oxidoreduktase und Elektrode im Kreis geführt werden können.

Als hervorragende Beispiele für erfindungsgemäße Elektronenüberträger haben sich
N-(2-Hydroxyethyl)-N′-p-nitrosophenyl-piperazin,
N,N-Bis-(2-hydroxyethyl)-p-nitrosoanilin,
o-Methoxy-(N,N-bis-(2-hydroxyethyl)) -p-nitrosoanilin,
p-Hydroxynitrosobenzol,
N-Methyl-N′-(4-nitrosophenyl)-piperazin,
p-Chinondioxim
N,N-Dimethyl-p-nitrosoanilin,
N,N-Diethyl-p-nitrosoanilin,
N-(4-Nitrosophenyl)-morpholin,
N-Benzyl-N-(5′-carboxypentyl) -p-nitrosoanilin,
N,N-Dimethyl-4-nitroso-1-naphthylamin,
N,N,3-Trimethyl-4-nitrosoanilin,
N-(2-Hydroxyethyl)-5-nitrosoindolin
N,N-Bis-(2-hydroxyethyl)-3-chlor-4-nitrosoanilin,
2,4-Dimethoxy-nitrosobenzol,
N,N-Bis-(2-methoxyethyl) -4-nitrosoanilin,
3-Methoxy-4-nitrosophenol,
N-(2-Hydroxyethyl)-6-nitroso-1,2,3,4-tetrahydrochinolin,
N,N-Dimethyl-3-chlor-4-nitrosoanilin
erwiesen.

Eine ganz besonders bevorzugte erfindungsgemäß reduzierbare Substanz ist N,N-Bis-(2-hydroxyethyl)-p-nitrosoanilin.

In der vorliegenden Erfindung wird als Analyt eine zu bestimmende Substanz bezeichnet. Üblicherweise handelt es sich hierbei um eine Komponente einer Mischung von Substanzen. Vor allem bietet diesbezüglich das erfindungsgemäße Verfahren Vorteile bei der Bestimmung eines Analyten in einer Körperflüssigkeit, wie Blut, Plasma, Serum, Urin, weil es hierbei sehr stark auf eine spezifische Reaktion nur einer Komponente des biologischen Vielkomponentensystems ankommt.

Das erfindungsgemäße Verfahren zur elektrochemischen Bestimmung eines Analyts beruht darauf, daß der Analyt selbst durch eine Oxidoreduktase oxidiert wird also ein entsprechendes Enzymsubstrat darstellt oder der Analyt in einer oder mehreren vorgeschalteten Reaktionen, vorzugsweise enzymatischen Reaktionen, in eine Verbindung überführt wird, die von einer Oxidoreduktase oxidiert werden kann. Die bei einer solchen Oxidation anfallenden Elektronen sind der Menge des zu bestimmenden Analyts proportional. Werden diese Elektronen von einer erfindungsgemäß reduzierbaren Substanz auf eine Elektrode übertragen, so führt dies zu einem Signal, das ein Maß für den zu bestimmenden Analyt ist. Möglich sind amperometrische Verfahren, wobei ein Strom gemessen wird oder Potentiometrie, d. h. Messung einer Spannung.

Für das erfindungsgemäße Verfahren sind als Oxidoreduktasen Oxidasen, nicht-NAD(P)-abhängige Dehydrogenasen oder Diaphorase bevorzugt. Beispielsweise können erfindungsgemäß Glucose mit Glucoseoxidase, Lactat mit Lactatoxidase, Glycerinphosphat mittels Glycerophosphat-Oxidase oder Cholesterin mittels Cholesterinoxidase bestimmt werden. Als nicht-NAD(P)-abhängige Dehydrogenase kann beispielsweise Glucose-dye-Oxidoreduktase zur Bestimmung von Glucose eingesetzt werden. Diaphorase die auch als NADH: dye-Oxidoreduktase bezeichnet werden kann, kann vorteilhaft zum Nachweis von NADH verwendet werden.

In Fällen in denen ein Analyt elektrochemisch bestimmt werden soll, der nicht selbst als Substrat für eine Oxidoreduktase dient, kann dieser Analyt durch eine oder mehrere vorgeschaltete Reaktionen, insbesondere enzymatische Reaktionen, in eine Verbindung überführt werden, die von einer Oxidoreduktase als Substrat akzeptiert wird. Beispielsweise können Triglyceride so bestimmt werden, daß diese mittels einer Esterase in Glycerin- und Säurereste gespalten werden, Glycerin mit Glycerinkinase und ATP in Glycerinphosphat überführt und dieses schließlich mittels Glyerophosphatoxidase oxidiert wird und die dabei anfallenden Elektronen von einem erfindungsgemäßen Elektronenüberträger an eine Elektrode abgegeben werden, wobei ein Strom erzeugt wird, der der Menge an Triglyceriden in der zu bestimmenden Probe proportional ist.

Analog kann beispielsweise auch Total-Cholesterin bestimmt werden, indem Cholesterinester durch Cholesterinesterase gespalten und das so gebildete Cholesterin mittels Cholesterinoxidase bestimmt werden kann. Auch hier ist die Menge an so gebildetem Cholesterin und der bei Oxidation mittels Cholesterinoxidase freiwerdenden Elektronen, die mittels einer erfindungsgemäß reduzierbaren Substanz auf eine Elektrode übertragen werden und so einen Strom erzeugen, proportional der zu bestimmenden Menge an Total- Cholesterin.

