DE4004430A1

DE4004430A1 - Aus polyaldehyden aufgebaute kontrastmittel

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Publication number: DE4004430A1
Application number: DE4004430A
Authority: DE
Inventors: Georg Dr Roessling; Celal Dr Albayrak; Matthias Dr Rothe; Joachim Dr Siegert
Original assignee: Schering AG
Current assignee: Bayer Pharma AG
Priority date: 1990-02-09
Filing date: 1990-02-09
Publication date: 1991-08-14
Also published as: PT96691B; IE76315B1; NO910510L; JPH059132A; NO910510D0; JP3363912B2; CA2036107A1; EP0441468B1; DK0441468T3; DE59108153D1; ES2094192T3; HU910427D0; GR3021206T3; PT96691A; EP0441468A2; FI910596A0; EP0441468A3; FI910596A; ZA91961B; NO300916B1

Description

Die Erfindung betrifft den in den Patentansprüchen gekennzeichneten Gegenstand, das heißt neue Mikropartikel, diese enthaltende pharmazeutische Mittel, deren Verwendung in der Ultraschalldiagnostik sowie Verfahren zur Herstellung dieser Mikropartikel und pharmazeutischen Mittel.

Es ist bekannt, daß durch periphere Injektion von Lösungen, die feine Gasblasen enthalten, cardiale Echokontraste erzielt werden können (Roelandt J., Ultrasound Med. Biol. 8: 471-492, 1982). Diese Gasblasen werden in physiologisch verträglichen Lösungen z. B. durch Schütteln, andere Agitation oder durch Zusatz von Kohlendioxid erhalten. Sie sind jedoch hinsichtlich Anzahl und Größe nicht einheitlich und können nur unzulänglich reproduziert werden. Auch sind sie in der Regel nicht stabilisiert, so daß ihre Lebensdauer gering ist. Ihre mittleren Durchmesser liegen meist über Erythrocytengröße, so daß keine Lungenkapillarpassage mit nachfolgender Kontrastierung von Organen wie linkes Herz, Leber Niere oder Milz möglich ist. Darüber hinaus eignen sie sich nicht für Quantifizierungen, da sich das von ihnen erzeugte Ultraschallecho aus mehreren, nicht voneinander zu trennenden Prozessen wie Blasenentstehung, Koaleszenz und Auflösung zusammensetzt. So ist es z. B. nicht möglich, mit Hilfe dieser Ultraschall-Kontrastmittel über die Messung des Kontrastverlaufs im Myokard Aussagen über die Transitzeiten zu gewinnen.

In der EP 01 31 540 ist die Stabilisierung der Gasblasen durch Zucker beschrieben. Damit wird zwar die Reproduzierbarkeit und Homogenität des Kontrasteffektes verbessert, eine Lungenpassage überstehen diese Blasen jedoch nicht.

In den EP 01 22 624 und 01 23 235 wird beschrieben, daß der gasblasenstabilisierende Effekt von Zuckern, Zuckeralkoholen und Salzen durch Zusatz von Tensiden verbessert wird. Eine Lungenkapillargängigkeit und die Möglichkeit zur Darstellung des arteriellen Gefäßschenkels und verschiedener Organe wie Leber oder Milz ist bei diesen Ultraschallkontrastmitteln gegeben. Der Kontrasteffekt ist hierbei jedoch auf das Gefäßvolumen beschränkt, da die Bläschen nicht von den Gewebezellen aufgenommen werden.

Keines der bisher bekannten Ultraschall-Kontrastmittel verbleibt längere Zeit unverändert im Körper. Eine Organdarstellung mit ausreichender Signalintensität durch selektive Anreicherung nach i. v. Gabe oder Quantifizierungen sind daher nicht möglich.

Eine Verkapselung von Gasen, wie beispielsweise Luft als Ultraschall-Kontrastmittel, wird in der DE-OS 38 03 972 beschrieben. Das hierbei verwendete Wandmaterial besteht aus bioabbaubarem synthetischem Material, wie vor allem Cyanacrylat und Polylactid.

Diese Mikropartikel sind jedoch - insbesondere in größerem Maßstab sowie im Hinblick auf ihre Aufarbeitung - schwierig herstellbar. So ist vor allem die breite Größenverteilung der Partikel von Nachteil.

Es bestand daher die Aufgabe, Ultraschall-Kontrastmittel zu schaffen, die diese Nachteile nicht aufweisen. Diese Aufgabe wird durch die vorliegende Erfindung, d. h. durch die Bereitstellung der erfindungsgemäßen Mikropartikel gelöst.

Diese Mikropartikel bestehen aus bioabbaubaren Polymeren, dadurch gekennzeichnet, daß sie aufgebaut sind aus polymerisierbaren Aldehyden, die gewünschtenfalls zur Copolymerisation fähige Zusätze und/oder Crosslinker enthalten, gegebenenfalls Tensiden oder Tensidgemischen, Gasen und/oder leichtflüchtigen Flüssigkeiten in freier oder gebundener Form, Kopplungsagentien, gegebenenfalls über diese Kopplungsagenzien gebundenen Bio- oder Makromolekülen sowie gegebenenfalls diagnostisch oder therapeutisch wirksamen Bestandteilen.

Die am Aufbau der Mikropartikel hauptsächlich beteiligten polymerisierten Aldehyde werden aus folgenden polymerisierbaren Aldehyden ausgewählt:

I. α,β-ungesättigten Aldehyden, wie zum Beispiel
Acrolein
Crotonaldehyd
Propionaldehyd
II. α-substituierten Acroleinderivaten, wie zum Beispiel
α-Methylacrolein
α-Chloracrolein
α-Phenylacrolein
α-Ethylacrolein
α-Isopropylacrolein
α-n-Butylacrolein
α-n-Propylacrolein
III. Dialdehyden, wie zum Beispiel
Glutaraldehyd, Succinaldehyd oder deren Derivate oder deren Mischungen mit zur Copolymerisation fähigen Zusätzen, wie zum Beispiel:
α-substituierten Acroleinen
β-substituierten Acroleinen
Ethylcyanacrylaten
Methylcyanacrylaten
Butylcyanacrylaten
Hexylcyanacrylaten
Methylmetacrylaten
Vinylalkoholen
Acrylsäuren
Methacrylsäuren
Acrylsäurechloriden
Methacrylsäurechloriden
Acrylnitril
Methacrylnitrilen
Acrylamiden
Substituierten Acrylamiden
Hydroxymethylmethacrylaten
Mesityloxid
Dimethylaminoethylmethacrylaten-2-Vinylpyridinen
N-vinyl-2-Pyrrolidinon

Bevorzugt sind dabei Acrolein und Glutaraldehyd.

Die gegebenenfalls am Aufbau der Mikropartikel beteiligten Tenside werden aus ionogenen oder nicht-ionogenen oberflächenaktiven Substanzen, wie z. B.

Polyethylenoxid
Polyoxyethylenpolyoxypropylenen wie
Pluronic®F 68, Pluronic®F 108, Pluronic®F 127, Polyethylenglykol, Poloxamin 908, Polaxamer 407
Carbonsäuresalzen, wie zum Beispiel: Natriumoleat
Polyoxyethylenfettsäureestern, wie zum Beispiel:
Polyoxyethylenstearat
Natriumdioctylsulfosuccinat
Polyglutaraldehydnatriumhydrogensulfit-Addukt
Polyvinylsulfonsäure

ausgewählt. Sie können allein oder in Form ihrer Gemische verwendet werden.

Bevorzugt sind hiervon: Polyglutaraldehydnatriumsulfit-Addukt, Pluronic®F 68, Pluronic®F 108 und Pluronic®F 127.

Besitzen die zum Aufbau der Mikropartikel benutzten polymerisierbaren Aldehyde oberflächenaktive Eigenschaften, so kann auf die Verwendung von Tensiden verzichtet werden. Als Beispiel derartiger Aldehyde sei der Glutaraldehyd genannt.

Als in den Mikropartikeln in freier oder gebundener Form enthaltene Gase bzw. leichtflüchtige Flüssigkeiten - bevorzugt sind hierbei Flüssigkeiten mit einem Siedepunkt unter 60°C - sind u. a. geeignet:

Ammoniak
Luft
Edelgase bzw. Edelgasverbindungen (Helium, Neon, Argon, Xenon, Krypton)
Schwefelhalogenide, wie zum Beispiel: Schwefelhexafluorid,
Stickstoff
Kohlenstoffoxide
Sauerstoff
Wasserstoff,
Kohlenwasserstoffe oder deren Gemische, wie zum Beispiel:
Methan
Ethan
Propan
Butan
Pentan
Neopentan
Isopentan
Cyclopentan
Ethylen
Propylen
Acetylen
3,3-Dimethyl-1-Butin
2,3-Pentadien
2-Methyl-2-Butan
2-Methyl-1,3-Butadien
2-Butin
2-Methyl-1-Buten
3-Methyl-1-Buten,
halogenierte Kohlenwasserstoffe oder Gemische, wie zum Beispiel:
Methylenchlorid
1,1-Dichlorethylen
Isopropylchlorid
Dibromdifluormethan
Brommethan,
Ether, wie zum Beispiel: Dimethylether, Diethylether oder fluorierte Ether,
oder Verbindungen wie zum Beispiel:
Dimethylaminoaceton
Propylenoxid
N-Ethylmethylamin
N-Ethyldimethylamin
Furan.

