DE4409436A1 - Verfahren zur Bearbeitung von Nukleinsäuren - Google Patents
Verfahren zur Bearbeitung von NukleinsäurenInfo
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- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
- B01L7/00—Heating or cooling apparatus; Heat insulating devices
- B01L7/52—Heating or cooling apparatus; Heat insulating devices with provision for submitting samples to a predetermined sequence of different temperatures, e.g. for treating nucleic acid samples
Description
Gegenstand der Erfindung sind Verfahren zur Bearbeitung von Nukleinsäuren
mittels eines Temperaturregulationselements sowie Vorrichtungen und Geräte
zur Durchführung dieser Verfahren.
In der Analytik, insbesondere in der medizinischen Diagnostik, beginnen sich
immer mehr Verfahren zu etablieren, welche auf Nachweisen und Synthesen
von Nukleinsäuren beruhen. Nukleinsäuren sind als z. B. sehr spezifisches Er
kennungsmittel für Organismen zur Diagnose von Krankheiten gut geeignet.
Während dieser Nachweisverfahren sind verschiedenste Bearbeitungsschritte,
wie Denaturierung, Hybridisierung, Synthesen und Immobilisierung von
Nukleinsäuren, sowie deren enzymatische Behandlung üblich. Ein Problem bei
solchen Verfahren war lange Zeit die geringe Menge an Nukleinsäure in den
Proben.
Eine Lösung für dieses Problem, mit der eine Vielzahl von Analyten für einen
Nachweis zugänglich gemacht wird, brachte die Amplifikation von Nuklein
säuren. Ein solches Verfahren ist in der EP-A-0 200 362 beschrieben, nämlich
die Polymerase Chain Reaction. Dabei wird durch mehrfache Verlängerung
von Primern in einer Reaktionslösung eine Vielzahl von Kopien der ur
sprünglichen Nukleinsäure hergestellt. Diese können beispielsweise durch
Hybridisierung mit einer markierten Nukleinsäuresonde gemäß
EP-A-0 201184 nachgewiesen werden. Die dabei verwendeten Reaktions
lösungen werden zur Trennung von Doppelsträngen und für die Extensions
reaktion jeweils in Intervallen auf bestimmte Temperaturen erhitzt bzw. wieder
abgekühlt. Dadurch, daß es sich um relativ große Volumina handelt, bedingen
die Zeiten für die Temperaturregulierung eine relativ lange Zeit für die
Durchführung des gesamten Amplifikationsverfahrens.
Eine Abhilfe versucht hier die sogenannte Kapillar-PCR zu schaffen. Dabei
befindet sich die Reaktionsmischung in Glaskapillaren mit einem geringen
Durchmesser. Dadurch kann die Zeit für die Durchführung einer Amplifika
tionssequenz auf ca. 30 min gesenkt werden. Ein Problem bei der Kapillar-
PCR ist die Anfälligkeit des mitzuerhitzenden Glases der Kapillare.
In jüngerer Zeit werden auch immer mehr Amplifikationsverfahren beschrie
ben, bei denen die Amplifikationsreaktionen in einem geschlossenen System,
d. h. ohne Zufuhr von Reagenzien während der Zyklen, durchgeführt werden
kann.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es unter anderem, die bestehenden
Nukleinsäurebearbeitungsverfahren zu verbessern und insbesondere Verfahren
bereitzustellen, bei denen die Amplifikation in noch kürzerer Zeit abge
schlossen werden kann.
Gegenstand der Erfindung ist daher ein Verfahren zur Bearbeitung und insbe
sondere Vermehrung von Nukleinsäuren in einer Reaktionsmischung, dadurch
gekennzeichnet, daß die Temperatur einer an die Reaktionsmischung an
grenzenden Oberfläche und deren unmittelbaren Umgebung reguliert wird,
jedoch der Hauptraum der Reaktionsmischung im wesentlichen isotherm ver
bleibt.
Ebenfalls Gegenstand der Erfindung sind eine Vorrichtung zum Bearbeiten
und Vermehrung von Nukleinsäuren mit einem Temperaturregulationselement
sowie ein Gerät, welches diese Vorrichtung enthält.
Nukleinsäuren im Sinne der Erfindung sind jede Art von Nukleinsäuren,
modifizierte oder unmodifizierte. Unmodifizierte Nukleinsäuren sind bei
spielsweise die natürlich vorkommenden Nukleinsäuren. Modifizierte
Nukleinsäuren können durch Austausch von Gruppen der natürlichen Nuklein
säuren durch andere chemische Reste entstehen. Beispiele sind Nukleinsäure-
Phosphonate, oder -Phosphothionate und an den Zuckerresten oder den Basen
durch chemische Gruppen, die auch nachweisbar sein können, modifizierte
Nukleinsäuren.
