DE4202850A1 - Analysenelement fuer immunoassays - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Analysenelement zur Bestimmung eines Analyten in einer Probenflüssigkeit nach dem Prinzip eines heterogenen Immunoassays bestehend aus einem porösen kapillaraktiven Trägermaterial mit einer Reaktionszone und mindestens zwei Detektionszonen. Weiterhin betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Bestimmung eines Analyten in einer Probenflüssigkeit nach dem Prinzip eines heterogenen Immunoassays unter Verwendung dieses Analysenelementes.

Auf dem Gebiet der medizinischen Diagnostik ist die Zahl der in physiologischen Probenflüssigkeiten zu bestimmen­ den Substanzen immens angewachsen. Zur Bestimmung dieser Substanzen oder Analyten kommen immunologischen Nachweis­ verfahren eine zunehmende Bedeutung zu. Hervorzuheben sind dabei heterogene Immunoassays, bei denen normalerweise ein analytspezifischer bioaffiner Bindungspartner an einer Festphase gebunden vorliegt. Allgemein wird dabei zwischen kompetitiven und Immunoassays und Sandwich-Immunoassays unterschieden.

Bei kompetitiven Immunoassays konkurriert eine vorbestimm­ te Menge eines markierten Analytderivates mit den zu be­ stimmenden Analytmolekülen um die Bindungsstelle des fest­ phasengebundenen Bindungspartners. Nach einer Inkubations­ phase wird das nichtgebundene Material ausgewaschen und die Menge des markierten Analytderivates in der gebundenen oder in der freien Phase als Maß für die Menge des Analy­ ten bestimmt.

Bei Sandwich-Immunoassays wird im allgemeinen nach der Bindung des Analyten an den festphasengebundenen analyt­ spezifischen Bindungspartner ein zweiter analytspezi­ fischer Bindungspartner, der eine meßbare Markierung trägt, im Überschuß zugegeben. Nach Auswaschen des nicht­ gebundenen Materials wird die Menge des markierten Reagen­ zes in der gebundenen Phase als Maß für die Analytmenge bestimmt.

Seit einiger Zeit wurden heterogene Immunoassays auf so­ genannten Testträgern aus porösen oder faserigen Mate­ rialien vorgeschlagen. Die chromatographische Eigenschaft dieser Testträger dient dazu, gebundenes von nichtgebun­ denem markiertem Reagenz zu trennen. Ziel war es weiter­ hin, auf solchen Testträgern alle für die heterogene Nach­ weisreaktion des Analyten notwendigen Bindungspartner auf einem Testträger zu integrieren und so die Zahl der Rea­ genzdosierschritte zu reduzieren (vollständig integrierte Analysenelemente).

US-Patent 43 61 537; EP-A-02 91 194 oder EP-A-01 86 799 beschreiben chromatographische Teststreifen mit einer Ana­ lytaufgabezone und einer Detektionszone, die auf der Ebene des Testträgers voneinander getrennt sind. Die Detektions­ zone enthält einen immobilisierten Bindungspartner. Der Bindungspartner kann für den Analyten direkt spezifisch sein (z. B. ein immobilisierter Antikörper), oder er kann spezifisch für einen analytspezifischen Bindungspartner sein (z. B. Streptavidin, das spezifisch biotinylierte Analytantikörper oder biotinylierte Analytderivate bin­ det). Die für den Immunoassay notwendigen weiteren Bin­ dungspartner sind zwischen Aufgabezone und Detektionszone auf verschiedenen separaten Zonen nacheinander aufge­ bracht, um eine vorzeitige Wechselwirkung der Reagenzien untereinander vor Analytaufgabe zu verhindern. Eine solche Wechselwirkung, beispielsweise von markiertem Analytderi­ vat mit den Bindungsstellen des analytspezifischen Bin­ dungspartners, ist insbesondere bei kompetitiver Testfüh­ rung solange möglichst zu vermeiden, bis der Analyt eben­ falls um diese Bindungsstelle konkurrieren kann.

Um überprüfen zu können, ob die chromatographische Wande­ rung der markierten Bindungskomponente zur Detektionszone stattfindet, bzw. ob die Markierung noch funktionstüchtig ist, wurde zusätzlich vorgeschlagen, hinter der Detek­ tionszone eine weitere Detektionszone als Kontrollzone anzubringen, auf der z. B. Antikörper gegen den freien markierten Bindungsparatner immobilisiert sind. In dieser Kontrollzone wird der freie markierte Bindungspartner nach Passieren der ersten Detektionszone gebunden. So soll eine positive Reaktionskontrolle ermöglicht werden.

Der Nachteil, der in den obigen Schriften beschriebenen chromatographischen Teststreifen liegt darin, daß, bedingt durch die serielle Anordnung der verschiedenen Immunrea­ genzien es nur zu einer unvollständigen homogenen Durch­ mischung der im Flüssigkeitsstrom nacheinander gelösten Reagenzien kommt. Die Konzentrationsverhältnisse an und hinter der Flüssigkeitsfront ändern sich ständig und damit auch die Bindungsgleichgewichte der verschiedenen Bin­ dungspartner. So können diese Teststreifen im allgemeinen nur für qualitative und halbquantitative Analysen einge­ setzt werden. Ferner ist das Problem einer positiven Re­ aktionskontrolle nicht zufriedenstellend gelöst, da die markierten Bindungspartner vor Erreichen der Kontrollzone zuerst die Detektionszone passieren müssen und hier durch unspezifische Wechselwirkungen festgehalten werden können. In der Kontrollzone können nur die freien, in der Detek­ tionszone nicht abgefangenen oder hängengebliebenen mar­ kierten Bindungspartner nachgewiesen werden, aber dies erst mit einiger Zeitverzögerung zum eigentlichen, in der Detektionszone angezeigten Analysenergebnis. Eine quanti­ tative Korrektur des Analysenergebnisses über solche Kon­ trollzonen ist nicht möglich.