Für die Bestimmung von NADH bietet sich das Enzym Diaphorase an. Mittels der erfindungsgemäß reduzierbaren Substanzen können Elektronen auch von Diaphorase auf eine Elektrode übertragen werden. Da sehr viele biologische Substanzen enzymatisch unter Bildung von NADH umgesetzt werden können, ist es auf diesem Wege möglich, viele Analyte durch enzymatische Reaktionssequenzen in NADH umzuwandeln und dieses dann schließlich über Diaphorase und eine erfindungsgemäß eingesetzte reduzierbare Substanz an einer Elektrode zu bestimmen.

Es versteht sich aus den vorangehenden Darlegungen von selbst, daß erfindungsgemäß natürlich auch Oxidoreduktasen bestimmt werden können, wenn eine entsprechende Verbindung, die als Enzymsubstrat akzeptiert wird und eine erfindungsgemäß reduzierbare Substanz vorgelegt werden. So kann beispielsweise Glucoseoxidase elektrochemisch bestimmt werden, wenn Glucose und ein erfindungsgemäßer Elektronenüberträger in Gegenwart eines entsprechenden Sensorelektrodensystems mit der zu bestimmenden Probe kontaktiert werden.

Das erfindungsgemäße Verfahren zeichnet sich vor allem dadurch aus, daß die zur Elektronenübertragung von einer Oxidoreduktase auf eine Elektrode eingesetzte reduzierbare Substanz in ihrer oxidierten Form lagerstabil ist und außerdem gut wasserlöslich ist, was vor allem für die Bestimmung von Analyten in Körperflüssigkeiten, wie Blut, Plasma, Serum, Urin sehr wichtig ist. Die erfindungsgemäß einsetzbaren reduzierbaren Substanzen weisen eine schnelle Reaktion mit Oxidoreduktasen auf und sind insbesondere bei Reaktion mit Oxidasen sehr gut konkurrenzfähig gegenüber Sauerstoff. Aufgrund ihrer Löslichkeit können sie sehr gut für amperometrische Endpunktsverfahren eingesetzt werden, wo ein Überschuß gegenüber der höchsten zu bestimmenden Analytkonzentration erforderlich ist. Da die erfindungsgemäß einsetzbaren reduzierbaren Substanzen in Körperflüssigkeiten nur vernachlässigbar nicht-enzymatische Reduktion durch dort anwesende Reduktionsmittel eingehen, an der Elektrodenoberfläche schnell oxidiert werden und in der reduzierten Form kaum sauerstoffempfindlich sind, eignen sich diese Substanzen sehr gut für spezifische, störungsfreie elektrochemische Analytbestimmungen. Daß störungsfreie und spezifische elektrochemische Analytbestimmungen möglich sind, wird darüber hinaus vor allem dadurch bedingt, daß die erfindungsgemäß einsetzbaren reduzierbaren Substanzen nur ein geringes Elektrodenpotential erfordern.

Das erfindungsgemäße Verfahren zur elektrochemischen Bestimmung eines Analyts ist nicht auf bestimmte elektrochemische Vorrichtungen beschränkt. Es lassen sich hierzu beispielsweise Sensorelektrodensysteme aus dem Stand der Technik einsetzen. Grundsätzlich sind Sensorelektrodensysteme zur Bestimmung eines Analyts in einer flüssigen Probe geeignet, die mindestens zwei elektrisch leitfähige Mittel als Elektroden enthalten, die isoliert voneinander vorliegen und die jeweils mittels einer elektrisch leitfähigen Oberfläche mit der zu untersuchenden Probe in elektrischen Kontakt gebracht werden können. Es ist hierbei denkbar, daß nur zwei Elektroden, nämlich eine Arbeits- und eine Referenzelektrode eingesetzt werden. Auch eine Meßanordnung ohne Referenzelektrode, d. h. nur mit Arbeits- und Gegenelektrode ist möglich. Hierbei wird lediglich extern die Spannung konstant gehalten. Möglich ist aber auch die Verwendung von drei Elektroden, nämlich einer Referenz-, einer Arbeits- und einer Gegenelektrode. Entsprechende Sensorelektrodensysteme sind aus dem Stand der Technik bekannt, beispielsweise aus G. Henze und R. Neeb, "Elektrochemische Analytik", Springer-Verlag (1986).

Wichtig ist, daß für die elektrochemische Bestimmung eines Analyts (mindestens) eine Elektrode, d. h. eine elektrisch leitfähige Oberfläche eine Oxidoreduktase und eine reduzierbare Substanz, die Elektronen zwischen der Oxidoreduktase und der elektrisch leitfähigen Oberfläche zu übertragen in der Lage ist, kontaktiert. Hierbei ist es denkbar, daß alle benötigten Reagenzien sich zusammen mit der zu untersuchenden Probe in Lösung befinden, oder daß ein Teil der Reagenzien, vorzugsweise die Oxidoreduktase und/oder die Elektronen übertragende reduzierbare Substanz auf einer Elektrode immobilisiert sind und der Rest in Lösung vorliegt, oder daß sämtliche für die Bestimmung notwendigen Reagenzien auf einer Elektrode immobilisiert sind. Grundsätzlich ist es für die Funktion eines Sensorelektrodensystems nicht entscheidend, ob die Arbeitselektrode die Oxidoreduktase und die als Elektronenüberträger fungierende reduzierbare Substanz als gelöste Substanzen kontaktiert oder ob diese Substanzen als feste Substanzen auf die Elektrode aufgebracht sind und sich ggf. bei Kontakt mit der zu bestimmenden flüssigen Probe lösen oder auch nach Kontakt mit der zu bestimmenden flüssigen Probe auf der Elektrode immobilisiert bleiben.

