DE4228457A1

DE4228457A1 - Herstellung von heterodimerem PDGF-AB mit Hilfe eines bicistronischen Vektorsystems in Säugerzellen

Info

Publication number: DE4228457A1
Application number: DE4228457A
Authority: DE
Inventors: Wolfram Dr Eichner; Volker Dr Achterberg; Albrecht Doerschner; Wolfgang Dr Meyer-Ingold; Heiko Mielke; Wilhelm Dr Dirks; Manfred Dr Wirth; Hansjoerg Dr Hauser
Original assignee: Beiersdorf AG
Current assignee: Beiersdorf AG
Priority date: 1992-08-27
Filing date: 1992-08-27
Publication date: 1994-04-28
Also published as: JP3515111B2; AU4953893A; DE59309088D1; WO1994005786A1; DK0658199T3; US5665567A; ES2124321T3; US5935819A; EP0658199B1; EP0658199A1; JPH08502884A

Description

Die Erfindung betrifft die rekombinante Herstellung von PDGF-AB (rPDGF-AB) in Säugerzellen als Wirtszellen, welches im wesentli chen frei ist von den homodimeren Begleitprodukten PDGF-AA und -BB.

Seit vielen Jahren ist es möglich, einzelne Proteine, deren Gene durch Klonierung isoliert wurden, nach Manipulation und Gen transfer in verschiedenen prokaryontischen und eukaryontischen Zellen herzustellen. Für das Erreichen der vollen biologischen Aktivität vieler Proteine sind korrekte Faltungen, richtiges Prozessieren und gegebenenfalls auch posttranslationale Modifikationen erforderlich, welche in prokaryontischen und niederen eukaryontischen Expressionssystemen oftmals nicht kor rekt ausgeführt werden. Aus diesem Grund bedient man sich häufig Säugerzellen als Wirte. Säugerzellen sind darüber hinaus in der Lage, große Mengen von Proteinen zu sekretieren.

Aus verschiedenen Gründen bedarf es oftmals der simultanen Her stellung zweier oder mehrerer Proteinketten. Zum Beispiel sind viele natürliche Proteine in ihrer funktionellen Form aus mehreren Untereinheiten zusammengesetzt (z. B. Antikörper). Na türlicherweise erfolgt die Assoziation verschiedener Unterein heiten von komplexen Proteinen nach der Proteinsynthese. An dieser Assoziation sind häufig andere Komponenten des zellulären Apparates als Katalysatoren oder Kontrollelemente beteiligt, wobei es gelegentlich auch zu Umfaltungen der ursprünglichen Strukturen kommt. Störungen der Assoziation, z. B. durch unglei che Synthese der einzelnen Komponenten, können sowohl für die zu bildenden Proteine als auch für die Wirtszelle negative Konse quenzen haben. Natürlicherweise unterliegt dieses System einer ausgefeilten, meist zellspezifischen Regulation. Da diese Regu lation in genetisch manipulierten Zellen im allgemeinen nicht nachstellbar ist, wurden die nachfolgend erläuterten Alternati ven zur simultanen Herstellung mehrerer Fremdproteine entwickelt und angewandt.

1. Die Gene werden getrennt in Expressionsvektoren integriert und dann in einem geeigneten Verhältnis in die Zellen co transferiert. Dies setzt voraus, daß mehrere Plasmidkopien gleichzeitig stabil aufgenommen und bei der Teilung weiter getragen werden. Das Verhältnis der Expression der verschie denen Gene zueinander hängt sowohl von der Kopienzahl als auch von der Integrationsstelle im Genom der Wirtszelle ab. Durch aufwendige Screeningverfahren ist es möglich, Zell klone zu isolieren, welche die einzelnen Genprodukte im gewünschten Verhältnis zueinander exprimieren.
2. Um die Kopienzahl zu nivellieren, werden die verschiedenen Gene in unabhängigen Transkriptionseinheiten auf einem Vek tor plaziert. Dies sichert weitgehend die stöchiometrische Repräsentanz der Gene, aber auch dieses Verfahren ist mit Problemen behaftet. Selbst wenn nämlich Expressionseinheiten mit Promotoren gleicher Stärke verwendet werden, ist keines wegs sichergestellt, daß die mRNAs, welche für die verschie denen Proteine kodieren, die gleiche Stabilität und Transla tionseffizienz aufweisen. Auch die Transkriptionseffizienz beider Gene muß nicht zwangsläufig identisch sein. In diesem Fall wird mit Hilfe von gentechnischen Tricks (Positionie rung der Transkriptionseinheiten zueinander, Modulation der Stärke der einzelnen Promotoren durch Wegnehmen oder Hinzu fügen einzelner Elemente) die Stöchiometrie der Expression schrittweise hergestellt.
3. Zur Vermeidung der Probleme im Zusammenhang mit der Stabili tät der mRNA verschiedener Transkripte wurden bi- oder mul ticistronische Vektoren entwickelt. Hierzu liegen die ein zelnen Leseraster der die Proteinketten kodierenden Genab schnitte - Cistrons - auf einer Transkriptionseinheit (Ex pressionseinheit). Die Expression des multicistronischen Gens erfolgt durch einen einzigen Promotor. Bei derartigen Vektoren wird normalerweise das erste Cistron sehr effizient translatiert, die nachfolgenden aber in Abhängigkeit von den intercistronischen Sequenzen. Verwendet man für diese inter cistronischen Sequenzen normale 5′ nicht translatierte Se quenzen (5′UTR) aus monocistronischen Genen, so ist die Expression des nachfolgenden Cistrons meist sehr niedrig (in der Regel um 0,5 bis 2% der Translation des ersten Cistrons, Kaufman et al., 1987; Boel et al., 1987). Diese Effizienz konnte zunächst durch Einfügen von Leadersequenzen (High Efficiency Leadern, HEL) auf etwa 20% gesteigert werden. Mit der Entdeckung und Verwendung von bestimmten zellulären und viralen Sequenzen, welche eine interne Translationsinitia tion ermöglichen (IRES; Jackson et al., 1990), war es mög lich, ein Translationsverhältnis zwischen dem ersten und dem nachfolgenden Cistron von 3 : 1 zu erzielen.

Die Schlüsselrolle bei der Verwendung bi- oder multicistroni scher Vektoren spielt die Translation. Normalerweise erfolgt die Initiation der Translation in Eukaryonten nach dem "cap"-abhän gigen Mechanismus, im Verlaufe dessen ein Prä-Initiationskomplex aus Proteinen und RNA am 5′ Ende einer mRNA mit "cap" (methylier tes Nukleotid) aufgebaut wird. Von dort aus wird ein geeignetes Translationsinitiationskodon ausgesucht, von dem ausgehend die Translation gestartet wird. Man glaubt, daß dies über einen "Scanning"-Prozeß abläuft, wobei sich der Prä-Initiationskomplex entlang der mRNA in 3′ Richtung bewegt. Auf diese Weise wird, von einigen Ausnahmen abgesehen, immer das am 5′ Ende liegende Ci stron effizient translatiert (Kozak, 1989). Alle nachfolgenden Cistrons werden gar nicht oder sehr ineffizient translatiert. Die Translations-Effizienz der nachfolgenden Cistrons konnte durch Optimierung des Abstandes zwischen den Genen (intercistro nische Regionen; Kozak, 1987; Wirth et al., 1991) oder durch Verwendung von sogenannten "high efficiency leader"-Sequenzen (HEL, s. o.) verbessert werden (z. B. Falcone und Andrews, 1991 und Ref. darin). HEL′s sind solche 5′ nicht translatierten Be reiche von Genen oder auch anderen Sequenzen, welche die Initia tion der "cap"-abhängigen Translation stimulieren. Auch bei derartigen Konstrukten sind jedoch die erreichbaren Expressions werte für das zweite und die nachfolgenden Cistrons immer deut lich geringer als die des "cap"-abhängig regulierten ersten Cistrons.

