DE4135404A1

DE4135404A1 - Stabiles fluessiges kontroll- bzw. eichserum fuer die klinische diagnostik

Info

Publication number: DE4135404A1
Application number: DE4135404A
Authority: DE
Inventors: Peter Dipl Chem In Stegmueller; Thomas Dipl Biol Dr Wild
Original assignee: Boehringer Mannheim GmbH
Current assignee: Roche Diagnostics GmbH
Priority date: 1991-10-26
Filing date: 1991-10-26
Publication date: 1993-04-29
Also published as: ES2113909T3; EP0539839B1; ATE162312T1; DE59209131D1; EP0539839A1; JPH06294799A; US5281536A; JPH0827290B2

Description

Gegenstand der Erfindung ist ein stabiles flüssiges Kontroll- bzw. Eichserum für die klinische Diagnostik, das ein flüssig stabiles Bilirubinderivat enthält.

Zur Richtigkeits- und Präzisionskontrolle von Bestimmungsmetho den und zum Kalibrieren von Analysenautomaten werden üblicher weise Kontroll- oder Eichseren oder als Kontroll- bzw. Eich serum genannte Zusammensetzungen eingesetzt, die die zu bestim menden Parameter in bekannten, genau festgelegten Konzen trationen enthalten. Man unterscheidet Spezialkontroll- bzw. Eichseren, die zur Kontrolle bzw. zur Eichung von ganz bestimm ten Parametern oder einer begrenzten, meist zusammengehörigen Gruppe von Parametern dienen und sogenannte Universalkontroll- bzw. Eichseren, die zur Kontrolle bzw. zum Eichen möglichst aller gängigen Parameter nach sämtlichen in der Praxis übli cherweise durchgeführten Bestimmungsmethoden einsetzbar sind.

Die Anforderungen, die an solche Produkte im klinisch/chemi schen Routinebetrieb gestellt werden, umfassen:

- Eine genau bekannte Konzentration der Meßparameter muß ein gehalten werden.
- Die Konzentrationen müssen im medizinisch relevanten Meßbe reich (normal bzw. pathologisch) liegen.
- Die Handhabung der Kontroll- bzw. Eichseren muß einfach sein.
- Die Kontroll- bzw. Eichseren müssen eine möglichst lange Haltbarkeit besitzen.

Bei einem Einsatz des Kontroll- bzw. Eichserums bei Analysen automaten werden hohe Anforderungen besonders an die beiden letzten Punkte, Handhabung und Haltbarkeit, gestellt. Bisher werden Kontroll- bzw. Eichseren meist in lyophilisierter Form angeboten, wodurch eine akzeptable Haltbarkeit vor der Rekon stitution gewährleistet wird. Diese Methode ist aber aufwendig und verlangt vor Gebrauch eine Rekonstitution mit einer Rekon stitutionsflüssigkeit. Lyophilisierte Produkte neigen danach oft zur Trübungsbildung, wodurch Fehler in der klinischen Diagnostik auftreten können, da viele Nachweismethoden kolori metrische Auswertungen verlangen. Auch können Fehler durch ungenaues Pipettieren der Rekonstitutionsflüssigkeit einge schleppt werden. Nach der Rekonstitution sind diese Kontroll- bzw. Eichseren meist nur einige Stunden bei Raumtemperatur haltbar, so daß sie täglich neu hergestellt werden müssen. Für eine einfache Handhabung ist es daher wünschenswert, ein flüs siges Kontroll- bzw. Eichserum zur Verfügung zu stellen, das ohne weitere Aufarbeitung durch das Bedienungspersonal der Analysenautomaten nutzbar ist.

In der US 38 76 375 wird eine flüssige biologische Zusammen setzung, die als Referenzkontrolle bei diagnostischen Analysen eingesetzt werden kann, beschrieben. Zur Stabilisierung werden 20-40% Alkylenpolyole mit 2-5 C-Atomen, wie Ethylenglycol, Propylenglycol, Butylenglycol, Pentandiol und Glycerin zuge setzt. Das Kontroll- bzw. Eichserum kann durch die Zugabe derart hoher Konzentrationen an Polyolen viskos werden. Dies kann bei den Pump- und Pipettierschritten der automatischen Analyse zu Schwierigkeiten und Ungenauigkeiten führen, weshalb die Zugabe hoher Konzentrationen an Alkylenpolyolen nicht zweckmäßig ist.