Selbstverständlich ist es so, daß für die Bestimmung einer Oxidoreductase vorstehende Beschreibung analog gilt. Es muß dann berücksichtigt werden, daß das Sensorelektrodensystem ein Oxidoreduktase-Substrat und eine erfindungsgemäß reduzierbare Substanz kontaktiert. Im übrigen gelten für diesen Fall die für die Bestimmung eines Analyts gemachten Ausführungen entsprechend.

Die beiliegenden Figuren erläutern die Erfindung näher. Es zeigen

Fig. 1 in Teil a) ein Schema zur Funktion der erfindungsgemäß einsetzbaren reduzierbaren Substanzen in erfindungsgemäßen Verfahren und Sensorelektrodensystemen, wenn die Konzentration des Elektronenüberträgers größer oder gleich der zu bestimmenden Analytkonzentration ist.

Fig. 1 in Teil b) ein Schema zur Funktion elektronenübertragender Substanzen in Verfahren und Sensorelektrodensystemen des Standes der Technik.

Fig. 2 in Teil a) ein Schema zur Funktion der erfindungsgemäß einsetzbaren reduzierbaren Substanzen in erfindungsgemäßen Verfahren und Sensorelektrodensystemen, wenn die Konzentration der elektronenübertragenden Substanz sehr viel kleiner als die Konzentration des zu bestimmenden Analyts ist.

Fig. 2 in Teil b) ein Schema zur Funktion elektronenübertragender Substanzen in Verfahren und Sensorelektrodensystemen des Standes der Technik.

Fig. 3 ein Sensorelektrodensystem für die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens bei der die benötigten Substanzen in Lösung vorliegen.

Fig. 4 ein Sensorelektrodensystem zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens, das als Einmal- bzw. Wegwerfsensor konzipiert ist.

Fig. 5 Diagramm mit der aus Cyclovoltammogrammen erhaltenen Werte für anodische Stromdichtemaxima bei verschiedenen Glucosekonzentrationen mit N,N-bis-(2-hydroxyethyl)-p- nitrosoanilin als elektrodenübertragender Substanz in einem erfindungsgemäßen elektrochemischen Glucosetest.

Fig. 6 Diagramm zur Beziehung zwischen Stromdichte und NADH-Konzentration in einem erfindungsgemäß NADH-Test.

Fig. 7 Cyclovoltammogramme für N-(2-hydroxyethyl) -N′-p- nitrosophenyl-piperazin und N,N-Bis-(2-hydroxyethyl)-p- nitrosoanilin.

Fig. 8 Diagramm zur Abhängigkeit der Stromdichte von der Glucosekonzentration nach dem erfindungsgemäßen Verfahren mit N- Methyl-N′-(4-nitrosophenyl) -piperazin als elektronenübertragender Substanz in Gegenwart und in Abwesenheit von Luftsauerstoff.

Fig. 9 Diagramm zur Abhängigkeit der Stromdichte von der Glucosekonzentration nach Verfahren des Standes der Technik mit Tetrathiafulvalen als elektronenübertragender Substanz in Gegenwart und in Abwesenheit von Luftsauerstoff.

Fig. 10 Diagramm zur Abhängigkeit der Stromdichte von der LDH- Konzentration nach dem erfindungsgemäßen Verfahren mit N,N-Bis-(2- hydroxyethyl)-p-nitrosoanilin als elektronenübertragende Substanz bei verschiedenen Zeiten nach Start der Bestimmungsreaktion durch Lactatdehydrogenase.

Fig. 11 Strom-Zeit-Kurven für das erfindungsgemäße Verfahren mit einer Einmal-Elektrode gemäß Fig. 4 zum Glucosenachweis.

Fig. 12 Diagramm zur Abhängigkeit des Stromes von der Glucosekonzentration nach dem erfindungsgemäßen Verfahren mit einer Einmalelektrode gemäß Fig. 4 nach 10 Sekunden Reaktionszeit.

In Fig. 1 und 2 werden die Unterschiede zwischen dem erfindungsgemäßen Verfahren (a) und dem Verfahren des Standes der Technik (b) bei Verwendung eines Überschusses der elektronenübertragenden Substanz über den zu bestimmenden Analyt (Fig. 1) und bei Einsatz einer gegenüber der Analytkonzentration sehr geringen Menge an elektronenübertragender Substanz (Fig. 2) dargestellt. Nach dem Verfahren des Standes der Technik gemäß Fig. 1b) wird die elektronenübertragende Substanz (E_{ox 1}) in Anwesenheit des zu bestimmenden Analyts oder der von dem Analyt abgeleiteten Substanz (S_red), die enzymatisch zu (S_ox) oxidiert wird, in die reduzierte Form (E_red) überführt. An einer Elektrode wird der reduzierte Elektronenüberträger (E_red) durch Elektronenabgabe in die ursprünglich eingesetzte reduzierbare Substanz (E_{ox 1}) zurückoxidiert.