Ein in den letzten Jahren auf gedeckter Mechanismus zur internen Translationsinitiation benutzt spezifische Nukleinsäuresequen zen. Zu diesen Sequenzen zählen die nicht translatierten Berei che einzelner Picorna-Viren, z. B. Polio-Virus, Encephalomyocar ditis-Virus, (Pelletier und Sonenberg, 1988; Jang et al., 1988; Jang et al., 1989) sowie einiger zellulärer Proteine, z. B. BiP (Macejak und Sarnow, 1991). Bei den Picorna-Viren sorgt ein kur zer Abschnitt des 5′nicht translatierten Bereichs, das sogenann te IRES (internal ribosomal entry site), für die interne Bindung eines Prä-Initiationskomplexes. Darüber hinaus sind weitere Bereiche aus dieser Region für die effiziente Initiation dieser Translation notwendig. So zeigt es sich z. B., daß für eine effi ziente Translation nicht nur die 400 Basenpaare stromaufwärts des IRES, sondern auch der extreme 5′-Teil der Picorna-Virus nicht-translatierten Region notwendig ist (Simoes und Sarnow, 1991). Auf der anderen Seite führt das "capping", die Voraus setzung für den normalen Initiationsmechanismus der Translation, zu einer Reduktion der Effizienz der internen Initiation von Polio-Virus IRES, wenn er am 5′Ende einer entsprechenden mRNA lokalisiert ist (Hambidge und Sarnow, 1991). Der negative Effekt wird aufgehoben, wenn die IRES für die Initiation des zweiten Cistrons verantwortlich ist, also zwischen "cap" und IRES ein Cistron liegt.

IRES-Elemente können also als Initiatoren für die effiziente Translation von Leserastern fungieren. Dabei beeinflussen sie die "cap"-habhängige Translation des ersten Cistrons nicht. Auch umgekehrt scheint eine Beeinflussung der IRES-abhängigen Ini tiation unabhängig von der "cap"-abhängigen Translationsinitia tion zu sein. Die Mechanismen beider Vorgänge unterscheiden sich auch deutlich in der Verwendung verschiedener zellulärer Fakto ren (Meerovitch et al., 1989; Jang und Wimmer, 1990). In der vergangenen Zeit wurden mehrere Untersuchungen publiziert, bei denen bicistronische Expressionsplasmide verwendet wurden (Adam et al., 1991; Ghattas et al., 1991; Kaufman et al.,1991; Wood et al., 1991; Wirth et al., 1991). Da aber offensichtlich die "cap"-abhängige Translation stärker ist als die IRES-abhängige Translation, konnte eine stöchiometrische Expression zweier Proteinketten nicht erreicht werden. Die bisherigen Verwendungen konzentierten sich deshalb auf die Verwendung von Selektions markern im zweiten Cistron. Die enge Expressionskoppelung des Selektionsmarkers mit dem zu exprimierenden Gen, welches das erste Cistron darstellt, ist besonders vorteilhaft bei der Se lektion auf Hochexpression, insbesondere, wenn eine vorausge hende Genamplifikation erforderlich ist.

Die Synthese äquimolarer Proteinmengen von bi- oder multicistro nischen Expressionsvektoren ist jedoch bisher nicht erreicht worden. Die äquimolare Expression zweier verschiedener Protein ketten ist für die rekombinante Herstellung des Wachstumsfak tors aus Blutplättchen, "Platelet-Derived-Growth-Factor" (PDGF), einem der Hauptmitogene im menschlichen Blutserum, von besonde rer Bedeutung. Aus menschlichen Thrombozyten aufgereinigtes PDGF besteht aus zwei unterschiedlichen, aber nahe verwandten Poly peptidketten, die durch Disulfidbrücken miteinander verknüpft sind. Unter reduzierenden Bedingungen zerfällt das dimere PDGF in seine monomeren Untereinheiten, wovon die größere (M_r 15- 17.000 D) als PDGF-A-Kette und die kleinere (M_r 14.000 D) als PDGF-B-Kette bezeichnet wurde (Johnsson et al., 1984).

Die Proteinketten PDGF-A und -B werden von verschiedenen Genen kodiert. Die vollständige Struktur beider Genprodukte konnte durch cDNA-Klonierung aufgeklärt werden (Ratner et al., 1985, Betsholtz et al., 1986). Dabei zeigte es sich, daß beide PDGF- Moleküle zunächst als ungewöhnlich lange Vorläufermoleküle, sog. Precursoren, synthetisiert und anschließend intrazellulär zu den reifen PDGF-Ketten prozessiert werden. Durch alternatives Spli cen lassen sich zwei verschiedene PDGF-A-Transkripte erklären, die sich durch An- oder Abwesenheit eines 69-bp Segmentes im 3′- Bereich unterscheiden (Betsholtz et al., 1986; Wise et al., 1989). Durch dieses Insert kommt es zu einer Änderung im codie renden Abschnitt mit der Folge, daß eine kurze (PDGF-A_K, 110 Aminosäuren) und eine lange (PDGF-A_L, 125 Aminosäuren) Form der PDGF-A-Kette gebildet wird. Beide Varianten sind als normale zelluläre Proteine nebeneinander nachweisbar, wobei die kürzere Form die häufigere Spezies ist (Matoskova et al., 1989; Young et al., 1990).

Beide Gene sind auf unterschiedlichen Chromosomen lokalisiert und zeigen einen hohen Homologiegrad. Eine Vielzahl von Arbeiten zeigt, daß beide Gene unterschiedlichen Regulationsmechanismen unterliegen. Eine Folge davon ist, daß beide PDGF-Ketten natür licherweise in verschiedenen Zelltypen in unterschiedlichem Verhältnis zueinander produziert werden.

Alle drei möglichen Isoformen des PDGF (AA, AB und BB) kommen natürlicherweise vor und sind in Thrombozyten in sogenannten α-Granula gespeichert. Aus überlagerten menschlichen Blutplätt chen kann neben dem die Hauptmenge bildenden PDGF-AB Heterodimer auch PDGF-BB zu etwa 30% isoliert werden (Hammacher et al., 1988). Frisch präparierte Blutplättchen enthalten auch einen hohen Anteil (27%) an PDGF-AA (Hart et al., 1990). Es kann daher angenommen werden, daß in den Vorläuferzellen der Thrombozyten, den Megakaryozyten, der Anteil beider Homodimere zusammen etwa dem AB-Heterodimer-Anteil entspricht. Da die Konzentration jeder PDGF-Spezies im Thrombozyten direkt korrelieren sollte mit ihrer individuellen Bedeutung im Wundheilungsgeschehen, kommt insbe sondere der häufigsten Isoform, dem PDGF-AB, eine herausragende Bedeutung auf der Suche nach einem "Wundheilungshormon zu.