Solche Teststreifen sind daher insgesamt relativ ungenau und benötigen lange Chromatographiezeiten. Es fehlt an quantitativen Kontrollmöglichkeiten des Testergebnisses und die Kontrolle der Funktion der markierten Komponente ist nicht befriedigend gelöst.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es deshalb, die Nachteile von Analysenelementen des Standes der Technik zu beseitigen und ein vollständig integriertes chromatogra­ phisches Analysenelement zur Verfügung zu stellen, das ge­ nauere Testergebnisse in kürzerer Zeit liefert, wobei die Testergebnisse zudem überprüfbar und korrigierbar sind und das Funktionieren des markierten Bindungspartners gleich­ zeitig und zuverlässig kontrolliert werden kann.

Die Aufgabe wird gelöst durch ein Analysenelement, wie es in der Ansprüchen charakterisiert ist.

Gegenstand der Erfindung ist ein Analysenelement zur Mes­ sung eines Analyten nach dem Prinzip eines heterogenen Immunoassays bestehend aus einem chromatographiefähigen Trägermaterial, mit einer Reaktionszone, mindestens zwei räumlich von der Reaktionszone getrennten Detektionszonen und mit Saugzonen, die sich an der von der Reaktionszone entfernten Seite an die Detektionszonen anschließen, da­ durch gekennzeichnet, daß auf der Reaktionszone analytspe­ zifische und markierte Bindungspartner auf einer Anzahl löslicher, eng benachbarter, aber voneinander räumlich ge­ trennter Kompartimente vorliegen, daß jede Detektionszone ein Bindungsreagenz für einen der auf der Reaktionszone vorliegenden Bindungspartner immobilisiert enthält, wobei mindestens eine Detektionszone ein Bindungsreagenz für den analytspezifischen unmarkierten Bindungspartner enthält, und die Detektionszonen um die Reaktionszone so angeord­ net sind, daß sie der Reaktionszone benachbart sind.

In dem Analysenelement liegt das poröse, kapillaraktive Trägermaterial als flächenförmige Matrix vor. Die Fläche kann beispielsweise quadratisch, rechteckig oder kreisför­ mig ausgebildet sein. Möglich ist aber auch ein entspre­ chenden Flächensegment, wie dies zum Beispiel ein Test­ streifen darstellt. Als Material für die saugfähige Matrix kommen alle porösen Materialien in Frage, die aufgrund von Kapillarkraft Flüssigkeit und darin gelöste Reagenzien parallel zur Trägermaterialebene transportieren können und die nicht nachteilig mit den eingesetzten Reagenzien wech­ selwirken oder reagieren. Solche porösen Trägermaterialien sind dem Fachmann bekannt. Beispielsweise können Papier, Cellulose, Nitrocellulose, gepreßte Fasern, wie z. B. Glasfasern, gesintertes Glas, Keramik oder Kunststoffe po­ röser oder faseriger Struktur mit hinreichend hydrophilen Eigenschaften eingesetzt werden. Besonders vorteilhaft kann Nitrocellulose eingesetzt werden.

Die Wahl der Porengröße des Materials hängt von den jewei­ ligen Reaktionsbedingungen ab. Als günstige Porengröße ha­ ben sich die Bereiche 0,1-5 µm, bevorzugt 0,45-1 µm, erwiesen. Die Matrixdicke liegt vorteilhafterweise zwi­ schen 50 und 250 µm.

Die gesamte heterogene Immunnachweisreaktion wird mit fol­ genden Bindungspartnern durchgeführt:

Ein erster Bindungspartner ist permanent trägerfixiert auf der Membran immobilisiert, der erste Bindungspartner ist dabei nicht analytspezifisch, aber spezifisch für einen zweiten Bindungspartner ("immobilisierter, nicht-analyt­ spezifischer Bindungspartner").

Ein zweiter Bindungspartner ist spezifisch an den ersten Bindungspartner bindefähig und ist andererseits analytspe­ zifisch ("analytspezifischer Bindungspartner") aber trägt keine Markierung. Dieser Bindungspartner liegt in nicht-immobilisierter Form vor, daß heißt, er wird bei Flüssigkeitskontakt frei löslich. Bei Kontakt mit dem ersten immobilisierten Bindungspartner wird er an diesen gebunden und erst dann immobilisiert.

Ein dritter Bindungspartner ist die markierte Reaktions­ komponente ("markierter Bindungspartner′) über die das Analysenergebnis ermittelt wird. Dieser Bindungspartner ist ebenfalls nicht-immobilisiert, d. h., er ist ablösbar auf dem Trägermaterial aufgebracht.

Methoden der Markierung von Immunkomponenten und deren Detektion sind dem Fachmann vertraut. Bewährt haben sich Direktmarkierungen, die ohne weitere Reagenzien nachweis­ bar sind, wie Farbstoffmoleküle, Metallsole, Fluorophore, Luminophore oder z. B. Phycobiliproteine oder fluoreszie­ render Latex. Besonders vorteilhaft kann Fluoreszenzmar­ kierung eingesetzt werden.

Die Art des dritten, markierten Bindungspartners hängt von dem immunologischen Testprinzip ab, das angewandt wird. Ist beispielsweise der Analyt ein Antigen, so kann der freie markierte Bindungspartner bei Verwendung eines kom­ petitiven Testprinzips ein dem Antigen entsprechendes mar­ kiertes Antigen sein. Der zweite Bindungspartner ist in diesem Fall ein an den ersten Bindungspartner bindefähiger Antikörper. Markierter Bindungspartner und Antigen konkur­ rieren um die Bindestelle des zweiten Bindungspartners, wobei die Menge des gebundenen markierten Analytanalogen ein Maß für die Konzentration des Analyten darstellt.

Bei Verwendung des Sandwich-Prinzips kann der freie mar­ kierte Bindungspartner ein markierter analytspezifischer Antikörper sein. Zweiter Bindungspartner und markierter Bindungspartner binden das Analytantigen über verschiedene Epitope. Die Menge des gebundenen markierten Bindungspart­ ners stellt ein Maß für die Konzentration des Analyten dar. Die Begriffe Antigen und Antikörper können in der oben gegebenen Beschreibung ausgetauscht werden.

