DE4311651A1 - Virus für den Transport von Fremd-DNA in höhere eukaryotische Zellen - Google Patents
Virus für den Transport von Fremd-DNA in höhere eukaryotische ZellenInfo
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Description
Die Erfindung bezieht sich auf das Einbringen von
Nukleinsäuren in höhere eukaryotische Zellen.
Bedarf an einem effizienten System für das Einführen
von Nukleinsäure in lebende Zellen besteht vor allem im
Rahmen der Gentherapie. Dabei werden Gene in Zellen
eingeschleust, um in vivo die Synthese therapeutisch
wirksamer Genprodukte zu erzielen, z. B. um im Falle
eines genetischen Defekts das fehlende Gen zu ersetzen.
Für den Transfer von Genen in die Zellen werden z. B.
virale Vektoren eingesetzt, die sich der effizienten
Eintrittsmechanismen ihrer Ausgangsviren bedienen.
Darunter werden Viren verstanden, in deren Genom das in
der Zelle zu exprimierende Gen mittels rekombinanter
Methoden integriert wurde. Diese Strategie wurde bei
der Konstruktion rekombinanter retroviraler und
adenoviraler Vektoren angewendet, um einen hoch
wirksamen Gentransfer in vitro und in vivo zu erzielen.
Die bisher am weitesten fortgeschrittenen Technologien
für die Anwendung von Nukleinsäuren im Rahmen der
Gentherapie benutzen retrovirale Systeme für den
Transfer von Genen in die Zelle (Wilson et al., 1990;
Kasid et al., 1990). Es wurden daher bereits Methoden
entwickelt, um die Anwendbarkeit der retroviralen
Systeme zu erweitern bzw. deren Spezifität für eine
definierte Zellpopulation zu ermöglichen, indem z. B.
der Tropismus der Viren verändert wurde.
Von Roux et al., 1989, und in der Französischen
Patentanmeldung 2 649 119 wurde ein System beschrieben,
das den Tropismus von Retroviren mit Hilfe
bifunktioneller Konjugate verändert, die auf der einen
Seite einen Antikörper gegen die Virushülle und auf der
anderen Seite einen spezifischen Zellmembranmarker für
die Zielzellen enthalten und somit die Verbindung des
Virus mit der Wirtszelle herstellen.
Der von Goud et al., 1988, vorgeschlagene Ansatz beruht
ebenfalls auf dem Prinzip bifunktioneller Konjugate.
Diese Konjugate sind eine Konstruktion aus zwei
monoklonalen Antikörpern, von denen einer gegen den
humanen Transferrinrezeptor und einer gegen das gp70
Hüllprotein des Moloney-Retrovirus gerichtet ist. Mit
Hilfe dieser Konjugate konnte das Retrovirus zwar in
die Zielzellen eindringen, nicht jedoch in diesen
replizieren.
Die in der WO 92/06180 beschriebene Methode zur
Veränderung des Tropismus eines Virus besteht darin,
die Oberfläche eines Virus mit einem Molekül zu
versehen, das an einen Oberflächenrezeptor der
Zielzelle bindet, womit das Virus eine -
natürlicherweise nicht vorhandene - Spezifität für die
Zielzelle erhält. In der WO 92/06180 wird die
Modifikation eines Retrovirus und von Hepatitisvirus B
mit Kohlenhydratmolekülen beschrieben, die an den
Asialoglykoproteinrezeptor binden.
Für die Anwendung im Rahmen der Gentherapie sind in
jüngster Zeit an die Stelle rekombinanter Retroviren
zunehmend rekombinante Adenoviren getreten (Berkner,
1988; Stratford-Perricaudet et al., 1990; Rosenfeld et
al., 1991; Rosenfeld et al., 1992; Stratford-
Perricaudet et al., 1992).
Adenovirale Vektoren haben die vorteilhafte Fähigkeit,
in nicht-teilende Zellen eindringen und eine DNA-
Fremdsequenz im Ausmaß von bis zu 8.5 kb aufnehmen zu
können. Ferner können die Adenoviruspartikel ausgiebig
gereinigt werden, ohne an Stabilität einzubüßen, und in
Titern höher als 10¹¹PFus/ml hergestellt werden.