Die Bearbeitung von Nukleinsäuren gemäß der vorliegenden Erfindung enthält
bevorzugt mindestens einen bei erhöhter Temperatur, zumindest aber von der
Umgebungstemperatur abweichenden Temperatur ablaufenden Reaktions
schritt. Solche Bearbeitungsschritte sind beispielsweise die thermische
Denaturierung von teilweise oder vollständig doppelsträngigen Nukleinsäuren.
Dabei werden, um Einzelstränge herzustellen, oder um Sekundärstrukturen
aufzuschmelzen die Nukleinsäuren auf Temperaturen oberhalb des
entsprechenden Schmelzpunktes erhitzt. Insbesondere in Amplifikations- oder
Sequenzierungsverfahren wird ein weiterer Bearbeitungsschritt durchgeführt,
nämlich die Verlängerung eines an eine sogenannte Templat-Nukleinsäure
hybridisierten Primers mit Hilfe weiterer Mono- oder Oligonukleotide. Hierbei
wird bevorzugt die Temperatur eingestellt, bei der das entsprechende ver
wendete Enzym sein Aktivitätsoptimum aufweist, bzw. Konkurrenzreaktionen
vermindert sind. Ein weiterer Bearbeitungsschritt von Nukleinsäuren ist die
Hybridisierung von zueinander komplementären Nukleinsäuren in einzel
strängigen Bereichen zu einem Nukleinsäuredoppelstrang (Hybrid). Dieser
findet bei Temperaturen unterhalb des Schmelzpunktes des Hybrides statt. Um
eine Hybridisierung zu erreichen, muß daher oft eine Abkühlung der Reak
tionsmischung vorgenommen werden.
Ein Spezialfall für die Bearbeitung von Nukleinsäuren ist die Vermehrung von
Nukleinsäuren. Dabei können gemäß der vorliegenden Erfindung praktisch alle
Amplifikationsverfahren, z. B. zielsequenzabhängige Amplifikationen
(z. B. Polymerase Chain Reaction, Ligase Chain Reaction oder ähnliche)
eingesetzt werden. Auch während dieser Vermehrungsverfahren findet
mindestens einer der oben genannten temperatursensitiven Bearbeitungs
schritte statt.
Zentrales Merkmal der vorliegenden Erfindung ist die Tatsache, daß die Ände
rung der Temperatur nicht in der gesamten Reaktionsmischung, sondern nur in
einem sehr kleinen Teil der Reaktionsmischung stattfindet. Dies hat zur Folge,
daß das Aufheizen bzw. das Abkühlen dieses relativ kleinen Bereiches sehr
schnell vor sich gehen kann und damit die Bearbeitung der Nukleinsäuren
stark beschleunigt wird. Zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens
wird daher die Reaktionsmischung mit einer temperaturregulierbaren Ober
fläche in Kontakt gebracht. Durch Änderung der Temperatur der Oberfläche
wird die unmittelbare Umgebung dieser Oberfläche erhitzt, angeglichen oder
abgekühlt, je nach Bearbeitungsschritt und Temperatur der Reaktions
mischung. Man kann hier mehrere Fälle unterscheiden.
Für den Fall, daß die Temperatur der Reaktionsmischung höher liegt als die
Schmelztemperatur der zu bearbeitenden Nukleinsäuren, kann die Oberfläche
gekühlt werden, um in der angrenzenden Umgebung eine Hybridisierung der
Nukleinsäuren zu erreichen. Für den Fall, daß die Temperatur der Reak
tionsmischung niedriger ist als die Schmelztemperatur und die Temperatur, die
für eine Verlängerung eines Primers an der Nukleinsäure erforderlich ist, kann
die Oberfläche und damit die unmittelbare Umgebung zunächst auf eine
Temperatur erhitzt werden, bei der die Extension des Primers stattfinden kann.
Anschließend kann die Temperatur über den Schmelzpunkt der Nukleinsäuren
erhöht werden, wodurch eine Denaturierung und Einzelsträngigmachung der
gebildeten doppelsträngigen Nukleinsäuren stattfinden kann. Daran kann sich
eine Abkühlung auf eine Temperatur, bei der die Einzelstränge mit neuen
Primern hybridisieren können, anschließen. So kann der Zyklus mehrfach
durchlaufen werden.
Für den Fall, daß die Temperatur zwischen der für die Extension optimalen
Temperatur und der Schmelztemperatur liegt, wird die Temperatur zunächst
erhöht, um Doppelstränge zu trennen. Anschließend wird die Temperatur auf
eine Temperatur gesenkt, bei der die Einzelstränge wieder mit neuen Primern
hybridisieren. Daraufhin wird die für die Extension optimale Temperatur ein
gestellt und gewünschtenfalls der Zyklus wiederholt.