Demgegenüber wird nach dem erfindungsgemäßen Verfahren gemäß Fig. 1a) die als Elektronenüberträger fungierende reduzierbare Substanz (E_{ox 1}) bei der enzymatischen Oxidation des zu bestimmenden Analyten bzw. der von dem Analyt abgeleiteten Substanz (S_red) zu (S_ox) in die reduzierte Form (Er_ed) überführt. Bei der anodischen Oxidation an einer Elektrode wird dann eine oxidierte Form des Elektronenüberträgers (E_{ox 2}) gebildet, die von der ursprünglich eingesetzten reduzierbaren Substanz (E_{ox 1}) verschieden ist. Wegen der zu Anfang der elektrochemischen Oxidation völligen Abwesenheit von E_ox2 kann E_red bei besonders niedrigem Potential oxidiert werden. Die erfindungsgemäße elektronenübertragende reduzierbare Substanz (E_{ox 1}) kann so gewählt werden, daß zur anodischen Oxidation der enzymatisch gebildeten reduzierten Form (E_red) ein relativ niedriges Potential genügt. Hierdurch können störende Begleitreaktionen vermieden werden, die entstehen, wenn bei Anlegung hoher Potentiale an den Elektroden Begleitsubstanzen in den zu untersuchenden Proben oxidiert werden, so zu einem Stromfluß und damit zu einem falsch positiven Ergebnis führen. Bei dem Verfahren des Standes der Technik gemäß Fig. 1b) ist zur Rückoxidation der enzymatisch gebildeten reduzierten Form des Elektronenüberträgers (Ered) wegen des Überschusses an E_{ox 1} ein höheres Potential als das der ursprünglich eingesetzten reduzierbaren Substanz (E_{ox 1}) erforderlich.

Wird die als Elektronenüberträger fungierende reduzierbare Substanz (E_{ox 1}) im Unterschuß gegenüber dem zu bestimmenden Analyt bzw. der von dem zu bestimmenden Analyt abgeleiteten Substanz (S_red) eingesetzt, so kann nach dem Verfahren des Standes der Technik (Fig. 2b) die reduzierbare Substanz zwischen Elektrode und Enzym im Kreis geführt werden, da die reduzierte Form (E_red) anodisch in die ursprünglich eingesetzte reduzierbare Substanz (E_{ox 1}) zurückoxidiert wird.

Gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren (Fig. 2a) kann dann, wenn die an der Elektrode gebildete oxidierte Form des Elektronenüberträgers (E_{ox 2}) ebenso von dem reduzierten Enzym reduziert wird wie die ursprünglich eingesetzte reduzierbare Substanz (E_{ox 1}), dann kann E_{ox 1} beispielsweise als lagerstabile Vorratsform für das Elektronenübertragungssystem E_{ox 2}/E_red dienen.

Für das erfindungsgemäße Verfahren können grundsätzlich alle Sensorelektrodensysteme eingesetzt werden, die auch für die Durchführung der Verfahren des Standes der Technik geeignet sind. So kann ein Sensorelektrodensystem gemäß Fig. 3 verwendet werden, wie es beispielsweise aus G. Henze und R. Neeb, "Elektrochemische Analytik", Springer-Verlag (1986) bekannt ist.

Hierbei tauchen eine Arbeitselektrode (1), eine Gegenelektrode (2) und eine Referenzelektrode (3) in die zu bestimmende flüssige Probe (4). Für die Elektroden können übliche Materialien verwendet werden. Arbeits- und Gegenelektrode (1, 2) können beispielsweise vorteilhaft aus Edelmetallen bestehen oder unter Mitverwendung solcher Metalle hergestellt sein. Bevorzugte Materialien für Arbeits- und Gegenelektroden (1, 2) sind beispielsweise Gold und Platin. Die Referenzelektrode (3) kann ebenfalls aus hierfür gebräuchlichen Systemen aufgebaut sein. Bevorzugt ist beispiels weise das Silber/Silberchloridsystem. Die Referenzelektrode (3) steht vorteilhaft über eine Salzbrücke, beispielsweise eine Kaliumchloridlösung in Verbindung mit dem übrigen Elektrodensystem (1, 2) in der zu bestimmenden flüssigen Probe (4).

Die für das erfindungsgemäße Verfahren erforderliche Oxidoredukta se bzw. das Oxidoreduktase-System (je nachdem, ob ein Analyt oder eine Oxidoreduktase bestimmt werden soll) und die als Elektronen überträger fungierende reduzierbare Substanz können in der zu bestimmenden Probe (4) gelöst sein oder sie können sich auch alle oder teilweise auf der Arbeitselektrode (1) befinden. Wie die Elektroden je nach dem zu messenden elektrischen Signal miteinander elektrisch verbunden und geregelt werden müssen, ist für den Fachmann selbstverständlich.

In Fig. 4 ist die Konstruktion einer Einmalelektrode dargestellt, wie sie beispielsweise zum Nachweis von Glucose verwendet werden kann. Auf einem isolierenden Trägermaterial (8), beispielsweise einer Polycarbonatfolie, können mit geeigneten Methoden die notwendigen Elektroden und zugehörigen Zuleitungen aufgebracht werden. Geeignete Methoden können beispielsweise Siebdruck-, Inkjet-, Aufdampfverfahren oder Dünnfilmtechnik sein. In Fig. 4 bedeuten (5) die Arbeitselektrode, (55) die zugehörigen elektrisch leitfähigen Zuleitungen, (6) eine Referenzelektrode mit Zuleitung (66) und (7) eine Gegenelektrode mit entsprechender Leiterbahn (77). Für Elektroden und Leiterbahnen können bekannte elektrisch leitfähige Materialien verwendet werden. Beispielsweise können zur Herstellung der elektrisch leitfähigen Zuleitungen zu den Elektroden käufliche Graphitdruckpasten verwendet werden. Die Elektroden enthalten meist Edelmetalle wie Silber, Gold oder Platin. In dem erfindungsgemäßen Sensorelektrodensystem gemäß Fig. 4 enthält die Arbeitselektrode die für die Durchführung der elektrochemischen Bestimmung eines Analyts bzw. einer Oxidoreduktase notwendigen Reagenzien. Für die Bestimmung von Glucose beispielsweise Glucoseoxidase, eine erfindungsgemäß elektronenübertragende reduzierbare Substanz, eine Puffersubstanz, die den pH-Wert der zu untersuchenden Probe für die enzymatische Reaktion optimiert, sowie ggf. ein Detergens und Quellungsmittel, um mit einem die Mischung leitfähig machenden Material eine zur Herstellung einer Elektrode notwendige Konsistenz zu erreichen und die Mischung als Paste verarbeitbar zu machen. Als leitfähig machendes Material kann beispielsweise Graphitpulver zugegeben werden. Referenz- (6) und Gegenelektrode (7) sowie die entsprechenden Zuleitungen (66) und (77) können beispielsweise aus käuflichen Silberleitpasten hergestellt werden, die pulverisiertes Silberchlorid enthalten. Ein Sensorelektrodensystem gemäß Fig. 4 kann in einer Größe von etwa 10×30 mm hergestellt werden. Die zu untersuchende Lösung kann auf die Elektrodenflächen aufgegeben werden oder der Testträger kann so in die zu untersuchende Lösung getaucht werden, daß die Elektrodenflächen mit Flüssigkeit bedeckt sind. Bei amperometrischer Messung kann dann ein Potential an die Elektroden angelegt und ein Strom gemessen werden, der proportional dem zu bestimmenden Analyt ist.

