DE4014540A1 - Immune conjugates for prophylaxis and treatment of organ damage - caused by inflammation, esp. sepsis, contain monoclonal antibody, crosslinker and enzyme inhibitor of protein kinase C or calcium antagonist - Google Patents
Immune conjugates for prophylaxis and treatment of organ damage - caused by inflammation, esp. sepsis, contain monoclonal antibody, crosslinker and enzyme inhibitor of protein kinase C or calcium antagonistInfo
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Abstract
Description
Immunkonjugate zur Prophylaxe und Therapie von Organschäden bei ent zündlichen Prozessen.Immunoconjugates for the prophylaxis and therapy of organ damage in ent inflammatory processes.
Die Erfindung gehört zum Gebiet der Immunologie. Sie bezieht sich auf die Entwicklung und den Einsatz von konjugierten Antikörpern (Immunkonjuga ten), die mit einer hohen Selektivität bestimmte Zielzellen (Leukozyten, Endothelzellen) in ihrer Funktion und Stoffwechselaktivität beeinflussen.The invention belongs to the field of immunology. It relates to the Development and use of conjugated antibodies (immune conjuga ten), which target cells (leukocytes, Endothelial cells) in their function and metabolic activity.
Die Immunkonjugate dieser Erfindung interferieren mit der Leukozyten- Endothel-Interaktion und der Leukozyten-/Endothelzellfunktion und sollen auf diese Weise einen Großteil der organschädigenden Wirkungen dieses Teils des retikulo-endothelialen Systems bei entzündlichen Prozessen insbesondere bei einer Sepsis verhindern.The immunoconjugates of this invention interfere with the leukocyte Endothelial interaction and leukocyte / endothelial cell function and should this way a large part of the organ damaging effects of this part of the reticulo-endothelial system in particular in inflammatory processes prevent in case of sepsis.
Das Auftreten einer Sepsis und ein damit assoziiertes multiples Organ versagen gehören zu den meistgefürchteten Komplikationen nach operativen Eingriffen. Infektionen, Trauma, Verbrennungen, Pankreatitis und Aspiration, deren Behandlung ein noch ungelöstes Problem darstellt.The appearance of sepsis and an associated multiple organ failure are among the most feared complications after surgery Interventions. Infections, trauma, burns, pancreatitis and aspiration, the treatment of which is still an unsolved problem.
Trotz intensivmedizinischer Fortschritte konnte weder die Inzidenz noch die hohe Mortalität dieser Komplikationen in den letzten Jahren vermindert werden. Bei einer steigenden Anzahl von Operationen an Patienten mit hohem Alter und Risiko, in Kombination mit ausgedehnteren Eingriffen, muß daher mit einer Zunahme septischer Komplikationen gerechnet werden, wenn es nicht gelingt, bessere Methoden der Früherkennung und eine spezifischere Therapie zu entwickeln.Despite intensive medical advances, neither the incidence nor the high mortality rate of these complications has decreased in recent years will. With an increasing number of operations on patients with old age and risk, in combination with extensive interventions, must therefore an increase in septic complications can be expected if better methods of early detection and a more specific one fail To develop therapy.
In den letzten zwei Jahrzehnten wurden zwar einige neue, erfolgver sprechende Therapiekonzepte eingeführt, aber die Mortalitätsrate bei Sepsis mit Organversagen blieb mit circa 60-80% nach wie vor hoch. Die gegen wärtig zur Verfügung stehenden nicht chirurgischen, routinemäßig ein gesetzten Behandlungskonzepte der postoperativen Unterstützung von Atmung (Beatmung), Kreislauf (Katecholamine), Ernährungs-/Infusions therapie und Antibiose können als weitgehend ausgereizt angesehen werden.In the past two decades, some new, successful talking therapy concepts introduced, but the mortality rate in sepsis organ failure remained high at around 60-80%. The against currently available non-surgical, routine set treatment concepts for the postoperative support of Breathing (ventilation), circulation (catecholamines), nutritional / infusion Therapy and antibiosis can be seen as largely exhausted.
Der Einsatz generell immunsuppressiver Stoffe, die in das Immunsystem hemmend oder regulierend eingreifen (z. B. Kortikosteroide, Acetylsali cylsäure) ist verbreitet und zeigt die Bedeutung der Immunsuppression in der Behandlung von Intensivpatienten. Bei parenteraler Verabreichung dieser Medikamente rufen sie jedoch durch ihre unspezifische Wirkung vielfältige Organstörungen hervor, so daß insbesondere der Einsatz von Kortikosteroiden nach heutigen Erkenntnissen als obsolet gilt (Bihari DJ et al. (1982) B J Hosp Med (October):323). Aber auch der Nutzen von neueren Therapien wie PEEP-Beatmung (Pepe P et al. (1984) N Engl J Med 311:281), Infusionen von Prostaglandinen PGE₁/PGI₂ (Brockmann DC et al. (1986) Am Rev Respir Dis 134:885; Bihari DJ et al. (1988) Intensive Care Med 15:2), Hämofiltration und Plasmapherese konnte bisher nicht durch prospektive Studien belegt werden.The use of generally immunosuppressive substances in the immune system intervene to inhibit or regulate (e.g. corticosteroids, acetylsali cyclic acid) is common and shows the importance of immunosuppression in the treatment of intensive care patients. When administered parenterally However, due to their non-specific effects, they call medicines diverse Organ disorders, so that in particular the use of corticosteroids According to current knowledge, it is considered obsolete (Bihari DJ et al. (1982) B J Hosp Med (October): 323). But also the benefits of newer therapies such as PEEP ventilation (Pepe P et al. (1984) N Engl J Med 311: 281), infusions of Prostaglandins PGE₁ / PGI₂ (Brockmann DC et al. (1986) Am Rev Respir Dis 134: 885; Bihari DJ et al. (1988) Intensive Care Med 15: 2), hemofiltration and plasmapheresis has so far not been demonstrated by prospective studies will.