Bei der Herstellung eines flüssigstabilen Kontroll- bzw. Eich serums ist das Substrat Bilirubin meist der stabilitätslimi tierende Faktor. Der Bilirubingehalt wird bei der Diagnose der Hyperbilirubinämie bestimmt. Im lyophilisierten Zustand ist Bilirubin ausreichend stabil, während nach der Rekonstitution die Haltbarkeit bei Zimmertemperatur nur wenige Stunden, bei -20°C ca. zwei Wochen beträgt.

In US 43 44 864 wird die Stabilisierung von konjugiertem Bili rubin durch Zusatz einer Sulfhydrylkomponente und eines Chela tors bei einem pH von 8,2-9,2 in Blutserum beschrieben. Bei der Herstellung von Universalkontroll- bzw. Eichseren ist es allerdings vorteilhaft, so wenig wie möglich Zusatzstoffe zu verwenden. Ein Stabilisator für einen bestimmten Parameter kann sich oft bei der Bestimmung anderer Parameter störend auswir ken. Reduzierende SH-Verbindungen können z. B. bei der anschließenden enzymatischen Umsetzung stören.

Aufgabe war es daher, ein flüssiges Kontroll- bzw. Eichserum bereitzustellen, das bei der Bestimmung von mehreren Parametern der klinischen Diagnostik eingesetzt werden kann und Bilirubin in einer stabilisierten Form enthält. Die Aufgabe wird durch die in den Ansprüchen näher charakterisierte Erfindung gelöst. Im wesentlichen wird die Aufgabe dadurch gelöst, daß das Kontroll- bzw. Eichserum ein flüssigstabiles Bilirubinderivat enthält.

Gegenstand der Erfindung ist somit ein stabiles flüssiges Kontroll- bzw. Eichserum für die klinische Diagnostik, das ein flüssigstabiles Bilirubinderivat enthält.

Weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Her stellung eines stabilen flüssigen Kontroll- bzw. Eichserums für die klinische Diagnostik, das ein flüssigstabiles Bilirubin derivat enthält, ausgehend von einer Rinderserumalbuminlösung, die mit den gewünschten Parametern bis zur gewünschten Para meterkonzentration vermischt wird, wobei gegebenenfalls Hilfs mittel zugesetzt werden.

Weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung eines flüssigstabilen Bilirubinderivates in einem Kontroll- bzw. Eichserum. Das Bilirubinderivat dient zur Erhöhung der Lager stabilität des Kontroll- bzw. Eichserums.

Das erfindungsgemäße stabile flüssige Kontroll- bzw. Eichserum enthält für die klinische Diagnostik wichtige Analytparameter. Bicarbonat, Bilirubin, Cholesterin, Creatinin, Eisen, Glucose, Harnsäure, Harnstoff, Lactat, Triglyceride, Phospholipide, Gesamtprotein, Albumin, Calcium, Phosphat, Magnesium, Natrium, Kalium und Chlorid können als Parameter vorkommen. Gegebenen falls können noch klinisch relevante Enzyme enthalten sein.

Die Parameterkonzentrationen liegen vorzugsweise im klinischen Entscheidungsbereich, d. h. in Konzentrationsbereichen, die in normalen oder pathologischen Patientenseren auftreten. Die Konzentrationen der einzelnen Parameter können selbstverständ lich von Charge zu Charge in den in der Tabelle 1 angegebenen Grenzen variieren.