Jede der verschiedenen Isoformen besitzt biologische Aktivität in vitro. Erst die Verfügbarkeit der hochreinen, rekombinanten PDGF-Isoformen (Hoppe et al., 1989; Hoppe et al., 1990) machte vergleichende Studien zur Differenzierung der unterschiedlichen Wirkungsspektren der verschiedenen PDGF-Spezies möglich. Inzwi schen belegen eine Reihe von Untersuchungen die unterschiedliche Potenz von PDGF-AA, AB und BB im Chemotaxis- und DNA-Prolifera tionstest (Hosang et al., 1989; Nister et al., 1988; Reilly & Broski, 1989; Siegbahn et al., 1990), sowie deren unterschiedli chen Einfluß auf die Freisetzung von Inositol-1,4,5-trisphos phat, Produktion von Diacylglycerol und [Ca²⁺]_i-Mobilisierung (Block et al., 1989; Sachinidis et al., 1990 A, 1990 B). Zwei unterschiedliche PDGF-Rezeptorpopulationen, von denen der PDGF-α-Rezeptor alle PDGF-Isoformen und der β-Rezeptor nur PDGF-BB bindet (Hart et al., 1988; Heldin et al., 1988) liefern eine plausible Erklärung dafür, wie sich Wirkungsunterschiede der PDGF-Isoformen über deren unterschiedliche Potenz zur Rezep toraktivierung entfalten können. Die meßbaren unterschiedlichen in vitro-Effekte der PDGF-Isoformen, zusammen mit dem Nachweis zweier verschiedenener Rezeptorpopulationen, lassen Rückschlüsse auf unterschiedliche in vivo Wirkungsspektren von PDGF-AA, AB und BB zu. Daher ist die Produktion von reinem PDGF-AB, ohne PDGF-BB oder PDGF-AA als Begleitproteine, wünschenswert. Um ein homogenes, gut charakterisiertes Heterodimer zu erhalten, müßten die Homodimere sonst durch Reinigung vollständig eliminiert werden, was durch die sehr ähnlichen chromatographischen Eigen schaften aller PDGF Spezies zusätzlich erschwert wird.

Eine Reihe verschiedener Wege zur Herstellung von rekombinanten PDGF-Homodimeren, insbesondere PDGF-BB, sind zum Teil schon seit längerer Zeit bekannt (Kelly et al., 1985; Heldin et al., 1986; Hoppe et al., 1989; Beckmann et al., 1988; Bywater et al., 1988; Stroobant & Waterfield 1984). Ein Herstellungsverfahren für hochreines PDGF-AB wurde von Hoppe et al. (1990, s.a. PCT/EP 90/00 063) beschrieben. Hier werden die getrennt in unterschied lichen E.coli-Zellen hergestellten, inaktiven Monomere durch in vitro-Renaturierung in biologisch aktives PDGF-AB überführt.

Die bislang synthetisierten Genprodukte der drei PDGF-lsoformen weisen, trotz variierender Länge der A- bzw. B-Einzelstränge, weitgehend übereinstimmende biologische Aktivität auf.

Für die heterologe Expression von PDGF-AB Heterodimeren in euka ryontischen Systemen gelten die eingangs erwähnten Kriterien der simultanen Expression zweier (oder mehrerer) Proteine. Die bisher publizierten Strategien zur Herstellung von PDGF-AB in rekombinanten CHO-Zellen (Östman et al., 1988) und mit Hilfe von Hefe-Expressionssystemen [EP 0 259 632] entsprechen dem oben unter 2) erläuterten Fallbeispiel, wo sich beide PDGF-Gene in unabhängigen Transkriptionseinheiten auf einem Vektor befinden. Die Quantifizierung der auf diese Weise in CHO-Zellen exprimier ten unterschiedlichen PDGF-Dimere ergab 19% für PDGF-AA, 69% für PDGF-AB und 12% für PDGF-BB (Östman et al., 1988).

Eine Grundvoraussetzung für die bevorzugte Synthese von PDGF-AB Heterodimeren mit Hilfe eukaryontischer Expressionssysteme ist daher nicht nur in der stöchiometrischen Repräsentanz beider Gene, sondern in erster Linie auch in deren koordinierter Ex pression zu sehen. Daher bieten sich bicistronische Expressions einheiten als mögliche Hilfsmittel für die Expression heterodi merer Proteine und damit des PDGF-AB an. In WO 90/01550 wird ein derartiges System auch für die Expression von PDGF beschrieben. Wie unter Punkt 3) oben näher erläutert, liefern diese Konstruk te jedoch nur sehr limitierte Expressionsraten für das zweite (und nachfolgende) Cistron. Abhängig von der im ersten Cistron lokalisierten PDGF-Kette werden vorwiegend Homodimere dieses Typs gebildet. Bisher in der Literatur beschriebene Versuche, beide PDGF-Gene mit Hilfe anderer Expressionssysteme in einer eukaryontischen Zelle zu exprimieren, führten zu Homodimer-Ne benproduktanteilen im Bereich von 30% oder mehr. Um dennoch mit diesen Zellsystemen PDGF-AB zu erhalten, müssen aufwendige und extrem verlustreiche Reinigungstechniken angewendet werden.

Aufgabe der Erfindung ist es daher, ein Expressionssystem zu schaffen, mit Hilfe dessen PDGF-AB ohne wesentliche Verunreini gung durch die jeweiligen Homopolymere hergestellt werden kann.

Erfindungsgemäß konnte die Aufgabe durch die Verwendung eines Konstrukts gelöst werden, welches in an sich bekannter Weise von der IRES-Sequenz zwischen dem ersten und zweiten Cistron Gebrauch macht, jedoch das für PDGF-B kodierende Gen in das erste Cistron einbringt. Überraschenderweise hat es sich erfin dungsgemäß gezeigt, daß die Wirtszellen nach Transfektion mit diesen Konstrukten PDGF-AB ohne nennenswerten Anteil an Homodi meren sezernieren. Ausbeute und Wirtschaftlichkeit der nachge schalteten Proteinreinigungsverfahren wird dadurch beträchtlich verbessert.

Gegenstand der Erfindung ist demgemäß eine bicistronische Ex pressionseinheit zur rekombinanten Herstellung von heterodimerem PDGF-AB in Säugerzellen als Wirtszellen, welche gekennzeichnet ist durch die allgemeine Formel

p - 5′UTR - C₁ - IRES - C₂ - 3′UTR - polyA,

in der
p ein transkriptionaler Promotor ist,
5′UTR eine nicht translatierte Nukleotidsequenz ist,
C₁ ein Cistron ist, welches ein für die B-Kette von PDGF, ein biologisch aktives Analogon oder ein Fragment derselben kodierendes Gen enthält,
IRES eine Nukleotidsequenz viralen, zellulären oder synthetischen Ursprungs ist, die in der Stufe der Translation für die interne Initiation verantwortlich ist,
C₂ ein Cistron ist, welches ein für die A-Kette von PDGF oder ein biologisch aktives Analogon oder ein Fragment derselben kodierendes Gen enthält,
3′UTR eine nicht translatierte Nukleotidsequenz,
und polyA ein Polyadenylierungssignal ist,
wobei C₁, IRES und C₂ operativ miteinander verknüpft sind.

Als Promotoren kommen alle diejenigen Promotoren in Betracht, die in eukaryontischen Zellen wirksam sind, d. h., die die Gen expression in eukaryontischen Zellen initiieren können. Insbe sondere können alle konstitutiven und induzierbaren Promotoren viralen (beispielweise die "Long terminal repeats", LTR′s, von Retroviren oder Herpes Simplex Thymidin-Kinase Promotor), zel lulären (beispielsweise Interferon- oder Ubiquitin-Promotor) oder synthetischen Ursprungs verwendet werden. Erfindungsgemäß ist der SV40-Promotor bevorzugt.

Die 5′UTR und die 3′UTR sind beliebige, in der Regel nichttrans latierte Nukleotidsequenzen, die regulierende Elemente enthalten können. Erfindungsgemäß geeignet sind beispielsweise die Sequen zen aus SV-40 nach Artelt et al. (1988).

Das erste Cistron, C₁, kann die vollständige PDGF-B Vorläuferse quenz (SEQ ID Nr. 2), deren Analoga und jegliches Fragment ent halten, welches für eine biologisch wirksame PDFG-B Kette ko diert. Insbesondere kommen in diesem Zusammenhang das zur PDGF- B-Kette homologe v-sis-Gen (Produkt des Simian Sarcoma Virus (SSV)) sowie die Basenpaare 283 bis 609 gemäß SEQ ID Nr. 2 in Betracht, welche die reife PDFG-B Kette kodieren.