Dazu wird zwischen Gegenelektrode (7) und Arbeitselektrode (5) der Strom derart gemessen und geregelt, daß zwischen Referenz- (6) und Arbeitselektrode (5) eine vorgegebene Spannung eingehalten wird. Die Spannungsmessung zwischen Arbeits- (5) und Referenzelektrode (6) erfolgt stromlos, so daß Widerstände der Leiterbahn keine Rolle spielen. Bei geringerer Anforderung an die Genauigkeit der Elektrodenpotentiale kann auch auf die stromlose Spannungsmessung verzichtet werden oder die Referenzelektrode (6) gleichzeitig als Gegenelektrode (7) betrieben werden.

Die Erfindung wird im folgenden durch Beispiele näher erläutert.

Beispiel 1 Glucosetest

Es wird ein Sensorelektrodensystem gemäß Fig. 3 eingesetzt. Die Arbeitselektrode (1) besteht aus einem Golddraht mit 0,1 cm² Fläche. Die Gegenelektrode (2) ist ein Platindraht mit 0,1 cm² Fläche und die Referenzelektrode (3) ist ein Silber/Silberchlorid system der Firma Orion Research Inc. (Boston, Massachusetts, USA).

Im Reaktionsgefäß befindet sich eine Lösung aus
0,1 mol/l Kaliumphosphatpuffer und 0,1 mol/l Kalimchlorid, pH 7,0;
10 mmol/l N,N-Bis-(2-hydroxyethyl)-p-nitrosoanilin und Glucose in einer Konzentration zwischen 0 und 100 mmol/l.

Die Bestimmungsreaktion wird durch Zugabe von Glucoseoxidase (EC 1.1.3.4) in die Reaktionsmischung und anschließendes Mischen ausgelöst. Es wird soviel Glucoseoxidase zugegeben, daß die Konzentration in der Reaktionsmischung 0,5 mg/ml (125 U/ml) beträgt. Eine Minute nach der Glucoseoxidasezugabe wird mit einem Potentiestaten (Mod. 273 EG & G, Princeton Applied Research, Princeton, New Jersey, USA) ein Cyclovoltammogramm bei einer Scan- Rate von 100 mV/s gemessen. Ausgewertet werden die Ströme des ersten Oxidationsmaximums bei 150 mV. Die erhaltenen Resultate zeigt Fig. 5. Entsprechende Messungen nach 5 Minuten nach Glucoseoxidasezugabe oder bei Sauerstoffausschluß (unter Argon) ergeben keine wesentliche Änderung.

Wie aus dem Diagramm gemäß Fig. 5 ersichtlich ist, ergibt sich bis zu einer Glucosekonzentration von etwa 30 mmol/l eine lineare Abhängigkeit des anodischen Stromdichtemaximums von der Glucosekonzentration. Bei höherer Glucosekonzentration als 30 mmol/l wird das als elektronenübertragende Substanz eingesetzte N,N-Bis-(2-hydroxyethyl)-p-nitrosoanilin vollständig zu dem entsprechenden Phenylendiamin umgesetzt. Höhere Konzentrationen als 30 mmol/l Glucose führen deshalb nicht zu einer weiteren Stromsteigerung. Da zwei Glucosemoleküle für die Erzeugung eines Moleküls Phenylendiamin nötig sind und nur etwa zwei Drittel der Gesamtglukose in β-Form vorliegen und damit für den Umsatz mittels Glucoseoxidase verfügbar sind, entspricht der gefundene vollständige Umsatz von 10 mmol/l elektronenübertragender Substanz durch 30 mmol/l Glucose genau der theoretischen Stöchiometrie.

Bei Verwendung von Glucose-dye-Oxidoreduktase (EC 1.1.99.17) anstelle von Glucoseoxidase (EC 1.1.3.4) in 0,1 mol/l Trispuffer, 0,1 mol/l Kaliumchlorid, pH 7,0 unter Zusatz von 1% Rinderserumalbumin, werden vergleichbare Ergebnisse erhalten.

Beispiel 2 NADH-Nachweis

Aufbau und Messanordnung sind wie in Beispiel 1 beschrieben. Das Reaktionsgefäß enthält 0,1 mol/l Kaliumphosphatpuffer, 0,1 mol/l Kaliumchlorid, pH 7,0,
10 mmol/l N,N-Bis-(2-hydroxyethyl)-p-nitrosoanilin und
NADH in Konzentrationen zwischen 0 und 10 mmol/l.

