DE4223613A1 - Verfahren zur Herstellung von ungesättigten Uroniden aus pektinhaltigen Stoffen - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von ungesättigten Uroniden (Oligogalacturonsäuren) aus pektin­ haltigen Stoffen unter Einsatz von Fermentation.

Pektinstoffe kommen in vielen Pflanzen als Bausteine für das Zellwandgerüst vor. Sie können von pektolytischen En­ zymen, den sogenannten Lyasen, zu niedermolekularen unge­ sättigten Uroniden abgebaut werden, vgl. Albersheim et al. Helv. Chim. Acta 43 (1960) 1422. Dabei wird das Grundgerüst des Pektins nach Überführung in die entesterte Form (als Pektinsäure oder Polygalacturonsäure) in der Weise in kurz­ kettige Untereinheiten gespalten, daß an der vormaligen Verknüpfungsstelle eine Doppelbindung entsteht:

Durch Umsetzung von sogenannter niedermolekularer Pektinsäure aus Citrus-Pektin mit Pektatlyase wurde eine ungesättigte Verbindung isoliert und als O-(4-Desoxy-L-threohexopyranos-4- enyluronsäure)-(1-4)-D-galacturonsäure charakterisiert, vgl. Hasegawa und Nagel, J.Biol. Chem. 237 (1962) 619.

Im Laufe der Zeit ist über die Gewinnung von verschiedenen Pektatlyase-Typen aus Bakterien und Pilzen berichtet worden, vgl. Linhardt et al., Appl. Biochem. Biotech. 12 (1986) 135.

Auch die Isolierung der ungesättigten Reaktionsprodukte wurde bereits beschrieben und zwar wurde Anionenaustausch­ chromatographie von Nagel und Wilson, J. Chromatogr. 41 (1969) 410 und präparative Hochleistungs-Flüssigchromato­ graphie (HPLC) von Hotchkiss et al., Carbohydr. Res. 215 (1991) 81 vorgeschlagen.

Die Reaktions- und Produktkontrolle erfolgt vorzugsweise mittels Hochleistungs-Flüssigchromatographie, vgl. Preston und Rice, Carbohydr. Res., 215 (1991) 137-145.

Die Herstellung der o.g. ungesättigten Pektinsäure- (Poly­ galacturonsäure-) Spaltprodukte erfolgt daher in der Praxis in 4 Schritten, wobei die Verfahren mit Reinkulturen durchge­ führt werden.

Es wird in einem ersten Schritt zunächst das Enzym gewonnen (als Pektatlyase-Präparat bzw. Rohpräparat), etwa durch sterile Fermentation vorgereinigter Pektinpräparate mit Reinkulturen von Bakterien bzw. Pilzen, z. B. Bacillus sp.

In einem zweiten Schritt wird aus Reststoffen der Citrus- oder Apfelsaftherstellung gewonnenes recht kostenintensives reines Pektin benutzt und durch saure Hydrolyse Pektinsäure bzw. Polygalacturonsäure hergestellt.

Diese beiden Substanzen (Polygalacturonsäure und Pektatlyase) werden nunmehr in gepuffertem, wäßrigem Medium zur Reaktion gebracht.

Es entstehen ungesättigte Uronide, auch als ungesättigte Oligogalacturonsäuren bezeichnet. Sie werden abschließend noch durch chromatographische Verfahren isoliert.

Diese Form der Herstellung ungesättigter Uronide ist auf­ wendig und darüber hinaus mit hohen Kosten verbunden. Die Gewinnung der Enzyme ist kompliziert und kostspielig.

Außerdem müssen gereinigte Substrate Pektin benutzt und die Fermentation steril durchgeführt werden, so daß außerdem hohe Investitionskosten für die dafür notwendigen Fermenta­ tionseinrichtungen anfallen. Außerdem erfordert die aerob durchgeführten Fermentation einen hohen Energieaufwand zur Belüftung des Fermenters.