Analog kann das zweite Cistron, C₂, die lange oder kurze PDGF-A Vorläufersequenz (PDGF-A_L oder PDGF-A_K - SEQ ID Nr. 1) sowie jegliche Fragmente enthalten, welche für eine biologisch aktive PDGF-A Kette kodieren. In Betracht kommt insbesondere das Frag ment gemäß den Basenpaaren 353 bis 682 gemäß SEQ ID Nr. 1, wel ches für die reife PDGF-A Kette kodiert.

Als IRES können alle diejenigen Sequenzen viralen, zellulären oder synthetischen Ursprungs verwendet werden, welche eine in terne Bindung der Ribosomen vermitteln. Beispiele für derartige Sequenzen sind die IRES aus Poliovirus Typ 1 gemäß SEQ ID Nr. 3, welche die ersten 628 Nukleotide der 5′ nicht-translatierten Region des Poliovirus Typ 1 einschließt, sowie ferner die 5′UTR des Enzephalomyocarditis Virus (EMV), des "Theilers murine ence phalomyelitis virus" (TMEV), des "foot and mouth disease virus" (FMDV), des "bovine enterovirus" (BEV), des "coxsackie B virus" (CBV), des "human rhinovirus" (HRV) und die "human immunoglobu lin heavy chain binding protein" (BIP) 5′UTR, die Drosophila Antennapediae 5′UTR, die Drosophila Ultrabithorax 5′UTR oder genetische Hybride oder Fragmente aus den oben angeführten Se quenzen. Erfindungsgemäß bevorzugt ist die IRES aus Poliovirus Typ 1 gemäß SEQ ID Nr. 3.

Gegenstand der Erfindung sind ferner rekombinante DNA Vektoren, welche die erfindungsgemäße Expressionseinheit enthalten. Ein erfindungsgemäß bevorzugter Vektor ist in Fig. 4B und dessen Herstellung in den Fig. 1 bis 3 dargestellt.

Die Erfindung schließt ferner Wirtszellen ein, welche Säugerzel len sind und mit einem Vektor transformiert sind, der die erfin dungsgemäße Expressionseinheit trägt. Vorzugsweise handelt es sich um CHO- oder BHK-Zellen, wobei letztere besonders bevorzugt sind. Eine erfindungsgemäß transformierte BHK-Zelle wurde unter der Bezeichnung 91-21-4D am 11. 8. 1992 bei der Deutschen Samm lung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSM) hinterlegt. Ihr wurde die Hinterlegungsnummer DSM ACC2045 zugeteilt.

Die Erfindung schließt darüber hinaus Verfahren zur Herstellung von heterodimerem rPDGF-AB ein, in deren Verlauf Säugerzellen als Wirtszellen, welche die erfindungsgemäße Expressionseinheit operativ insertiert enthalten, in einem geeigneten Medium kulti viert werden und das so erzeugte rPDGF-AB von den Zellen und dem Medium abgetrennt wird. Als Medium kommen alle bekannten Medien zum Kultivieren von Säugerzellen in Betracht, einschließlich synthetischer, proteinfreier oder proteinarmer Produktionsme dien. Erfindungsgemäß wurde DMEM (Dulbecco′s Modified Eagle Medium), angereichert mit 4,5 g/l Glukose und 5 bis 10% FCS, bevorzugt.

Das rPDGF-AB wird nach herkömmlichen Verfahren (vgl. beispiels weise Östmann et al. 1988) von den Zellen und dem Medium abge trennt. Vorzugsweise wird erfindungsgemäß ein für PDGF-AA ent wickeltes und hoch effizientes Verfahren (Eichner et al., 1989) angewendet.

Gegenstand der Erfindung ist schließlich heterodimeres rPDGF-AB, welches im wesentlichen frei ist von homodimeren Begleitproduk ten und welches erhältlich ist durch Kultivieren der oben be schriebenen, erfindungsgemäßen Wirtszellen. Überraschenderweise hat es sich gezeigt, daß die mit dem erfindungsgemäßen Konstrukt transformierten Wirtszellen das heterodimere PDGF-AB mit einer Reinheit von 90% und mehr, bezogen auf die Gesamtmenge des ge bildeten PDGF, sezernieren. Erfindungsgemäß bevorzugt ist PDGF- AB, welches durch Kultivieren von BHK-Zellen, transformiert mit dem erfindungsgemäßen Konstrukt, beispielsweise derjenigen Zel len, welche unter der Bezeichnung 91-21-4D am 11. 8. 1992 bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSM) hinterlegt -wurden (Hinterlegungsnummer DSM ACC2045), zu gänglich ist.

Das erfindungsgemäße rPDGF-AB unterscheidet sich von den bisher bekannten rekombinanten PDGF-AB Produkten in erster Linie durch seinen hohen Reinheitsgrad. Wie eingangs ausgeführt, ist bisher kein rekombinantes Verfahren beschrieben worden, bei dem 90% und mehr des erhaltenen Produktes aus dem Heterodimeren besteht. Da die vollständige Abtrennung der Homodimeren von dem Heterodime ren nahezu unmöglich ist, sind die bekannten Produkte zwangs läufig Gemische aus allen 3 Isoformen.

Darüberhinaus haften den bekannten Produkten, abhängig von deren Herstellung, in mehrfacher Hinsicht Nachteile an. So ist es be kannt, daß die heterologe Genexpression in Hefezellen, wie in EP 259 632 oder 288 307 beschrieben, zu Proteinprodukten mit gegen über dem humanen Produkt veränderten Glykosylierungsmustern führt. Zudem ist in Hefezellen exprimiertes PDGF-B zumindest teilweise unvollständig prozessiert und/oder proteolytisch abge baut (vgl. WO 912/01716). Derartige Produkte weisen somit ein verändertes Kohlenhydratmuster auf und sie sind mit proteoly tischen Abbauprodukten verunreinigt. Zur Vermeidung der vorge nannten Nachteile beschreibt die WO 92/01716 Verfahren zur Her stellung modifizierter PDGF-Ketten, bei denen die Konsensus- Sequenzen für die Glykosylierung bzw. die Protease sensitiven Domänen entfernt sind. Derartige Modifikationen beeinflussen jedoch die biologische Aktivität des Produktes (vgl. WO 92/01716).

Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird durch Kultivieren von erfindungsgemäß transformierten BHK- Zellen, und insbesondere durch Kultivieren der Wirtszellen 91- 21-4D mit der Hinterlegungs-Nr.: DSM ACC2045 heterodimeres rPDGF-AB gewonnen.

Ferner ist aus der WO 90/08163 die rekombinante Herstellung von PDGF-AB in Bakterienzellen, insbesondere in E. coli bekannt, welche zwangläufig zu einem nicht glykosylierten Produkt führt. Eine nach diesem Verfahren in E. coli Zellen exprimierte PDGF-B- Kette ist jedoch aminoterminal um 12 Aminosäuren verkürzt. Dar überhinaus muß das Produkt aus Bakterien in vitro renaturiert werden, ein Vorgang, bei dem die korrekte inter- und intramole kulare Bildung der Disulphidbrücken und die korrekte Faltung des Proteins nicht gewährleistet ist mit der Folge, daß die immuno logischen Eigenschaften des Produkts verändert und die biologi sche Aktivität beeinflußt werden können.