Ein Beschränkung bei der Anwendung der von den
Adenoviren Ad2 und Ad5 abgeleiteten rekombinaten
Vektoren besteht in ihrer nur geringen Fähigkeit, in
Blutzellen einzudringen. Blutzellen sind jedoch ein
bevorzugtes Ziel für gentherapeutische Anwendungen,
weil sie leicht verfügbar sind und in den Patienten
wiedereingeführt werden können, auch sind die Methoden
zu ihrer Gewinnung und Kultivierung etabliert. Der
Grund für die schwache Aktivität der adenoviralen
Vektoren in Blutzellen liegt in der offensichtlich
geringen Zahl an Rezeptoren für Adenoviren auf diesen
Zellen (Horvath und Weber 1988; Silver und Anderson,
1988). Während die Bindung des Virus an diese Zellen um
das Zwei- bis Fünffache reduziert ist, ist die
Internalisierung des gebundenen Virus noch wesentlich
geringer. Die von vornherein geringe Rezeptorzahl
dürfte also mit einer stark verminderten
Internalisierung der vorhandenen Rezeptoren
einhergehen.
Kürzlich wurde in mehreren Arbeiten der Einsatz von
nicht-rekombinanten Adenoviren aufgrund der Fähigkeit
von Adenoviren, den Inhalt von Endosomen freisetzen zu
können, für den Gentransfer mit DNA-Komplexen mittels
Rezeptor-vermittelter Endozytose vorgeschlagen. Der
Einsatz von Adenoviren bewirkt eine Steigerung der
Effizienz des Gentransfers, indem der Abbau der in die
Zelle internalisierten DNA-Komplexe in den Lysosomen
vermieden wird (Curiel et al., 1991; Curiel et al.,
1992a; Zatloukal et al., 1992; Cotten et al., 1992;
Wagneret al., 1992; Curiel et al., 1992b; Yoshimura et
al., 1993). U.a. wurde vorgeschlagen, die Adenoviren
durch Bindung an Polylysin zu modifizieren. Die
Adenovirus-Polysin-Konjugate können zusammen mit
Konjugaten aus Transferrin-Polylysin mit DNA
komplexiert werden, wobei ternäre Transferrin-
Polylysin/Adenovirus-Polylysin/DNA-Komplexe entstehen
(Wagner et al., 1992). Im Zuge dieser Arbeit wurde
festgestellt, daß K562-Zellen in Gegenwart von freiem
Adenovirus bei Transfektion mit Transferrin-Polylysin-
Konjugaten nur sehr geringe Expressionsraten des
importierten Reportergens zeigten, während Polylysin
gekoppeltes Adenovirus, gemeinsam mit Transferrin-
Polylysin unter Bildung eines ternären Komplexes an die
Reporter-DNA komplexiert, sehr gute Ergebnisse brachte.
Dieses Phänomen ist vermutlich darauf zurückzuführen,
daß die Internalisierung der DNA-Komplexe in
Blutzellen, die eine geringe Zahl an
Adenovirusrezeptoren aufweisen, über den
Transferrinrezeptor abläuft, über den die Blutzellen in
großer Zahl verfügen.
Adenoviren können nicht in Zellen eindringen, die
Adenovirusrezeptoren nicht oder in für eine effiziente
Internalisierung ungenügender Zahl aufweisen, oder
auch, was vor allem bei Anwendungen in vivo von
Bedeutung ist, aufgrund der Tatsache, daß die
Bindungsstellen des Virus, z. B. durch einen Antikörper,
blockiert sind.
Der vorliegenden Erfindung lag die Aufgabe zugrunde,
Adenoviren mit der Fähigkeit bereitzustellen, in
Zellen, in die sie normalerweise nicht eindringen
können, effizient unter Beibehaltung ihrer Fähigkeit
zur Genexpression und/oder ihrer endosomolytischen
Eigenschaften eindringen zu können.
Die Erfindung betrifft somit ein Virus für den
Transport von Fremd-DNA in höhere eukaryotische Zellen,
dessen Oberfläche mit einem Liganden für einen
Oberflächenrezeptor der Zielzelle derart modifiziert
ist, daß es an die Zelle bindet und derart
internalisiert wird, daß die Fremd-DNA in der Zelle
exprimiert wird. Das Virus ist dadurch gekennzeichnet,
daß es ein Adenovirus und der Ligand Transferrin ist.