Die Messung wird durch Zugabe und Vermischen von Diaphorase (NADH : dye-Oxidoreduktase) aus Mikroorganismen und Vermischen des Enzyms mit der Reaktionsmischung gestartet. Es wird soviel Enzym zugegeben, daß die Enzymkonzentration in der Reaktionsmischung 0,2 mg/ml (3 U/ml) beträgt. Messung der Stromdichte nach 1 Minute Reaktionszeit ergibt die in Fig. 6 dargestellte lineare Stromdichte-Konzentrationsbeziehung.

Beispiel 3 Bestimmung von Lactat

Mit dem gleichen experimentellen Aufbau und dem gleichen Elektronenüberträger wie in Beispiel 1 kann auch Lactat bestimmt werden. Als Enzym wird Lactat-Oxidase (EC 1.1.3.2) eingesetzt und als Puffer 0,1 mol/l Citratpuffer, 0,1 mol/l Kaliumchlorid, pH 5,5 verwendet.

Beispiel 4 Bestimmung von Glycerinphosphat

Wird in Beispiel 1 das Enzym Glucoseoxidase durch Glycerophosphatoxidase (EC 1.1.3.21) und der Puffer durch 0,1 mol/l Trispuffer, 0,1 mol/l Kaliumchlorid, pH 8,0 ersetzt, kann analog Glycerinphosphat bestimmt werden.

Beispiel 5 Bestimmung von Cholesterin

Wird in Beispiel 1 Glucoseoxidase durch Cholesterinoxidase aus Streptomyces (EC 1.1.3.6), der Elektronenakzeptor durch 10 mmol/l N-Methyl-N′-(4-nitrosophenyl)-piperazin und der Puffer durch 0,1 mol/l Kaliumphosphatpuffer, 0,1 mol/l Kaliumchlorid, pH 5,5 mit 2% Triton X 100® ersetzt, kann analog Beispiel 1 Cholesterin bestimmt werden.

Beispiel 6 Erfindungsgemäße elektronenübertragende reduzierbare Substanzen

Die in der folgenden Tabelle 1 genannten Verbindungen werden in einer Konzentration von 10 mmol/l in 0,1 mol/l Kaliumphosphatpuffer, 0,1 mol/l Kaliumchlorid, pH 7,0 mit 50 mmol/l Glucose und 0,5 mg/ml Glucoseoxidase (125 U/ml) umgesetzt. Es wird hierbei eine Meßanordnung wie in Beispiel 1 beschrieben, verwendet. Entsprechende Cyclovoltammogramme ergeben die in mV gegen eine Normalwasserstoffelektrode angegebenen Peak-Potentiale des mit Glucoseoxidase und Glucose reduzierten Elektronenüberträgers.

Als Maß für die Umsatzgeschwindigkeit wird in Tabelle 1 das Verhältnis der Oxidationsströme beim Potential des höchsten Oxidationspeaks nach einer und nach zehn Minuten angegeben.

Tabelle 1

In Fig. 7 sind die Cyclovoltammogramme für N-(2-hHdroxyethyl)-N′- p-nitrosophenyl-piperazin und N,N-Bis-(2-hydroxyethyl)-p- nitrosoanilin dargestellt. Die Cyclovoltammogramme wurden mit 10 mmol/l Glucose gemessen, um Beeinflussungen durch Reaktionen von restlicher Glucose während der Aufnahme des Cyclovoltammogramms zu vermeiden.

Beispiel 7 Vergleich eines erfindungsgemäßen Elektronenüberträgers mit einem solchen des Standes der Technik

a) In einem Versuchsaufbau, wie in Beispiel 1 beschrieben, wird N- Methyl-N′-(4-nitrosophenyl)-piperazin in einer Konzentration von 10^-4 mol/l in einem Phosphatpuffer pH 7,0 eingesetzt. Die Messung von Cyclovoltammogrammen bei Glucosekonzentrationen zwischen 0 und 3 mmol/l ergibt eine Abhängigkeit der Stromdichte von der Glucosekonzentration wie sie in Fig. 8 dargestellt ist. Bei kleinen Konzentrationen wird eine Beeinflussung durch Luftsauerstoff festgestellt, die durch Messung unter Argon vermieden werden kann. Das gleiche Ergebnis wie bei Verwendung von Argon als Schutzgas wird durch Verwendung des Elektronenüberträgers in einer höheren Konzentration (10^-2 mol/l) erreicht. Ebenso kann die Beeinflussung der Messung durch Sauerstoff durch Einsatz von Glucosedehydrogenase statt Glucoseoxidase vermieden werden.
b) Wird statt N-Methyl-N′-(4-nitrosophenyl)-piperazin als erfindungsgemäßer Elektronenüberträger Tetrathiafulvalen als Elektronenüberträger des Standes der Technik verwendet, stellt sich die Abhängigkeit der Stromdichte von der Glucosekonzentration wie in Fig. 9 abgebildet, dar. Tetrathiafulvalen zeigt eine wesentlich höhere Sauerstoffstörung als dies bei dem Elektronenüberträger gemäß der Erfindung der Fall ist. Außerdem werden wesentlich geringere Stromdichten gemessen.