Die Gründe für die bisher noch unbefriedigenden Therapieerfolge in der Behandlung einer Sepsis liegen zum einen in der noch unvollständigen Kenntnis der auslösenden Pathomechanismen in ihrem zeitlichen Ablauf und zum anderen in den bisher nur beschränkt zur Verfügung stehenden Möglich keiten darin spezifisch einzugreifen. Die initialen Triggermechanismen bestehen im wesentlichen aus Veränderungen der Vasomotorik und der Kapillarpermeabilität, hervorgerufen durch die Freisetzung von Eicosanoiden (Demling RH et al. (1981) Am J Physiol 240:H348) - vor allem von Thromboxan und Leukotrienen - , Komplementspaltprodukten (Heideman M (1979) J Surg Res 26:670) und Histamin (Brigham KL et al (1980) J Appl Physiol 49:516). Diese Frühphasenreaktionen sind reversibler Natur und können daher abgemildert werden durch die Gabe von Cyclooxigenase hemmern (Adams T Jr et al. (1982) Circ shock 9:481; Huttemeier PC et al. (1982) Circ Res 50:688), Leukotrien-antagonisten und Antihistaminika (Brigham KL et al. (1980) J Appl Physiol 49:516).The reasons for the so far unsatisfactory therapeutic success in the Treatment of sepsis is, on the one hand, incomplete Knowledge of the triggering pathomechanisms in their chronological sequence and on the other hand, in the options available so far only to a limited extent to intervene specifically. The initial trigger mechanisms consist essentially of changes in the vasomotor system and the Capillary permeability caused by the release of eicosanoids (Demling RH et al. (1981) Am J Physiol 240: H348) - especially from Thromboxane and leukotrienes, complement cleavage products (Heideman M (1979) J Surg Res 26: 670) and histamine (Brigham KL et al (1980) J Appl Physiol 49: 516). These early phase reactions are reversible in nature and can therefore be mitigated by the administration of cyclooxygenase inhibitors (Adams T Jr et al. (1982) Circ shock 9: 481; Huttemeier PC et al. (1982) Circ Res 50: 688), leukotriene antagonists and antihistamines (Brigham KL et al. (1980) J Appl Physiol 49: 516).
Die Ausbildung irreversibler Endothel- und Parenchymschädigungen jedoch, die zum Vollbild therapieresistenter Organversagen führen, setzt nach heutiger Erkenntnis die Anwesenheit von aktivierten Leukozyten voraus.However, the formation of irreversible endothelial and parenchymal damage that lead to the full picture of therapy-resistant organ failure follows today's knowledge the presence of activated leukocytes ahead.
Eine Schlüsselstellung nehmen dabei sequestrierte Granulozyten und ge websständige Makrophagen ein, die durch eine überschießende, lokale Frei setzung von lysosomalen Enzymen, toxischen Sauerstoffradikalen und Ent zündungsmediatoren (Interleukin-1, TNF) das komplexe, gewebszerstörende Entzündungsgeschehen induzieren und perpetuieren. A key position is taken by sequestered granulocytes and ge web-like macrophages caused by excessive local free setting of lysosomal enzymes, toxic oxygen radicals and ent Ignition mediators (Interleukin-1, TNF) the complex, tissue-destroying Induce inflammation and perpetuate.
Das System der mononukleären Phagozyten in Leber und Lunge ist primär verantwortlich für die Klärung des Blutes von zirkulierenden Fremdpartikeln (z. B. Bakterien, Endotoxin).The system of mononuclear phagocytes in the liver and lungs is primary responsible for clearing the blood of circulating foreign particles (e.g. bacteria, endotoxin).
Aktivierte Makrophagen stellen somit ein primäres Induktionssystem dar, um neutrophile Granulozyten - die zweite zelluläre Komponente der unspezi fischen Immunabwehr - zu rekrutieren und zu aktivieren.Activated macrophages are therefore a primary induction system, around neutrophilic granulocytes - the second cellular component of the unspecific fishing immune defense - to recruit and activate.
Die Sequestrierung und das "Sticking" aktivierter Granulozyten in den Lungenkapillaren ist, wie eine Fülle von Studien belegt, eine entscheidende Grundvoraussetzung für die Ausbildung des Vollbildes eines akuten Lungen versagens (Tate RM et al. (1983) Am Rev Respir Dis 128:552; Meyrick B et al. (1983) Lab Clin Invest 48:458; Worthen GS et al. (1987) Am Rev Respir Dis 136:19; Weiland JE et al. (1986) Am Rev Respir Dis 133:218; Warshawski FJ et al. (1986) Am Rev Respir Dis 133:797).The sequestration and "sticking" of activated granulocytes in the Lung capillaries are, as a large number of studies have shown, a crucial one Basic requirement for the formation of the full image of an acute lung fail (Tate RM et al. (1983) Am Rev Respir Dis 128: 552; Meyrick B et al. (1983) Lab Clin Invest 48: 458; Worthen GS et al. (1987) On Rev Respir Dis 136: 19; Weiland JE et al. (1986) Am Rev Respir Dis 133: 218; Warshawski FJ et al. (1986) Am Rev Respir Dis 133: 797).
Die Arbeitsgruppen von Brigham, Malik und Hohn haben eindrucksvoll demonstriert, daß Tiere, die vor der Gabe von Endotoxin oder aktiviertem Komplement bzw. vor einer Mikroembolisation neutropenisch gemacht wurden, nicht mit einer Zunahme der Permeabilität und des pulmonal-arteriellen Druckes reagieren und kein letales Lungenversagen entwickeln (Barie PS et al. (1982) Am Rev Respir Dis 126:904; Heflin AC Jr et al. (1981) J Clin Invest 68:1253; Johnson A et al. (1982) J Appl Physiol 52:155; Hohn DC et al. (1980) Surgery 88:48). Für die massive, anhaltende Sequestrierung von Granulozyten bei septischen Prozessen sind zwei ineinandergreifende Patho mechanismen verantwortlich:The working groups from Brigham, Malik and Hohn have impressive demonstrates that animals pre-endotoxin or activated Complement or prior to microembolization were made neutropenic, not with an increase in permeability and pulmonary arterial Respond to pressure and do not develop fatal lung failure (Barie PS et al. (1982) Am Rev Respir Dis 126: 904; Heflin AC Jr et al. (1981) J Clin Invest 68: 1253; Johnson A et al. (1982) J Appl Physiol 52: 155; Hohn DC et al. (1980) Surgery 88:48). For massive, ongoing sequestration of Granulocytes in septic processes are two interlocking pathos mechanisms responsible:
Ein vermehrter, zielgerichteter Einstrom von Leukozyten in den Entzün dungsherd (Chemotaxie) und eine gesteigerte Adhärenz der Leukozyten am Gefäßendothel (Sticking).An increased, targeted influx of leukocytes into the inflammation focus of development (chemotaxy) and increased adherence of the leukocytes on Vascular endothelium (sticking).
Der chemotaktische Einstrom wird durch Faktoren (Chemotaxine) wie z. B. Komplementspaltprodukt C5a und Leukotrien LTB₄ vermittelt, die bei ent zündlichen und traumatischen Prozessen gebildet werden.The chemotactic inflow is influenced by factors (chemotaxins) such. B. Complement cleavage product C5a and leukotriene LTB₄ mediated, which at ent inflammatory and traumatic processes are formed.