Bevorzugt sind hiervon: Luft, Argon, Xenon, Schwefelhexafluorid, Propan, Butan und Furan.

Als am Aufbau der Mikropartikel beteiligten Kopplungsagenzien sind vor allem geeignet:

I. Aminogruppenhaltige Verbindungen, wie zum Beispiel:
Hydroxylamin
Butylamin
Allylamin
Ethanolamin
Trishydroxymethylaminomethan
3-Amino-1-propansulfonsäure
5-Aminovaleriansäure
8-Aminooctansäure
D-Glucosaminhydrochlorid
Aminogalactose
Aminosorbit
Aminomannit
Diethylaminoethylamin
Aniline
Sulfonilsäureamid
Cholin
N-Methylglucamin
Piperazin
1,6-Hexandiamin
Harnstoff
Hydrazin
Glycin
Alanin
Lysin
Serin
Valin
Leucin
Peptide
Proteine
Albumin
Polylysin
Gelatine
Polyglykolamine
Aminopolyalkohole
Dextransulfate mit Aminogruppen
Antikörper
Immunoglobuline
II. Säuregruppenhaltige Verbindungen, wie zum Beispiel:
Carbonsäuren
Essigsäure
Propionsäure
Buttersäure
Valeriansäure
Capronsäure
Caprylsäure
Caprinsäure
Laurinsäure
Myristinsäure
Palmitinsäure
Stearinsäure
Ölsäure
Linolsäure
Linolensäure
Cyclohexancarbonsäure
Phenylessigsäure
Benzoylessigsäure
Chlorbenoesäure
Brombenzoesäure
Nitrobenzoesäure
Ortho-Phthalsäure
Meta-Phthalsäure
Para-Phthalsäure
Salicylsäure
Hydroxybenzoesäure
Aminobenzoesäure
Methoxybenzoesäure
III. Hydroxygruppenhaltige Verbindungen, wie z. B.: Alkohole
Methanol
Ethanol
Propanol
Butanol
Pentanol
Hexanol
Meptanol
Octanol
Decanol
Dodecanol
Tetradecanol
Hexadecanol
Octadecanol
Isopropylalkohol
Isobutylalkohol
Isopentylalkohol
Cyclopentanol
Cyclohexanol
Crotylalkohol
Benzylalkohol
Phenylalkohol
Diphenylmethanol
Triphenylmethanol
Zimtalkohol
Ethylenglykol
1,3-Propandiol
Glycerin
Pentaerythrit
IV. Polymerisierfähige Substanzen, wie
α,β-ungesättigte Aldehyde, wie z. B.:
Acrolein
Crotonaldehyd
Propionaldehyd
α-substituierte Acroleinderivate, wie z. B.:
α-Methylacrolein
α-Chloracrolein
α-Phenylacrolein
α-Ethylacrolein
α-Isoproylacrolein
α-n-Butylacrolein
α-n-Propylacrolein
Dialdehyde, wie z. B.:
Glutaraldehyd, Succinaldehyd oder deren Derivate oder deren Mischungen mit zur Copolymerisation fähigen Zusätzen, wie z. B.:
α-substituierten Acroleinen
β-substituierten Acroleinen
Ethylcyanacrylaten
Methylcyanacrylaten
Butylacrylaten
Hexylcyanacrylaten
Methylmetacrylaten
Vinylalkoholen
Acrylsäuren
Methacrylsäuren
Acrylsäurechloriden
Acrylnitril
Methacrylnitrilen
Acrylamiden
Substituierten Acrylamiden
Hydroxymethylmethacrylaten
Mesityloxid
Dimethylaminoethylmethacrylaten-2-Vinylpyridinen
N-vinyl-2-Pyrrolidinon

Bevorzugt sind hiervon: Hydroxylamin, Trishydroxymethylaminomethan, 3-Amino-1-propansulfonsäure, D-Glucosaminhydrochlorid, Aminomannit, Harnstoff, Hydrazin, Proteine, Polyglykolamine und Aminopolyalkohole.

Die unter I. genannten Kopplungsagenzien sind über ihre Aminogruppe an die sich auf der Oberfläche der aus polymerisierten Aldehyden und gegebenenfalls Tensiden aufgebauten Mikropartikel befindlichen Formylgruppen kondensiert.

Ebenfalls über die Formylgruppen gebunden sind die unter IV. aufgeführten Monomere, die mit weiteren Monomeren polymerisiert sind.

Die unter II. und III. genannten Säuren und Alkohole sind dagegen erst nach vorheriger Umwandlung der Aldehydfunktion an die Mikropartikel angekoppelt.

Durch die Wahl geeigneter, über diese Kopplungsagenzien gebundenen Bio- oder Makromoleküle, wie z. B. Enzyme, Dextrane, Immunoglobuline, monoklonale Antikörper (s. weiter unten) erhält man erfindungsgemäße Mikropartikel, die eine überraschend hohe Gewebe- und Organspezifität aufweisen.

Die erfindungsgemäßen Mikropartikel enthalten gegebenenfalls diagnostisch oder therapeutisch wirksame Bestandteile zur Diagnose und Therapie von Tumoren, wie zum Beispiel

Doxorubicin
Actinomycin
Magnetit
Mitomycin C
Triamcinolon.

Die erfindungsgemäßen Mikropartikel weisen die eingangs geschilderten gewünschten Eigenschaften auf. Sie sind einfach und mit hoher Ausbeute herstellbar. Eine Maßstabsvergrößerung der Herstellung (up-scaling) ist ebenso wie die Reinigung der Mikropartikel problemlos.

Die Partikel weisen eine schmale Größenverteilung (monodispers) auf; es ist dabei möglich, die Größe der Partikel je nach eingesetzter Konzentration der Ausgangsstoffe über einen großen Bereich zu variieren (s. weiter unten). Durch Steuerung der Herstellungsbedingungen (z. B. pH-Wert) ist es möglich, auch das Molekulargewicht in großen Bereichen zu variieren.

Ein weiterer Vorteil besteht darin, daß die Reaktion zur Synthese der Mikropartikel durch viele Möglichkeiten ausgelöst werden kann, beispielsweise Anionische Polymerisation durch pH-Änderung, kationische Polymerisation mit z. B. Eisensalzen, radikalische Polyermisation mit UV-Licht und durch ionisierende Strahlung.

Der für die Herstellung der Mikropartikel mögliche weite Temperaturbereich (-5 bis +80°C) gestattet eine einfache Versuchssteuerung mit optimalen Ausbeuten bei sehr unterschiedlichen Gasen bzw. leichtsiedenden Flüssigkeiten.

Die Partikel enthalten freie Aldehydgruppen, die durch chemische Reaktionen mit anderen Molekülen kovalent verknüpft werden können. Diese Möglichkeit gestattet es, die Eigenschaften der Partikeloberfläche gezielt zu verändern, ohne die echogenen Eigenschaften zu beeinflussen. Durch Auswahl geeigneter Moleküle läßt sich die kolloidale Stabilität beeinflussen. Insbesondere wird dadurch das für kolloidale Systeme häufig auftretende Phänomen der Agglomeration verhindert. Dies wiederum ist von großem Vorteil für die Entwicklung einer stabilen Formulierung.

Neben der Beeinflussung der Stabilität bieten sich Möglichkeiten, die Oberfläche der Partikel so zu verändern, daß ein drug-targeting möglich ist. Dies geschieht durch Ankopplung geeigneter Bio- oder Makromoleküle (z. B. monoklonaler Antikörper), die eine hohe Gewebe- und Organspezifität bewirken (G. Gregoriadis, G. Poste "Targeting of Drugs", Plenum Press 1988, New York) oder durch Beeinflussung der Oberflächeneigenschaften der Partikel durch Adsorption von Molekülen (z. B. Tensiden).

In Abhängigkeit von der Wahl dieser Moleküle und von der Größe der Mikropartikel läßt sich eine Partikelanreicherung in/an Tumoren bzw. z. B. in der Lunge, Leber, Milz und im Knochenmark erreichen. Die Anreicherung im Knochenmark wird insbesondere dadurch erreicht, daß kleine Partikel (<100 nm) mit z. B. Poloxamer 407 gecoatet werden. Sind die Partikel z. B. mit Poloxamin 908 gecoated, wird das RES-System von diesen Partikeln überwunden, und sie bleiben im Blutkreislauf (blood pool agent).