Die Verwendung der ungesättigten Uronide und ihrer homologen Oligomeren wird zunehmend interessanter, so wurde die Verwen­ dung als pharmazeutisches Präparat zur Prophylaxe und Thera­ pie in der Medizin bei Intoxikation mit toxischen Schwerme­ tallen in der DD 268 866 A1 vorgeschlagen und in der EP 0 294 879 A2 ihre Verwendung als Reaktionskomponente für die Michael-Addition angeregt.

Aufgabe der Erfindung ist es daher, ein kostengünstigeres Verfahren zur Herstellung von ungesättigten Uroniden aus pektinhaltigen Stoffen vorzuschlagen.

Diese Aufgabe wird dadurch gelöst, daß der pektinhaltige Stoff mit einer das Entstehen des Enzyms Pektatlyase för­ dernden Bakterienkultur versetzt und anaerob fermentiert wird, so daß gleichzeitig die pektinhaltigen Stoffe zumindest teilweise in Polygalacturonsäure umgewandelt werden, daß die Fermentation während des Vorgangs abgebrochen wird, daß nach dem Abbruch die entstandene Fermentationsflüssig­ keit von Bakterien befreit und eine katalytische Reaktion des entstandenen Enzyms Pektatlyase in der Fermentations­ flüssigkeit mit der Polygalacturonsäure gefördert wird, und daß das entstehende Produkt ungesättigter Uroniden iso­ liert wird.

Mit diesem Verfahren können als Ausgangsmaterialien Nebenpro­ dukte der Lebensmittelindustrie mit sehr niedrigem Preis, wie extrahierte Zuckerrübenschnitzel oder Kartoffelpülpe, ohne weitere Vorbehandlung verwendet werden. Da diese Aus­ gangsmaterialien zunehmend anfallen und ihre anderweitige Verwendung oder auch ihre Beseitigung als Abfall zunehmend erschwert ist, wird auf diese Weise zugleich eine Möglichkeit geschaffen, diese Nebenprodukte sinnvoll weiterzuverarbeiten.

Das erfindungsgemäße Verfahren macht sich zunutze, daß die pektinhaltigen Rohmaterialien sowohl zur Bildung der Polygalacturonsäure als auch des Enzyms Pektatlyase heran­ gezogen werden können. Nach Durchführung einer geeigneten Fermentation liegen sie auch beide in der Fermentationsflüs­ sigkeit, einer Kulturbrühe, vor. Dadurch wird die Anzahl der Verfahrensschritte bis zum biokatalytischen Abbau des Rohmaterials erheblich reduziert, zusätzlich wird eine ganze Anzahl von Reinigungsschritten und sonstigen Manipula­ tionen bei den Vorprodukten überflüssig.

Darüber hinaus können unsteril/anaerob, also auf besonders kostengünstige Weise gewonnene Biokatalysatoren eingesetzt werden. Gegenüber aus der Literatur bekannten Verfahren werden weit kostengünstigere Substrate und Enzyme eingesetzt und weniger und einfachere Verfahrensstufen angewendet, so daß alle Voraussetzungen für die brauchbare Anwendung des Verfahrens im technischen Bereich gegeben sind.

Verfahren zur Mischenzymproduktion mit bakteriellen Mischkul­ turen durch Umsetzung von polysaccharidhaltigen Substraten wie Extraktionsrückständen der Nahrungsmittel- und Zuckerin­ dustrie sind schon von Buchholz et al., Zuckerind. 113 (1988) 204, vorgeschlagen worden. Diese bakteriellen Mischkul­ turen können auch hier eingesetzt werden.

Die Erfindung macht es sich zunutze, daß bei dem verwendeten Fermentationsprozeß die Konzentration von gelöster Polygalac­ turonsäure einen Maximalwert erreicht und zwar zu einem Fermentationszeitpunkt, an dem die zweite notwendige Reak­ tionskomponente, das Pektatlyase-Rohenzym, ebenfalls im Fermentationsprozeß fast ihren endgültigen Maximalwert erreicht hat.