Konzentrationsbereiche für die einzelnen Parameter eines flüssigen Kontroll- bzw. Eichserums
Substanz
Konzentrationsbereich [mg/dl]
Bicarbonat
268-317
Bilirubin	0,25-6,00
Cholesterin	125-200
Creatinin	0,5-3,0
Eisen	0,06-0,3
Glucose	70-210
Harnsäure	2,5-8,5
Harnstoff	10-150
Lactat	6-22
Triglyceride	70-210
Phospholipide	150-280
Gesamtprotein	5000-9000
Albumin	3500-7000
Calcium	9-14
Phosphat	2,5-7
Magnesium	1,8-4,5
Natrium	260-360
Kalium	14-22,5
Chlorid	280-385

Das erfindungsgemäße stabile flüssige Kontroll- bzw. Eichserum enthält als Parameter für die Bilirubinbestimmung nicht freies Bilirubin selbst, sondern ein Bilirubinderivat. Die erfindungs gemäßen Bilirubinderivate zeigten überraschenderweise eine erheblich höhere Stabilität bei flüssiger Aufbewahrung als underivatisiertes Bilirubin. Als Ausgangsverbindung zur Her stellung der Bilirubinderivate können freies Bilirubin, dessen lösliche Alkalisalze, z. B. Natrium-Bilirubinat, Bilirubinester oder Bilirubinamide verwendet werden. Wesentlich für die Stabi lisierung der Bilirubinderivate ist, daß an die in Position 18 am Tetrapyrrolring vorhandene Vinylgruppe ein Alkohol oder ein Mercaptan, d. h. eine Thiolgruppe enthaltende Verbindung, addiert wird. Beispielsweise können Thioglykolsäure, Methyl thioglykolsäure, 2-Mercaptoethanol oder N-Acetyl-L-Cystein addiert werden. Solche Bilirubinderivate sind aus Experientia 28 (1972), 379-380 bekannt. Die erfindungsgemäß im Kontroll- bzw. Eichserum einsetzbaren Bilirubinderivate werden durch die folgende allgemeine Formel (I) wiedergegeben:

wobei
X Sauerstoff oder Schwefel,
R eine ein- oder mehrfach durch Carboxy, Alkoxycarbonyl, Hydroxy, Mercapto, Amino, Alkylamino, Dialkylamino oder Alkylcarbonylamino substituierte C₁-C₆-Alkylgruppe und
Y Amino, Alkylamino, Dialkylamino, Hydroxy, Alkoxy oder deren Alkalisalze bedeuten.

Ganz besonders bevorzugt wird Bilirubinthioglycolsäureether eingesetzt.

Das erfindungsgemäße flüssige Kontroll- bzw. Eichserum kann neben den Analytparametern noch zusätzliche Hilfsstoffe, bei spielsweise weitere Analytstabilisatoren, Detergenzien und Kon servierungsstoffe enthalten. Dabei ist bei dem Zusatz dieser Hilfsstoffe stets darauf zu achten, daß die Messung bestimmter Parameter nicht störend beeinflußt wird. Die Zugabe von Ascor binsäure bevorzugt in Konzentrationen von 0,5 bis 1,5 mg/dl, besonders bevorzugt 0,9 mg/dl, führt beispielsweise zu einer weiteren Steigerung der Stabilität der Bilirubinderivate. Durch eine Aufbewahrung des Reagenzes unter einer Schutzgasatmosphä re, besonders einer N₂-Schutzgasatmosphäre, in Kombination mit dem Ascorbinsäurezusatz, wird eine besonders hohe Stabilität des Bilirubinderivats erzielt. Die Schutzgasatmosphäre wirkt sich außer auf die Stabilität des Bilirubinderivats sehr günstig auf die Stabilität anderer Parameter, wie z. B. Harn säure aus. Die Stabilisierung des Bicarbonatwertes wird durch Zusatz von ca. 0,3 Vol.-% CO₂ zum N₂-Inertgas erreicht. Neben diesen Analytstabilisatoren können noch weitere einzelne analyt stabilisierende Hilfsstoffe zugesetzt werden. So wirkt sich zum Beispiel ein Zusatz von EDTA stabilisierend auf den Eisenwert aus. Die Zugabe einer verdünnten Fe-Lösung bei der Herstellung des Kontroll- bzw. Eichserums in Gegenwart von EDTA, bevorzugt in einem Verhältnis von 1 : 1,1 (Fe/EDTA), führt zu stabilisier ten Fe-Komplexen, die nicht von Lipoproteinen bzw. Rinderserum albumin zerstört werden.