Durch mit Antikörpern gekoppelte Teilchen läßt sich eine Anreicherung der Partikel in/an Tumoren erreichen.

Ein aktives targeting läßt sich auch mit Magnetit-enthaltenden Mikropartikeln durchführen. Durch ein von außen angelegtes Magnetfeld werden die Partikel in den gewünschten Stellen im intravasalen System angereichert. Es ergibt sich hierdurch die Möglichkeit, Strömungsverhältnisse z. B. in Blutgefäßen zu untersuchen.

Mit Hilfe der mit Magnetit beladenen Partikel ist es auch möglich, durch ein von außen eingestrahltes magnetisches Wechselfeld lokal hohe Temperaturen zu erzeugen. Dies läßt sich therapeutisch ausnutzen, z. B. zur Zerstörung von Tumoren (Hyperthermie-Therapie). Außer der Verwendung eines magnetischen Wechselfeldes läßt sich ein Ultraschallfeld verwenden. Auch hierbei kommt es zu starken lokalen Temperaturerhöhungen.

Die Herstellung der erfindungsgemäßen Mikropartikel erfolgt dadurch, daß man eine 0 bis 40%, vorzugsweise 0,01 bis 10% w/v Tensid(e) und 0 bis 10% w/v diagnostisch oder therapeutisch wirksame Bestandteile und Gase oder leichtflüchtige Flüssigkeiten enthaltende wäßrige Lösung unter Rühren, bei einer Temperatur von -5% bis +80°C, vorzugsweise 0° bis 40°C, einem pH-Wert von 7 bis 14, vorzugsweise 9 bis 13, innerhalb von 1 Minute bis 10 Stunden, vorzugsweise 10 Minuten bis 2 Stunden, und gegebenenfalls unter Einleiten von Gas mit copolymerisierbarem/n Aldehyd(en) bis zu einer Konzentration bezogen auf die Reaktionsmischung von 0,1 bis 50%, vorzugsweise 3 bis 20% w/v, sowie mit copolymerisierbaren Zusätzen einer Konzentration bezogen auf die Reaktionslösung von 0 bis 20%, vorzugsweise 1 bis 5% w/v, mit Crosslinker(n) einer Konzentration bezogen auf die Reaktionsmischung von 0-5%, vorzugsweise 0,1 bis 1% w/v, umsetzt, anschließend - gegebenenfalls nach Reinigung - die so erhaltenen Mikropartikel mit einer wäßrigen Lösung, die - bezogen auf die Aldehydmenge - bis zu äquimolare Mengen an Kopplungsagenz sowie 0 bis 20%, vorzugsweise 0,01 bis 10% w/v Tensid(e) bezogen auf das Gesamtvolumen enthält, unter Rühren bis zu 3 Tagen, vorzugsweise bis zu 2 Tagen, bei Temperaturen von 0° bis 60°C, vorzugsweise 5° bis 30°C, bei einem pH-Wert von 3 bis 9, vorzugsweise 5 bis 8, umsetzt und - gewünschtenfalls nach Reinigung - diese gegebenenfalls an Bio- oder Makromoleküle bindet.

Die nach der ersten Reaktionsstufe erhaltenen Polymeraldehyd-Partikel haben auf der Oberfläche Aldehydgruppen. Mit diesen Aldehydgruppen lassen sich die für Aldehyde typischen Reaktionen durchführen (R. C. Schulz, Kolloidzeitschrift und Zeitschrift für Polymere, 182 (1-2), 99 (1961); Lehrbuch der organischen Chemie "Organikum", VEB Verlag der Wissenschaften, Berlin, 1984). Dadurch ist man in der Lage, aufder Partikeloberfläche Moleküle anzukoppeln, die die Oberflächeneigenschaften ändern.

Beispiele für mögliche Reaktionen der Aldehydgruppen:

- Reduktion zu Alkohol
- Oxidation zu Säuren
- Oximierung
- Iminbildung, gegebenenfalls gefolgt von Hydrierung
- Hydrazonbildung, gegebenenfalls gefolgt von Hydrierung
- Mercaptalisierung
- Acetalisierung
- Disproportionierung durch NaOH (Cannizzaro-Reaktion)
- Aldolkondensation

Die Kopplung von aminogruppenhaltigen Molekülen an die in der ersten Reaktionsstufe gebildeten Partikel erfolgt durch Umsetzung mit den Aldehydgruppen. Hierbei wählt man beispielsweise folgende experimentelle Bedingungen:

1000 mg Polyacrolein- Partikel werden in 50 ml destilliertem Wasser suspendiert. Zu dieser Partikelsuspension werden 5000 mg der umzusetzenden Substanz zugegeben und bei Raumtemperatur gerührt. Entsprechend der Reaktionsgeschwindigkeit der Umsetzung muß gerührt werden; bei langsamen Reaktionsgeschwindigkeiten bis 48 Stunden. Die Partikelsuspension wird anschließend dialysiert (Cut off 10000 d).

Enthalten die durch z. B. die oben angegebenen Reaktionen eingeführten Substituenten (gegebenenfalls intermediär geschützte) funktionelle Gruppen, so können diese nach dem Fachmann bekannten Verfahren in für die Kopplung an Bio- oder Makromoleküle geeignete reaktive Gruppen umgewandelt werden. Bevorzugte derartige Gruppen sind beispielsweise die Maleimidobenzoyl-, 3-Sulfomaleimido-benzoyl-, 4-(Maleimidomethyl)-cyclohexylcarbonyl-, 4-[3-Sulfo-(maleimido-methyl)-cyclohexyl-carbonyl-, 4-(p-Maleimidophenyl)-butyryl-, 3-(2-Pyridyl-dithio)propionyl-, Methacryloyl-(pentamethylen)-amido-, Bromacetyl-, Jodacetyl-, 3-Jodpropyl-, 2-Bromethyl-, 3-Mercaptopropyl-, 2-Mercaptoethyl-, Phenylenisothiocyanat, 3-Aminopropyl-, Benzyl ester-, Ethylester-, t-Butylester, Amino-, C₁-C₆-Alkylamino-, Aminocarbonyl-, Hydrazino-, Hydrazinocarbonyl-, Maleimido-, Methacrylamido-, Methacryloylhydrazinocarbonyl-, Maleimidamidocarbonyl-, Halogeno-, Mercapto-, Hydrazinotrimethylenhydrazinocarbonyl-, Aminodimethylenamidocarbonyl-, Bromcarbonyl-, Phenylendiazonium-, Isothiocyanat-, Semicarbazid-, Thiosemicarbazid-, Isocyanat-Gruppe.

Eine Aminogruppe kann beispielsweise nach literaturbekannten Methoden (z. B. mit Thiophosgen in einem Zweiphasensystem, S. Scharma, Synthesis 1978, 803, D. K. Johnson, J. Med. Chem. 1989, Vol. 32, 236) in eine Isothiocyanatgruppe umgewandelt werden.

Durch Umsetzung einer Aminofunktion mit einem Halogenessigsäurehalogenid kann eine α-Halogenacetamidgruppe generiert werden (JACS 1969, Vol. 90, 4508; Chem. Pharm. Bull. 29 (1), 128, 1981), die ebenso wie z. B. die Isothiocyanatgruppe zur Kopplung an Bio- und Makromoleküle geeignet ist.

Als Substituenten, der in eine für eine Bindung an ein Makro- oder Biomolekül geeignete funktionelle Gruppe überführt werden kann, sind unter anderem Hydroxy- und Nitrobenzyl-, Hydroxy- und Carboxyalkyl- sowie Thioalkylreste mit bis zu 20 Kohlenstoffatomen geeignet. Sie werden nach dem Fachmann bekannten Literaturverfahren [Chem. Pharm. Bull. 33, 674 (1985). Compendium of Org. Synthesis Vol. 1-5, Wiley and Sons, Inc., Houben-Weyl, Methoden der organischen Chemie, Band VIII, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, J. Biochem. 92, 1413, (1982)] in die gewünschten Substituenten (zum Beispiel mit der Amino-, Hydrazino-, Hydrazinocarbonyl-, Epoxid-, Anhydrid-, Methacryloylhydrazinocarbonyl-, Maleimidamidocarbonyl-, Halogeno-, Halogenocarbonyl-, Mercapto-, Isothiocyanatgruppe als funktioneller Gruppe) umgewandelt, wobei im Fall des Nitrobenzylrestes zunächst eine katalytische Hydrierung (zum Beispiel nach P. N. Rylander, Catalytic Hydrogenation over Platinum Metals, Academic Press 1967) zum Aminobenzylderivat vorgenommen werden muß.