Am zweiten Pathomechanismus in der Genese sepsis-induzierter Organ versagen, dem Leukozytensticking im kapillären Strombett, sind folgende Faktoren ursächlich beteiligt:On the second pathomechanism in the genesis of sepsis-induced organ failure, leukocyte sticking in the capillary flow bed, are the following Factors involved:
- 1. Eine reduzierte Strömungsgeschwindigkeit des Blutes, als Folge von initialen Störungen der Vasomotorik, von Mikrothromben oder - im Sinne eines circulus vitiosus - vom Leukozytensticking selbst (Lawrence MB et al. (1987) Blood 70:1284). 1. A reduced blood flow rate as a result of initial vasomotor disorders, microthrombi or - in the sense a vicious circle - from leukocyte stitching itself (Lawrence MB et al. (1987) Blood 70: 1284).
- 2. Ein verminderter, intrazellulärer Gehalt an c-AMP und eine dadurch reduzierte Cytosolviskosität in Reaktion auf Entzündungsmediatoren (Chopra J et al. (1988) Am Rev Respir Dis 138:915).2. A reduced, intracellular content of c-AMP and one as a result reduced cytosol viscosity in response to inflammatory mediators (Chopra J et al. (1988) Am Rev Respir Dis 138: 915).
- 3. Die Expression von adhärenzfördernden Glykoproteinstrukturen an der Granulozyten-/Monozyten-membran, insbesondere des CD11/w18-Antigens (CR3-Rezeptor), das neben dem Kontakt zum Kapillarendothel auch eine ge steigerte Opsonierung C3bi-beladener Partikel vermittelt (Pohlmann TH et al. (1986) J Immunol 136:4548).3. The expression of adherence-promoting glycoprotein structures on the granulocyte / monocyte membrane, in particular the CD11 / w18 antigen (CR3 receptor), which, in addition to contact with the capillary endothelium, also mediates increased opsonization of C3b i- laden particles (Pohlmann TH et al. (1986) J Immunol 136: 4548).
- 4. Die Expression von adhärenzfördernden Glykoproteinstrukturen an der Endothelzellmembran, ebenfalls in Reaktion auf Entzündungsmediatoren (TNF, Interleukin-1, GM-CSF) (Bevilacqua MP et al. (1985) J Clin Invest 76:2003).4. The expression of adherence-promoting glycoprotein structures on the Endothelial cell membrane, also in response to inflammatory mediators (TNF, Interleukin-1, GM-CSF) (Bevilacqua MP et al. (1985) J Clin Invest 76: 2003).
Die letzten beiden pathogenetisch relevanten Faktoren, die adhärenz vermittelnden Glykoproteinstrukturen an der Zellmembran, bilden gleichsam die eigentlichen Kontaktbrücken zwischen Leukozyten und Endothel.The last two pathogenetically relevant factors, the adherence mediating glycoprotein structures on the cell membrane, as it were the actual contact bridges between leukocytes and endothelium.
An der Zellmembran von Endothelien in vitro wurden adhärenzvermittelnde Glykoproteine nachgewiesen, die nach einer Stimulation durch Mediatoren (z. B. IL-1, TNF) de novo synthetisiert und mit einer lag-phase von 6-8 Stunden an der Zellmembran exprimiert werden (Bevilacqua MP et al. (1985) J Clin Invest 76:2003).Adherence mediators were found on the cell membrane of endothelia in vitro Glycoproteins detected after stimulation by mediators (e.g. IL-1, TNF) synthesized de novo and with a lag phase of 6-8 Hours are expressed on the cell membrane (Bevilacqua MP et al. (1985) J Clin Invest 76: 2003).
Auf der Zellmembran von Leukozyten ist vor allem das CD11/w18-Antigen eine wichtige Glykoproteinstruktur über die eine Adhärenz der Leukozyten am Endothel vermittelt wird. Das CD11/w18-Antigen - auch als CR3-Rezeptor bezeichnet - ist ein Heterotrimer aus CD11 und CDw18 Antigenen, das per manent an der Zellmembran von Granulozyten und Monozyten exprimiert ist und - ähnlich wie der FMLP-Rezeptor - in Reaktion auf Entzündungsmedia toren (z. B. TNF) innerhalb weniger Minuten vermehrt werden kann (Socinski MA et al. (1988) Blood 72:691; Berger M et al. (1984) J Clin Invest 74:1566).The CD11 / w18 antigen is primarily on the cell membrane of leukocytes an important glycoprotein structure about the adherence of the leukocytes is mediated at the endothelium. The CD11 / w18 antigen - also as a CR3 receptor called - is a heterotrimer of CD11 and CDw18 antigens, which by is expressed on the cell membrane of granulocytes and monocytes and - similar to the FMLP receptor - in response to inflammatory media tors (e.g. TNF) can be increased within a few minutes (Socinski MA et al. (1988) Blood 72: 691; Berger M et al. (1984) J Clin Invest 74: 1566).
Nach Untersuchungen in vitro, ist die Expression des CD11/w18-Antigens auf der Granulozyten- und Monozytenmembran eine Grundvoraussetzung für die Aggregation von Leukozyten und ihre Adhärenz an endothelialen Mono layern (Beatty PG et al. (1984) Lancet 1:535; Harlan JM et al (1985) Blood 66:167; Schwartz BR et al. (1985) Blood 65:1553).After in vitro studies, the expression of the CD11 / w18 antigen on the granulocyte and monocyte membrane a basic requirement for the aggregation of leukocytes and their adherence to endothelial mono layern (Beatty PG et al. (1984) Lancet 1: 535; Harlan JM et al (1985) Blood 66: 167; Schwartz BR et al. (1985) Blood 65: 1553).
Monoklonale Antikörper gegen Epitope dieses CD11/w18-Antigens können z. B. die Adhärenz von Granulozyten am Endothel um 70-90% hemmen (Marks RM et al. (1989) Nature 339:314). Monoclonal antibodies against epitopes of this CD11 / w18 antigen can e.g. B. inhibit the adherence of granulocytes to the endothelium by 70-90% (Marks RM et al. (1989) Nature 339: 314).
In eigenen Untersuchungen hat der Antragsteller nachweisen können, daß die CD11b-Expression durch C5a und PMA (Phorbol-myristat-acetat) stimuliert wird, und daß die Adhärenz von Neutrophilen an plasmabe schichteten Plastikoberflächen durch monoklonale Anti-CD11b-Antikörper um mehr als 50% reduziert werden kann. An Tiermodellen konnte man zeigen, daß durch die Gabe von monoklonalen Anti-CDw18-Antikörpern (MoAb 60.3) die Granulozytenadhärenz auch in vivo um 80-90% vermindert wird (Arfors KE et al. (1987) Blood 69-338). Durch die Vorgabe von monoklonalen Anti- CDw18 (MoAb 60.3) gelang es erstaunlicherweise auch die Letalität in einem hämorrhagischen Schockmodell (Kaninchen) hoch signifikant zu verringern (Vedder NB et al. (1988) J Clin Invest 81:939).The applicant has been able to demonstrate in its own investigations that CD11b expression by C5a and PMA (phorbol myristate acetate) is stimulated, and that the adherence of neutrophils to plasmabe layered plastic surfaces with anti-CD11b monoclonal antibodies can be reduced by more than 50%. On animal models you could show that by the administration of monoclonal anti-CDw18 antibodies (MoAb 60.3) granulocyte adherence is also reduced by 80-90% in vivo (Arfors KE et al. (1987) Blood 69-338). By specifying monoclonal anti CDw18 (MoAb 60.3) surprisingly also managed to achieve lethality in one hemorrhagic shock model (rabbit) highly significant decrease (Vedder NB et al. (1988) J Clin Invest 81: 939).