Als erster Bindungspartner (immobilisiert und nichtanalyt­ spezifisch) kann bevorzugt Streptavidin (oder Avidin) ver­ wendet werden, das den zweiten analytspezifischen Bin­ dungspartner aufgrund dessen Konjugation mit einem Biotin­ molekül spezifisch binden kann. Möglich sind aber auch alle dem Fachmann bekannten weiteren spezifischen Binde­ paare wie Zucker/Lectin, komplementäre Nukleotidsequenzen, Enzym/Cofaktor, Antikörper/Antigen usw.

Das poröse kapillaraktive Trägermaterial beinhaltet auf der Trägerebene mindestens drei räumlich voneinander abge­ grenzte flächenförmige Zonen auf der Trägerebene, die auf­ grund der in ihnen enthaltenen Immunreagenzien zu funktio­ nalen Zonen werden.

Die Reaktionszone befindet sich bevorzugt in zentraler Position der Trägermaterialfläche. Die Reaktionszone ist dadurch charakterisiert, daß sich in ihr in einem gemein­ samen, abgegrenzten Bereich die beiden Bindungspartner analytspezifischer Bindungspartner und markierter Bin­ dungspartner auf vielen eng benachbarten aber räumlich voneinander getrennten Kompartimenten auf einer Fläche be­ finden.

Die Reaktionszone stellt bevorzugt einen kreisförmigen Bereich dar, möglich sind aber auch andere Formate, wie z. B. ein rechteckiges Format, im Falle eines Teststreifens. Die Flächengröße der Reaktionszone richtet sich im wesent­ lichen nach der Menge der aufzubringenden Immunreagenzien. Bevorzugt ist der Bereich der Reaktionszone ein Teil des Trägermaterial selbst. Möglich ist aber auch, daß im Be­ reich der Reaktionszone zusätzlich eine kapillaraktive Schicht auf das Trägermaterial aufgebracht ist, die mit diesem in flüssigkeitstransportierendem Kontakt steht und alle Immunreagenzien enthält.

Der Begriff "Kompartiment" bezeichnet einen gegenüber den Dimensionen der Reaktionszone wesentlich kleineren, flächenförmigen abgegrenzten Teilbereich, der eine Rea­ genzspezies enthält. Ein Kompartiment kann aus einem Fleck oder mehreren überlappenden Flecken oder aus einer Linie bestehen.

Die Kompartimente sind dadurch räumlich voneinander ge­ trennt, daß sie in sehr geringem Abstand nebeneinander in der Reaktionszone angeordnet sind, wobei die Kompartimente mit verschiedenen Reagenzien bevorzugt alternieren, das heißt, daß wechselweise Kompartimente verschiedener Rea­ genzien benachbart sind. Aus praktischen Gründen ist ein regelmäßiges Alternieren zweckmäßig, bei dem sich also Kompartimente verschiedener Reagenzien in einer oder auch in zwei Flächenrichtungen zyklisch wiederholen, so daß sich ein regelmäßiges Linien- bzw. Punktmuster ergibt. In Aus­ nahmefällen kann aber auch ein alternierendes Muster ohne zyklische Wiederholung zweckmäßig sein. Idealerweise soll­ te der Abstand der Kompartimente unendlich klein sein. Auf der anderen Seite sollten sich die Kompartimente ver­ schiedener Reagenzien in trockenem Zustand gerade nicht berühren.

Praktischerweise liegt der Abstand der äußeren Begrenzung verschiedener Kompartimente zwischen 10 µm und 1 mm, be­ vorzugt zwischen 30 µm und 250 µm, ganz besonders bevor­ zugt zwischen 40 µm und 100 µm. Die Breite der Komparti­ mentlinien bzw. der Durchmesser der Kompartimentflecken sollte vorteilhafterweise weniger als 2 mm betragen und liegt bevorzugt zwischen 50 µm und 1 mm. Diese Formatie­ rung und Anordnung der Kompartimente wird im folgenden auch als Mikrokompartimentierung bezeichnet.

Die Reagenzien, die in den Kompartimenten der Reaktionszo­ ne enthalten sind, sind nicht-immobilisiert, d. h. sie haften zwar in trockenem Zustand auf oder in der ein Kom­ partiment bildenden Trägermaterialfläche sind aber in ei­ ner auf die Reaktionszone aufgegebenen Flüssigkeit gut löslich ("lösliche Kompartimente"). Es empfiehlt sich da­ her als Trägermaterialien solche Materialien auszuwählen, die keine oder nur geringe unspezifische Wechselwirkungen mit dem Analyt oder den in löslichen Kompartimenten ent­ haltenen Immunreagenzien eingehen. Beispiele dafür sind modifizierte Nylonmembrane wie Loprodyne® oder andere hydrophile Membrane wie hydrophiles Durapore® der Firma Millipore.

Das Aufbringen der Immunreagenzien in Kompartimenten muß durch solche Verfahren erfolgen, die geeignet sind, mehre­ re verschiedene Immunreagenzien auf porösen Membranen in eng begrenzten und eng benachbarten Bereichen gezielt und in reproduzierbarer Weise aufzubringen, wobei die Immun­ reagenzien in feuchtem Zustand des Trägermaterials eluier­ bar sein sollen.

Das Aufbringen von Immunreagenzien in dieser Weise wurde bisher noch nicht beschrieben.

Als geeignet haben sich eine große Zahl verschiedener Drucktechniken herausgestellt. Dazu zählen Siebdrucktech­ nik, die aus der Computerdrucktechnik bekannten Techniken wie Ink-Jet in verschiedenen Variationen, Nadeldrucktech­ niken, Sprühtechniken wie Air-brush, "Charged drop"-Druck­ techniken und andere.

Bei der Siebdrucktechnik wird durch ein feinmaschiges Raster zuerst eine Komponente auf das Trägermaterial auf­ gestrichen, dann das Raster verschoben und eine zweite und gegebenenfalls weitere Komponenten in die Lücken des er­ sten Rasters aufgestrichen. Die Abstände der Kompartimente liegen eher an der oberen für die Erfindung noch tolerier­ baren Grenze.