Beispiele für die Umwandlung von an aromatische oder aliphatische Reste gebundenen Hydroxy- oder Aminogruppen sind die in geeigneten Lösungsmitteln wie Tetrahydrofuran, Dimethoxyethan oder Dimethylsulfoxid, zweiphasigen wäßrigen Systemen, wie z. B. Wasser/Dichlormethan, in Gegenwart eines Säurefängers wie zum Beispiel Natriumhydroxid, Natriumhydrid oder Alkali oder Erdalkalicarbonaten wie zum Beispiel Natrium-, Magnesium-, Kalium-, Calciumcarbonat oder Poly-(t-vinylpyridin) Reillex® bei Temperaturen zwischen 0°C und dem Siedepunkt des jeweiligen Lösungsmittels, vorzugsweise jedoch zwischen 20°C und 60°C, durchgeführten Umsetzungen mit einem Substrat der allgemeinen Formel I

Nf-L-Fu (I)

worin Nf für ein Nucleofug wie z. B. Cl, Br, J, CH₃C₆H₄SO₃ oder CF₃SO₃, L für einen aliphatischen, aromatischen, arylaliphatischen, verzweigten, geradkettigen oder cyclischen Kohlenwasserstoffrest mit bis zu 20 Kohlenstoffatomen und Fu für die gewünschte funktionelle Gruppe, gegebenenfalls in geschützter Form, stehen (DE-OS 34 17 413).

Als Beispiele für Verbindungen der allgemeinen Formel I seien genannt

Umwandlungen von Carboxy-Gruppen können zum Beispiel nach der Carbodiimid-Methode (Fieser, Reagents for Organic Synthese 10, 142), über ein gemischtes Anhydrid [Org. Prep. Proc. Int. 7, 215 (1975)] oder über einen aktivierten Ester (Adv. Org. Chem. Part B, 472) durchgeführt werden.

Die so erhaltenen kopplungsagenz-tragenden Mikropartikel können auch an Bio- oder Makromoleküle geknüpft sein, von denen bekannt ist, daß sie sich in dem zu untersuchenden Organ oder Organteil besonders anreichern. Solche Moleküle sind beispielsweise Enzyme, Hormone, Polysaccharide wie Dectrane oder Stärken, Porphyrine, Bleomycine, Insulin, Prostaglandine, Steroidhormone, Aminozucker, Aminosäuren, Peptide wie Polylysin, Proteine (wie zum Beispiel Immunoglobuline, monoklonale Antikörper, Lektine), Lipide (auch in Form von Liposomen) und Nukleotide vom DNA- oder RNA-Typ. Besonders hervorzuheben sind Konjugate mit Albuminen, wie Humanserumalbumin, Antikörpern, wie zum Beispiel monoklonale, für tumorassoziierte Antigene spezifische Antikörper oder Antimyosin. Anstelle von biologischen Makromolekülen können auch geeignete synsthetische Polymere wie Polyethylenimine, Polyamide, Polyharnstoffe, Polyether wie Polyethylenglykole und Polythioharnstoffe angeknüpft werden. Die hieraus gebildeten pharmazeutischen Mittel eignen sich beispielsweise zur Anwendung in der Tumor- und Infarkt-Diagnostik sowie Tumortherapie. Monoklonale Antikörper (zum Beispiel Nature 256, 495, 1975) haben gegenüber polyklonalen Antikörpern die Vorzüge, daß sie spezifisch für eine antigene Determinate sind, eine definierte Bindungsaffinität besitzen, homogen sind (damit wird ihre Reindarstellung wesentlich einfacher) und in Zellkulturen in großen Mengen herstellbar sind. Als solche sind zum Beispiel für die Tumordarstellung monoklonale Antikörper bzw. deren Fragmente Fab und F(ab′)₂ geeignet, die zum Beispiel spezifisch sind für humane Tumore des Gastrointestinaltraktes, der Brust, der Leber, der Blase, der Keimdrüsen und von Melanomen [Cancer Treatment Repts. 68, 317, (1984), Bio Sci 34, 150, (1984)] oder gegen Carcinomembryonales Antigen (CEA), Humanes Choriogonadotropin (β-HCG) oder andere tumorständige Antigene, wie Glycoproteine, gerichtet sind [New Engl. J. Med. 298, 1384, (1973), US-P 43 31 647]. Geeignet sind unter anderem auch Anti-Myosin, Anti-Insulin- und Anti-Fibrin-Antikörper (US-P 40 36 945).

Coloncarcinome lassen sich mit Hilfe von Mikropartikel-Konjugation mit dem Antikörper 17-1A (Centocor, USA) diagnostisch nachweisen.

Im Falle der Antikörper-Konjugate darf die Bindung des Antikörpers an die Mikropartikel nicht zum Verlust oder zur Verminderung der Bindungsaffinität und Bindungsspezifität des Antikörpers zum Antigen führen. Dies kann entweder durch Bindung an den Kohlenhydrat-Anteil im Fc-Teil des Glycoproteins bzw. in den Fab oder F(ab′)₂-Fragmenten oder durch Bindung an Schwefelatome des Antikörpers bzw. der Antikörper-Fragmente erfolgen.

Im ersten Fall muß zunächst eine oxidative Spaltung von Zuckereinheiten zur Generation kopplungsfähiger Formylgruppen durchgeführt werden. Diese Oxidation kann auf chemischem Wege mit Oxidationsmitteln wie z. B. Perjodsäure, Natriummetaperjodat oder Kaliummetaperjodat nach literaturbekannten Methoden (zum Beispiel J. Histochem and Cytochem. 22, 1084, 1974) in wäßriger Lösung in Konzentrationen von 1 bis 100, vorzugsweise 1 bis 20 mg/ml, und einer Konzentration des Oxidationsmittels zwischen 0,001 bis 10 mMol, vorzugsweise 1 bis 10 mMol, in einem pH-Bereich von ca. 4 bis 8 bei einer Temperatur zwischen 0 bis 37°C und einer Reaktionsdauer zwischen 15 Minuten und 24 Stunden vorgenommen werden. Auch auf enzymatischem Wege kann die Oxydation, beispielsweise mit Hilfe von Galaktoseoxidase, in einer Enzymkonzentration von 10-100 Einheiten/ml, einer Substratkonzentration von 1 bis 20 mg/ml, bei einem pH-Wert von 5 bis 8, einer Reaktionsdauer von 1 bis 8 Stunden und einer Temperatur zwischen 20 und 40°C, durchgeführt werden (zum Beispiel J. Biol. Chem. 234, 445, 1959).

An die durch Oxidation generierten Aldehyde werden Mikropartikel mit geeigneten funktionellen Gruppen, wie zum Beispiel Hydrazin, Hydrazid, Hydroxylamin, Phenylhydrazin, Semicarbazid und Thiosemicarbazid, durch Reaktion zwischen 0-37°C, bei einer Reaktionsdauer von 1 bis 65 Stunden, einem pH-Wert zwischen ca. 5,5 und 8, einer Antikörperkonzentration von 0,5 bis 20 mg/ml und einem molaren Verhältnis des Komplexbildners zum Antikörperaldehyden von 1 : 1 bis 1000 : 1 gebunden. die anschließende Stabilisierung des Konjugats erfolgt durch Reduktion der Doppelbindung, z. B. mit Natriumborhydrid oder Natriumcyanoborhydrid; das Reduktionsmittel wird dabei in einem 10- bis 100fachen Überschuß verwendet (zum Beispiel J. Biol. Chem. 254, 4359, 1979).

Die zweite Möglichkeit der Bildung von Antikörper-Konjugaten geht aus von einer schonenden Reduktion der Disulfid-Brücken des Immunoglobulin-Moleküls; hierbei werden die empfindlichen Disulfid-Brücken zwischen den H-Ketten des Antikörper-Moleküls gespalten, während die S-S-Bindungen der Antigenbindenden Region intakt bleiben, so daß praktisch keine Verminderung der Bindungsaffinität und -spezifität des Antikörpers eintritt (Biochem. 18, 2226, 1979, Handbook of Experimental Immunology, Vol. 1, Second Edition, Blackwell Scientific Publications, London 1973, Chapter 10). Diese freien Sulfhydryl-Gruppen der interH-Ketten Regionen werden dann mit geeigneten funktionellen Gruppen der Mikropartikel bie 0 bis 37°C, einem pH-Wert von ca. 4 bis 7, und einer Reaktionsdauer von 3 bis 72 Stunden unter Ausbildung einer kovalenten Bindung, die die Antigen-Bindungsregion des Antikörpers nicht beeinflußt, umgesetzt. Als geeignete reaktive Gruppen seien beispielsweise genannt: Halogenalkyl-, Halogenacetyl-, p-Mercuribenzoat-, Isothiocyanat-, Thiol-, Epoxidgruppen sowie Gruppen, die einer Michael-Additions-Reaktion, wie zum Beispiel Maleinimide, Methacrylogruppen (zum Beispiel J. Amer. Chem. Soc. 101, 3097, 1979), zu unterwerfen sind.