Durch den Einsatz dieser leukozytenspezifischen, monoklonalen Antikörper könnte somit erreicht werden, daß Leukozyten, die durch chemotaktische Stimuli (s. o.) in einen Infektionsherd gelockt werden, nicht über das CD11/w18-Antigen als Kontaktbrücke am Gefäßendothel des entzündeten Organs haften können.Through the use of these leukocyte-specific, monoclonal antibodies could thus be achieved that leukocytes by chemotactic Stimuli (see above) are lured into a focus of infection, not via the CD11 / w18 antigen as a contact bridge on the vascular endothelium of the inflamed Organ can adhere.
Dadurch würde das Ausmaß der zellulären Infiltration mit Leukozyten in diesen Organen und die resultierenden Entzündungsreaktionen, die eine lokale Gewebeschädigung hervorrufen können, deutlich reduziert werden.This would limit the extent of cellular leukocyte infiltration these organs and the resulting inflammatory reactions that a local tissue damage can be significantly reduced.
Es wurden neben dem CD11/w18-Antigen noch weitere Glykoprotein strukturen auf Leukozyten beschrieben, die eine Endotheladhärenz durch eine Interaktion mit gewebespezifischen Endotheldeterminanten vermitteln können (Lewinsohn et al (1987) J Immunol 138:4313).In addition to the CD11 / w18 antigen, there were other glycoproteins structures on leukocytes that show endothelial adherence mediate an interaction with tissue-specific endothelial determinants can (Lewinsohn et al (1987) J Immunol 138: 4313).
Diese verschiedenen, adhärenzfördernden Glykoproteinstrukturen an der Zellmembran des Endothels und der Leukozyten können daher nur durch die Gabe von mehreren monoklonalen Antikörpern ausreichend neutralisiert werden.These different, adherence-promoting glycoprotein structures on the The cell membrane of the endothelium and leukocytes can therefore only be removed through the Sufficiently neutralized administration of several monoclonal antibodies will.
Außerden wird sich bei Behandlungsbeginn in der Klinik nur ein Teil der Patienten im Frühstadium einer Sepsis befinden. Bereits ablaufende Entzündungsreaktionen des Endothels oder der Leukozyten, die schon am Gefäßendothel adhärieren oder das Gewebe infiltriert haben, können somit weder mit Hilfe der bisher verfügbaren und oben beschriebenen Antikörper noch mit anderen spezifisch an den Leukozyten oder am Endothel wirksamen Methoden verhindert oder supprimiert werden.In addition, only a part of the patient will be affected at the start of treatment in the clinic Patients are in the early stages of sepsis. Already expiring Inflammatory reactions of the endothelium or leukocytes, which are already on Vascular endothelium can adhere or have infiltrated the tissue neither with the help of the antibodies currently available and described above with others specifically active on the leukocytes or on the endothelium Methods are prevented or suppressed.
Der vorliegenden Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, sowohl die Adhärenz von Leukozyten im Entzündungsherd und damit verbundene Ent zündungsreaktionen zu hemmen, als auch spezifisch die Produktion und Freisetzung von schädlichen Entzündungsfaktoren (lysosomale Enzyme, Sauerstoffradikale, Eicosanoide, Zytokine) durch bereits adhärente Leuko zyten und entzündlich veränderte Gefäßendothelien zu reduzieren.The present invention is based, both the task Adherence of leukocytes in the focus of inflammation and associated ent to inhibit ignition reactions, as well as specifically the production and Release of harmful inflammatory factors (lysosomal enzymes, Oxygen radicals, eicosanoids, cytokines) through already adherent leuco to reduce cytogenesis and inflammatory changes in vascular endothelia.
Diese Erfindung soll also entzündliche Prozesse, insbesondere bei einer Sepsis, durch eine gezielte Immunsuppression, sowohl prophylaktisch und im Frühstadium, als auch im bereits voll ausgebildeten Entzündungsgeschehen vermindern.This invention is thus intended to be an inflammatory process, particularly in one Sepsis, through targeted immunosuppression, both prophylactically and in Early stage, as well as in the already fully developed inflammatory process Reduce.
Diese Aufgabe wird erfindungsgemäßig dadurch gelöst, daß mit Hilfe von Immunkonjugaten gemäß Patentanspruch, die spezifisch gegen Membran antigene von Leukozyten oder Endothelzellen sind, ein Hemmstoff (Proteinkinase c Inhibitor oder ein Calcium/Calmodulin-antagonist) über wiegend zu diesen Zielzellen gebracht wird, der nach Aufnahme in diese Zielzellen deren Produktion und Freisetzung von Entzündungsmediatoren verringern soll.This object is achieved in that with the help of Immunoconjugates according to claim, which are specific against membrane antigens from leukocytes or endothelial cells are an inhibitor (Protein kinase c inhibitor or a calcium / calmodulin antagonist) weighed is brought to these target cells, after being incorporated into them Target cells their production and release of inflammatory mediators should decrease.
Die Immunkonjugate dieser Erfindung unterscheiden sich von anderen, bisher bekannten Immunkonjugaten zur Tumorbehandlung (z. B. Moolten FL et al. (1975) J Natl Cancer Institute 55:473; Thorpe PE et al. (1978) Nature 271:752) durch einen völlig neuartigen Anwendungszweck, durch die verwendeten Hemmstoffe bzw. Toxine und die dadurch erreichte Wirkung und beeinflußte Zielzellenart.The immunoconjugates of this invention are different from others previously known immune conjugates for tumor treatment (e.g. Moolten FL et al. (1975) J Natl Cancer Institute 55: 473; Thorpe PE et al. (1978) Nature 271: 752) by a completely new application, by which inhibitors or toxins used and the effect achieved thereby and affected target cell type.