Es wurde überraschend festgestellt, daß mittels
Transferrin-modifiziertem Adenovirus Fremd-DNA in
Blutzellen, die der Aufnahme von nicht-modifiziertem
Adenovirus nicht zugänglich sind, internalisiert und
effizient zur Expression gebracht wird. Bei der
Infektion einer Zelle durch ein Virus läuft eine Reihe
komplexer Vorgänge ab, die bei den verschiedenen Viren
unterschiedlichen Strategien folgen. Da am produktiven
Eintritt eines Virus zahlreiche Ereignisse beteiligt
sind, die mit der Bindung des Virus an seinen Rezeptor
in Zusammenhang stehen, wobei z. B. eine
Konformationsänderung, die das Virus bei der Bindung an
seinen Rezeptor erfährt, eine für den Ablauf der
Internalisierung und Replikation unabdingbare
Voraussetzung sein kann, konnte nicht vorausgesagt
werden, ob der Zusammenhang der für die Infektion
erforderlichen Ereignisse erhalten bleibt, wenn am
Virus Modifikationen vorgenommen wurden.
Der Eintritt von Transferrin-modifiziertem Adenovirus
über den Transferrinrezeptor (B) im Vergleich zum
Eintritt des nichtmodifizierten Virus (A) über seinen
Rezeptor ist schematisch in Fig. 1 dargestellt.
Die erfindungsgemäßen Transferrin-modifizierten
Adenoviren können verwendet werden, um in trans die
Aufnahme von Transferrin-Polylysin/DNA-Komplexen in
Zellen zu verbessern, die Transferrin-Rezeptoren, aber
keine oder nicht genügend Adenovirus-Rezeptoren
aufweisen. Bei der Anwendung in trans wird das
modifizierte Adenovirus gemeinsam mit Transferrin-
Polylysin/DNA-Komplexen auf die zu transfizierenden
Zellen aufgebracht, um zusammen mit den DNA-Komplexen
in die Zelle aufgenommen zu werden und aufgrund seiner
endosomolytischen Fähigkeit die Freisetzung der DNA-
Komplexe aus den Endosomen zu bewirken (Curiel et al.
1991).
Das modifizierte Adenovirus kann auch verwendet werden,
um als Bestandteil von ternären oder
Kombinationskomplexen (Zatloukal et al., 1992) die
Effizienz dieser Komplexe zu steigern. Zu diesem Zweck
wird das erfindungsgemäße Transferrin-modifizierte
Virus, beispielsweise durch eine Biotin-Streptavidin-
Brücke, mit einem Polylysin/DNA-Komplex verbunden,
wobei gegebenenfalls auch das Polylysin mit Transferrin
konjugiert ist. Durch das an das Adenovirus gekoppelte
Transferrin übernimmt in diesem Fall das Virus bei
Zellen, die Transferrin-Rezeptoren haben, zusätzlich zu
seiner endosomolytischen Funktion die Funktion eines
Internalisierungsfaktors für den Kombinationskomplex.
Die erfindungsgemäßen Adenovirus-Konjugate können in
sämtlichen Anwendungen, in denen Adenoviren eine
Steigerung des Gentransfers bewirken, zum Einsatz
kommen (Curiel et al., 1991; Curiel et al., 1992a;
Zatloukal et al., 1992; Cotten et al., 1992; Wagner et
al., 1992; Curiel et al., 1992b; Yoshimura et al.,
1993).
In einer Ausführungsform der Erfindung ist das
Adenovirus ein rekombinantes Adenovirus, d. h. ein
Adenovirus, das in seinem Genom mittels rekombinanter
Methoden integrierte Fremdsequenzen enthält. Dabei sind
vor allem Sequenzen von Interesse, deren Expression in
der Zielzelle einen erwünschten biologischen Effekt
erzielt, z. B. DNA, die ein defektes Gen ersetzt. In
dieser Ausführungsform bietet die vorliegende Erfindung
den Vorteil, den limitierten Tropismus, den die
ansonsten erfolgreiche Verwendung rekombinanter
Adenoviren für die Gentherapie aufweist, zu beseitigen
und das System breiter anwendbar zu machen.
Für die erfindungsgemäßen Virus-Konjugate besteht
keinerlei Beschränkung hinsichtlich der
Adenoviruskomponente, sämtliche Adenoviren, die an
ihrer Oberfläche eine zur Bindung an Transferrin fähige
Gruppierung aufweisen, sind geeignet, z. B. die von
Berkner, 1988; Stratford-Perricaudet et al., 1990;
Rosenfeld et al., 1991; Rosenfeld et al., 1992;
Stratford-Perricaudet et al., 1992, beschriebenen
Adenoviren, die als Vektoren für den Import von DNA in
die menschliche Zelle, insbesondere für die
gentherapeutische Anwendung, vorgeschlagen wurden,
können modifiziert werden, um DNA selektiv in vivo oder
ex vivo in die Zielzelle zu befördern.