Dadurch wird es möglich, Polygalacturonsäure und das Enzym Pektatlyase gleichzeitig in einer einstufigen Reaktion als Substrat und Enzym zu erzeugen. Dazu werden z. B. Rüben­ preßschnitzel mittels Bakterienmischkulturen anaerob fermen­ tiert.

Am Maximum der Konzentration von gelöster Polygalacturonsäure sowie einer bereits sehr hohen Enzymaktivität wird die Fer­ mentation zunächst abgebrochen und die Kulturbrühe von Fest­ stoffen und Bakterien, etwa durch Mikrofiltration, befreit. Die Lösung wird anschließend mit Hilfe einer Querstrom-Ultra- Filtrationseinheit konzentriert.

Die entstehende konzentrierte Lösung wird nun auf Bedingungen eingestellt, die für die Lyase-Reaktion günstig sind, dies ist etwa ein pH-Wert von 8 und eine Temperatur von 37°C. Unter diesen Bedingungen bilden sich die gewünschten unge­ sättigten Uronide.

Dabei entstehen zunächst bevorzugt Tetramere und Pentamere, bei länger andauernder Reaktion jedoch zunehmend Trimere und letztlich Dimere. Wie sich gezeigt hat, sind vor allem Dimere, aber auch noch Trimere flexibler einsetzbar und sollten daher bevorzugt hergestellt werden.

Werden aus bestimmten Gründen gerade Tetramere, Pentamere oder Trimere als Reaktionsprodukt gewünscht, so kann einfach die Reaktion zu dem entsprechend gewählten Zeitpunkt abge­ brochen werden, um ein anderes Zusammensetzungsverhältnis in der Mischung zu erhalten.

Nach Abschluß der Reaktion wird die Reaktionslösung durch bekannte chromatographische Verfahren aufgearbeitet.

Das Verfahren wird besonders kostengünstig, wenn als pektin­ haltige Stoffe pflanzliche Gerüstsubstanzen eingesetzt werden, wie erwähnt besonders bevorzugt Zuckerrübenschnitzel oder Kartoffelpülpe.

Die Fermentation läuft vorzugsweise bei einem pH-Wert von 6 bis 7, vorzugsweise von 6,5. Sie sollte bei einer Tempe­ ratur von 30 bis 40°C, vorzugsweise bei 35°C, durchgeführt werden.

Die entstandene Fermentationslösung (Kulturbrühe) wird bevorzugt nach dem Abbrechen mittels eines Mikrofilters von Bakterien und Feststoffen befreit und/oder mittels einer Querstrom-Ultra-Filtrationseinheit konzentriert.

Die weitere Umsetzung der Polygalacturonsäure in der Fermen­ tationsflüssigkeit mittels des Enzyms Pektatlyase erfolgt vorzugsweise bei einer Temperatur zwischen 25 und 45, insbesondere 37°C.

Dabei sollte ein pH-Wert zwischen 6 und 9, insbesondere bei 8, eingehalten werden.

Der Umsetzungsprozeß sollte mehr als 6 Stunden, vorzugsweise 24 Stunden, durchgeführt werden, um einen möglichst hohen Gehalt an Uronid-Dimeren zu erhalten.

In bestimmten Fällen empfiehlt es sich, ein technisch weniger günstiges, dafür aber zu höheren Ausbeuten führendes abgewan­ deltes Verfahren zu bevorzugen. Es dient z. B. zur Gewinnung von Standardsubstanzen, die für die Kontrolle des Gewinnungs­ prozesses dienen. Da hier wirtschaftliche Gesichtspunkte nur eine untergeordnete Rolle spielen, wird diese aufwendige­ re Verfahrensvariante angewendet.