Zur Verknüpfung der Antikörperfragmente mit den Mikropartikeln gibt es zusätzlich eine Reihe geeigneter, oft auch kommerziell erhältlicher bifunktioneller "Linker" (siehe zum Beispiel Pierce, Handbook and General Catalogue 1986), die sowohl gegenüber den SH-Gruppen der Fragmente als auch gegenüber den Amino- bzw. Hydrazinogruppen der Mikropartikel reaktiv sind.

Als Beispiele seien genannt:

m-Maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimidester (MBS),
M-Maleimidobenzoyl-N-sulfosuccinimidester (Sulfo-MBS),
N-Succinimidyl-[4-(Iodacetyl)-amino]benzoesäureester (SIAB),
Succinimidyl-4(N-maleimidomethyl)-cyclohexan-1-carbonsäureester (SMCC),
Succinimidyl-4(p-maleimidophenyl)-buttersäureester (SMPB),
N-Succinimidyl-3-(2-pyridyldithio)-propionsäureester (SDPD),
4-[3-(2,5-Dioxo-3-pyrrolinyl)-propionyloxy]-3-oxo-2,5-diphenyl-2,3-d-ihydrothiophen-1,1-dioxid,
Acetylalanylleucylalanylaminopbenzyl,
Acetamido-p-thioureidobenzyl.

Es können auch Bindungen nicht-kovalenter Art zur Kopplung an das Bio- oder Makromolekül genutzt werden, wobei sowohl ionische als auch von der Waals- und Wasserstoffbrücken-Bindungen in wechselnden Anteilen und Stärke (Schlüssel-Schloß-Prinzip) zur Bindung beitragen können (zum Beispiel Avidin-Biotin, Antikörper-Antigen). Auch Einschlußverbindungen (host-guest) kleinerer Komplexe in größere Cavitäten beim Makromolekül sind möglich.

Das Kopplungsprinzip besteht darin, zunächst ein bifunktionelles Makromolekül herzustellen, indem man entweder ein gegen ein Tumorantigen gerichtetes Antikörper-Hybridom mit einem gegen die erfindungsgemäßen Mikropartikel gerichteten zweiten Antikörper-Hybridom fusioniert oder die beiden Antikörper chemisch über einen Linker (beispielsweise in der im J. Amer. Chem. Soc. 101, 3097 (1979) angegebenen Weise) miteinander verknüpft oder den gegen das Tumorantigen gerichteten Antikörper, gegebenenfalls über einen Linker, an Avidin (bzw. Biotin) bindet [D. J. Hnatowich et al., J. Nucl. Med. 28, 1294 (1987)]. Anstelle der Antikörper können auch ihre entsprechenden F(ab)- bzw. F(ab′)₂-Fragmente verwendet werden. Für die pharmazeutische Anwendung injiziert man zunächst das bifunktionelle Makromolekül, das sich am Zielort anreichert, und dann im zeitlichen Abstand die erfindungsgemäßen Mikropartikel [gegebenenfalls an Biotin (bzw. Avidin) gebunden], di in-vivo am Zielort angekoppelt werden und dort ihre diagnostische oder therapeutische Wirkung entfallen können. Darüberhinaus können auch andere Kopplungsmethoden wie beispielsweise das in Protein Tailoring Food Med. Uses [Am. Chem. Soc. Symp.] (1985), 349, beschriebene "Reversible Radiolabeling" zur Anwendung kommen.

Mit der sogenannten Festphasen-Kopplung steht eine besonders einfache Methode zur Herstellung von Antikörper-Konjugaten bzw. Antikörperfragment-Konjugaten zur Verfügung: Der Antikörper wird an eine stationäre Phase (z. B. einen Ionenaustauscher), der sich zum Beispiel in einer Glassäule befindet, gekoppelt. Durch sukzessives Spülen der Säule mit einer zur Generierung von Aldehyd-Gruppen geeigneten Lösung, Waschen, Spülen mit einer Lösung der funktionalisierten Mikropartikel, Waschen und schließlich Eluieren des Konjugats werden sehr hohe Konjugat-Ausbeuten erhalten.

Dieses Verfahren erlaubt die automatische und kontinuierliche Produktion beliebiger Mengen an Konjugaten.

Auch andere Kopplungsschritte können auf diese Art und Weise durchgeführt werden.

So können zum Beispiel durch die Sequenz Papain-Reduktion/bifunktioneller Linker/funktionalisierte Mikropartikel Fragment-Konjugate hergestellt werden.

Die so gebildeten Verbindungen werden anschließend vorzugsweise chromatographisch gereinigt.

Es lassen sich Partikel in der Größe von 0,04-100 µm, vorzugsweise 0,1-40 µm, herstellen. Die Größe der Partikel läßt sich im wesentlichen beeinflussen durch Variation der Ausgangskonzentration von Monomer, Tensid und pH-Wert.

Beispiele für die Herstellung von Partikeln bestimmter Größe

1. Acroleinkonzentration:
10% (W/V)
Tensidkonzentration:	1,5% (W/V)
pH-Wert:	10,0
Temperatur:	4°C

Werden diese Bedingungen gewählt, so erhält man Partikel mit einem mittleren Durchmesser von 750 nm.

2. Acroleinkonzentration:
20% (W/V)
Tensidkonzentration:	0,2% (W/V)
pH-Wert:	10,0
Temperatur:	2°C

Unter diesen Bedingungen erhält man Partikel mit einem mittleren Durchmesser von 40 µm.

3. Bei gleichen Bedingungen wie unter 2.) aufgeführt, jedoch bei einer Acroleinkonzentration von 10% (W/V) erhält man Partikel mit einem mittleren Durchmesser von 8 µm.

4.) Acroleinkonzentration:
10% (W/V)
Tensidkonzentration:	0,5% (W/V)
pH-Wert:	11,0
Mittlerer Partikeldurchmesser:	560 nm

5.) Unter gleichen Bedingungen wie unter 4.), nur bei einem pH-Wert von 9 ergibt sich eine mittlere Partikelgröße von 3,2 µm.

Als Tensid wird Polyglutaraldehydnatriumhydrogensulfit-Addukt (PGL) verwendet.

Synthese von PGL

Eine 25% wäßrige Lösung von Glutaraldehyd wird über Aktivkohle gereinigt. Anschließend wird durch die Einleitung von N₂ in die wäßrige Lösung die Lösung von O₂ befreit. Ferner wird eine Pufferlösung (Phosphatpuffer, 1 molar) auf pH=11 eingestellt. Die Pufferlösung wird auch von O₂ durch Einleitung von N₂ befreit. Die Pufferlösung und Glutaraldehydlösung werden zusammengebracht und unter N₂-Atmosphäre 72 Stunden lang polymerisiert. Danach wird das Polymerisat filtriert und mit Aceton und Wasser gewaschen. Das gewaschene Polymerisat wird im Vakuumtrockenschrank bei 45°C getrocknet. In 30 ml H₂O, das 12,5 g NaHSO₃ enthält, werden 5 g Polyglutaraldehyd gelöst. Die Lösung wird mit destilliertem H₂O dialysiert. Anschließend wird die Lösung lyophilisiert.

Die erfindungsgemäßen Partikel lassen sich in wäßrigen Lösungen suspendieren, ohne daß es zu Aggregation der Teilchen kommt. Zur Herstellung einer galenischen Formulierung, die parenteral applizierbar ist, lassen sich wäßrige Lösungen verwenden, die isotonisierende Zusätze wie Natriumchlorid, Zuckeralkohole (Mannit, Sorbit, Xylit etc.) oder Zucker (Glucose, Fructose) enthalten. Zur Einstellung des pH-Wertes können Puffer wie Trometamol/HCl, Citronensäure/NaOH etc. gewählt werden.

Beispiele

1.) In 100 ml einer Formulierung sind enthalten:

Partikel:\|100 mg
Trometamol:	2,4 mg
+HCL für pH	7,4
Mannit:	5500 mg
Wasser:	ad 100 ml

2.) In 100 ml einer Formulierung sind enthalten:

Partikel:\|50 mg
Natriumchlorid:	860 mg
Wasser	ad 100 ml

Ein Aufschwimmen der Partikel kann dadurch verhindert werden, daß die mittlere Dichte des Partikels an die des umgebenden Vehikels angeglichen wird. Dazu sind folgende Maßnahmen geeignet:

a) Die Partikel können so hergestellt werden, daß sie aufschwimmen, sedimentieren oder statistisch verteilt in der wäßrigen Lösung schweben.
b) Eine weitere Möglichkeit, die Dichte der Partikel der Dichte des Vehikels anzupassen, besteht darin, daß man die mittlere Dichte durch Zusätze von Substanzen höherer Dichte (Röntgenkontrastmittel, Magnetite) beeinflußt. Diese Möglichkeit bietet sich an bei Partikeln mit geringem Polyaldehydgehalt.