Das heterodimere rPDGF-AB gemäß der Erfindung wird vorzugsweise zusammen mit pharmazeutisch verträglichen Hilfs- und Trägerstof fen als pharmazeutisches Präparat, insbesondere für die Wundhei lung formuliert. In diesem Zusammenhang kann es als Wirkstoff in Pflastern, Wundverbänden und dergleichen enthalten sein. Es ist besonders für die topische Verabreichung geeignet, es kommen jedoch auch Applikationen in Betracht, in deren Verlauf der Wirkstoff in die Wunde eingebracht oder subkutan verabreicht wird. Beispielsweise kann das PDGF-AB in einer geeigneten Matrix mit Depotfunktion im Wundrandbereich subkutan appliziert werden oder direkt subkutan injiziert werden.

Geeignete Hilfs- und Trägerstoffe schließen Cellulose-Gele auf wäßriger Basis, biologisch abbaubare Polymere sowie jegliche Salben- und Cremebasis und Sprays ein. Ferner können zusätzliche Wirkstoffe, welche die Wundheilung beeinflussen, wie beispiels weise Kollagen, Fibronektin, Faktor XIII, Fibroblasten Wachs tumsfaktor (aFGF, bFGF), Transformierender Wachstumsfaktor Typ α oder β, Epidermis Wachstumsfaktor, Insulin oder "Insulin-like Growth Factor" (IGF I, II) oder weitere Wachstumsfaktoren in den erfindungsgemäßen Präparaten enthalten sein. Die erfindungsgemä ßen Produkte können beispielsweise auch in Wundverbänden in wäßriger Lösung vorliegen.

Die Erfindung wird nachfolgend anhand von Beispielen erläutert.

1. Beschreibung der Figuren

Fig. 1. Schematische Darstellung der Herstellung der Basis vektoren pSBC-1 und pSBC-2.

Fig. 2. Vektor M13BCL1; in der Vektorkarte ist der c-sis (PDGF- B) homologe Bereich aus pMVW-2 angegeben. Der Bereich des reifen PDGF-B und der Ncol/Sall (SEQ ID Nr. 6 + 7) Adapter sind durch schwarze Balken hervorgehoben.

Fig. 3. Schematische Darstellung der Rekonstruktion der voll ständigen PDGF-B-Vorläufersequenz.

Fig. 4A +B. Schematische Darstellung der Konstruktion des bici stronischen Vergleichs-Vektors pSBC-A/B (Fig. 4A) und des erfindungsgemäßen Expressionsvektors pSBC-PDGF-B/A (Fig. 4B) aus den Basisvektoren pSBC-1 und pSBC-2. Die Expressionsvektoren pSBC-PDGF-A/B und pSBC-PDGF-B/A unterscheiden sich dabei durch die Orientierung der ko dierenden cDNA-Sequenzen der PDGF-A- und -B-Kette, d. h. durch ihre Lokalisierung auf dem Plasmid als in Lese richtung erstes bzw. zweites Cistron.

Fig. 5. Northern-Blot Analyse transformierter BHK-Zellen. Es wurde die mRNA aus dem Gesamtpool der BHK-Zellen unter sucht, die stabil mit den monocistronischen bzw. bici stronischen PDGF-Expressionskonstrukten transfiziert worden waren. Erwartungsgemäß zeigen die monocistroni schen mRNAs eine Größe von etwa 1.300 nt, während bei den bicistronischen mRNAs die Größe der codierenden Sequenzen beider PDGF-Ketten (2.500 Nucleotide) vor handen ist. Hiermit ist gezeigt, daß die entsprechenden Genprodukte von einer einzigen bicistronischen mRNA abgelesen werden. Als Referenz wurde die murine α-Actin Probe verwendet [Minty, A.J. et al., J. Biol. Chem. 256, 1008-1014, (1981)].

Fig. 6. Sandwich-ELISA zum Nachweis von PDGF-AB mit Hilfe eines monoklonalen und eines polyklonalen Anti-PDGF-Antikör pers: Eichkurven von PDGF-Standards.
Polystyrolplatten wurden mit Schaf-Anti-Maus-IgG be schichtet und anschließend mit einem Maus-Hybridoma- Überstand (von Klon 1B3, enthält monoklonale Antikörper gegen die B-Kette in PDGF-AB und -BB) inkubiert; nach Inkubation mit verschiedenen PDGF Standards wurde das gebundene PDGF mit Hilfe eines polyklonalen Kaninchen- Anti-PDGF-AA, gefolgt von Peroxidase-markiertem Anti- Kaninchen-IgG nachgewiesen;
Quelle der PDGF-Standards:
AB: aus humanen Thrombozyten, von PROMEGA Corp. No. G 5161;
BB: rekombinant aus Hefe, von PROMEGA Corp. No. G 5191;
AA: rekombinant aus BHK-Zellen, ca. 70%^ig (Eichner et al., 1989).
Für PDGF′s aus eukaryontischen Quellen ergibt sich ein spezifisches Signal mit PDGF-AB (aus humanen Thrombozy ten) mit einer geringen Kreuzreaktion mit PDGF-BB.

Fig. 7. Nachweis von PDGF-AB in Kulturüberständen von rekombi nanten BHK-Zellen mittels PDGF-AB-ELISA: (Eichkurven von Standards s. Fig. 6). Die dargestellten Proben stammten von BHK-Zellen, die mit folgenden Vektorkon strukten transfiziert worden waren:

Probe: Nr. 1: pSBC-A/B,
Nr. 2: pSBC-B/A,
Nr. 3: pSBC-2-PDGF-A +pSBC-2-PDGF-B,
Nr. 4: pSBC-2-PDGF-A,
Nr. 5: pSBC-2-PDGF-B,
Nr. 6: pSBC-2-Kontrolle.

Fig. 8. Analyse von gereinigtem rPDGF über SDS-PAGE. Die Proben wurden auf einem 13,5%igen Polyacrylamidgel in der Gegenwart von SDS auf getrennt und anschließend mit Coomassieblau gefärbt.

1, 6, 11 = LMW (PHARMACIA) [14400, 20100, 30000, 43000, 67000, 94000 D]
2 = pSBC-B/A
3 = pSBC-2-PDGF-A + pSBC-2-PDGF-B
4 = pSBC-A/B
5 = pSBC-2-PDGF-A
7-10 = gleiche Auftragsreihenfolge wie 2-5, unter Zugabe von jeweils 10% (v/v) β-Mercaptoethanol (10 min, 95°C)

Die Analyse der gereinigten Sekretionsprodukte über SDS-PAGE korreliert mit den Ergebnissen aus der Analyse der Kultur überstände (Tab. 2). Insbesondere an den unter reduzierenden Bedingungen auftretenden Banden der PDGF-Monomere kann man gut erkennen, daß Transfektionszellpools der Konstellation pSBC-2PDGF-A + pSBC-2-PDGF-B (Cotransfer) und pSBC-A/B (PDGF-A-Kette im ersten Cistron) überwiegend PDGF-AA-Homodi mere sekretieren.

Das aus pSBC-B/A-Kulturüberständen isolierbare PDGF bandiert gegenüber dem als Referenz auf getragenen PDGF-AA bei einem geringfügig niedrigeren Molekulargewicht. Unter reduzieren den Bedingungen lassen sich beide Monomere zu etwa gleichen Teilen nachweisen. Die oberen Banden korrespondieren mit den Monomer-Banden der PDGF-A-Kette. Für rekombinantes PDGF-AA aus BHK-Zellen wurde bereits gezeigt, daß dieses Material zu etwa gleichen Anteilen aus der vollständigen PDGF-A-Kette, sowie einer C-terminal verkürzten Spezies besteht (Eichner et al., 1989).