Die Bezeichnung "Immunkonjugat" und der Gegenstand dieser Erfindung bezieht sich auf kovalente Verbindungen aus monoklonalen Antikörpern, Crosslinkern und Hemmstoffen, die in der Lage sind, Leukozyten oder Endothelzellen spezifisch in ihrer Funktion zu beeinflussen und/oder in der Leukozyten-Endothel-Interaktion zu hemmen und durch die folgende Formel charakterisiert werden können:The term "immunoconjugate" and the subject of this invention refers to covalent compounds from monoclonal antibodies, Crosslinkers and inhibitors that are able to leukocytes or To influence endothelial cells specifically in their function and / or in the Inhibit leukocyte-endothelial interaction and by the following formula can be characterized:
moAb-(F₁-(CrosslinkerR)m-F₂-Hemmstoff)n (mit m=0-1 und n=1-10)moAb- (F₁- (CrosslinkerR) m -F₂ inhibitor) n (with m = 0-1 and n = 1-10)
Die Bezeichnung "moAb" (monoklonale Antikörper) bezieht sich dabei auf glykosylierte Proteine, die als Immunglobuline bezeichnet werden und sich spezifisch mit Antigenen verbinden. Sie bezieht sich auf alle Klassen von Immunglobulinen (IgG, IgM, IgD, IgA oder IgE) und auf alle Fragmente und chemischen Modifikationen von Immunglobulinen (z. B. Fab, F(ab′)2, Fab′, Fv), die leukozyten- oder endothel-assoziierte Membranantigene spezifisch binden.The term "moAb" (monoclonal antibodies) refers to glycosylated proteins called immunoglobulins and themselves specifically link with antigens. It applies to all classes of Immunoglobulins (IgG, IgM, IgD, IgA or IgE) and on all fragments and chemical modifications of immunoglobulins (e.g. Fab, F (ab ′) 2, Fab ′, Fv), the leukocyte- or endothelium-associated membrane antigens specifically tie.
Die verwendeten Antikörper dienen dabei gleichsam als Vehikel, um den kovalent angekoppelten Hemmstoff zu bestimmten Zielzellen (Leukozyten, Endothelien) zu bringen und die intrazelluläre Aufnahme (Phagozytose) des Hemmstoffes in die Zielzelle zu fördern.The antibodies used serve as a vehicle to the covalently coupled inhibitor to certain target cells (leukocytes, Endothelia) and the intracellular uptake (phagocytosis) of the To promote inhibitor into the target cell.
Das Verfahren zur Herstellung von monoklonalen Antikörpern durch die Hybridom-Technologie ist wohlbekannt und erfolgt nach der Methode von Köhler und Milstein (1975) Nature 356:497 und nach Levy und Dilley (1978) Proc Natl Acad Sci USA 75:4211.The process for the production of monoclonal antibodies by the Hybridoma technology is well known and uses the method of Köhler and Milstein (1975) Nature 356: 497 and after Levy and Dilley (1978) Proc Natl Acad Sci USA 75: 4211.
Dieser Erfindung entsprechend, sollen für diese Immunkonjugate bevorzugt Antikörper verwendet werden, die spezifisch für Leukozyten- oder Endothel-membranantigene sind, die an der Leukozyten-Endothel-Inter aktion beteiligt sind. Dazu gehören z. B. monoklonale Antikörper bzw. ihre Fab-Fragmente (s. o.) gegen das CD11/w18-Antigen auf Granulozyten und Monozyten. Die Verwendung von Fab-Fragmenten ist bei der Herstellung von Immunkonjugaten gemäß dieser Erfindung zu bevorzugen, da sie im Vergleich zu kompletten Antikörpern aufgrund des fehlenden Fc-Stückes kein Komple ment aktivieren, nicht über den Fc-Rezeptor an Zellmembranen binden und eine geringere Fremdantigenität beim Empfänger auslösen.According to this invention, should be preferred for these immunoconjugates Antibodies are used that are specific for leukocyte or Endothelial membrane antigens are attached to the leukocyte endothelium inter action are involved. These include e.g. B. monoclonal antibodies or their Fab fragments (see above) against the CD11 / w18 antigen on granulocytes and Monocytes. The use of Fab fragments is in the production of To prefer immunoconjugates according to this invention as compared no complete to complete antibodies due to the missing Fc piece activate, do not bind to cell membranes via the Fc receptor and trigger a lower level of foreign antigenicity in the recipient.
"Leukozyten" sind weiße Blutzellen, die Granulozyten, Monozyten/Makro phagen und Lymphozyten umfassen."Leukocytes" are white blood cells, the granulocytes, monocytes / macro phages and lymphocytes.
Die Bezeichnung "Antigen" bezieht sich auf Glykoprotein- oder Glyko peptid-strukturen, die auf der Zellmembran von Leukozyten oder von Endothelzellen exprimiert sind, oder nach einer Stimulation dieser Zellen exprimiert werden.The term "antigen" refers to glycoprotein or glyco peptide structures on the cell membrane of leukocytes or of Endothelial cells are expressed, or after stimulation of these cells be expressed.
Unter "CrosslinkerR" werden zweiwertige organische Reste von Kopplungsreagenzien verstanden, die in der Lage sind, Antikörper und Hemmstoff durch zwei, zum Teil unterschiedliche, funktionelle chemische Gruppen kovalent so zu koppeln, daß die Spezifität des Antikörpers erhalten bleibt und der Hemmstoff erst intrazellulär nach einer Freisetzung aus dem Immunkonjugat wirksam wird. Das heißt, die Kopplung zwischen Antikörper und Hemmstoff soll während der Zirkulation im Blut so lange stabil bleiben, bis die Immunkonjugate nach Bindung an die entsprechenden Membran rezeptoren der Zielzellen von diesen Zellen aufgenommen sind. Der Hemmstoff soll somit ganz überwiegend erst nach Aufnahme des Immun konjugates in der Zielzelle unter der Einwirkung von lysosomalen Enzymen freigesetzt werden.Under "CrosslinkerR" are divalent organic residues from Coupling reagents understood that are capable of antibodies and Inhibitor by two, partly different, functional chemical Coupling groups covalently so that the specificity of the antibody is maintained remains and the inhibitor only intracellularly after a release the immunoconjugate takes effect. That is, the coupling between antibodies and inhibitor is said to remain stable while circulating in the blood, until the immunoconjugates after binding to the corresponding membrane receptors of the target cells are taken up by these cells. The Inhibitor should therefore predominantly only after the immune system has been absorbed conjugates in the target cell under the influence of lysosomal enzymes to be released.
Um die Nebenwirkungen bei einem parenteralen Einsatz dieser Immun konjugate durch unspezifisch aufgenommene Hemmstoffe z. B. in Leber und Niere möglichst gering zu halten, ist es vorteilhaft, die Hemmstoffe gemäß Patentanspruch chemisch so zu derivatisieren, daß ihre Halbwertszeit im Blut auf Minuten bis Stunden begrenzt ist und unterhalb der Halbwertszeit der kovalenten Bindung an die verwendeten Crosslinker liegt.To reduce the side effects of parenteral use of this immune conjugates by unspecific inhibitors z. B. in liver and To keep the kidney as small as possible, it is advantageous to use the inhibitors according to To chemically derivatize the claim so that its half-life in Blood is limited to minutes to hours and below half-life the covalent bond to the crosslinker used.