Die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Mittel enthalten 0,1 µg-100 mg Mikropartikel/ml, vorzugsweise 10 µg-1 mg Mikropartikel/ml galenischer Formulierung und werden in der Regel in Dosen von 0,01 ml-10 ml/kg, vorzugsweise 0,1-1 ml/kg Körpergewicht, dosiert. Sie sind zur enteralen und parenteralen Applikation bestimmt.

Zur Verwendung in der Hyperthemie-Therapie werden die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Mittel in der Regel in Mengen von 0,001-10 mg, vorzugsweise 0,01-1 mg pro g Tumor eingesetzt.

Die nachfolgenden Beispiele sollen die Erfindung erläutern, ohne sie auf diese zu beschränken.

Methoden zur Herstellung des Kontrastmittels 1. Reaktionsstufe

A) Eine tensidhaltige (0,01-5% w/v wäßrige Lösung wird unter Rührung auf 0°C abgekühlt. Dabei wird ein Gas in die Lösung eingeleitet. Der pH-Wert der Lösung wird mit NaOH auf den gewünschten pH-Wert (vorzugsweise 9-13) eingestellt. Zu dieser Lösung wird das Monomer bzw. Monomergemisch gegeben. Nach 30 Minuten wird die Rührgeschwindigkeit reduziert. Nach 1 Stunde wird das Reaktionsgemisch mit der oben angegebenen tensidhaltigen wäßrigen Lösung verdünnt. Die Rührgeschwindigkeit wird noch weiter gesenkt. Nach 4 Stunden werden die ausgefallenen nicht-gasenthaltenden Mikropartikel von der übrigen Suspension dekantiert und verworfen. Die dekantierte Suspension wird dialysiert, um das Kontrastmittel von Restmonomeren zu reinigen. Ausbeute: 80-90%.

B) Eine wäßrige Lösung, welche die gewünschte Tensid- und Monomermenge enthält, wird auf 0°C abgekühlt. Dabei wird das gewünschte Gas unter Rühren durch die Lösung eingeleitet. Anschließend wird mit NaOH der pH-Wert der Lösung auf vorzugsweise 9-13 eingestellt. Nach 1 Stunde wird das Reaktionsgemisch verdünnt. Nach 3-4 Stunden wird die Mikropartikel enthaltende Suspension von dem ausgefallenen Polymerisat, das verworfen wird, getrennt. Die Suspension wird durch Dialyse gereinigt. Ausbeute: 80-90%.

Beispiel 1

Es werden 91 ml 0,5%ige wäßrige Tensidlösung in einen Kolben gegeben. Der pH-Wert der Lösung wird mit 0,2 N NaOH-Lösung auf 11 eingestellt. Durch die Lösung wird N₂ eingeleitet. Zu der auf 0°C abgekühlten 0,5%igen Tensidlösung wird 9,5 ml frisch destilliertes Acrolein getropft. Nach 1 Stunde werden zum Reaktionsgemisch weitere 100 ml 0,5%ige Tensidlösung gegeben. Nach 3 Stunden wird die Mikropartikel enthaltende Suspension von den ausgefallenen Polymeren dekantiert und durch Dialyse gereinigt.

Beispiel 2

Es werden 82 ml 0,08%ige wäßrige Tensidlösung in einen Kolben gegeben. Die Lösung wird auf 0°C abgekühlt. Zu der abgekühlten Lösung werden 18 ml frisch destilliertes Acrolein zugegeben. In die Lösung wird unter Rühren Argon eingeleitet. Nach 1 Stunde wird der pH-Wert der Lösung mit einer 0,2 N NaOH-Lösung auf 12 eingestellt. Nach 2 Stunden werden 100 ml 0,08%ige Tensidlösung zugegeben. Nach 3 Stunden wird die Suspension dekantiert und dialysiert.

Beispiel 3

Es werden 70 ml 0,08%ige wäßrige Tensidlösung, die 10% Dimethylformamid enthält, in einen Kolben gegeben. Der pH-Wert der Lösung wird mit 0,2 N NaOH-Lösung auf 11,5 eingestellt. Die Lösung wird auf 0°C abgekühlt. Dabei wird N₂ in die Lösung eingeleitet. In diese Lösung werden 30 ml frisch destilliertes Acrolein getropft. Nach 1 Stunde wird der Lösung 100 ml 0,08%ige Tensidlösung zugegeben. Nach 4 Stunden wird die Suspension von den ausgefallenen Polymeren getrennt und gereinigt.

Beispiel 4

Es werden 91 ml 0,5%ige wäßrige Tensidlösung, die 5% Magnetit enthält, in einem Kolben auf 0°C abgekühlt. Der pH-Wert der Lösung wird mit 0,2 N NaOH auf 12 eingestellt. Durch die Lösung wird N₂ eingeleitet. Zu der auf 0°C abgekühlten Lösung werden 9 ml frisch destilliertes Acrolein zugetropft. Nach 1 Stunde werden dem Reaktionsgemisch 100 ml der 0,5%igen Tensidlösung zugegeben. Die Mikropartikel enthaltende Suspension wird durch Dekantieren von ausgefallenen Polymeren getrennt und dialysiert.

Beispiel 5

Es werden 91 ml 0,5%ige Tensidlösung in einen Kolben gegeben. Der pH-Wert der Lösung wird durch Zugabe von 0,2 N NaOH-Lösung auf 12 eingestellt. Die Lösung wird auf 0°C abgekühlt. Durch die Lösung wird Argon eingeleitet. Zu dieser Lösung werden 9 ml frisch destilliertes Acrolein, welches 5% Butylcyanoacrylat enthält, zugetropft. Nach 1 Stunde werden weitere 100 ml der 0,5%igen Tensidlösung zugegeben. Die Suspension wird vom Bodensatz getrennt und gereinigt.

Beispiel 6

Es werden 91 ml 0,08%ige wäßrige Tensidlösung in einen Kolben gegeben. Der pH-Wert der Lösung wird durch Zugabe von 0,2 N NaOH-Lösung auf 10,5 eingestellt. Die Lösung wird auf 0°C abgekühlt. Durch die Lösung wird N₂ eingeleitet. Zu dieser Lösung werden 9 ml frisch destilliertes Acrolein, welches 20% α-Methylacrolein enthält, zugetropft. Nach 1 Stunde werden weitere 100 ml der 0,08%igen Tensidlösung zugegeben. Nach 2 Stunden wird die Mikrosphären- Suspension vom Bodensatz getrennt und gereinigt.

Beispiel 7

Es werden 91 ml 0,08%ige wäßrige Tensidlösung, welche 25% Isopentan enthält, in einen Kolben gegeben. Die Lösung wird auf 0°C abgekühlt. Zu dieser Lösung werden 9 ml frisch destilliertes Acrolein unter Rühren zugegeben. Nach 2 Stunden wird das Reaktionsgemisch filtriert. Die Mikropartikel werden durch Waschen mit Wasser gereinigt. Die Mikrosphären werden in Wasser resuspendiert.
Tensidlösung: Polyglutaraldehydnatriumhydrogensulfit-Addukt.

2. Reaktionsstufe Beispiel 8

1000 mg Polyacrolein-Mikropartikel aus Beispiel 1 werden in 50 ml Wasser resuspendiert. Zu dieser Suspension werden 1000 mg 3-Aminopropansulfon zugegeben und 48 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Danach wird die Suspension gegen Wasser dialysiert.

Beispiel 9

1000 mg Polyacrolein-Mikropartikel aus Beispiel 2 werden in 50 ml Wasser resuspendiert. Zu dieser Suspension werden 1000 mg 3-Aminopropanphosphat zugegeben und 48 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Danach wird die Suspension gegen Wasser dialysiert.

Beispiel 10

1000 mg Polyacrolein-Mikropartikel aus Beispiel 3 werden in 50 ml Wasser resuspendiert. Zu dieser Suspension werden 1000 mg 8-Aminooctansäure zugegeben und 24 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Danach wird die Suspension gegen Wasser dialysiert.

Beispiel 11

1000 mg Polyacrolein-Mikropartikel aus Beispiel 4 werden in 50 ml Wasser resuspendiert. Zu dieser Suspension werden 1000 mg 5-Aminovaleriansäure zugegeben und 36 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Danach wird die Suspension gegen Wasser dialysiert.