Im Hinblick auf die Anwendung im Menschen wird als
Transferrin-Komponente insbesondere Humantransferrin
verwendet. Transferrin ist ein Eisentransportprotein,
das mit hoher Effizienz über Rezeptor-vermittelte
Endozytose in die Zelle aufgenommen wird, wodurch es
als Transport-Vehikel bereits für verschiedene
Anwendungen benutzt wurde, z. B. um in Form verschiedener
Konjugate Toxine, niedermolekulare Substanzen oder Gene
in die Zelle zu transportieren. Der Vorgang, der bei
der Internalisierung von Transferrin durch seinen
Rezeptor abläuft, unterscheidet sich von anderen
Ligand/Rezeptor-Paarungen u. a. dadurch, daß der
Transferrinrezeptor mit hohem Durchsatz rezykliert
wird.
Bezüglich der Fremd-DNA bestehen keinerlei durch die
vorliegende Erfindung bedingten Beschränkungen; die DNA
kann ein beliebiges Gen sein oder auch ein Plasmid-
Konstrukt, das z. B. für inhibierende RNA kodierende
Elemente enthält. Gentherapeutisch wirksame Sequenzen
sind dem Fachmann bekannt; Beispiele für derzeit als
für therapeutisch aussichtsreich angesehene Sequenzen
sind u. a. der Übersicht von Anderson, 1992, entnehmbar.
Die Erfindung betrifft in einem weiteren Aspekt ein
Verfahren zum Einbringen von Fremd-DNA in menschliche
Zellen, die keine oder nur eine geringe Zahl von
Adenovirus-Rezeptoren aufweisen oder deren Adenovirus-
Rezeptoren ganz oder teilweise blockiert sind, in
welchem man die Zellen mit dem erfindungsgemäßen Virus
in geeigneter Formulierung ex vivo oder in vivo
behandelt.
Insbesondere sind die Zellen Blutzellen.
Die Anforderungen an die Formulierung, in der die
erfindungsgemäßen modifizierten Viren verabreicht
werden, werden durch die spezielle Anwendung definiert;
der Fachmann kann einschlägigen pharmazeutischen
Handbüchern (z. B. Remington′s Pharmaceutical Sciences,
1980) zahlreiche Träger- und Zusatzstoffe entnehmen,
die für die Formulierung verwendet werden, wesentlich
ist vor allem, daß die Formulierung die Transport-
Funktion des erfindungsgemäßen Virus-Transferrin-
Konjugats sowie die Bioverfügbarkeit des in der Zelle
exprimierten Proteins nicht beeinträchtigen.
Das Virus kann an Transferrin in für die Kopplung von
Peptiden an sich bekannter Weise erfolgen, vorzugsweise
erfolgt die Bindung des Adenovirus an Transferrin über
die Kohlenhydratseitenketten des Transferrins. Dieser
Typ Bindung ist in der DE-A1 41 150 38, auf deren
Offenbarung hiermit Bezug genommen wird, für
Transferrin-Polylysin-Konjugate beschrieben.
Es wurde überraschend festgestellt, daß sich diese Art
der Bindung mehr gut zur Modifikation von Adenoviren
mit Transferrin eignet, um Fremd-DNA in Zellen zu
importieren, die ansonsten dem Transportvehikel
Adenovirus nicht bzw. nicht ausreichend zugänglich
sind.
Voraussetzung für die Fähigkeit des Virus, an die
Kohlenhydratseitenketten des Transferrins zu koppeln,
ist das Vorliegen von Aminogruppen an der Oberfläche
des Virus. Ohne auf diese Theorie festgelegt sein zu
wollen, dürfte es dabei von Vorteil sein, daß die
Kohlenhydratseitenkette des Transferrins einen
natürlichen Abstandhalter zwischen Transferrin und dem
Virus darstellt. Dadurch dürfte einerseits die
Bindungs- und Internalisierungsfähigkeit des
Transferrins, andererseits dürfte, was für die
Anwendung der erfindungsgemäßen Konjugate als
Bestandteil von Kombinationskomplexen von Bedeutung
ist, die endosomolytische Aktivität des Adenovirus
erhalten bleiben.