Die monomeren PDGF-A-Ketten bandieren bei einer M_r von etwa 17 KD. Darunter bandiert die PDGF-B-Kette (M_r 16 KD), die bei dem aus pSBC-B/A-Überständen isolierten Material eben falls in einer verkürzten Form auftritt. Die Subspezies beider Ketten wurden gemeinsam durch Proteinsequenzanalyse analysiert und eindeutig als PDGF-A und PDGF-B identifi ziert. Molekulargewichtsunterschiede für PDGF-B sind daher, genau wie bei PDGF-A, möglicherweise auf C-terminale Verkür zungen oder veränderte Glycosylierungsmuster zurückzuführen. PDGF aus Überständen von pSBC-B/A besteht demnach zu etwa gleichen Teilen aus PDGF-A und PDGF-B-Ketten.

Das als Referenz auf getragene, ebenfalls in BHK-Zellen exprimierte PDGF-AA ist nicht glykosyliert (Eichner et al., 1989), während in CHO-Zellen exprimiertes PDGF einen Kohlen hydratanteil von etwa 7% enthält (Kolvenbach et al., 1991). Die PDGF-A-Monomere sowohl aus dem PDGF-AA-Homodimer als auch aus dem AB-Heterodimer stimmen in ihrem Laufverhalten in der SDS-PAGE gut überein.

2. Expression von PDGF-AB Heterodimer mit Hilfe des bicistroni schen Vektorsystems 2.1 Herstellung der Basisvektoren pSBC-1 und pSBC-2 (Fig. 1)

Für die Konstruktion des Vektors pSBC-1 wurde ein 627 bp MseI/BalI-Fragment aus dem Plasmid pGEM3-5′ Polio (M) (Sar now, 1989) als Matrize für eine PCR mit folgenden Primern verwendet:

Das nach der Amplifikation erhaltene 652 bp Fragment wurde mit Pol I K behandelt, anschließend mit PstI gespalten und in den entsprechend präparierten Vektor pBEH (Artelt et al., 1988) insertiert.

Für die Konstruktion des Vektors pSBC-2 wurde das Plasmid pBEH mit Eco RI linearisiert und die folgenden Oligonukleo tidsequenzen hybridisiert und insertiert:

2.2 Rekonstitution der vollständigen PDGF-B-Vorläufersequenz

Das Plasmid pMVW-2 enthält die cDNA des humanen PDGF-B Gens, welches im 5′-translatierten Bereich der Vorläufersequenz unvollständig ist (Weich et al., 1986). Für die Rekonstitu tion des authentischen PDGF-B precursors wurde in den 5′- terminalen Bereich des Vorläufers durch einen C-T-Austausch in Position 30 des codogenen Abschnittes des Klons pMVW-2 eine BclI-Schnittstelle eingeführt. Durch diesen Schritt geht letzlich nur ein kurzer Abschnitt des kodierenden Be reiches verloren und die lokal codierte Aminosäure (Aspara ginsäure) bleibt dabei erhalten. Da die BclI-Schnittstelle in den meisten E. coli-Stämmen durch Methylierung resistent gegenüber enzymatischer Spaltung ist, muß das diese Schnitt stelle enthaltene Fragment entweder in einen dam⁻-Stamm um kloniert, oder über einen PCR-Schritt amplifiziert werden. Der fehlende Bereich des Vorläufers wird dann als syntheti sches SalI/BclI-Fragment [Oligomere PPDGFB1 und PPDGFB2 (SEQ ID Nr. 9 + 10)] eingesetzt.

Hierfür wurde zunächst das 914 bp BamHI/Ncol-Fragment aus pMVW-2 über einen synthetischen Adapter [Oligomere NCCLSAI und NCCLSA2 (SEQ ID Nr. 6 + 7)] in den BamHI/SalI-gespal tenen Bakteriophagen M13mp19 (Pharmacia) insertiert. Dieses Konstrukt lieferte die notwendige Einzelstrang-DNA für den nachgeschalteten in vitro Mutageneseschritt, der mit Hilfe des Oligomer-directed in vitro mutagenesis system (Version 2) der Fa. Amersham, basierend auf der Methode von Eckstein et al. [Taylor J. W., Ott J. and Eckstein F. (1985) Nucl. Acids Res. 13, 8764-8785; Nakamaye K. and Eckstein F. (1986) Nucl. Acids Res. 14, 9679-9698; Sayers J. R., Schmidt W. and Eckstein F. (1988) Nucl. Acids Res. 16, 791-802] durchge führt wurde. Durch den synthetischen Primer [PDGBBCL (SEQ ID Nr. 8)] wird nach der Mutagenese ein Basenaustausch (C zu in Position 144 der unter SEQ ID Nr. 2 dargestellten Sequenz erreicht und dadurch im 5′-Bereich des PDGF-B precursors eine BclI-Schnittstelle eingeführt. Dieses Mutagenesederivat wurde als M13BCL1 bezeichnet (Fig. 2).

Ein 1100 bp Fragment aus M13BCL1 wurde über einen PCR- Schritt mit Hilfe der Primer M1317MER und M1324MER (SEQ ID Nr. 4 + 5) amplifiziert, anschließend einer BclI/HindIII- Restriktion unterworfen und das resultierende 770 bp Frag ment isoliert. Die synthetischen Oligomere PPDGFB1 und PPDGFB2 (SEQ ID Nr. 9 + 10) bilden den fehlenden 5′-Bereich des PDGF-B-Vorläufers bis zur BclI-Schnittstelle. Nach dem Annealing wurde dieses doppelsträngige Oligomer anschlie ßend, zusammen mit dem 770 bp PDGF-B Fragment, in den mit einer SalI/HindIII Restriktion vorbereiteten Vektor pGEM-2 (Promega) ligiert (Fig. 3). Die authentische Sequenz von PDGF-B wurde durch vollständige Sequenzierung verifiziert.

2.3 Konstruktion der bicistronischen Expressionsvektoren pSBC- PDGF-A/B und pSBC-PDGF-B/A für die PDGF-A- und B-Kette (Fig. 4A und B)

Die vollständige codierende cDNA für den PDGF-B precursor (Ratner et al., 1985) 1iegt in dem Vektor pGEM2-PDGF-B vor, wie unter 1.2 beschrieben. Die vollständige cDNA-Sequenz der kurzen Variante der PDGF-A-Kette (Betsholtz et al., 1986) ist im Expressionsvektor pODA (Eichner et al., 1989) enthal ten. Dieser Vektor wurde erhalten durch Klonierung des RsaI- Fragments aus pPGF-1 (Hoppe et al., 1987) in den SV-40 Ex pressionsvektor pBEH (Artelt et al., 1988).

Die kodierenden cDNA-Sequenzen der PDGF-A- und -B-Kette wurden unter Verwendung von EcoRI/HindIII Restriktionen in die monocistronischen Vektoren pSBC-1 und -2 insertiert (Abb. 4). Die Fusion beider Vektoren zu einer bicistroni schen Expressionseinheit wurde mit Hilfe der Restriktions enzyme XmnI/NotI durchgeführt.