Die "CrosslinkerR" können z. B. von Succinimidyl-4-(N-maleimidomethyl)- cyclohexan-1-carboxylat (SMCC), m-Maleimidobenzoyl-N-hydroxysulfosuccin imid-ester (MBS), Succinimidyl-4-(p-maleimidophenyl)butyrat (SMPB), N,N′-(1,2-Phenylen)dimaleimid, N,N′-(1,4-Phenylen)-dimaleimid, 4,4′- bis(Maleoyl-amino)-azobenzol, bis(N-Maleimodomethyl)-ester, N,N′-Alky lenbis(Bromacet-amid) oder N,N′-Alkylen-bis(Jodacetamid) abgeleitet sein.The "CrosslinkerR" can e.g. B. from succinimidyl-4- (N-maleimidomethyl) - cyclohexane-1-carboxylate (SMCC), m-maleimidobenzoyl-N-hydroxysulfosuccin imide ester (MBS), succinimidyl 4- (p-maleimidophenyl) butyrate (SMPB), N, N ′ - (1,2-phenylene) dimaleimide, N, N ′ - (1,4-phenylene) dimaleimide, 4,4′- bis (maleoyl-amino) -azobenzene, bis (N-maleimodomethyl) ester, N, N'-alky lenbis (bromoacet amide) or N, N'-alkylene bis (iodoacetamide).
"F₁" und "F₂" bezeichnen die Atome, über die das Immunglobulin "moAb" bzw. der "Hemmstoff" kovalent an den "CrosslinkerR" gebunden wird. Bei der vorzugsweisen Anwendung eines heterobifunktionellen Crosslinkers, mit zwei unterschiedlichen funktionellen Bindungsgruppen (um die Bindung von moAb- moAb-Konjugaten oder Hemmstoff-Hemmstoff-Konjugaten zu reduzieren), kann z. B. F₁ ein Schwefelatom aus einer durch Reduktion von Disulfid brücken resultierende Sulfhydrylgruppe des moAb sein und F₂ ein zur Amid-Bindung dienendes Stickstoffatom eines Staurosporine-derivates darstellen (s. Fig. 1)."F₁" and "F₂" denote the atoms via which the immunoglobulin "moAb" or the "inhibitor" is covalently bound to the "CrosslinkerR". In the preferred application of a heterobifunctional crosslinker, with two different functional binding groups (to reduce the binding of moAb-moAb conjugates or inhibitor-inhibitor conjugates), e.g. B. F₁ is a sulfur atom from a reduction by disulfide bridging resulting sulfhydryl group of the moAb and F₂ is an amide bond nitrogen atom of a staurosporine derivative (see FIG. 1).
F₁ kann aber auch ein Stickstoffatom sein, wenn die Kopplung an den Crosslinker über eine freie Aminogruppe des moAb erfolgt.F₁ can also be a nitrogen atom if the coupling to the Crosslinker via a free amino group of the moAb.
Die Verwendung von heterobifunktionellen Crosslinkern gestattet die schrittweise Herstellung von Immunkonjugaten nach bekannten Methoden, wobei z. B. zuerst der Hemmstoff und dann das moAb an den Crosslinker gebunden wird (Lomants AJ et al. (1976) Arch Biochem Biophys 167:311; Anjaneyula PSR et al. (1987) Int J Pep Pro Res 30:117; Partis MD et al. (1983) J Pro Chem 2:263; Weltman JK et al. (1983) Bio Techniques 1:148).The use of heterobifunctional crosslinkers allows the step-by-step production of immune conjugates according to known methods, where z. B. first the inhibitor and then the moAb to the crosslinker is bound (Lomants AJ et al. (1976) Arch Biochem Biophys 167: 311; Anjaneyula PSR et al. (1987) Int J Pep Pro Res 30: 117; Partis MD et al. (1983) J Pro Chem 2: 263; Weltman JK et al. (1983) Bio Techniques 1: 148).
Sollen bei Verwendung von heterobifunktionellen Crosslinkern, die sowohl mit freien Amino- als auch mit Sulfhydrylgruppen reagieren können, der moAb über eine freie Aminogruppe und der Hemmstoff über die freie Sulfhydrylgruppe gebunden werden, müssen im Immunglobulin moAb die möglichen freien Sulfhydrylgruppen z. B. durch N-Äthyl-maleimid geblockt werden. Soll die Bindung des Immunglobulins moAb an den Crosslinker über eine freie Sulfhydrylgruppe erfolgen, müssen im moAb freie SH-Gruppen durch eine Reduktion von Disulfid-Brücken erzeugt werden. Die Anzahl der frei verfügbaren SH-Gruppen kann z. B. nach Reaktion mit Ellman's Reagenz berechnet werden. Die Kopplungsreaktion an Maleimid-Crosslinker erfolgt dann unter neutralen bis leicht sauren pH-Bedingungen in einem SH-freien, entgasten Puffer innerhalb von Minuten.If heterobifunctional crosslinkers are used, both can react with free amino as well as with sulfhydryl groups moAb via a free amino group and the inhibitor via the free one Sulfhydryl group must be bound in the immunoglobulin moAb possible free sulfhydryl groups such. B. blocked by N-ethyl-maleimide will. Should the binding of the immunoglobulin moAb to the crosslinker a free sulfhydryl group must occur in the moAb free SH groups can be generated by reducing disulfide bridges. The number of freely available SH groups can e.g. B. after reaction with Ellman's reagent be calculated. The coupling reaction to maleimide crosslinkers takes place then under neutral to slightly acidic pH conditions in an SH-free, degas buffer in minutes.
Das Endprodukt (Immunkonjugat) wird, nach Abschluß der zweiten Kopplungsreaktion, vom Reaktionsgemisch durch Gelfiltration oder Dialyse isoliert.The end product (immunoconjugate) is, after completion of the second Coupling reaction, from the reaction mixture by gel filtration or dialysis isolated.
Da die Hemmstoffe eventuell auch direkt an die moAb, bzw. mehrere Hemmstoffmoleküle pro moAb gebunden werden können, wurden m=0-1 bzw. n=1-10 angegeben.Because the inhibitors may also go directly to the moAb, or several Inhibitor molecules can be bound per moAb, m = 0-1 or n = 1-10 specified.
Mit "Hemmstoff" wird eine Substanz aus der Klasse von Enzyminhibitoren oder Antagonisten bezeichnet, die"Inhibitor" is a substance from the class of enzyme inhibitors or antagonists called the
- 1. die intrazelluläre Proteinkinase c hemmen, oder1. inhibit the intracellular protein kinase c, or
- 2. einen intrazellulären Calciumanstieg oder das Calcium/Calmodulin-system inhibieren.2. an intracellular calcium increase or the calcium / calmodulin system inhibit.
Proteinkinase c Inhibitoren sind z. B. Staurosporine und seine möglichen Derivate, sowie Polymyxin B, H-7 und Chlorpromazine.Protein kinase c inhibitors are e.g. B. Staurosporine and its possible Derivatives, as well as polymyxin B, H-7 and chlorpromazine.