Ein bevorzugtes Verfahren zur Herstellung der
erfindungsgemäßen Adenovirus-Transferrin-Konjugate, das
ebenfalls Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist,
besteht darin, Transferrin unter schonenden Bedingungen
zu einer im Kohlenhydratanteil Aldehydgruppen
enthaltenden Form zu oxidieren und das oxidierte
Transferrin unter reduzierenden Bedingungen mit dem
Adenovirus zu koppeln.
Für den Oxidationsschritt, bei dem terminale
Sialinsäuren der Kohlenhydratketten des Transferrins
zur Aldehydform oxidiert werden, wird als
Oxidationsmittel bevorzugt Perjodat, insbesondere
Natriumperjodat, eingesetzt.
Als Substanzen zur Schaffung reduzierender Bedingungen
bei der Kopplung der Aldehydform des Transferrins mit
dem Adenovirus sind Reduktionsmittel geeignet, die
unter schonenden Bedingungen Schiff′sche Basen selektiv
reduzieren. Bevorzugt für den Einsatz als
Reduktionsmittel im erfindungsgemäßen Verfahren sind
Natriumcyanoborhydrid oder tertiäres Butylaminboran.
Das Verfahren wird bevorzugt bei niedrigen
Temperaturen, insbesondere 0°C bis Raumtemperatur,
durchgeführt.
Die Mechanismen der einzelnen Reaktionsstufen sind dem
Durchschnittsfachmann geläufig; es liegt daher im
Rahmen seiner Fähigkeiten, die Bedingungen für die
einzelnen Verfahrensschritte den jeweiligen
individuellen Bedürfnissen anzupassen.
Fig. 1: Schematische Darstellung des Viruseintritts in
die Zelle. A: Nichtmodifiziertes Adenovirus.
B: Transferrin-modifiziertes Adenovirus.
Fig. 2: Quantifizierung des an Adenovirus gebundenen
Transferrin auf Nitrozellulosemembranblot.
Fig. 3: Expression von β-Galaktosidase in K562-Zellen
nach Transfektion mit rekombinantem
Adenovirus. A:
Nichtmodifiziertes Adenovirus.
B: Transferrin-modifiziertes Adenovirus.
C: Kontrolle (nichtinfizierte Zellen).
Nichtmodifiziertes Adenovirus.
B: Transferrin-modifiziertes Adenovirus.
C: Kontrolle (nichtinfizierte Zellen).
Die Erfindung wird anhand des folgenden Beispiels
illustriert:
5 × 10⁶ 293-Zellen (ATCC No. 1573; Graham et al., 1977)
wurden in 175 cm² Flaschen mit 60 ml DMEM Medium plus
10% FCS und 1% Glutamin sowie einem Antibiotikazusatz
(Penicillin, Streptomycin) 3 Tage bei 37°C und 5% CO₂
gezüchtet, bis ca. 2 × 10⁷ Zellen, die zu ca. 80-100%
konfluent waren, erhalten wurden. Danach wurde das
Medium entfernt und die Zellen mit Adenovirus
Ad.RSVβgal (E1-, E3-defektes Adenovirus Typ 5, das das
E.coli β-Galektosidasegen unter Kontrolle des RSV
Promotor/Enhancers trägt; Stratford-Perricaudet et al.,
1992) infiziert (ca. 2 × 10⁹ Partikel in 5 ml Medium
mit 2% FCS). Nach ca. 2 Tagen Inkubation bei 37°C
waren die Zellen angeschwollen und hatten sich nahezu
vollständig vom Boden abgelöst. Daraufhin wurden die
Zellen 10 min in einem Sorvall GSA Rotor bei 3.000 rpm
zentrifugiert, die Zellpellets mit PBS in ein 50 ml
Röhrchen transferiert und 10 min in einer Heraeus
Zentrifuge bei 1.000 rpm zentrifugiert. Das Pellet
wurde im 2- bis 3fachen Volumen 10 mM HEPES/1 mM EDTA (HE)
aufgenommen, in flüssigem Stickstoff
schockgefroren und bei -70°C gelagert. Für den
Zellaufschluß wurden die Zellen vier Frier-/Tauzyklen
(flüssiger Stickstoff/37°C Wasserbad) unterworfen und
10 min zentrifugiert (Heraeus, 4.000 rpm). Anschließend
wurde das Zellysat einer Ultrazentrifugation
unterworfen (vTI-50 47.000 rpm/1 h/20°C; CsCl
Dichtegradient: 20 ml 1.33 g/cm³ CsCl in HE,
unterschichtet mit 10 ml 1.45 g/cm³ CsCl in HE,
überschichtet mit 10 ml Zellysat). Die opaleszente
Virusbande wurde gesammelt und einer zweiten
Ultrazentrifugation unterworfen (vTI-50 63.000 rpm/
4 h/20°C; CsCl Gleichgewichtsgradient: 2.5 ml
1.33 g/cm³ CsCl in HE, gemischt mit 2.5 ml Virusbande).