Eine Applikation von Immunreagenzien über Nadelapplikation eignet sich ebenfalls in solchen Fällen eher, indem die Abstände der Kompartimente nicht besonders klein zu sein brauchen.

Durch eine feine hohle Nadel von 0,05-1 mm Innendurch­ messer wird mit einer extakt dosierenden Pumpe Reagenz­ flüssigkeit auf die Membran aufgebracht. Die Strichstärke hängt davon ab, wie schnell die Nadel über die Membran bzw. die Membran unter der Nadel bewegt wird. Bevorzugt ist eine Applikation von Reagenzien mit nach oben stehen­ der Nadelöffnung und darüber geführter Nadel.

Bevorzugtere Verfahren im Sinne der Erfindung, sind Ver­ fahren, die einen kleineren Abstand der Kompartimente er­ lauben. Dazu zählt beispielsweise die Applikation von Immunreagenzien mit dem sogenannten Airbrush-Verfahren. Dies ist ein kontinuierliches Sprühverfahren, bei dem, von einem Gasstrom umhüllt, Mikrotropfen auf eine Oberfläche bevorzugt in Linien aufgebracht werden. Der Gasstrom dient zum Ablenken und Positionieren des Mikrotropfenstrahls. Bekannt ist dieses Verfahren zum Aufbringen von Analyt­ lösungen auf die Startlinie von Dünnschichtplatten.

Es hat sich herausgestellt, daß die hierfür kommerziell erhältlichen Geräte (zum Beispiel CAMAG DC-Probenautomat III) geeignet sind, verschiedene Immunreagenzien mikrokom­ partimentiert auf eine poröse Matrix aufzubringen. Dabei werden typischerweise Mikrotropfen der Größe 10 nl-1000 nl, bevorzugt unter 100 nl, auf die Multifunktionszone des erfindungsgemäßen Analysenelementes in Punkt- oder Strich­ mustern, vorzugsweise in alternierender Folge miteinander unverträglicher Reagenzien aufgebracht. Die Dichte der Linien beziehungsweise Punkte ist dabei abhängig von der Saugfähigkeit des Trägermaterials und der Größe der Tropfen und liegt vorzugsweise zwischen 10 und 100 Linien pro cm² beziehungsweise 100 bis 10 000 Tropfen pro cm².

Im Sinne der Erfindung noch vorteilhafter sind die ur­ sprünglich für Computerdrucker (Tintenstrahldrucker) ent­ wickelten Ink-Jet-Techniken, weil sich mit diesen Verfah­ ren noch kleinere Reagenzflüssigkeitsquanten aufbringen lassen. Unter den verschiedenen Methoden dieser Technolo­ gie ist die sogenannte Bubble-Jet-Technik besonders bevor­ zugt. Ink-Jet-Techniken können in kontinuierliche und dis­ kontinuierliche Techniken eingeteilt werden. Beide Gruppen sind für die Erfindung geeignet.

Die Anwendung zweier spezieller Varianten der diskonti­ nuierlichen Ink-Jet-Technik zum Aufbringen eines Reagenzes auf einen räumlich abgegrenzten flächigen Bereich wird in EP-A-1 19 573 und EP-A-2 68 237 (US-A-48 77 745) beschrie­ ben. Ein solcher abgegrenzter Bereich kann zum Beispiel die Form eines Plus- oder Minuszeichens zu haben, um das Analysenresultat deutlicher beziehungsweise für den Laien verständlicher zu machen, oder er kann dazu dienen eine unmittelbaren Vergleich zwischen einem mit reagenzbe­ schichteten Teilbereich und einem reagenzfreien Teilbe­ reich zu ermöglichen. In Bezug zur Ink-Jet-Technologie wird auf die oben genannten Schriften hier Bezug genommen. Die Ink-Jet-Technik zeichnet sich dadurch aus, daß sehr kleine Teilmengen einer Flüssigkeit in hoher Präzision auf eine Tragschicht appliziert werden können. Die Präzision bezieht sich dabei sowohl auf die exakte Positionierung des von dem Reagenztropfen erzeugten Punktes auf der Trag­ schicht, als auch auf das Reagenzvolumen. Die Tropfen kön­ nen mit hoher Frequenz hintereinander ausgestoßen werden.

Mit Ink-Jet-Techniken können auch verschiedene Reagenzien auf kleinem Raum in eng benachbarten, aber räumlich von­ einander getrennten Kompartimenten auf porösen Membranen appliziert werden, um ein erfindungsgemäßes Analysen­ element bereitzustellen.

Zur Herstellung eines erfindungsgemäßen Analysenelementes liegt das Volumen eines von einem Ink-Jet-Düsenkopfausge­ stoßenen Quantums Reagenzflüssigkeit typischerweise zwi­ schen 20 und 2000 µl, bevorzugt zwischen 100 und 800 µl. Die Fläche des von einem solchen Quantums auf der Trag­ schicht erzeugten Punktes ist stark von der Reagenzflüs­ sigkeit und der Tragschicht abhängig. Sie liegt zwischen 500 µm² und 0,2 mm² bevorzugt zwischen 3000 µ² und 0,1 mm². Die Reagenzflüssigkeitsquanten werden typischerweise mit einer Frequenz von mehr als 1000 s^-1, bevorzugt zwi­ schen 1000 und 200 000 s^-1 ausgestoßen. Nähere Einzelhei­ ten können der noch nicht veröffentlichten deutschen Pa­ tentanmeldung Aktenzeichen P 40 24 544.6 entnommen werden.

In den oben angegebenen Schriften EP-A-1 19 573 und EP-A- 2 68 237 wurden zum großflächigen Applizieren von Reagen­ zien lediglich spezielle Varianten der Ink-Jet-Technologie benutzt, bei denen das Volumen einer Düsenkammer in einer Variante mechanisch in der anderen Variante piezoelek­ trisch komprimiert wird, wenn ein Tropfen ausgestoßen wer­ den soll.