Die gewünschte Temperatur kann über einen festgelegten Zeitraum aufrecht
erhalten werden, z. B. solange, bis die gewünschten Reaktionen an der Ober
fläche abgelaufen sind. Dazu kann die Temperatur der Oberfläche auch durch
bekannte Kontrollmaßnahmen und angeschlossene Regelmaßnahmen
(Nachheizen, -Kühlen) konstant gehalten werden. Die Zeiträume hängen, wie
bei bekannten Verfahren üblich, von der Länge der zu bearbeitenden Nuklein
säuren und deren Homologie sowie den speziellen Hybridisierungsbedingun
gen ab. Der Fachmann kann jedoch durch einfache Versuche die optimalen
Zeiträume ermitteln.
Bei den oben geschilderten Fällen verbleibt der Hauptraum der Reaktions
mischung im wesentlichen isotherm, während sich die in unmittelbarer Um
gebung der Oberfläche befindliche Reaktionsmischung den an der Oberfläche
eingestellten Temperaturen anpaßt.
Zur Regulierung der Temperatur und zum Einstellen spezifischer Tempera
turen an der Oberfläche und deren unmittelbarer Umgebung empfiehlt es sich,
als Oberfläche die Oberfläche einer Vorrichtung zu wählen, die aus einem
Heizelement und einem Kühlelement besteht. Das Heizelement hat bevorzugt
eine relativ große Oberfläche bei vergleichsweise geringer Wärmekapazität.
Als geeignet haben sich beispielsweise Metallfolien erwiesen, die auf ge
eignete Weise erhitzt werden können, z. B. durch elektrischen Strom. Als
Materialien für die Metallfolie sind gut wärmeleitende Materialien, z. B. Gold,
bevorzugt.
Das Kühlelement sollte eine vergleichsweise hohe Wärmekapazität haben. Als
Kühlmedium kommen feste, flüssige oder gasförmige Stoffe in Frage. Bevor
zugt sind flüssige Kühlmedien, z. B. Wasser. Eine gute Wärmeleitfähigkeit ist
von Vorteil.
Die Anordnung des Heizelements und des Kühlelements kann entsprechend
der Temperatur des Reaktionsmediums verändert werden, je nach dem, ob die
Vorrichtung mehr zum Erhitzen oder zum Kühlen der Oberfläche und deren
unmittelbarer Umgebung benutzt werden soll. Im allgemeinen wird jedoch das
Heizelement in unmittelbarer Nähe der Oberfläche lokalisiert sein. Die
Oberfläche des Heizelementes kann auch schon direkt die an die Reak
tionsmischung angrenzende Oberfläche sein. Es ist jedoch auch möglich, das
Heizelement durch eine dünne, wärmeleitfähige Schicht von der Reaktions
mischung zu trennen.
Das Kühlelement kann prinzipiell an jeder Stelle positioniert sein, mit der eine
Abkühlung der Oberfläche und der unmittelbaren Umgebung möglich ist. Als
bevorzugt hat es sich jedoch erwiesen, das Kühlelement auf der der Reak
tionsmischung abgelegenen Seite des Heizelements zu positionieren. Für den
Fall, daß das Heizelement eine geringe Wärmekapazität hat, ist die Tatsache,
daß das Heizelement ebenfalls abgekühlt werden muß, nicht von entscheiden
dem Nachteil.
Im erfindungsgemäßen Verfahren wird mit Hilfe des Heizelements so lange
geheizt, bis die Oberfläche und ihre unmittelbare Umgebung auf die ge
wünschte Temperatur erhitzt ist. Dabei wird sich ein starker Temperatur
gradient in der Nähe der Oberfläche ausbilden, während ein Teil, bevorzugt
der restliche Teil des Reaktionsgemisches im wesentlichen isotherm bleibt. Im
wesentlichen isotherm bedeutet hier eine Abweichung von weniger als
20%°C, bevorzugt weniger als 10%°C und besonders bevorzugt weniger als
2%°C. Dies gilt insbesondere, wenn kein bemerkenswerter Flüssigkeitsaus
tausch während des Aufheizvorganges realisiert wird, aber auch, wenn ein
Flüssigkeitsaustausch stattfindet. Der Aufheizvorgang kann innerhalb von Se
kundenbruchteilen, in günstigen Fällen sogar Millisekunden, abgeschlossen
sein. Dasselbe gilt für die Kühlung. Der Reaktionsraum, welcher auf die ge
wünschte Temperatur erhitzt wird, kann sehr klein sein, bevorzugt ist er
weniger als 0,2 mm, besonders bevorzugt weniger als 0,5 µm tief. Die auf die
Reaktionsmischung hingerichtete Fläche des Heizelements beeinflußt die Tiefe
des Temperaturgradienten und seine Aufbaugeschwindigkeit. Aus den ge
wünschten Anwendungen des Verfahrens kann sich eine bevorzugte Größe der
Oberfläche ergeben. In der Regel ist die Oberfläche < 1 cm², besonders
bevorzugt zwischen 0,2 cm² und 0,2 mm². Die Oberfläche kann glatt oder auch
rauh sein. Für den Fall, daß die Oberfläche gleichzeitig als Träger von Mitteln
für die Bearbeitung der Nukleinsäuren genutzt wird, ist es vorteilhaft, diese
Oberfläche durch Oberflächenstrukturen zu vergrößern.