Beispiel 12

1000 mg Polyacrolein-Mikropartikel aus Beispiel 5 werden in 50 ml Wasser resuspendiert. Zu dieser Suspension werden 1000 mg D-Glucoseaminhydrochlorid zugegeben und 30 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Danach wird die Suspension gegen Wasser dialysiert.

Beispiel 13

1000 mg Polyacrolein-Mikropartikel aus Beispiel 6 werden in 50 ml Wasser resuspendiert. Zu dieser Suspension werden 1000 mg Hexamethylendiamin zugegeben und 24 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Danach wird die Suspension gegen Wasser dialysiert.

Beispiel 14

1000 mg Polyacrolein-Mikropartikel aus Beispiel 7 werden in 50 ml Wasser resuspendiert. Zu dieser Suspension werden 1000 mg Polylysin (MG=32 600 Dalton) zugegeben und 30 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Danach wird die Suspension mit Wasser gewaschen.

Beispiel 15

1000 mg Polyacrolein-Mikropartikel aus Beispiel 5 werden in 50 ml Wasser resuspendiert. Zu dieser Suspension werden 1000 mg Human Albumin zugegeben und 24 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Danach wird die Suspension mit Wasser gewaschen.

Beispiel 16

1000 mg Polyacrolein-Mikropartikel aus Beispiel 4 werden in 50 ml Wasser resuspendiert. Zu dieser Suspension werden 1000 mg von (2-Diethylamino(- ethylamin zugegeben und 20 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Danach wird die Suspension gegen Wasser dialysiert.

In-vitro-Versuche

In in-vitro-Experimenten werden durch Rückstreumessungen der Echoamplitude von Suspensionen beispielhaft ausgewählter erfindungsgemäßer Mikropartikel deren sehr gute akustische Eigenschaften belegt.

Zur Erklärung der in-vitro-Versuche und der daraus gewonnenen Abbildungen:

Die Meßapparatur besteht aus einem Ultraschallsender kombiniert mit einem Ultraschallempfänger und einer Meßküvette mit der Probe. Zur Messung der akustischen Eigenschaften der Probe wird ein Ultraschallimpuls ausgesendet. Der Impuls wird an der Glaswand der Küvette gestreut, durchläuft die Probe und wird dann, falls die Probe nicht echogen ist, an der Rückseite der Küvette gestreut. Die Rückstreuung des Ultraschallimpulses wird vom Empfänger gemessen und durch eine Änderung der Amplitude (siehe Abbildungen) angezeigt.

In Abb. 1 ist das Rückstreuverhalten von Wasser (als Beispiel für eine nichtechogene Probe) dargestellt. Es ist deutlich die Rückstreuamplitude der Vorderwand (bei 3 µsec) und der Rückwand (bei ca. 16 µsec) der Küvette erkennbar.

Wird eine echogene Probe vermessen, so ergibt sich eine Rückstreuverhalten wie es in den Abb. 2-4 wiedergegeben ist. Das Rückstreusignal der Küvettenwand wird nicht erhalten, da der Ultraschallimpuls durch Wechselwirkung mit der echogenen Probe dissipiert bzw. so verändert wird, daß keine Rückstreuung mehr zum Empfänger erfolgen kann.

Es wurden die Rückstreuamplituden von wäßrigen Partikelsuspensionen der Beispiele 8 (Abb. 2), 11 (Abb. 4), jeweils in einer Konzentration von 0,5 mg/ml, bestimmt.

In-vivo-Versuche

Zur Durchführung einer echokardiographischen Untersuchung bei einem ca. 10 kg schweren Hund (Beagle) werden die erfindungsgemäßen Kontrastmittel folgenderweise verwendet: Aus dem Vial mit der gebrauchsfertigen Suspension wird 1 ml der Lösung entnommen, die 40 µg/ml mit Albumin gekoppelte Partikel (Beispiel 15) in 5% Glukoselösung enthält. Die Injektion dieses Kontrastmittels erfolgt in die Vena saphena ramus caudalis über einen allseitig offenen Dreiwegehahn mit einer Injektionsgeschwindigkeit von mindestens 1 ml/s, günstiger jedoch mit einer Geschwindigkeit von 3 ml/s, gefolgt von einer Nachinjektion von 5 ml einer physiologischen Kochsalzlösung (0,9%ig). Die Nachinjektion erfolgt, um einen möglichst lange bestehenbleibenden Kontrastmittelbolus zu erhalten. Vor der Injektion (Abb. 5) wird ein "apikaler Vierkammerblick" bei dem Versuchstier mit einem handelsüblichen Schallkopf für die Echokardiographie an der Thoraxwand (transthorakale Ableitung) eingestellt und mit einer Klammer fixiert. Vor, während und nach der Injektion wird die Schallableitung auf dem Bildschirm des Ultraschall- Untersuchungsgerätes angezeigt und ggf. auf Videoband oder mit einem Videoprinter dokumentiert. Diese Versuchsanordnung entspricht dem Stand der Technik und ist dem Fachmann bekannt.

Bei Erreichen des Ultraschall-Kontrastmittels im rechten Herz lassen sich die Kontrasteffekte im Farbdoppler, im 2D-Echobild oder im M-Mode Echobild verfolgen. Das Kontrastmittel markiert zuerst das Blut des rechten Vorhofes, dann wird der rechte Ventrikel und schließlich die Pulmonalarterie kontrastiert. Hierbei tritt eine homogene Füllung auf, die für eine diagnostische Untersuchung ausreichende Zeit anhält. Während die Höhlen des rechten Herzens sich wieder mit nicht kontrastiertem Blut füllen (Abnahme und Verschwinden der Echogenität in den Herzhöhlen) erscheint das Kontrastmittel nach der Lungenpassage (transkapillär) in den Pulmonalvenen, füllt dann ist linken Vorhof, den linken Ventrikel und das nachfolgende Hochdrucksystem homogen. Die Kontrasteffekte in den Höhlen des linken Herzens halten länger an als die auf der rechten Herzseite. Neben der Kontrastierung der Höhlen des linken Herzens erfolgt auch eine Kontrastierung anderer Organe, die die Durchblutung wiederspiegelt.

Abb. 6 zeigt die Füllung des linken Ventikels mit Kontrastmittel.

Die Verwendung der erfindungsgemäßen Ultraschall-Kontrastmittel beschränkt sich nicht auf die Sichtbarmachung der Blutströme im Gefäßsystem, eine Kontrastierung von Körperhöhlen ist ebenso möglich. Bedingt durch die Durchblutungsdarstellung kann auch mit gutem Erfolg die Untersuchung anderer Organe mit diesen Kontrastmitteln erfolgen.

Claims

1. Mikropartikel bestehend aus bioabbaubaren Polymeren, dadurch gekennzeichnet, daß sie aufgebaut sind aus polymerisierbaren Aldehyden, die gewünschtenfalls zur Copolymerisation fähige Zusätze und/oder Crosslinker enthalten, gegebenenfalls Tensiden oder Tensidgemischen, Gasen und/oder leichtflüchtigen Flüssigkeiten in freier oder gebundener Form, Kopplungsagentien, gegebenenfalls über diese Kopplungsagenzien gebundenen Bio- oder Makromolekülen sowie gegebenenfalls diagnostisch oder therapeutisch wirksamen Bestandteilen.

2. Pharmazeutische Mittel, dadurch gekennzeichnet, daß sie Mikropartikel nach Anspruch 1 sowie gegebenenfalls in der Galenik übliche Zusätze enthalten.

3. Mikropartikel nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie in der Ultraschalldiagnostik angewendet werden.

4. Mikropartikel nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie in der künstlichen partiellen Hyperthermie angewendet werden.

5. Mikropartikel nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie durch ein äußeres Magnetfeld gelenkt werden können.