Es hat sich herausgestellt, daß unter den Ink-Jet-Techni­ ken die bisher noch nicht zum Applizieren von Reagenzien beschriebene Bubble-Jet-Technik auch vorteilhaft zur Her­ stellung des erfindungsgemäßen Analysenelementes benutzt werden kann.

Bei der ebenfalls von Computerdruckern bekannten Bubble- Jet-Technik wird ein Teilvolumen der Flüssigkeit in der Düsenkammer jeweils kurzfristig verdampft und expandiert, um ein Quantum der Flüssigkeit durch die Düse auszustoßen. Es sind dabei keine mechanisch beweglichen Teile mehr er­ forderlich, wodurch sich eine hohe Zuverlässigkeit ergibt. Ferner kann über einen breiten Viskositätsbereich der Flüssigkeit gearbeitet werden. Trotz der starken Erhitzung der Flüssigkeit in der Düsenkammer kommt es überraschen­ derweise zu keiner praktisch bedeutsamen Beschädigung von in der Flüssigkeit gelösten Immunreagenzien. Zur Komparti­ mentierung der verschiedenen Reagenzien auf dem erfin­ dungsgemäßen Analysenelement mit Ink-Jet-Techniken wird vorteilhafterweise mit einem Mehrkanaldruckkopf gearbei­ tet, wie sie für den Farbdruck entwickelt worden sind. Der Druckkopf kann mit einem von einer Steuereinheit gesteuer­ ten X-Y-Antrieb in beiden Flächenrichtungen der Multifunk­ tionszone positioniert werden. Ansonsten können die für die Ink-Jet-Technik, insbesondere die für die Bubble-Jet- Technik bekannten konstruktiven Einzelteile verwendet werden, die der Literatur über diese Techniken entnommen werden können. Nähere Einzelheiten können auch der noch nicht veröffentlichten deutschen Patentanmeldung Aktenzei­ chen P 40 24 545.4 entnommen werden.

Die Reaktionszone des erfindungsgemäßen Analysenelementes ist von mindestens zwei Detektionszonen umgeben. Unter ei­ ner Detektionszone wird ein räumlich abgegrenzter, von der Reaktionszone durch einen flüssigkeitstransportierenden Bereich des Trägermaterials getrennter Bereich verstanden, in dem ein spezifisches Bindungsreagenz für eines der aus der Reaktionszone chromatographierenden Immunreagenzien immobilisiert vorliegt und in dem eine markierte Immun­ reaktionskomponente nachgewiesen wird. Die Immobilisierung des Bindungsreagenzes kann durch dem Fachmann bekannte Methoden wie kovalente Bindung oder Adsorption auf oder in dem Trägermaterial erfolgen.

Unter einem spezifischen Bindungsreagenz kann dabei sowohl ein Bindungsreagenz für den analytspezifischen Bindungs­ partner (und dessen Immunkomplexe) verstanden werden, als auch ein Bindungsreagenz, das den markierten Bindungspart­ ner spezifisch bindet. Als Bindereagenz, das einen analyt­ spezifischen Bindungspartner bindet, kann beispielsweise vorteilhaft Streptavidin benutzt werden, das als Poly­ streptavidin oder TRSA-Streptavidin auf der Detektionszone ganzflächig, beispielsweise mit einem Druckverfahren, immobilisiert wird und biotinylierte Antikörper oder bio­ tinylierte Analytderivate sehr schnell und fest binden kann (siehe EP-A-03 44 578). Es können aber auch andere bioaffine Bindungspartner wie Lectin/Zucker, komplementäre Nucleotidsequenzen, Enzym/Co-faktor, Antikörper/Antigen usw. eingesetzt werden.

Ein Bindungsreagenz, das einen markierten Bindungspartner bindet, kann z. B. ein immobilisierter Antikörper sein, der gegen die freien markierten Bindungspartner gerichtet ist.

In einer Detektionszone, die ein Bindungsreagenz gegen den analytspezifischen Bindungspartner immobilisiert enthält, wird das eigentliche Meßergebnis detektiert ("Meß-Detek­ tionszone"), das heißt, die Anzahl der mit einem Markie­ rungsreagenz gekuppelten analytspezifischen Bindepaare wird in dieser Zone als Maß für die Menge des Analyten in der Probenflüssigkeit gemessen.

In einer Detektionszone, die ein Bindungsreagenz für einen freien markierten Bindungspartner enthält, wird die Menge des gewanderten markierten Bindungspartners detektiert. Eine solche Zone kann auch als "Kontroll-Detektionszone" bezeichnet werden, da in ihr die chromatographische Wande­ rung des markierten Bindungspartners aus der Reaktionszone und seine Funktion kontrolliert werden kann.

Erfindungswesentlich ist, daß die zwei oder mehr Detek­ tionszonen um die Reaktionszone so angeordnet sind, daß sie dieser benachbart sind. Darunter wird verstanden, daß eine Anordnung Reaktionszone - Detektionszone - Detek­ tionszone in einer Linie ausgeschlossen wird. Jede Detek­ tionszone soll lediglich durch das kapillaraktive Träger­ material von der Reaktionszone getrennt sein. Besonders vorteilhaft ist es, wenn alle Detektionszonen den gleichen Abstand zur Reaktionszone haben. Beispielsweise können auf einem Teststreifen mit einer zentralen Reaktionszone je eine Detektionszone zu beiden Seiten der Reaktionszone auf der Teststreifenoberfläche aufgebracht sein, bevorzugt in gleichem Abstand von der Reaktionszone.

Mehr als zwei Detektionszonen können auf einem flächigem Trägermaterial konzentrisch in verschiedenen Richtungen um die Reaktionszone angeordnet werden. Bei gleichem Abstand zur Reaktionszone sind die Detektionszonen somit kreisför­ mig um die Reaktionszone angeordnet.