Pro Zellkulturflasche wurden 1-3 × 10¹¹ Viruspartikel
erhalten, die mit 40% (v/v) Glycerin bei -70°C
gelagert wurden. Die Bestimmung der Virion-
Konzentration wurde über den Proteingehalt mittels
Bradfordassay (BSA, Fraktion V, BMB als Standard)
bestimmt, wobei das Verhältnis 1 mg/ml Virusprotein =
1.34 × 10¹² Viruspartikel (Lemay et al., 1980)
herangezogen wurde.
Eine Lösung von 105 mg (1.30 µmol) Transferrin (human,
Sigma) in 1 ml 30 mM Natriumacetatpuffer (pH 5) wurde
einer Gelfiltration auf einer Sephadex G-25 PD10 Säule
(Pharmacia) unterworfen, wobei derselbe Puffer
verwendet wurde. Die erhaltenen 2 ml Lösung, die 80 mg
(1.0 µmol) Transferrin enthielten (der
Transferringehalt wurde durch UV-Messung bei 280 nm und
Ninhydrinassay bestimmt), wurden in einem Speedvac
(Savant) auf 1 ml konzentriert, auf 0°C gekühlt und mit
50 µl 30 mM Natriumacetatpuffer (pH 5), enthaltend
1.1 mg (5 pmol) Natriumperjodat, behandelt. Die
Mischung wurde in einem Eisbad im Dunklen 90 min lang
stehen gelassen. Anschließend wurde eine weitere
Gelfiltration (Sephadex G-25 PD10 Säule, Pharmacia,
150 mM NaCl, 10 mM HEPES, pH 7.3) durchgeführt, dabei
wurden 1 ml einer Lösung, enthaltend 66 mg (0.82 µmol)
oxidiertes Transferrin erhalten (der Gehalt an
oxidierter, Aldehyd enthaltender Form von Transferrin
wurde bestimmt mittels Färbung mit Anisaldehydreagens,
wie von Wagner et al., 1991, beschrieben). Ein Teil der
modifizierten Transferrinlösung (0.6 ml; 0.5 µmol)
wurde rasch zu einer Lösung, enthaltend 25 µg (bezogen
auf Protein) Adenovirus in 300 µl HBS, hinzugefügt.
Nach 1 h bei Raumtemperatur wurde eine Lösung von 1 mg
(15 µmol) Natriumcyanborhydrid zugegeben. Nach 24 h bei
Raumtemperatur wurde das Transferrin-konjugierte
Adenovirus von überschüssigem freiem Transferrin
gereinigt, indem das Virus mit einem gleichen Volumen
HBS (150 mM NaCl, 20 mM HEPES, pH 7.4) verdünnt und das
Material über einen CsCl-Stufengradienten zentrifugiert
wurde. Ca. 1.5 ml des modifizierten Virus wurden in
einem vTI-65 Röhrchen (Beckman) mit 3 ml 1.31 g/cm³
CsCl und 1 ml 1.45 g/cm³ CsCl (beide CsCl-Lösungen in
1 mM EDTA, 20 mM HEPES, pH 7.4) unterschichtet. Die
Probe wurde 1 h lang bei 63.000 rpm in einem vTi-65
Rotor (Beckman) zentrifugiert. Die opaleszente
Virusbande wurde geerntet, mit einem gleichen Volumen
HBS verdünnt und einer zweiten identischen CsCl-
Gradientenreinigung unterworfen. Alternativ wurde die
erste Virusbande mit 1.33 g/cm³ CsCl, 20 mM HEPES, 1 mM
EDTA, pH 7.4, auf 5.5 ml gebracht und die Probe bis zum
Gleichgewicht zentrifugiert (4 h, 63.000 rpm, vTi-65
Rotor). Das gereinigte modifizierte Virus wurde
geerntet, mit einem gleichen Volumen von 96% Glyzerin
(Fluka) verdünnt und bis zur Verwendung bei -70°C
gelagert. Parallel wurde eine Kopplung mit eisenfreiem
Transferrin durchgeführt; das gereinigte Virus wurde
mit 1 µl 1 mM Eisen (III) Citratpuffer, pH 7.5
versetzt.