Tetrathiafulvalen ist recht schwer löslich. Um eine Konzentration von 10^-4 mol/l in einem Phosphatpuffer pH 7,0 zu erzielen, muß 2,5% Tween 20® als Detergens eingesetzt werden. Die Einstellung wesentlich höherer Konzentrationen an Tetrathiafulvalen zur Verminderung der Sauerstoffstörung, wie es im Falle des erfindungsgemäßen Elektronenüberträgers möglich ist, scheidet hier wegen der Schwerlöslichkeit aus.

Beispiel 8 Enzymbestimmung a) Lactat-Dehydrogenase-Test

Analog dem Testaufbau nach Beispiel 1 werden folgende Lösungen vorgelegt:
0,1 mol/l Natriumphosphatpuffer, 0,1 mol/l Kaliumchlorid, pH 9,0,
10 mmol/l N,N-Bis-(2-hydroxyethyl)-p-nitrosoanilin,
0,1 mol/l D,L-Lactat (Natriumsalz);
1 U/ml Diaphorase aus Mikroorganismen,
10 mmol/l NAD⁺.

Unter starkem Rühren (Magnetrührer 1000 Umdrehungen pro Minute) wird bei konstantem Potential von 75 mV gegen Silber/Silberchlorid Strom gemessen. Gestartet wird durch Zugabe von Lactat-Dehydrogenase (EC 1.1.1.27). Es werden verschiedene Mengen Lactat-Dehydrogenase hinzugegeben und nach jeweils 100, 200, 300, 400, 500 und 600 Sekunden gemessen. Die erhaltenen Strom/Zeit-Kurven zeigt Fig. 10. Die auf der Ordinate angegebenen LDH-Aktivitäten wurden nach dem üblichen Pyruvatreduktionstest ermittelt.

b) Glucose-Dehydrogenase-Test

Analog wie unter a) beschrieben, kann in 0,1 mol/l Kaliumphosphatpuffer, 0,1 mol/l Kaliumchlorid, pH 7,0 mit 10 mmol/l NAD⁺, 10 mmol/l erfindungsgemäßer Elektronenüberträger, 1 U/ml Diaphorase und 0,1 mol/l Glucose ein Test auf NAD-abhängige Glucose-Dehydrogenase durchgeführt werden.

Entsprechend können auch Oxidasen, Diaphorase oder nicht NAD- abhängige Dehydrogenasen bestimmt werden.

Beispiel 9 Einmal-Elektrodensystem zum Glucosenachweis

Ein Sensorelektrodensystem gemäß Fig. 4 wird so hergestellt, daß auf eine Polycarbonatfolie (8) durch Siebdruck mit geeigneten Druckpasten Arbeitselektrode (5), Referenzelektrode (6), Gegenelektrode (7) und Leiterbahnen (55, 66, 77) aufgebracht werden. Die Leiterbahnen bestehen aus käuflicher Graphitdruckpaste (Acheson 421 SS, Deutsche Acheson Colloids, Ulm, Bundesrepublik Deutschland). Die Referenzelektrode (6) und die Gegenelektrode (7) bestehen aus käuflicher Silberleitpaste, die mit 20 Gew.-% pulverisiertem Silberchlorid versetzt ist (Acheson SS 24 566, Deutsche Acheson Colloids, Ulm, Bundesrepublik Deutschland).

Für die Arbeitselektrode (5) werden in einer Quellung von 2 Gew.-% Hydroxyethylcellulose (Natrosol 250 G, Hercules BV, Rÿswÿk, Niederlande) in 0,05 mol/l Natriumphosphatpuffer (pH 7,0) 3 mmol/l N,N-Bis-hydroxyethyl-p-nitrosoanilin, 500 KU Glucoseoxidase (Glucoseoxidase, Reinheitsgrad II, Boehringer Mannheim GmbH, Mannheim Bundesrepublik Deutschland) pro 100 g Mischung, 30 Gew.-% Graphitpulver (UF 296/97, Graphitwerke Kropfmühl, Bundesrepublik Deutschland) und 4 Gew.-% Ethylenglykol homogenisiert. Die Elektrodenflächen sind
bei der Arbeitselektrode (5): 4×6 mm² = 24 mm²,
bei der Referenzelektrode (6): 1×1,5 mm² = 1,5 mm² und
bei der Gegenelektrode (7): 1×1,5 mm² = 1,5 mm² groß.

Das mittels Siebdruck hergestellte Sensorelektrodensystem wird so in eine Messlösung getaucht, die 0,05 mol/l Natriumphosphatpuffer (pH 7,0), 0,1 mol/l Natriumchlorid und 0-45 mmol/l Glucose enthält, getaucht, daß die Elektrodenflächen von der zu untersuchenden Flüssigkeit bedeckt sind. Bei 200 mV Potential gegen die integrierte Silber/Silberchlorid- Referenzelektrode (6) werden Strom/Zeit-Kurven aufgenommen, die in Fig. 11 dargestellt sind. Die Auftragung der Stromwerte nach 10 Sekunden Meßzeit ergibt die in Fig. 12 gezeigte Eichkurve, die die Abhängigkeit des Stromflusses von der Glucosekonzentration angibt.

Claims

1. Verfahren zur elektrochemischen Bestimmung eines Analyts in Gegenwart einer Oxidoreduktase und einer reduzierbaren Substanz, welche im Verlauf der Bestimmungsreaktion anfallende Elektronen von der Oxidoreduktase auf eine Elektrode überträgt und so zu einem Signal führt, das ein Maß für den zu bestimmenden Analyt ist, wobei die reduzierbare Substanz enzymatisch reduziert und an der Elektrode oxidiert wird, dadurch gekennzeichnet, daß die an der Elektrode durch Oxidation entstehende Substanz von der ursprünglich eingesetzten reduzierbaren Substanz verschieden ist.