Von den mindestens zwei Detektionszonen, die um die Reak­ tionszonen angeordnet sind, ist mindestens eine Detek­ tionszone eine Meß-Detektionszone, die ein Bindungsreagenz für den analytspezifischen Bindepartner und dessen Kom­ plexe enthält. Die weiteren Detektionszonen sind eine oder mehrere Meß-Detektionszonen und/oder eine oder mehrere Kontroll-Detektionszonen, die immobilisiertes Bindungsrea­ genz für die markierten Bindungspartner enthalten.

Hinter den Detektionszonen, an der von der Reaktionszone abgewandten Seite, schließt sich der Saugzonenbereich des Trägermaterials an. Der Saugzonenbereich des Trägermate­ rials dient dazu, durch Kapillarkräfte Probenflüssigkeit, Waschflüssigkeit und nicht in der Detektionszone fixierte Reagenzien aufzunehmen. Vorteilhafterweise kann diese Funktion des Trägermaterials noch durch das zusätzliche Anbringen eines besonders saugfähigen Materials im Saugzo­ nenbereich unterstützt werden. Bewährt hat sich dafür bei­ spielsweise Whatman 3 MM Papier.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Bestimmung eines Analyten in einer Probenflüssigkeit nach dem Prinzip eines heterogenen Immunoassays unter Ver­ wendung des erfindungsgemäßen Analysenelementes, das da­ durch gekennzeichnet ist, daß Probenflüssigkeit auf die Reaktionszone aufgegeben wird, mit anschließend auf die Reaktionszone aufgegebener Waschflüssigkeit gelöste Rea­ genzien aus der Reaktionszone in Richtung zu den Detek­ tionszonen chromatographiert werden, die dort gebundenen markierten Reaktionskomponenten gemessen werden, und die Messungen in verschiedenen Detektionszonen zur qualitati­ ven Kontrolle und/oder quantitativen Verbesserung der Ana­ lytbestimmung benutzt werden.

Zur Durchführung einer Analytbestimmung auf dem erfin­ dungsgemäßen Analysenelement wird die den Analyten ent­ haltende Probenlösung auf die Reaktionszone aufgebracht. Bevorzugt erfolgt die Aufgabe auf die Mitte dieser Zone und das Volumen der Probenflüssigkeit sollte so groß sein, daß die gesamte Zone von Flüssigkeit benetzt wird. Durch die Auftragung der Reagenzien in Mikrokompartimenten wer­ den die Reagenzien bei Aufgabe der Probenflüssigkeit schnell und gleichmäßig gelöst und reagieren untereinander schnell in einer homogenen Reaktion. Nach beendeter Reak­ tion der Bindungspartner wird eine Waschflüssigkeit bevor­ zugt auf das Zentrum der Reaktionszone aufgegeben und die gelösten Reagenzien und Immunkomplexe im wesentlichen nach allen Seiten radial aus der Reaktionszone chromatogra­ phiert. Bei Teststreifen erfolgt der Reagenzientransport aufgrund der äußeren Begrenzung des Streifens im wesent­ lichen gleichmäßig in beiden Längsrichtungen des Streifens nach außen. Als Waschflüssigkeit werden für Immunreagenzen übliche Pufferlösungen benutzt.

Erreichen Bindungspartner Detektionszonen, die die ihnen entsprechenden Bindungsreagenzien immobilisiert enthalten, werden sie dort festgehalten, während die übrigen Reagen­ zien die Detektionszone passieren und von der Saugzone aufgenommen werden.

Mindestens eine Detektionszone enthält immobilisierte Bin­ dungsreagenzien für den analytspezifischen Bindungspart­ ner, so daß diese Meß-Detektionszone über die Messung der immobilisierten Markierung ein erstes Meßergebnis für die Menge des Analyten in der Probenlösung liefert. Enthält das Analysenelement eine oder mehrere weitere Meß-Detek­ tionszonen, erhält man ein oder mehrere weitere Meßergeb­ nisse, die mit dem ersten Meßergebnis bzw. untereinander verglichen werden können. Der große Vorteil einer solchen Doppelt- oder Mehrfachmessung mit dem erfindungsgemäßen Analysenelement liegt darin, daß die meisten Parameter der Testführung identisch sind. Beispielsweise bilden die Reaktionspartner in der Reaktionszone eine homogene Lö­ sung, die sich radial nach außen gleichmäßig verteilt, so daß die Ausgangskonzentration der Reaktionspartner für jedes Meßergebnis identisch ist. Lediglich Inhomogenitäten des Reagenzientransports von der Detektionszone zu den verschiedenen Meß-Detektionszonen haben im wesentlichen Einfluß auf die verschiedenen Meßergebnisse und lassen sich durch Doppelt- oder Mehrfachmessungen auf verschiede­ nen Meß-Detektionszonen leicht herausmitteln, wodurch ein genaueres Meßergebnis erhalten wird.

Wenn man zwei oder mehrere voneinander getrennte, aber identische Meß-Detektionszonen zur Verfügung hat, hat man zusätzlich die Möglichkeit, die Genauigkeit der Analytbe­ stimmung noch weiter zu erhöhen. Verschiedene Meß-Detek­ tionszonen können gleichzeitig mit unterschiedlichen Wel­ lenlängen vermessen werden. Dies ist insbesondere dann sinnvoll, wenn Komponenten der Analytenlösung die Messung in der Meß-Detektionszone stören. Beispielsweise zeigen viele Serumbestandteile, die unspezifisch in der Meß- Detektionszone binden können, einen erhöhten Fluoreszenz­ hintergrund. Solche Störungen können durch Messung zweier Meß-Detektionszonen bei verschiedenen Wellenlängen erfaßt und mathematisch eliminiert werden.