Die Zugabe von Creatin wirkt sich positiv auf die Stabilität des Parameters Creatinin aus, da die Creatinin-Hydrolyse hier durch verhindert oder zumindest stark vermindert wird.

Für den Triglycerid-Parameter wird in bisher gebräuchlichen Kontroll- bzw. Eichseren eine Eigelbfraktion eingesetzt. Trü bungen sind bei einer solchen Zusammensetzung nicht auszu schließen. Durch den Ersatz dieser Eigelbfraktion durch Glycerin als Triglycerid kann diese potentielle Störung gänz lich vermieden werden. Glycerin zeigt auch bei längerer Lage rung keine Neigung zur Trübungsbildung und ist daher für den Einsatz im erfindungsgemäßen flüssigen Kontroll- bzw. Eichserum vorzüglich geeignet.

Als Konservierungsstoffe sind prinzipiell bekannte Konservie rungsstoffe zu verwenden. Es muß allerdings darauf geachtet werden, daß die Messung der Parameter nicht negativ beeinflußt wird. Vorteilhaft für die Konservierung des erfindungsgemäßen flüssigen Kontroll- bzw. Eichserums hat sich eine Kombination von fungiziden und bakteriziden Konservierungsmitteln erwiesen. Besonders bevorzugt ist die Verwendung von Gentamycin in einer Konzentration von 100-150 µg/ml in Kombination mit 2,4- Dichlorbenzylalkohol in einer Konzentration von 150-250 mg/dl. Die Verwendung einer Schutzgasatmosphäre besitzt weiter hin einen positiven Effekt auf die Konservierung.

Der pH-Wert des flüssigen Kontroll- bzw. Eichserums wird durch Verwendung eines Puffers auf einen schwach alkalischen Wert eingestellt, bevorzugt auf einen pH von 8,2 bis 8,4. Die Ver wendung von 20-100 mM TAPS-Puffer, insbesondere 50 mM, pH 8,3, hat sich günstig erwiesen. Der leicht alkalische pH wirkt sich positiv auf die Stabilität des Kontroll- bzw. Eichserums aus, da ein Pilzwachstum gehemmt wird. Hierdurch ist es möglich, die Konzentration des Fungizids - falls dieser Hilfsstoff erforder lich erscheint - gering zu halten und Störungen bei der Bestim mung der Parameter auszuschließen.

Zur Herstellung des erfindungsgemäßen stabilen flüssigen Kontroll- bzw. Eichserums geht man bevorzugt von einer Serum albuminlösung aus. Besonders bevorzugt wird eine Rinderserum albuminlösung anstelle des bisher üblichen Humanserums eingesetzt. Die Rinderserumalbuminlösung zeigt den Vorteil, daß sie nicht infektiös ist, vor allem im Hinblick auf Infektionen mit Hepatitis- und HIV-Viren. Weiterhin ermöglicht die Verwen dung einer Rinderserumalbuminlösung im Vergleich zum Humanserum eine genau definierte und reproduzierbare Grundrezeptur mit wesentlich geringeren Chargenschwankungen. In dieser Grund matrix wird in üblicher Weise die gewünschte Parameterkonzen tration eingestellt.

Zur Herstellung kann ebenfalls von einem trockenen Gemisch, das die gewünschten Analytparameter einschließlich des Bilirubin derivats der Formel (I) enthält, ausgegangen werden. Dieses Gemisch wird bis zur gewünschten Analytparameterkonzentration in Wasser gelöst.

Das erfindungsgemäße flüssige Kontroll- bzw. Eichserum ist im ungeöffneten Zustand bei 4°C über 12 Monate hinaus stabil. Durch eine Aufbewahrung bei -20°C kann diese Stabilität noch deutlich erhöht werden. Auch in geöffnetem Zustand bei 10°C ist das Produkt mehrere Tage haltbar. Es eignet sich hervor ragend als Qualitätskontroll- und Eichserum für Parameter der klinischen Diagnostik, insbesondere unter Berücksichtigung von Bilirubin. Besonders bevorzugt wird das erfindungsgemäße flüssige Kontroll- bzw. Eichserum bei der automatischen klini schen Diagnostik verwendet.