Sie zeichnet sich dadurch aus, daß die anaerobe Fermentation so durchgeführt wird, daß unterschiedliche Fermentations­ flüssigkeiten entstehen, vorzugsweise durch Abbrechen der Fermentation zu unterschiedlichen Zeitpunkten und daß anschließend das weitere Verfahren mit einer Mischung aus den beiden Fermentationsflüssigkeiten fortgesetzt wird.

Durch diese Verfahrensmaßnahme können beide Reaktionskompo­ nenten im wesentlichen gleich hergestellt, aber zu unter­ schiedlichen Abbruchszeiten zu ihrem jeweiligen, nicht exakt identischen Maximalwert gewonnen werden.

Dabei wird in der einen Fermentationslösung, die optimal auf die Gewinnung auf Polygalacturonsäure ausgerichtet ist, keine Ultrafiltration durchgeführt. Dadurch werden auch Polygalacturonsäurebruchstücke mit einem Molekular­ gewicht unterhalb von 3000 der anschließenden Enzymreaktion zugänglich.

Im folgenden wird anhand zweier Beispiele das erfindungsge­ mäße Verfahren näher erläutert. Die Zeichnung dient dabei zur Erläuterung.

Es zeigt:

Fig. 1 den zeitlichen Verlauf der Fermentation; aufgetragen sind Pektatlyase-Aktivität und Polygalacturonsäure­ anteil; und

Fig. 2 den zeitlichen Verlauf der Lyasereaktion; aufgetragen ist die Konzentration der verschiedenen ungesättigten Oligogalacturonsäuren.

Es wird zunächst in einem Beispiel die Reaktionsführung für die Bildung eines ungesättigten Diuronids beschrieben.

Zunächst wird diskontinuierlich aber gleichzeitig das Enzym Pektatlyase sowie das Substrat Polygalacturonsäure herge­ stellt.

In einem 150-l-Rührfermenter mit Blattrührer, der 200 mm Durchmesser besitzt und mit einer Drehzahl von 120 U/min betrieben wird, werden 140 l Leitungswasser und 14 kg feuchte Rübenpreßschnitzel (5,2 kg Trockensubstanz) gegeben und mit Inoculum angeimpft. Als Inoculum (Starterkultur) dient ein an das Substrat angepaßter Versäuerungsschlamm. Dieser wird dadurch gewonnen, daß Bakterienschlamm aus einer anaeroben Abwasserreinigung (Herkunft, z. B. kommunale Kläranlage) in einer Konzentration von 0,5 kg Trockenmasse je Liter Flüssig­ keit mit Rübenpreßschnitzeln bei einem Feststoffgehalt von 20 g Trockensubstanz je Liter bei 35 bis 40°C 48 Stunden fer­ mentiert wird. Nach dem Abtrennen des groben Feststoffes enthält der Überstand eine Bakterientrockensubstanz von 1 bis 2 g je Liter Suspension.

Die Fermentation wird durch Zugabe von 1 Liter Inoculum ge­ startet und unter Luftabschluß durchgeführt. Die Fermentation erfolgt bei 35°C und einem pH-Wert von 6,5, der automatisch durch Zugabe von 25%iger Natronlauge korrigiert wird. Nach einer Lag-Phase von ca. 10 Stunden beginnen die Mikroorganis­ men, die gewünschten Enzyme in das Medium auszuscheiden.

Wie Fig. 1 zeigt, ist nach etwa 38 Stunden das Maximum an Substrat (Polygalacturonsäure) in Lösung erreicht, ein weiteres Fermentieren würde den Polygalacturonsäureanteil relativ schnell wieder abfallen lassen.

Zum gleichen Zeitpunkt ist praktisch das Maximum der Enzym­ aktivitäten ebenfalls schon erreicht.

Zu diesem Zeitpunkt (nach 38 Stunden) enthält die Kulturbrühe bzw. Kulturflüssigkeit eine Pektatlyaseaktivität von 3,5 nkat/ml und eine Konzentration von Polygalacturonsäure von 2,0 g/l.

An dieser Stelle wird daher die Fermentation abgebrochen.