2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sowohl die ursprünglich eingesetzte reduzierbare Substanz als auch die an der Elektrode durch Oxidation entstehende Substanz von der Oxidoreduktase reduziert werden.

3. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß als reduzierbare Substanz eine solche Verbindung eingesetzt wird, die die im Verlauf der Bestimmungsreaktion anfallenden Elektronen von der Oxidoreduktase unter Bildung eines elektronenreichen aromatischen Amins aufnimmt.

4. Verfahren gemäß Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß als reduzierbare Substanz eine Verbindung aus der Gruppe der Verbindungen der allgemeinen Formel I X-R (I)in der
R einen elektronenreichen aromatischen Rest und
X NO oder NHOH
darstellt, und Verbindungen der allgemeinen Formel IIHO-N=Y (II)in der
Y ein chinoides System, das im durch Reduktion entstandenen aromatischen Zustand als elektronenreich bezeichnet werden kann, darstellt, eingesetzt wird.

5. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1-4, dadurch gekennzeichnet, daß als Oxidoreduktase eine Oxidase, eine nicht-NAD(P)-abhängige Dehydrogenase oder Diaphorase eingesetzt wird.

6. Verfahren zur elektrochemischen Bestimmung einer Oxidoreduktase in Gegenwart eines entsprechenden Enzymsubstrats und einer reduzierbaren Substanz, welche Elektronen von einer Oxidoreduktase auf eine Elektrode zu übertragen in der Lage ist und so zu einem Signal führt, das ein Maß für das zu bestimmende Enzym ist, wobei die reduzierbare Substanz enzymatisch reduziert und an der Elektrode oxidiert wird, dadurch gekennzeichnet, daß die an der Elektrode durch Oxidation entstehende Substanz von der ursprünglich eingesetzten reduzierbaren Substanz verschieden ist.

7. Verwendung einer Substanz, die Elektronen von einer Oxidoreduktase unter Bildung eines elektronenreichen aromatischen Amins aufnehmen kann, als Elektronenüberträger zwischen einer Oxidoreduktase und einer Elektrode in einem elektrochemischen System.

8. Verwendung einer Substanz gemäß Anspruch 7, dadurch gekennzeicht, daß sie aus der Gruppe der Verbindungen der allgemeinen Formel I X-R (I)in der
R einen elektronenreichen aromatischen Rest und
X NO oder NHOH
darstellt, und Verbindungen der allgemeinen Formel (II)HO-N=Y (II)in der
Y ein chinoides System, das im durch Reduktion entstandenen aromatischen Zustand als elektronenreich bezeichnet werden kann, darstellt, ausgewählt ist.

9. Sensorelektrodensystem zur elektrochemischen Bestimmung eines Analyts in einer flüssigen Probe enthaltend mindestens 2 elektrisch leitfähige Mittel, die isoliert voneinander vorliegen und die jeweils mittels einer elektrisch leitfähigen Oberfläche mit der zu untersuchenden Probe in elektrischen Kontakt gebracht werden können, wobei mindestens eine der elektrisch leitfähigen Oberflächen eine Oxidoreduktase und eine reduzierbare Substanz, die Elektronen zwischen der Oxidoreduktase und der elektrisch leitfähigen Oberfläche zu übertragen in der Lage ist, kontaktiert, dadurch gekennzeichnet, daß als reduzierbare Substanz eine Verbindung eingesetzt ist, die nach Reduktion durch die Oxidoreduktase an der elektrisch leitfähigen Oberfläche zu einer Substanz oxidiert wird, die von der ursprünglich eingesetzten reduzierbaren Substanz verschieden ist.

10. Sensorelektrodensytem gemäß Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß sowohl die ursprünglich eingesetzte reduzierbare Substanz als auch die an der elektrisch leitfähigen Oberfläche durch Oxidation entstehende Verbindung von der Oxidoreduktase reduziert werden.

11. Sensorelektrodensystem zur elektrochemischen Bestimmung einer Oxidoreduktase in einer flüssigen Probe, enthaltend mindestens zwei elektrisch leitfähige Mittel, die isoliert voneinader vorliegen und die jeweils mittels einer elektrisch leitfähigen Oberfläche mit der zu untersuchenden Probe in elektrischen Kontakt gebracht werden können, wobei mindestens eine der elektrisch leitfähigen Oberflächen ein Oxidoreduktase-Substrat und eine reduzierbare Substanz, die Elektronen zwischen der Oxidoreduktase und der elektrisch leitfähigen Oberfläche zu übertragen in der Lage ist, kontaktiert, dadurch gekennzeichnet, daß als reduzierbare Substanz eine Verbindung eingesetzt ist, die nach Reduktion durch die Oxidoreduktase an der elektrisch leitfähigen Oberfläche zu einer Substanz oxidiert wird, die von der ursprünglich eingesetzten reduzierbaren Substanz verschieden ist.

12. Verwendung einer Substanz, die Elektronen von einer Oxidoreduktase unter Bildung eines elektronenreichen aromatischen Amins aufnehmen kann, zur Herstellung eines Sensorelektrodensystems gemäß Anspruch 9 oder 11.

13. Verwendung einer Substanz gemäß Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß sie aus der Gruppe der Verbindungen der allgemeinen Formel I X-R (I)in der
R einen elektronenreichen aromatischen Rest und
X NO oder NHOH darstellt, und Verbindungen der allgemeinen Formel (II)HO-N=Y (II)in der
Y ein chinoides System, das im durch Reduktion entstandenen aromatischen Zustand als elektronenreich bezeichnet werden kann, darstellt, ausgewählt ist.