Transferrin-modifiziertes Adenovirus,
nichtmodifiziertes Adenovirus sowie Transferrin-
Standards (jeweils in HBS; die Anzahl der aufgetragenen
Viruspartikel bzw. Transferrinmoleküle ist Fig. 2
entnehmbar) wurden an eine Nitrozellulosemembran
(Schleicher &, Schuell, 0.1 mm Porengröße) gebunden. Der
Blot wurde über Nacht bei 4°C mit 3% (w/v)
pulverisierter Magermilch in HBS (10 ml)
vorhybridisiert. Der Transferringehalt jeder Probe
wurde bestimmt, indem die Membran 4 h bei
Raumtemperatur einem Mausantikörper, der humanes
Transferrin erkennt (Chemicon MAB 033-19/1, Verdünnung
1 : 2000 in HBS/Milch, 10 ml), und im Anschluß daran
(nach 2stündigem Waschen mit 4 × 130 ml HBS/Milch) 1 h
lang einem ¹²⁵I-markiertem zweiten Antikörper (Schaf
anti-Maus-Ig, Amersham, Kat.No. L52215, 2 µCi, in 20 ml
HBS/Milch) exponiert wurde. Die Phosphoimager-Analyse
der Membran zeigt die Gegenwart von Transferrin in den
Proben mit modifiziertem Adenovirus, jedoch kein Signal
beim nichtmodifizierten Adenovirus. Der Vergleich der
mit den modifizierten Virus erhaltenen Signale mit den
Transferrinstandards erlaubt eine Bestimmung der Menge
an Transferrin, die an ein Virusteilchen gebunden ist.
Es wurde gefunden, daß 3 × 10⁹ Viruspartikel ein Signal
geben, das mit dem von 4 × 10¹² Transferrinmolekülen
vergleichbar ist. Daraus ergibt sich, daß an ein
Adenovirusteilchen ca. 1.000 Transferrinmoleküle
gebunden sind. Die Assoziation der Transferrinmoleküle
mit Adenovirusteilchen durch zwei CsCl-Dichtegradienten
spricht für eine kovalente Bindung zwischen
Kapsidproteinen des Virus und dem Transferrinmolekül.
Damit in Einklang ist auch das Ergebnis einer Analyse
von Viruskapsidproteinen mittels SDS-PAGE, die zeigte,
daß die Hauptmenge des gekoppelten Transferrins an das
Hexon gebunden ist.
K562-Zellen (ATCC No. CCL 243) wurden in Suspension in
RPMI 1640 Medium (Gibco BRL) plus 10% FCS, 100
Einheiten/ml Penicillin, 100 µg/ml Streptomycin und
2 mM Glutamin gezüchtet. 20 h vor der Transfektion
wurden die Zellen in frisches Medium, enthaltend zwecks
Erhöhung ihrer Transferrinrezeptor-Zahl 50 µM
Deferrioxamin (Cotten et al., 1990), überführt. Die
Transfektionen wurden bei einer Dichte von 250.000
Zellen/ml in demselben Medium (plus 50 µM
Deferrioxamin) durchgeführt. Es wurden jeweils gleiche
Mengen (3.000 Viruspartikel/Zelle bis 300
Viruspartikel/Zelle) von entweder nichtmodifiziertem
Adenovirus (Ad.RSVβgal) oder von modifiziertem
Adenovirus (Tf-Ad.RSVβgal) auf die K562-Zellen
aufgebracht. 48 h nach der Transfektion wurden ca.
25.000 Zellen in einem Volumen von 100 bis 200 µl in
die Vertiefungen einer rundbödigen 96-Well-Platte
überführt und bei 800 rpm in einem Beckman GH 3.7 Rotor
10 min lang zentrifugiert. Der Überstand wurde
vorsichtig entfernt und mit 100 µl 0.5%
Glutardialdehyd in HBS ersetzt. Die Zellen wurden durch
Pipettieren dispergiert und dann wieder zentrifugiert.