Aus dem Fermenter wird die Fermentationsflüssigkeit abgezo­ gen, grob gefiltert sowie nachfolgend mit Hilfe einer Quer­ strom-Mikrofiltrationseinheit mit einer Ausschlußgrenze von 0,2 µm von Bakterien und Feststoff befreit, gesammelt und über eine Ultrafiltrationseinheit (Prinzip "hollow fiber") mit einer Ausschlußgrenze von 3000 g/mol konzentriert.

Die Fermentationslösung enthält nun das Enzym Pektatlyase als auch das Substrat Polgalacturonsäure. Diese beiden Reak­ tionskomponenten werden nunmehr zu ungesättigter Digalactu­ ronsäure verarbeitet, also zu (O-(4-Desoxy-L-threo-hexo­ pyranosido-4-enyluronsäure)-(1-4)-D-galacturonsäure).

Hierzu werden 50 ml des Konzentrats (Konzentrierungsfaktor 10) auf einen pH-Wert von 8,0 eingestellt und bei 37°C inkubiert. Die Bildung der ungesättigten Digalacturonsäure wird mittels Hochleistungsanionenaustausch-Chromatographie (HPAEC) verfolgt. Nach Beendigung der Reaktion, etwa nach 24 Stunden, wird die Reaktionslösung aufgearbeitet.

Wird die Reaktion vor dem Ablauf von 24 Stunden gestoppt, vgl. Fig. 2, entstehen nicht die gewünschten Dimere, sondern längerkettige ungesättigte Uronide.

Es folgt jetzt noch die Produktisolierung.

Das Reaktionsgemisch wird zur Abtrennung von kationischen und neutralen Begleitstoffen über eine Anionenaustauscher­ säule (Amberlite IRA 400, Formiat-Form, Bettvolumen 65 cm³) gegeben. Die auf dem Harz verbleibenden anionischen Produkte werden nach einem Waschvorgang (500 ml H₂O) mit 500 ml 0,2 m Natriumformiatlösung (pH 4,7) eluiert. Das Produkt wird durch Zugabe von 150 mg Sr(NO₃)₂ und 6 Vol. Ethanol aus der Puffer­ lösung ausgefällt. Nach Zentrifugation wird das Präzipitat in wenig Wasser gelöst und über eine Kationenaustauschersäu­ le (Amberlite IR 120, Bettvolumen 65 cm³) gegeben. Nach Gefriertrocknung des Eluats erhält man 250 mg ungesättigte Digalacturonsäure. Das entspricht einer Ausbeute von 25% bezogen auf Polygalacturonsäure in Lösung (Reinheit 80%, mit HPLC bestimmt).

Eine weitere Aufreinigung (95% Reinheit) gelingt mittels präparativer HPLC. Dazu werden 250 mg des Präparats (80%ige Reinheit) auf eine präparative Hochleistungssäule (NH₂-Phase, 25×3,2 cm ) gegeben und mit 0,11 m Natriumacetatlösung, pH 6,5 bei einer Fließrate von 25 ml/min eluiert. Das Produkt wird durch Zusatz von 150 mg Sr(NO₃)₂ und 6 Vol. Ethanol ausgefällt. Nach Zentrifugation wird das Präzipitat in wenig Wasser gelöst und über eine Kationenaustauschersäule (Amberlite IR 120, Bettvolumen 65 cm³) gegeben. Nach Gefrier­ tocknung erhält man 210 mg ungesättigte Digalacturonsäure (95%ige Reinheit).

In einem zweiten Beispiel sei noch die Gewinnung von Stan­ dardsubstanzen für die Chromatographie erläutert. Die Aus­ beute kann um den Faktor 2 erhöht werden, wenn Enzym- und Substratherstellung zwar grundsätzlich wie im ersten Bei­ spiel, jedoch in zwei Fermentationen durchgeführt werden, um jeweils einzeln aufeinander abgestimmte optimale Zusammen­ setzungen zu erhalten.