Zu den Calcium/Calmodulin-inhibitoren gehören z. B. die Substanzen Compound 48/80, Calmidazolium, W-7, Verapamil, Trifluoperazine, TMB-8.Calcium / calmodulin inhibitors include e.g. B. the substances Compound 48/80, Calmidazolium, W-7, Verapamil, Trifluoperazine, TMB-8.
Die Substanz Staurosporine ist ein Alkaloid und wird von Pilzen der Gattung Streptomyces produziert. Staurosporine wurde erstmals durch seine antibiotischen Eigenschaften bekannt (Omura S et al (1977), J Antibiot 30:275) und gilt heute als der potenteste (IC50=2,7nM) Proteinkinase c Inhibitor (Tamaoki T et al. (1986) Biochem Biophys Res Commun 135:387). Darüber hinaus wird berichtet, daß diese Substanz auch c-AMP-abhängige Proteinkinase hemmt.The substance staurosporine is an alkaloid and is used by fungi Genus Streptomyces produced. Staurosporine was first created by his antibiotic properties known (Omura S et al (1977), J Antibiot 30: 275) and is considered the most potent (IC50 = 2.7nM) protein kinase c Inhibitor (Tamaoki T et al. (1986) Biochem Biophys Res Commun 135: 387). In addition, it is reported that this substance is also c-AMP-dependent Protein kinase inhibits.
Die intrazelluläre Aufnahme von circa 2000 Molekülen Staurosporine pro Zielzelle (10 picoliter) würden z. B. ausreichen, um die Aktivität der intrazellulären Proteinkinase c um circa 50% zu hemmen.The intracellular uptake of approximately 2000 molecules of staurosporine per Target cell (10 picoliter) would e.g. B. sufficient to the activity of inhibit intracellular protein kinase c by approximately 50%.
Durch die Hemmung dieses wichtigen Schlüsselenzyms wird nachfolgend die Aktivierung (Phosphorylierung) einer Reihe von weiteren Enzymen (NADPH- abhängige Membranoxidase, Phospholipase A₂, etc.) reduziert, die eine Produktion von Entzündungsmediatoren (Sauerstoffradikale, Leukotriene) induzieren.By inhibiting this important key enzyme, the Activation (phosphorylation) of a number of other enzymes (NADPH- dependent membrane oxidase, phospholipase A₂, etc.) reduced, the one Production of inflammatory mediators (oxygen radicals, leukotrienes) induce.
Die so definierten Immunkonjugate dieser Erfindung sollen vorzugsweise am Menschen und Säugetieren bei geeigneter Indikation und unter Antibiotika schutz des Empfängers, um die Ausbreitung einer bakteriellen Infektion zu verhindern, auf parenteralem Weg eingesetzt werden.The immunoconjugates of this invention defined in this way should preferably be on Humans and mammals with suitable indication and under antibiotics protect the recipient to prevent the spread of a bacterial infection prevent being used parenterally.
Dazu muß das Immunkonjugat in eine injizierbare Form (Lösung, Suspension, Emulsion) mit Hilfe von akzeptablen Trägersubstanzen (z. B. elektrolyt haltige oder proteinhaltige wäßrige Lösungen oder ölhaltige Emulsionen) gebracht werden. Die Trägerlösung kann eventuell Additive enthalten (Puffer, Konservierungsstoffe), die die Haltbarkeit und die Isotonizität dieser Immunkonjugatlösung gewährleisten.For this, the immune conjugate must be in an injectable form (solution, suspension, Emulsion) with the help of acceptable carrier substances (e.g. electrolyte containing or protein-containing aqueous solutions or oil-containing emulsions) to be brought. The carrier solution may contain additives (Buffers, preservatives) that have durability and isotonicity ensure this immunoconjugate solution.
Die Immunkonjugate sind mit definierter Konzentration (z. B. 0,1-50 mg/ml) in bestimmten Zeitintervallen zu infundieren. Die dadurch erreichte Kon zentration im Blut soll dabei so hoch wie nötig sein, daß ausreichend viele Immunkonjugate von den zirkulierenden und adhärenten Zielzellen (Leukozyten, Endothel) aufgenommen werden, um den erwünschten Hemm effekt zu erreichen, aber so niedrig wie möglich sein, um toxische Neben wirkungen (Leber- und Nierenschäden) durch eine unspezifische Aufnahme des Hemmstoffes gering zu halten.The immune conjugates are at a defined concentration (e.g. 0.1-50 mg / ml) infuse at certain time intervals. The Kon concentration in the blood should be as high as necessary so that enough Immunoconjugates from circulating and adherent target cells (Leukocytes, endothelium) are added to the desired inhibitor effect, but as low as possible to avoid toxic side effects effects (liver and kidney damage) due to non-specific absorption to keep the inhibitor low.
Der Einsatz von Immunkonjugaten dieser Erfindung ermöglicht somit erstmals fulminante Entzündungsreaktionen im Organismus, die zu Funk tionsstörungen und Schädigungen von Organen führen können, selektiv und gezielt zu vermindern, durch eine Hemmung bestimmter Zellgruppen (Leukozyten, Endothel), die an der Ausbildung dieser Entzündungsreaktionen beteiligt sind.The use of immunoconjugates of this invention thus enables for the first time fulminant inflammatory reactions in the organism that lead to radio selective disorders and damage to organs targeted reduction by inhibiting certain cell groups (Leukocytes, endothelium) involved in the formation of these inflammatory reactions involved.
Das Alkaloid Staurosporine, dessen Strukturformel in Zeichnung 1 (s. Fig. 1) wiedergegeben wird, kann auf verschiedene Weise derivatisiert werden, um mit Hilfe eines Crosslinkers an einen monoklonalen Antikörper (oder ein Fragment davon) gegen Leukozyten- oder Endothelantigene gemäß dem unten aufgeführten Patentanspruch kovalent gekoppelt zu werden.The alkaloid staurosporine, the structural formula of which is shown in drawing 1 (see FIG. 1), can be derivatized in various ways in order to crosslink to a monoclonal antibody (or a fragment thereof) against leukocyte or endothelial antigens according to the list below Claim to be covalently coupled.