Enthält das Analysenelement neben einer oder mehreren Meß- Detektionszonen noch eine oder mehrere Kontroll-Detek­ tionszonen, so kann die Zuverlässigkeit und Genauigkeit der Messung weiterhin erhöht werden. Eine Kontroll-Detek­ tionszone im Sinne der Erfindung zeigt an, daß freie mar­ kierte Bindungspartner von der Reaktionszone zur Detek­ tionszone gewandert sind. Ferner zeigt sie an, ob und in welchem Maße das Markierungssystem dieser Bindungspartner noch funktionsfähig ist, das heißt, in welchem Maß die Antikörper, Fluorophore oder Enzyme (bei Enzymmarkierung) beispielsweise durch Alterungserscheinungen geschädigt sind. Die in einer Kontroll-Dektektionszone erhaltenen Ist-Meßwerte lassen sich mit einem Soll-Referenzwert ver­ gleichen, und so das in der Meß-Detektionszone erhaltene Ergebnis mit einem entsprechenden Faktor korrigieren. Der Vorteil des erfindungsgemäßen Analysenelementes liegt darin, daß diese Kontrolle unabhängig und gleichzeitig zu der Analytmessung stattfindet. Das Kontroll-Meßergebnis kann nicht dadurch verfälscht werden, daß der Flüssig­ keitsstrom zuerst eine andere Detektionszone passieren muß. Auch kommt es zu keiner zeitlichen Verzögerung zwi­ schen Analyt-Meßergebnis und der qualitativen Bestätigung dieses Ergebnisses.

Mit dem erfindungsgemäßen Analysenelement kann ein schnel­ les und sehr genaues Analysenergebnis erhalten werden.

Bei Aufgabe der Probenflüssigkeit auf die Reaktionszone werden die in Kompartimenten aufgebrachten Reagenzien gleichmäßig gelöst und reagieren in einer sehr schnellen homogenen Reaktion. Die Chromatographie der Reagenzien zu den Detektionszonen benötigt nur kurze Chromatographiewege was eine schnelle und genaue Testführung ermöglicht. Ein erstes Analysenergebnis mit gleichzeitiger positiver Reak­ tionskontrolle kann innerhalb von 10-300 Sekunden erhal­ ten werden. Dadurch, daß mehrere voneinander unabhängige Detektionszonen auf einem Analysenelement aufgebracht wer­ den können, ist es möglich, die Genauigkeit des Analysen­ ergebnisses weiter zu verbessern. Werden die verschiedenen Detektionszonen gleichzeitig apparativ ausgewertet, erhält man ohne weiteren zusätzlichen Zeitbedarf ein sehr präzi­ ses korrigiertes Analysenergebnis.

Die Zeichnungen geben beispielhaft Ausführungsformen des Analysenelementes wieder:

Fig. 1 zeigt einen Teststreifen mit einem streifenför­ migen Trägermaterial (1). In zentraler Position enthält das Trägermaterial eine Reaktionszone (2) (gleichzeitig Probenauftragszone). Im gleichen Abstand von der Reak­ tionszone befindet sich je eine mit Streptavidin beschich­ tete Meß-Detektionszone (3), mit der Reaktionszone (2) verbunden durch das kapillaraktive Material der Trägerma­ trix. Der Bereich der Trägermatrix hinter den Detektions­ zonen (3) dient als Absorptionsmittel (4) für überschüssi­ ge Flüssigkeit und kann von einem zusätzlichen absorp­ tionsfähigen Material (5) unterstützt werden.

Fig. 2 zeigt einen ähnlichen Teststreifen, bei dem eine streptavidinbeschichtete Meß-Detektionszone durch eine Kontroll-Detektionszone (6) ersetzt, die mit Antikörpern gegen einen im Test benutzten markierten Antikörper be­ schichtet ist.

Fig. 3 zeigt ein Analysenelement mit einem Trägermaterial (1) und einer zentral aufgebrachten kreisförmigen Reak­ tionszone (2) mit mikrokompartimentierten Reagenzien. In gleichem Abstand um die Reaktionszone (2) befinden sich drei Meß-Reaktionszonen (3) und eine Kontroll-Detektions­ zone (6).

Beispiel 1: Kompetitiver Immunoassay auf T4 Reagenzien

• A: biotinylierter T4-Antikörper (5×10^-7M) in PBS- Puffer mit 10 Gew.% Trehalose und 0,2 Gew.% 8-Anilino- 1-naphthalin-sulfonsäure (ANS).
• B: T4-B-Phycoerythrin (1 : 1, 10^-6M in obigem Puffer)
• C: Poly-Streptavidin (polymerisiert mit Bis-hydroxysucci­ nimid, mittlere Molekülgröße < 70 nm, 5 mg/ml in obi­ gem Puffer)

Reagenzien A und B wurden mit einem Hewlett-Packard-Paint- Jet-Mehrkanal-Drucker (Bubble-Jet) auf die Mitte einer 4×4 cm² großen Nitrocellulose-Membran (AES 98, Schleicher und Schüle) nach folgendem Linienmuster aufgebracht:

Die Auftragsmenge lag bei 0,5 µl Reagenz/cm².
Die Linien bedeckten ein Quadrat von 0,7 cm Kantenlänge.
Das Quadrat stellt die Reaktionszone dar.

Reagenz c wurde mit einer dünnen Hohlnadel (Innendurchmes­ ser 0,6 mm) in Form eines Quadrates mit der Seitenlänge 1,2 cm um das A/B-Linienquadrat aufgegeben.

stellen 4 Streptavidin-Meß-Detektionszonen dar.

Testdurchführung

Die Membran wurde in einem Festphasenhalter eingebaut. 5 µl einer Analytprobe (Humanserum) aus einer Serumstandard­ reihe wurden auf die Mitte der Reaktionszone aufgegeben. Nach 3 Minuten wurden 3×15 µl Waschpuffer (PBS mit 0,1 Gew.% Tween 20) in 15 Sekunden-Abständen auf die Mitte der Reaktionszone aufgegeben. Nach weiteren 2 Minuten wurden 3 der 4 Detektionszonen an einem Hitachi 4010 bei Ex 515 nm, Em 580 nm vermessen.

Aus 5 Analysen sind die Meßwerte der drei Detektionszonen, die Mittelwerte dieser Werte und die Werte der Vermessung nur einer Detektionszone angegeben.