6. Mikropartikel nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die polymerisierbaren Aldehyde ausgewählt werden aus:

I. α,β-ungesättigten Aldehyden, wie zum Beispiel
Acrolein
Crotonaldehyd
Propionaldehyd
II. α-substituierten Acroleinderivaten, wie zum Beispiel
α-Methylacrolein
α-Chloroacrolein
α-Phenylacrolein
α-Ethylacrolein
α-Isopropylacrolein
α-n-Butylacrolein
α-n-Propylacrolein
III. Dialdehyden, wie zum Beispiel
Glutaraldehyd, Succinaldehyd oder deren Derivate oder deren Mischungen mit zur Copolymerisation fähigen Zusätzen, wie zum Beispiel:
α-substituierten Acroleinen
β-substituierten Acroleinen
Ethylcyanacrylaten
Methylcyanacrylaten
Butylcyanacrylaten
Hexylcyanacrylaten
Methylmetacrylaten
Vinylalkoholen
Acrylsäuren
Methacrylsäuren
Acrylsäurechloriden
Methacrylsäurechloriden
Acrylnitril
Methacrylnitrilen
Acrylamiden
Substituierten Acrylamiden
Hydroxymethylmethacrylaten
Mesityloxid
Dimethylaminoethylmethacrylaten-2-Vinylpyridinen
N-vinyl-2-Pyrrolidinon

7. Mikropartikel nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die gegebenenfalls enthaltenen Tenside ausgewählt werden aus ionogenen oder nicht-ionogenen oberflächenaktiven Substanzen wie zum Beispiel: Polyethylenoxid
Polyoxyethylenpolyoxypropylenen wie
Pluronic® F 68, Pluronic® F 108, Pluronic® F 127, Polyethylenglykol, Poloxamid 908, Polaxamer 407
Carbonsäuresalzen, wie zum Beispiel: Natriumoleat
Polyoxyethylenfettsäureestern, wie zum Beispiel: Polyoxyethylenstearat
Natriumdioctylsulfosuccinat
Polyglutaraldehydnatriumhydrogensulfit-Addukt
Polyvinylsulfonsäure

8. Mikropartikel nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Gase bzw. leichtflüchtige Flüssigkeiten Ammoniak
Luft
Edelgase bzw. Edelgasverbindungen (Helium, Neon, Argon, Xenon, Krypton)
Schwefelhalogenide, wie zum Beispiel: Schwefelhexafluorid,
Stickstoff
Kohlenstoffoxide
Sauerstoff
Wasserstoff,
Kohlenwasserstoffe oder deren Gemische, wie zum Beispiel:
Methan
Ethan
Propan
Butan
Pentan
Neopentan
Isopentan
Cyclopentan
Ethylen
Propylen
Acetylen
3,3-Dimethyl-1-Butin
2,3-Pentadien
2-Methyl-2-Buten
2-Methyl-1,3-Butadien
2-Butin
2-Methyl-1-Buten
3-Methyl-1-Buten,
halogenierte Kohlenwasserstoffe oder Gemische, wie zum Beispiel:
Methylenchlorid
1,1-Dichlorethylen
Isopropylchlorid
Dibromdifluormethan
Brommethan,
Ether, wie zum Beispiel: Dimethylether, Diethylether oder fluorierte Ether,
oder Verbindungen wie zum Beispiel:
Dimethylaminoaceton
Propylenoxid
N-Ethylmethylamin
N-Ethyldimethylamin
Furanverwendet werden.

9. Mikropartikel nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Kopplungsagenzien

I. Aminogruppenhaltige Verbindungen, wie zum Beispiel:
Hydroxylamin
Butylamin
Allylamin
Ethanolamin
Trishydroxymethylaminomethan
3-Amino-1-propansulfonsäure
5-Aminovaleriansäure
8-Aminooctansäure
D-Glucosaminhydrochlorid
Aminogalactose
Aminosorbit
Aminomannit
Diethylaminoethylamin
Aniline
Sulfonilsäureamid
Cholin
N-Methylglucamin
Piperazin
1,6-Hexandiamin
Harnstoff
Hydrazin
Glycin
Alanin
Lysin
Serin
Valin
Leucin
Peptide
Proteine
Albumin
Polylysin
Gelatine
Polyglykolamine
Aminopolyalkohole
Dextransulfate mit Aminogruppen
Antikörper
Immunoglobuline
II. Säuregruppenhaltige Verbindungen, wie z. B.: Carbonsäuren
Essigsäure
Propionsäure
Buttersäure
Valeriansäure
Capronsäure
Caprylsäure
Caprinsäure
Laurinsäure
Myristinsäure
Palmitinsäure
Stearinsäure
Ölsäure
Linolsäure
Linolensäure
Cyclohexancarbonsäure
Phenylessigsäure
Benzoylessigsäure
Chlorbenzoesäure
Brombenzoesäure
Nitrobenzoesäure
Ortho-Phthalsäure
Meta-Phthalsäure
Para-Phthalsäure
Salicylsäure
Hydroxybenzoesäure
Aminobenzoesäure
Methoxybenzoesäure
III. Hydroxygruppenhaltige Verbindungen, wie z. B.: Alkohole
Methanol
Ethanol
Propanol
Butanol
Pentanol
Hexanol
Heptanol
Octanol
Decanol
Dodecanol
Tetradecanol
Hexadecanol
Octadecanol
Isopropylalkohol
Isobutylalkohol
Isopentylalkohol
Cyclopentanol
Cyclohexanol
Crotylalkohol
Benzylalkohol
Phenylalkohol
Diphenylmethanol
Triphenylmethanol
Zimtalkohol
Ethylenglykol
1,3-Propandiol
Glycerin
Pentaerythrit
IV. Polymerisierfähige Substanzen, wie
α,β-ungesättigte Aldehyde, wie z. B.:
Acrolein
Crotonaldehyd
Propionaldehyd
α-substituierte Acroleinderivate, wie z. B.:
α-Methylacrolein
α-Chloroacrolein
α-Phenylacrolein
α-Ethylacrolein
α-Isopropylacrolein
α-n-Butylacrolein
α-n-Propylacrolein
Dialdehyde, wie z. B.:
Glutaraldehyd, Succinaldehyd oder deren Derivate oder deren Mischungen mit zur Copolymerisation fähigen Zusätzen, wie z. B.:
α-substituierten Acroleinen
β-substituierten Acroleinen
Ethylcyanacrylaten Methylcycanacrylaten
Butylcyanacrylaten
Hexylcycanacrylaten
Methylmetacrylaten
Vinylalkoholen
Acrylsäuren
Methacrylsäuren
Acrylsäurechloriden
Acrylnitril
Methacrylnitrilen
Acrylamiden
Substituierten Acrylamiden
Hydroxymethylmethacrylaten
Mesityloxid
Dimethylaminoethylmethacrylaten-2-Vinylpyridinen
N-vinyl-2-Pyrrolidinon

verwendet werden.

10. Mikropartikel nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie als Bio- oder Makromoleküle organ- oder gewebespezifische Verbindungen, wie zum Beispiel monoklonale Antikörper enthalten.

11. Mikropartikel nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie diagnostisch oder therapeutisch wirksame Bestandteile zur Diagnose und Therapie von Tumoren wie zum Beispiel Doxorubicin
Actinomycin
Magnetit
Mitomycin C
Triamcinolonenthalten.

12. Verfahren zur Herstellung von Mikropartikeln nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man eine 0 bis 40%, vorzugsweise 0,01 bis 10% w/v Tensid(e) und 0 bis 10% w/v diagnostisch oder therapeutisch wirksame Bestandteile und Gase oder leichtflüchtige Flüssigkeiten enthaltende wäßrige Lösung unter Mischen, bei einer Temperatur von -5° bis +80°C, vorzugsweise 0° bis 40°C, einem pH-Wert von 7 bis 14, vorzugsweise 9 bis 13, innerhalb von 1 Minute bis 10 Stunden, vorzugsweise 10 Minuten bis 2 Stunden, und gegebenenfalls unter Einleiten von Gas mit copolymerisierbarem/n Aldehyd(en) bis zu einer Konzentration bezogen auf die Reaktionsmischung von 0,1 bis 50%, vorzugsweise 3 bis 20% w/v, sowie mit copolymerisierbaren Zusätzen einer Konzentration bezogen auf die Reaktionslösung von 0 bis 20%, vorzugsweise 1 bis 5% w/v, mit Crosslinker(n) einer Konzentration bezogen auf die Reaktionsmischung von 0-5%, vorzugsweise 0,1 bis 1% w/v, umsetzt, anschließend - gegebenenfalls nach Reinigung, die so erhaltenen Mikropartikel mit einer wäßrigen Lösung, die - bezogen auf die Aldehydmenge - bis zu äquimolare Mengen an Kopplungsagenz sowie 0 bis 20%, vorzugsweise 0,01 bis 10% w/v Tensid(e) bezogen auf das Gesamtvolumen enthält, unter Rühren bis zu 3 Tagen, vorzugsweise bis zu 2 Tagen, bei Temperaturen von 0° bis 60°C, vorzugsweise 5° bis 30°C, bei einem pH-Wert von 3 bis 9, vorzugsweise 5 bis 8, umsetzt und - gewünschtenfalls nach Reinigung - diese gegebenenfalls an Bio- oder Makromoleküle bindet.

13. Verfahren zur Herstellung der pharmazeutischen Mittel nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man die in Wasser gelösten oder suspendierten Mikropartikel, gegebenenfalls mit den in der Galenik üblichen Zusätzen, in eine für die enterale oder perenterale Applikation geeignete Form bringt.

14. Mikropartikel nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie einen Durchmesser von 0,1 bis 40 µm haben.

15. Pharmazeutische Mittel nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Konzentration der Mikropartikel 1 µg bis 100 mg pro ml, vorzugsweise 10 µg bis 1 mg pro ml, galenischer Formulierung beträgt.