Daraufhin wurde das Fixiermittel entfernt und die
Zellen gewaschen. Anschließend wurde mit der
Färbelösung (10 mM Phosphatpuffer pH 7.0, 150 mM NaCl,
1 mM MgCl₂, 3.3 mM K₄Fe(CN)₆3H₂O, 3.3 mM K₃Fe(CN)₆ und
0.2% 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-β-galaktopyranosid) bei
37°C 20 min bis 3 h inkubiert (Lim und Chae, 1989).
Die Zellen wurden bei 38°C 5 h lang inkubiert, dann 2 ×
gewaschen und nach dem Transfer in flachbödige
Vertiefungen einer 96-Well-Platte photographiert.
Das Ergebnis der Transfektionen ist in Fig. 3
wiedergegeben: Es wurde gefunden, daß beim höchsten
Virus/Zellverhältnis das nichtmodifizierte Virus die
Zellen mit einer Leistungsfähigkeit von ca. 5%
transduzieren kann. Beim selben Virus/Zellverhältnis
transduziert jedoch das Transferrin-modifizierte Virus
mehr als 90% der Zellpopulation, wobei auch die
tatsächlichen Mengen an pro Zelle produzierter β-
Galaktosidase höher sind. Kontrollversuche zeigten, daß
sowohl nichtmodifiziertes als auch Transferrin
modifiziertes Adenovirus in HeLa-Zellen mit gleicher
Leistungsfähigkeit eindringen konnte.
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Claims (12)
1. Virus für den Transport von Fremd-DNA in höhere
eukaryotische Zellen, dessen Oberfläche mit einem
Liganden für einen Oberflächenrezeptor der
Zielzelle derart modifiziert ist, daß es an die
Zelle bindet und derart internalisiert wird, daß
die Fremd-DNA in der Zelle exprimiert wird,
dadurch gekennzeichnet, daß das Virus ein
Adenovirus und der Ligand Transferrin ist.
2. Modifiziertes Adenovirus nach Anspruch 1, dadurch
gekennzeichnet, daß das Virus und das Transferrin
über die Kohlenhydratseitenketten des Transferrins
miteinander verbunden sind.
3. Modifiziertes Virus nach Anspruch 1 oder 2, dadurch
gekennzeichnet, daß das Virus ein Adenovirus vom
Typ 2 ist.
4. Modifiziertes Virus nach Anspruch 1 oder 2, dadurch
gekennzeichnet, daß das Virus ein Adenovirus vom
Typ 5 ist.
5. Modifiziertes Virus nach einem der vorhergehenden
Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das Virus
ein rekombinantes Adenovirus ist, das als Fremd-
DNA eine gentherapeutisch wirksame DNA-Sequenz
enthält.
6. Modifiziertes Virus nach einem der Ansprüche 1 bis
5, dadurch gekennzeichnet, daß das Transferrin
Humantransferrin ist.
7. Verfahren zur Herstellung von Adenovirus-
Transferrin-Konjugaten nach Anspruch 1, dadurch
gekennzeichnet, daß man Transferrin unter
schonenden Bedingungen zu einer im
Kohlenhydratanteil Aldehydgruppen enthaltenden
Form oxidiert und das oxidierte Transferrin unter
reduzierenden Bedingungen mit dem Adenovirus
koppelt.
8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet,
daß man das Transferrin mit Periodat oxidiert.
9. Verfahren nach Anspruch 7 oder 8, dadurch
gekennzeichnet, daß man die Kopplung unter
reduzierenden Bedingungen in Gegenwart einer
Substanz durchführt, die unter für das Transferrin
schonenden Bedingungen Schiff′sche Basen selektiv
reduziert.
10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet,
daß man die Kopplung in Gegenwart von
Natriumcyanoborhydrid vornimmt.
11. Verfahren zum Einführen von Fremd-DNA mittels
humanem Adenovirus in humane Zellen, die keine
oder nur eine geringe Zahl von Adenovirus-
Rezeptoren aufweisen oder deren Adenovirus-
Rezeptoren ganz oder teilweise blockiert sind,
dadurch gekennzeichnet, daß man die Zellen mit
einem in Anspruch 6 definierten Virus behandelt.
12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet,
daß die Zellen Blutzellen sind.
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