Der Mittelwert aus den Meßergebnissen dreier Detektionszo­ nen liefert eine genaue gleichmäßige Kurve für verschiede­ ne T4-Konzentrationen mit guten Abstufungen auch noch für T4-Konzentrationen über 100 mmol/l und somit reproduzier­ bare Ergebnisse.

Die Meßreihen mit nur einem Meßpunkt als Grundlage erzeu­ gen dagegen stark streuende Kurven, die zum Teil bei T4- Konzentration von über 100 mmol/l nur kleine Abstufungen aufweisen.

Claims (20)

1. Analysenelement zur Bestimmung eines Analyten in einer Probenflüssigkeit nach dem Prinzip eines heterogenen Immunoassays bestehende aus einem chromatographiefähi­ gen porösen Trägermaterial (1) mit einer Reaktionszo­ ne, mindestens zwei räumlich voneinander getrennten Detektionszonen (3, 3, oder 3, 6) und mit Saugzonen (4), die sich an die Detektionszonen (3, 6) an den von der Reaktionszone (2) abgewandten Seiten anschließen, dadurch gekennzeichnet, daß auf der Reaktionszone (2) analytspezifische und markierte Bindungspartner auf einer Anzahl löslicher, eng benachbarter, aber räum­ lich voneinander getrennter Kompartimente vorliegen, daß jede Detektionszone (3, 6) ein Bindungsreagenz für einen der auf der Reaktionszone (2) vorliegenden Bin­ dungspartner immobilisiert enthält, wobei mindestens eine Detektionszone (3) ein Bindungsreagenz für den analytspezifischen unmarkierten Bindungspartner ent­ hält, und die Detektionszonen (3, 6) so um die Reak­ tionszone (2) angeordnet sind, daß sie der Reaktions­ zone (2) benachbart sind.

2. Analysenelement gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeich­ net, daß zwei oder mehrere Detektionszonen (3, 6) im wesentlichen den gleichen Abstand von der Reaktionszo­ ne (2) haben.

3. Analysenelement gemäß Anspruch 1 oder 2, dadurch ge­ kennzeichnet, daß das Bindungsreagenz für den analyt­ spezifischen unmarkierten Bindungspartner Streptavidin oder Avidin ist.

4. Analysenelement gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, da­ durch gekennzeichnet, daß eine oder mehrere der Detek­ tionszonen (6) ein Bindungsreagenz für den markierten Bindungspartner enthalten.

5. Analysenelement gemäß Anspruch 4, dadurch gekennzeich­ net, daß das Bindungsreagenz für den markierten Bin­ dungspartner ein Antikörper ist.

6. Analysenelement gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, da­ durch gekennzeichnet, daß die Kompartimente einen Ab­ stand von weniger als 1 mm voneinander haben.

7. Analysenelement gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7, da­ durch gekennzeichnet, daß die Kompartimente der Reak­ tionszone (2) eine Ausdehnung in einer Flächenrichtung von weniger als 2 mm haben.

8. Analyseelement gemäß Anspruch 7, dadurch gekennzeich­ net, daß die Ausdehnung in einer Flächenrichtung zwi­ schen 50 µm und 1 mm beträgt.

9. Analysenelement gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8, da­ durch gekennzeichnet, daß die Kompartimente Linien bilden.

10. Analysenelement gemäß einem der Ansprüche 1 bis 9, da­ durch gekennzeichnet, daß die Kompartimente Punkte bilden.

11. Analysenelement gemäß einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß Kompartimente gleicher Reagenzien durch Kompartimente verschiedener Reagen­ zien voneinander getrennt sind.

12. Analysenelement gemäß einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß die Kompartimente der Reaktionszone (2) über ein Ink-Jet-Verfahren aufge­ bracht sind.

13. Analysenelement gemäß Anspruch 12, dadurch gekenn­ zeichnet, daß die Kompartimente der Reaktionszone (2) über ein Bubble-Jet-Verfahren aufgebracht sind.

14. Analysenelement gemäß einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß die Kompartimente über Air-brush aufgebracht sind.

15. Verfahren zur Bestimmung eines Analyten in einer Pro­ benflüssigkeit nach dem Prinzip eines heterogenen Im­ munoassays, dadurch gekennzeichnet, daß Probenflüssig­ keit auf die Reaktionszone (2) des Analysenelementes gemäß einem der Ansprüche 1 bis 14 aufgegeben wird, gelöste Reagenzien durch auf die Reaktionszone (2) aufgegebene Waschflüssigkeit aus der Reaktionszone in Richtung zu den Detektionszonen (3, 6) chromatogra­ phiert werden, die dort gebundenen markierten Reak­ tionskomponenten gemessen werden, und die Meßergebnis­ se verschiedener Detektionszonen zur qualitativen Kon­ trolle und/oder quantitativen Verbesserung der Analyt­ bestimmung benutzt werden.

16. Verfahren gemäß Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß die Meßergebnisse zweier oder mehrerer Detektions­ zonen (3), die ein Bindungsreagenz für den analytspe­ zifischen Bindungspartner enthalten, gemittelt wer­ den.

17. Verfahren gemäß Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß die Meßergebnisse zweier oder mehrerer Detektions­ zonen (3), die ein Bindungsreagenz für den analytspe­ zifischen Bindungspartner enthalten, mit verschiedenen Meß-Verfahren erhalten werden.

18. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 15 bis 17, dadurch gekennzeichnet, daß die Meßergebnisse einer oder meh­ rerer Detektionszonen (6), die ein Bindungsreagenz für den markierten Bindungspartner enthalten, zur positi­ ven Reaktionskontrolle benutzt werden.

19. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 15 bis 18, dadurch gekennzeichnet, daß die Meßergebnisse einer oder meh­ rerer Detektionszonen (6), die ein Bindungsreagenz für den markierten Bindungspartner enthalten, zur quantitativen Korrektur der Analytbestimmung benutzt werden.

20. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 15 bis 19, dadurch gekennzeichnet, daß die Bestimmung des Analyten nach einem kompetitiven Immunassay durchgeführt wird.