Darüber hinaus wird die Substratlösung ohne Ultrafiltration hergestellt. Dabei werden auch Polygalacturonsäurebruchstücke mit einem Molekulargewicht von weniger als 3000 der anschlie­ ßenden Enzymreaktion zugänglich.

Die Umsetzung der Substratlösung mit der Enzymkonzentrat­ lösung erfolgt so, daß 200 ml der Substratlösung auf einen pH-Wert von 8,0 eingestellt werden. Nach Zugabe von 2 ml der Enzymkonzentratlösung wird die Reaktionslösung 30 Stunden bei 37°C inkubiert.

Schließlich erfolgt die Aufarbeitung wie im ersten Beispiel. Man erhält 200 mg ungesättigter Digalacturonsäure. Das entspricht einer Ausbeute von 50% bezogen auf Polygalac­ turonsäure in Lösung.

Claims (14)

1. Verfahren zur Herstellung von ungesättigten Uroniden aus pektinhaltigen Stoffen unter Einsatz von Fermentation, dadurch gekennzeichnet,
daß der pektinhaltige Stoff mit einer das Entstehen des Enzyms Pektatlyase fördernden Bakterienkultur versetzt und anaerob fermentiert wird, so daß gleichzeitig die pektinhaltigen Stoffe zumindest teilweise in Polygalac­ turonsäure umgewandelt werden,
daß die Fermentation während des Vorgangs abgebrochen wird,
daß nach dem Abbruch die entstandene Fermentationsflüssig­ keit von Bakterien befreit und eine katalytische Reaktion des entstandenen Enzyms Pektatlyase in der Fermentations­ flüssigkeit mit der Polygalacturonsäure gefördert wird, und
daß das entstehende Produkt ungesättigter Uroniden iso­ liert wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die pektinhaltigen Stoffe pflanzliche Gerüstsubstanzen sind.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die pektinhaltigen Stoffe Zuckerrübenschnitzel oder Kartoffelpülpe sind.

4. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Fermentation bei einem pH-Wert von 6 bis 7, vorzugsweise 6,5, durchgeführt wird.

5. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Fermentation bei 30° bis 40°C, vorzugsweise bei 35°C, durchgeführt wird.

6. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Fermentation im Bereich der maximalen Konzentra­ tion von gelöster Polygalacturonsäure abgebrochen wird.

7. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Fermentation nach 35 bis 40 Stunden, vorzugsweise nach 38 Stunden, abgebrochen wird.

8. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die entstandene Fermentationsflüssigkeit nach dem Abbrechen mittels Mikrofiltration von Bakterien und Feststoffen befreit wird.

9. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die entstandene Fermentationsflüssigkeit nach dem Abbrechen mittels einer Querstrom-Ultra-Filtrationseinheit konzentriert wird.

10. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Umsetzung der Polygalacturonsäure mittels des Enzyms Pektatlyase bei einer Temperatur zwischen und 25° und 45°C, vorzugsweise 37°C, erfolgt.

11. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Umsetzung der Polygalacturonsäure mittels des Enzyms Pektatlyase bei einem pH-Wert zwischen 6 und 9, vorzugsweise 8, erfolgt.

12. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der Umsetzungsprozeß der Polygalacturonsäure mittels des Enzyms Pektatlyase mehr als 6 Stunden, vorzugsweise 24 Stunden, durchgeführt wird.

13. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Isolierung der ungesättigten Uronide durch Fällung und/oder säulenchromatographische Verfahren erfolgt.

14. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche,
dadurch gekennzeichnet,
daß die anaerobe Fermentation so durchgeführt wird,
daß unterschiedliche Fermentationsflüssigkeiten entstehen, vorzugsweise durch Abbrechen der Fermentation zu unter­ schiedlichen Zeitpunkten und
daß anschließend das weitere Verfahren mit einer Mischung aus den beiden Fermentationsflüssigkeiten fortgesetzt wird.