Die Erfindung wird durch folgende Beispiele näher erläutert:

Beispiel 1 Synthese von Bilirubinthioglycolsäureether

Eine sauerstofffreie Lösung aus 10 g Bilirubin und 156 g Thio glycolsäure in 6 l Dimethylformamid und 30 ml Triethylamin bestrahlt man unter Stickstoffatmosphäre 20 Stunden mit einer Quecksilberdampflampe bei einer Wellenlänge <300 nm. Die Temperatur der Lösung soll dabei zwischen 30 und 60°C liegen. Die Umsetzung läßt sich dünnschichtchromatographisch verfolgen (DC: Kieselgel 60, Eluens Toluol/Methanol/Essigsäure = 87/9/4). Nach Abschluß der Reaktion wird Dimethylformamid und Triethyl amin im Hochvakuum abgezogen. Das Produkt fällt dabei aus der höher siedenden Thioglykolsäure aus und wird abfiltriert. Die verbleibende Lösung versetzt man mit ca. 150 ml Wasser, um Reste des Produktes auszufällen. Aus den vereinigten Filtraten wäscht man mit 500 ml Wasser und anschließend mit 200 ml kaltem Methanol restliche Spuren der Thioglykolsäure heraus. Man erhält nach Trocknen im Hochvakuum bei 30°C 8 g (69 %) rotes Produkt.
DC (Kieselgel 60, Eluens Toluol/Methanol/Essigsäure = 87/9/4), RF = 0,3
MS (negativ FAB): m/e = 675 (M-H).

Beispiel 2 Herstellung des flüssigen Kontroll- bzw. Eichserums für die klinische Diagnostik

Für einen 100-l-Ansatz werden 60 l Wasser mit 3,718 g EDTA Natriumsalz, 1,194 g FeSO₄×7 H₂O, ca. 10 l Lipoprotein fraktion, 241 ml Gentamycinsulfat-Lösung, 200 g Myacide® SP (2,4-Dichlor-benzylalkohol) und 6 kg Rinderserumalbumin ver mischt. Dieser erste Ansatz wird über Nacht bei 4°C gerührt, wodurch Rinderserumalbumin und Myacide® SP in Lösung gehen.

Am zweiten Tag werden folgende Substanzen, die vorher gelöst wurden, zugegeben:

37,28 g KCl in 200 ml H₂O gelöst
44,11 g CaCl₂×2 H₂O in 100 ml H₂O gelöst
30 50 g MgCl₂×6 H₂O in 100 ml H₂O gelöst
22,65 g Na-L-Lactat in 100 ml H₂O gelöst
26,73 g NaH₂PO₄×H₂O in 100 ml H₂O gelöst
198 g Glucose×H₂O in 1,0 l H₂O gelöst
130 g Harnstoff in 1,0 l H₂O gelöst
2,2 g Creatinin in 100 ml H₂O gelöst
7,7 g Creatin×H₂O in 100 ml H₂O gelöst
ca. 22 g Glycerin in 100 ml H₂O gelöst
7,0 g Li₂CO₃ + 7,0 g Harnsäure in 1,0 l H₂O gelöst
1217 g TAPS in 2,5 l H₂O gelöst
881 mg Ascorbinsäure in 100 ml H₂O gelöst
318 g Na₂CO₃ in 3,0 l H₂O gelöst
6,6 g Bilirubinthioglycolsäureether in Na₂CO₃-Lösung gelöst
200-400 g NaCl (ad 135 mM Na⁺) in 2,0 l H₂O gelöst
ca. 120 g Tetramethylammoniumchlorid (ad 95 mM Cl^-) in 1,0 l H₂O gelöst
400-500 ml 2 N Essigsäure (oder u. U. 2 N NaOH) ad pH = 8,3
H₂O ad 100 l

Das flüssige Kontroll- bzw. Eichserum wird anschließend steril filtriert und in geeignete Gefäße abgefüllt. Über Nacht erfolgt eine Stickstoffbegasung, wonach die Gefäße verschlossen werden.