2.4 Herstellung transformierter BHK-Zellen

Die Transfektion der mono- und bicistronischen Expressions vektoren, die die codierenden Sequenzen der A- und B-Kette von PDGF tragen (vgl. Fig. 1, 4A+B) wurde mit der Calcium phosphat-Präzipitationstechnik in BHK-Zellen durchgeführt (Wigler et al., 1979; Graham & van der Eb, 1973). Einen Tag vor der Transfektion wurden 2-3×10⁵ BHK-Zellen/24 cm² in neue Kulturflaschen umgesetzt. Vier Stunden vor der Trans fektion wurde ein Medienwechsel mit DME-Medium durchgeführt. 5 µg der o. g. Plasmid-DNA zusammen mit 0,5 µg der Selek tionsplasmide pAG60 und pSVpac (Colbere-Garapin, 1981; Vara et al., 1986), welche für ein Neomycinresistenzgen bzw. für eine Puromycin-Resistenz kodieren, in 250 µl 250 mM CaCl₂ suspendiert. Die Lösung wurde langsam unter ständiger Ver wirbelung durch steril eingeblasene Luft zu 250 µl 2 × HEPES-Puffer (280 mM NaCl; 50 mM HEPES; 1,5 mM NaH₂PO₄ pH 7,1) gegeben und und das erhaltene Präzipitat dem Nährmedium zugesetzt. Zwei Tage nach der Transfektion wurde durch Me dienwechsel von DME- auf Doppelselektionsmedium (5 µg/ml Puromycin; 500 µg/ml G418, Wirth et al., 1988) die Selektion auf stabil transfizierte Zellen begonnen und eine Population von PDGF sekretierenden Zellklonen erhalten. Ein repräsenta tives Klongemisch dieser Zellen wurde bei der DSM am 11. 8. 1992 unter der Nummer DSM ACC2045 hinterlegt.

2.5 Northern Blot Analvse

Polyadenylierte RNA aus transformierten BHK-Zellen wurde nach Purchio et al., (1979) isoliert, über ein 1%iges Agarose-Formaldehydgel fraktioniert (Lehrach et al., 1977), auf eine Nylonmembran geblottet und mit [³²P]-markierten PDGF-A- und -B-Ketten spezifischen Sonden hybridisiert (Fig. 5).

2. 6 Gewinnung konditionierter Zellkulturüberstände

Die Transformation der BHK-Zellen erfolgte analog 1.4. Nach dem Auszählen der Kolonien wurden die Zellen abtrypsini siert, in frischem Selektionsmedium aufgenommen und auf eine Zellzahl von 10⁵ Zellen/ml eingestellt. Je 10 ml dieser Zellsuspension wurden in eine Flasche mit 65 cm² Bodenfläche überführt und für weitere 48 h kultiviert. Danach wurde das wurde das Medium abgenommen und durch serumhaltiges Selek tionsmedium ersetzt. Die geernteten Überstände wurden bis zur Analyse bei -20°C gelagert. Zum Zeitpunkt der Ernte betrug die Zellzahl/Flasche 0.8-1.2×10⁷.

2.7 Nachweis von PDGF in den Kulturüberständen mit Hilfe des Mitogentests

Die Messung der Stimulierung der DNA-Syntheserate von dich tearretierten Fibroblasten erlaubt eine Bestimmung der mitogenen Aktivität des PDGF. Eine Unterscheidung zwischen den Isoformen ist dabei nicht möglich.

Der Assay wurde gemäß Shipley et al. (1984) mit AKR-2B-Maus fibroblasten in 24-Well-Platten durchgeführt. Reines PDGF zeigt in dem Test eine halbmaximale Stimulierung bei einer Konzentration von etwa 5 ng/ml. Dieser Wert wurde benutzt, um Produktivitäten zu bestimmen. Die Ergebnisse aus dem Mitogentest sind in Fig. 7 den Werten aus dem PDGF-AB-ELISA gegenübergestellt.

2.8 Nachweis von PDGF-AB Heterodimer in den Kulturüberständen mit Hilfe eines spezifischen PDGF-AB ELISA′s

Es wurde ein "two-antibody sandwich assay" aufgebaut, der eine spezifische Quantifizierung von PDGF-AB neben PDGF-AA und -BB erlaubt.

Sandwich-Assay mit Hilfe eines monoklonalen und eines poly klonalen Anti-PDGF-Antikörpers:

Polystyrolplatten mit 96 Kavitäten (Fa. Dynatech, U-Platte, No. M124B) werden in folgender Reihenfolge beschichtet (zwischen jedem Schritt jeweils 4 × Waschen mit PBS mit 150,05% Tween 20):

1) Schaf-Anti-Maus-IgG (Fa. Boehringer Mannheim, Nr. 1097 105), 3 µg/ml.
2) 1% BSA (Fa. E. Merck, Nr. 12018) in PBS, pH 7,5, 100 µl für 1 h bei R.T.
3) Maus-Hybridoma-Überstand von Klon 1B3 [erhalten durch Fusion von SP2/0-Myelomzellen mit Milzzellen von Mäu sen, die mit rekomb. PDGF-AB (aus E. coli gemäß Hoppe et al. (1990) immunisiert worden waren], 2 µg/ml IgG2a/ml. Der monoklonale Antikörper bindet spezifisch an der B-Kette von PDGF-Dimeren.
4) PDGF-haltige Lösungen, verdünnt in PBS mit 0,1% BSA und 0,05% Tween 20 (PBS+), 50 µl für 1 h bei R.T.
5) Polyklonales Kaninchen-Anti-PDGF-AA-IgG (Fa. Genzyme, No. ZP-214, bindet an der A-Kette von dimerem PDGF), 2 µg/ml in PBS+, 50 µl für 1 h bei R.T.
6) POD-markiertes Ziege-Anti-Kaninchen IgG (Fa. Pierce, No. 31460), 0,1 µg/ml in PBS+, 50 µl für 1 h bei R.T., Detektion mit dem Substrat Tetramethylbenzidin gemäß E.S. BOS et al. (J. Immunoassay 2 (1981), 187-204).

2.8.1 Ergebnisse

In der Abb. 7 sind die Resultate von drei unter schiedlichen Analysen für PDGF aus Kulturüberständen rekombinanter BHK-Zellen dargestellt.

Der Mitogentest liefert einen brauchbaren Wert für die Gesamtmenge des in den Kulturüberständen vorhandenen rPDGF, ohne zwischen den verschiedenen Isoformen (PDGF-AA, AB oder BB) differenzieren zu können.

Der spezifische Anteil an heterodimerem PDGF-AB kann mit ausreichend hoher Genauigkeit durch den PDGF-AB- spezifischen ELISA bestimmt werden. Aus der Differenz dieser Analyse zum Ergebnis des Mitogentests kann der prozentuale Anteil von PDGF-Homodimeren rechnerisch ermittelt werden (Tabelle 1).

Das Ergebnis des ELISA′s zeigt, daß nur in Kulturüber ständen von transfizierten Zellinien des Typs pSBC- PDGF-B/A die meßbare biologische Aktivität im Mitogen test mit hohen PDGF-AB-Werten korreliert.

2.9 Reinigung des sekretierten PDGF-AB

Für die Reinigung der Sekretionsprodukte aus 1,5-2,5 Litern konditionierter Kulturüberstände der unterschiedli chen Transfektions-Zellpools wurde ein für die Reinigung von rPDGF-AA aus Zellkulturüberständen entwickeltes Verfahren angewendet (Eichner et al., 1989). Das nach dem HPLC-Schritt hoch- oder teilgereinigte PDGF wurde auf einem Polyacryla midgel nach Laemmli (1970) in der Gegenwart von SDS aufge trennt und nach anschließender Coomassieblaufärbung analy siert (Fig. 8).

2.10 Aminoterminale Sequenzierung von PDGF-Polypeptiden

Durch Proteinsequenzanalyse sollten beide PDGF-Ketten eindeutig identifiziert werden um auszuschließen, daß hier verkürzte, prozessierte Formen nur einer PDGF-Kette vorlie gen (s. Fig. 8).

Die automatische Sequenzanalyse wurde am Modell 477A (Ap plied Biosystems) mit dem Zyklus BLOTT1 durchgeführt. Die Analyse der Phenylthiohydantoin-Aminosäuren-Derivate erfolg te auf dem online gekoppelten 120A PTH-Analyser.