Angegeben wird hier (s. Fig. 1) die reduktive Aminierung der Carbonyl gruppe von Staurosporine zum primären Amin:The reductive amination of the carbonyl group from staurosporins to the primary amine is given here (see FIG. 1):
1 mol Staurosporine wird in 500 ml Methanol gelöst, das bei 10°C mit Ammoniak gesättigt wurde (etwa 5,5 mol). Im Schüttelautoklaven wird dann nach Zugabe von Raney-Nickel aus 30 g Legierung bei 90°C und 100 atm hydriert. Anschließend wird entspannt und der Katalysator abfiltriert und der überschüssige Ammoniak abdestilliert. Der Überstand wird angesäuert, die nichtbasischen Verbindungen ausgeäthert und die Ätherlösung an schließend über Ätzkali getrocknet. Nach Verdampfen des Lösungsmittels wird über eine 20-cm-Vigreux-Kolonne destilliert.1 mol of staurosporine is dissolved in 500 ml of methanol, which at 10 ° C with Ammonia was saturated (about 5.5 mol). Then in the shake autoclave after adding Raney nickel made of 30 g alloy at 90 ° C and 100 atm hydrated. The pressure is then released and the catalyst is filtered off and the excess ammonia is distilled off. The supernatant is acidified, exhaled the non-basic compounds and the etheric solution finally dried over caustic potash. After evaporation of the solvent is distilled over a 20 cm Vigreux column.
Nach der Derivatisierung zum primären Amin muß geprüft werden, wie hoch die inhibierende Wirkung des erhaltenen Staurosporine-derivates auf die Proteinkinase c ist.After derivatization to the primary amine, it must be checked how high the inhibitory effect of the staurosporine derivative obtained on the Protein kinase c is.
Staurosporine kann aber auch über eine mildere Reaktion (Cyanhydrin synthese und anschließende Bouveault-Blanc Reduktion) aminiert werden, falls die Reaktionsbedingungen für das Staurosporine zu drastisch sind und die Aktivität des Endprodukts aufgrund dessen zu niedrig ist.Staurosporine can also have a milder reaction (cyanohydrin synthesis and subsequent Bouveault-Blanc reduction), if the reaction conditions for the staurosporine are too drastic and the activity of the end product is too low due to this.
Ein aminiertes Staurosporine-derivat (s. Fig. 1) wird in einem ersten Reaktionsschritt über seine primäre Aminogruppe in einem leicht alkalischen Puffer (pH 7,0-7,5), der keine freien Sulfhydryl- oder Aminogruppen enthält, an die N-hydroxysuccinimid-Gruppe des heterobifunktionellen Crosslinkers Succinimidyl-4-(p-maleimidophenyl)butyrat (SMPB) gekoppelt (s. Fig. 2). Das molare Staurosporine : SMPB Verhältnis im Reaktionsgemisch be trägt dabei etwa 1 : 10.An aminated staurosporine derivative (see FIG. 1) is in a first reaction step via the primary amino group in a slightly alkaline buffer (pH 7.0-7.5), which contains no free sulfhydryl or amino groups, to the N- hydroxysuccinimide group of the heterobifunctional crosslinker succinimidyl 4- (p-maleimidophenyl) butyrate (SMPB) coupled (see FIG. 2). The molar staurosporine: SMPB ratio in the reaction mixture is about 1:10.
Überschüssiger Crosslinker wird vom konjugierten Staurosporine-derivat durch Gelfiltration entfernt.Excess crosslinker is derived from the conjugated staurosporine derivative removed by gel filtration.
Vor dem zweiten Reaktionsschritt muß der verwendete Anti-MAC1- Antikörper (Anti-CD11b) mit 25 mM Dithiothreitol (DTT) in 0,01 M Phosphat- Puffer (PBS) (pH 7,5) reduziert werden, um freie Sulfhydryl-Gruppen zu erzeugen. Der Überschuß an DTT wird ebenfalls durch Gelfiltration entfernt.Before the second reaction step, the anti-MAC1- Antibody (anti-CD11b) with 25 mM dithiothreitol (DTT) in 0.01 M phosphate Buffer (PBS) (pH 7.5) can be reduced to free sulfhydryl groups produce. The excess DTT is also removed by gel filtration.
Der zweite Reaktionsschritt, die Thioätherbindung des Antikörpers an den Crosslinker SMPB über eine freie Sulfhydrylgruppe, zur Herstellung des kompletten Immunkonjugates erfolgt dann unter leicht sauren Bedingungen (pH 6,5-7,0) in einem entgasten Puffer in 15 Minuten bei Raumtemperatur (s. Fig. 3). Die Isolierung des fertigen Immunkonjugates vom Reaktionsgemisch kann ebenfalls durch Gelfiltration vorgenommen werden.The second reaction step, the thioether binding of the antibody to the crosslinker SMPB via a free sulfhydryl group, to produce the complete immune conjugate is then carried out under slightly acidic conditions (pH 6.5-7.0) in a degassed buffer in 15 minutes at room temperature (see. Fig. 3). The finished immune conjugate can also be isolated from the reaction mixture by gel filtration.
Vor dem Einsatz des Immunkonjugates müssen dann die funktionelle Aktivität des konjugierten Antikörpers und die molaren Verhältnisse von moAb zu konjugiertem Staurosporine geprüft werden.Before using the immunoconjugate, the functional Activity of the conjugated antibody and the molar ratios of moAb to be conjugated staurosporine.
Die erhaltenen Immunkonjugate sind biochemisch im Blut relativ stabil, im Inneren der Zielzellen (Leukozyten) jedoch so labil (lysosomale Enzyme), daß gewährleistet ist, daß die so gekoppelten Hemmstoffe sich im Zellinneren vom monoklonalen Antikörper (moAb) lösen können.The immune conjugates obtained are relatively stable in the blood biochemically Inside the target cells (leukocytes), however, so unstable (lysosomal enzymes) that it is ensured that the inhibitors thus coupled are inside the cell from the monoclonal antibody (moAb).
Dadurch kann bei parenteraler Anwendung erreicht werden, daß bei niedrigen Blutkonzentrationen dieses Immunkonjugates ein überwiegend spezifischer Effekt auf die Zielzellen ausgeübt wird und die unspezifischen Nebenwirkungen (Leber- oder Nierenschaden) voraussichtlich gering gehalten werden. Vorteilhaft wären - wie bereits oben erwähnt - Hemmstoffe mit sehr kurzer Halbwertszeit im Vergleich zur Halbwertszeit der kovalenten Bindung an die verwendeten Crosslinker.This can be achieved with parenteral use that at low blood concentrations of this immunoconjugate predominantly specific effect is exerted on the target cells and the non-specific ones Side effects (liver or kidney damage) are expected to be kept to a minimum will. As already mentioned above, inhibitors with very short half-life compared to the half-life of the covalent bond to the crosslinker used.
Claims (12)
- 1. die intrazelluläre Proteinkinase c hemmen, oder
- 2. einen intrazellulären Calciumanstieg oder das Calcium/Calmodulin-system inhibieren.
- 1. inhibit the intracellular protein kinase c, or
- 2. inhibit an intracellular calcium increase or the calcium / calmodulin system.
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| DE4014540A DE4014540A1 (en) | 1990-05-07 | 1990-05-07 | Immune conjugates for prophylaxis and treatment of organ damage - caused by inflammation, esp. sepsis, contain monoclonal antibody, crosslinker and enzyme inhibitor of protein kinase C or calcium antagonist |
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