Das so hergestellte flüssige Kontroll- bzw. Eichserum enthält die folgenden Bestandteile in den in der Tabelle 2 angegebenen Konzentrationen.

Analytkonzentrationen im flüssigen Kontroll- bzw. Eichserum
Analyt
Konzentration
Bilirubin
4,8 mg/dl
Cholesterin	150 mg/dl
Creatinin	2,2 mg/dl
Eisen	240 µg/dl
Glucose	180 mg/dl
Harnsäure	7,0 mg/dl
Harnstoff	130 mg/dl
Lactat	18 mg/dl
Triglyceride	180 mg/dl
Phospholipide	195 mg/dl
Gesamtprotein	6,0 g/dl
Albumin	6,0 g/dl
Calcium	3,0 mmol/l
Phosphat	6,0 mg/dl
Magnesium	1,5 mmol/l
Natrium	135 mmol/l
Kalium	5,0 mmol/l
Chlorid	95 mmol/l

Claims

1. Stabiles flüssiges Kontroll- bzw. Eichserum für die klini sche Diagnostik, das ein flüssigstabiles Bilirubinderivat der allgemeinen Formel (I) enthält, wobei
X Sauerstoff oder Schwefel,
R eine ein- oder mehrfach durch Carboxy, Alkoxycarbonyl, Hydroxy, Mercapto, Amino, Alkylamino, Dialkylamino oder Alkylcarbonylamino substituierte C₁-C₆-Alkylgruppe und
Y Amino, Alkylamino, Dialkylamino, Hydroxy, Alkoxy oder deren Alkalisalze bedeuten.

2. Ein Kontroll- bzw. Eichserum gemäß Anspruch 1, das das flüssigstabile Bilirubinderivat Bilirubinthioglycolsäure ether enthält.

3. Ein Kontroll- bzw. Eichserum gemäß einem der Ansprüche 1 und 2, das weitere Konservierungsmittel und Analytstabili satoren enthält.

4. Ein Kontroll- bzw. Eichserum gemäß Anspruch 3, das als Analytstabilisator Ascorbinsäure enthält und unter Schutz gas aufbewahrt wird.

5. Ein Kontroll- bzw. Eichserum gemäß einem der Ansprüche 3 und 4, in dem als Konservierungsmittel eine Kombination aus bakteriziden und fungiziden Substanzen eingesetzt wird.

6. Ein Kontroll- bzw. Eichserum gemäß Anspruch 5, das Genta mycin und 2,4-Dichlorbenzylalkohol enthält.

7. Ein Kontroll- bzw. Eichserum gemäß einem der Ansprüche 5 und 6 mit einem pH von 8,2-8,6.

8. Ein Kontroll- bzw. Eichserum gemäß einem der Ansprüche 1-7, das den Analytstabilisator Creatin enthält.

9. Ein Kontroll- bzw. Eichserum gemäß einem der Ansprüche 1-8, das auf Rinderserumalbuminbasis zusammengesetzt ist.

10. Verfahren zur Herstellung eines Kontroll- bzw. Eichserums gemäß einem der Ansprüche 1-9, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Rinderserumalbuminlösung mit den gewünschten Analytparametern bis zur gewünschten Analytparameter- Konzentration vermischt und gegebenenfalls Hilfsmittel zusetzt.

11. Verfahren zur Herstellung eines Kontroll- bzw. Eichserums gemäß einem der Ansprüche 1-9, dadurch gekennzeichnet, daß man ein trockenes Gemisch, das die Analytparameter einschließlich des Bilirubinderivats der Formel (I) ent hält, bis zur gewünschten Analytparameterkonzentration in Wasser auflöst.

12. Verwendung des Bilirubinderivats der Formel (I) in einem Kontroll- bzw. Eichserum.

13. Verwendung des Bilirubinderivats der Formel (I) zur Erhöhung der Lagerstabilität von Kontroll- bzw. Eich seren.