Die Disulfidbrücken der Probe werden mit Dithiothreitol reduziert und mit 4-Vinylpyridin alkyliert. Sie wird auf einem horizontalen SDS-Elektrophorese-Gel nach Schägger und von Jagow, modifiziert wie beschrieben (Westermeier et al. SD 092/89, Pharmacia LKB Biotechnologie) getrennt. Die Probe wird auf eine PVDF-Membran (Problot, Applied Biosystems) mit einem diskontinuierlichen Puffersystem wie beschrieben (We stermeier et al. SDRE-072, Pharmacia LKB Biotechnologie) geblottet und mit Comassie Brillant Blau R250 gefärbt. Die beiden Doppelbanden bei 17 und 16 KD werden ausgeschnitten und zusammen sequenziert.

Nach den Ergebnissen der Proteinbestimmung wurden 10 µg Probe analysiert. Es konnten die N-terminalen Aminosäuren der PDGF-A- und PDGF-B-Kette in gleicher Ausbeute nachgewie sen werden (Tabelle 2). Nebensequenzen wurden nicht detek tiert.

Tabelle 2

Aminosäuresequenzanalyse der PDGF-A- und PDGF-B-Kette

Abkürzungen:

BHK - Hamsterzellinie (Baby Hamster Kidney)
bp - Basenpaar(e)
CHO - Hamsterzellinie (Chinese Hamster Ovary)
BSA - Rinderserumalbumin
D - Dalton
DMEM - Dulbecco′s Modified Eagle Medium
ELISA - enzyme-linked immunosorbent assay
HEPES - 4-(2-Hydroxyl)-1-piperazinethansulfonsäure
HPLC - Hochdruckflüssigkeitschromatographie
IgG - Immunglobulin der Klasse G
IRES - internal ribosomal entry site
nt - Nukleotid(e)
PAGE - Polyacrylamid-Gelelektrophorese
PBS - phosphatgepufferte Kochsalzlösung
PCR - Polymerase Kettenreaktion
PDGF - Wachstumsfaktor aus Thrombozyten
POD - Peroxidase
PVDF - Polyvinylidenfluorid
SDS - Natriumdodecylsulfat
UTR - nicht translatierte Region

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Claims

1. Bicistronische Expressionseinheit zur rekombinanten Herstel lung von heterodimerem PDGF-AB in Säugerzellen als Wirtszel len, gekennzeichnet durch die allgemeine Formel p - 5′UTR - C₁ - IRES - C₂ - 3′UTR - polyA,in der
p ein transkriptionaler Promotor ist,
5′UTR eine nicht translatierte Nukleotidsequenz ist,
C₁ ein Cistron ist, welches ein für die B-Kette von PDGF, ein biologisch aktives Analogon oder ein Fragment der selben kodierendes Gen enthält,
IRES eine Nukleotidsequenz viralen, zellulären oder synthetischen Ursprungs ist, die in der Stufe der Trans lation für die interne Initiation verantwortlich ist,
C₂ ein Cistron ist, welches ein für die A-Kette von PDGF oder ein biologisch aktives Analogon oder ein Fragment derselben kodierendes Gen enthält,
3′UTR eine nicht translatierte Nukleotidsequenz ist,
und polyA ein Polyadenylierungssignal ist,
wobei C₁, IRES und C₂operativ miteinander verknüpft sind.

2. Expressionseinheit nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß C₁ die vollständige PDGF-B Vorläufersequenz (SEQ ID Nr. 2), deren allelische Varianten oder Fragmente derselben ent hält, welche für eine biologisch wirksame PDFG-B Kette ko diert.

3. Expressionseinheit nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß C₁ das v-sis-Gen aus Simian Sarcoma Virus oder die Basen paare 283 bis 609 gemäß SEQ ID Nr. 2 enthält.

4. Expressionseinheit nach den Ansprüchen 1 bis 3, dadurch ge kennzeichnet, daß C₂ die PDGF-A_K- (SEQ ID Nr. 1) oder die PDGF-A_L Vorläufer-Sequenz enthält.

5. Expressionseinheit nach den Ansprüchen 1 bis 4, dadurch ge kennzeichnet, daß IRES die Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID Nr. 3 ist.

6. Expressionseinheit nach den Ansprüchen 1 bis 4, dadurch ge kennzeichnet, daß IRES die 5′UTR des Enzephalomyocarditis Virus (EMV), des "Theilers murine encephalomyelitis virus" (TMEV), des "foot and mouth disease virus" (FMDV), des "bovine enterovirus" (BEV), des "coxsackie B virus" (CBV), des "human rhinovirus" (HRV) oder die "human immunoglobulin heavy chain binding protein" (BIP) 5′UTR, die Drosophila Antennapediae 5′UTR, die Drosophila Ultrabithorax 5′UTR oder genetische Hybride oder Fragmente aus den oben angeführten Sequenzen ist.

7. Rekombinanter DNA-Vektor, welcher die Expressionseinheit nach den Ansprüchen 1 bis 6, operativ verknüpft mit Expressionskon trollsequenzen, enthält.

8. Wirtszelle, welche eine Säugerzelle transformiert mit dem Vektor gemäß Anspruch 7 ist.

9. Wirtszelle nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine CHO- oder BHK-Zelle ist.

10. Wirtszelle nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine BHK-Zelle ist und von dem Klon 91-24-4D mit der Hinter legungs-Nr. DSM ACC2045 abstammt.

11. Verfahren zur Herstellung von heterodimerem rPDGF-AB, dadurch gekennzeichnet, daß man Säugerzellen als Wirtszellen, die eine Expressionseinheit nach den Ansprüchen 1 bis 6 operativ insertiert enthalten, in einem geeigneten Medium kultiviert und das so erzeugte rPDGF-AB von den Zellen und dem Medium ab trennt.

12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß die Wirtszelle eine Zelle nach den Ansprüchen 9 bis 11 ist.

13. Heterodimeres rPDGF-AB, im wesentlichen frei von homodimeren Begleitprodukten, erhältlich durch Kultivieren von Säuger zellen als Wirtszellen, die eine Expressionseinheit nach den Ansprüchen 1 bis 6 operativ verknüpft enthalten, in einem geeigneten Medium und Abtrennen des so erzeugten rPDGF-AB von den Zellen und dem Medium.

14. Heterodimeres rPDGF-AB, im wesentlichen frei von homodimeren Begleitprodukten, erhältlich durch Kultivieren von BHK- oder CHO-Zellen als Wirtszellen, die eine Expressionseinheit nach den Ansprüchen 1 bis 6 operativ verknüpft enthalten, in einem geeigneten Medium und Abtrennen des so erzeugten rPDGF-AB von den Zellen und dem Medium.

15. Heterodimeres, im wesentlichen von homodimeren Begleitproduk ten freies PDGF-AB, erhältlich durch Kultivieren von Wirts zellen gemäß Anspruch 10, die eine Expressionseinheit nach den Ansprüchen 1 bis 6 operativ verknüpft enthalten, in einem geeigneten Medium und Abtrennen des so erzeugten rPDGF-AB von den Zellen und dem Medium.

16. Pharmazeutisches Präparat, enthaltend rPDGF-AB hergestellt nach dem Verfahren gemäß den Ansprüchen 11 oder 12 zusammen mit pharmazeutisch verträglichen Hilfs- und Trägerstoffen.

17. Pharmazeutisches Präparat, enthaltend rPDGF-AB nach den An sprüchen 13 bis 15 zusammen mit pharmazeutisch verträglichen Hilfs- und Trägerstoffen.

18. Pharmazeutisches Präparat nach den Ansprüchen 16 oder 17 in Form einer Salbe, eines Gels, eines Sprays, eines Pflasters, eines Wundverbandes oder einer Wundauflage.