Das Volumen der Reaktionsmischung ist für die Erfindung praktisch nicht von
großer Bedeutung. Es kann sich hierbei um einen Tropfen mit einem Volumen
von 20 µl, jedoch auch um ein beliebig großes Volumen handeln. Es ist ein
Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens, daß die das Heiz- und das Kühl
element enthaltende Vorrichtung beispielsweise auch in ein großes Gefäß mit
Reaktionsmischung eingebracht werden kann, wobei die wesentlichen Reak
tionen nur in einem sehr kleinen Grenzbereich der Oberfläche stattfinden,
während der übrige Reaktionsraum praktisch keinen Einfluß auf die Reaktion
ausübt. Andererseits stellen die erhältlichen Proben und Reagenzmengen ein
praktisches Limit für die Größe der Reaktionsmischung dar. Die Reaktions
volumina werden sich daher meist in einem Bereich zwischen 1 ml und 30 µl,
bevorzugt zwischen 100 µl und 50 µl, bewegen, jedoch läßt sich zum Beispiel
durch Aufbringen des Reaktionsansatzes auf die temperaturregulierende Ober
fläche auch mit sehr viel kleineren Volumina arbeiten.
Zur Bearbeitung der Nukleinsäuren werden diese an die temperaturregulier
bare Oberfläche oder deren unmittelbare Umgebung gebracht. Dies kann auf
verschiedene Weise geschehen, beispielsweise mechanisch oder durch Diffu
sion. Bevorzugt werden die Nukleinsäuren an die Oberfläche gebunden. Diese
Bindung wiederum kann unterschiedlicher Art sein. Bevorzugt ist eine
chemische Bindung, entweder über Adsorption oder biospezifische Wech
selwirkungen. Im Falle einer Bindung durch Adsorption kann die Oberfläche
mit einem nukleinsäurebindenden Reagenz belegt sein. Biospezifische Wech
selwirkungen können Wechselwirkungen zwischen Nukleinsäuren und den zu
bearbeitenden Nukleinsäuren sein (Hybridisierung, komplementärer Teil dieser
Nukleinsäuren), jedoch auch Wechselwirkungen zwischen Antigenen oder
Haptenen mit dagegen gerichteten Antikörpern und Rezeptor-Ligand-Wech
selwirkungen. Eine bevorzugte Art der Bindung der zu bearbeitenden
Nukleinsäuren an die Oberfläche geschieht über Nukleinsäuren, bevorzugt
Oligonukleotide, die kovalent an die Oberfläche gebunden sind und zumindest
zu einem Teil der zu bearbeitenden Nukleinsäure soweit komplementär sind,
daß sie mit innen hybridisieren. Diese Oligonukleotide können auch über
biospezifische Wechselwirkungen, z. B. Biotin-Streptavidin, an die Oberfläche
gebunden sein. An der Oberfläche können auch Nukleinsäuren unterschied
licher Sequenz, z. B. nach WO 90/15070, gebunden sein.
Die Bindung der zu bearbeitenden Nukleinsäuren ist gemäß der vorliegenden
Erfindung reversibel. Die Nukleinsäuren können nach einer von dem durchzu
führenden Vorgang abhängigen Zeit durch Erhitzen der Oberfläche und ihrer
unmittelbaren Umgebung wieder freigesetzt werden. Zwischen dem Binden
und Freisetzen der Nukleinsäure können beliebige Schritte vorgenommen
werden, z. B. Durchführung chemischer Reaktionen, jedoch auch eine
Trennung der gebundenen Nukleinsäuren von der ursprünglichen Reaktions
mischung und Überführung in eine neue Reaktionsmischung.
Für den Fall einer Vermehrungsreaktion der Nukleinsäuren können die an die
Oberfläche gebundenen Oligonukleotide als Primer für die Elongation oder
Extension unter Verwendung der zu bearbeitenden Nukleinsäure als Matrize
verwendet werden. Dadurch bildet sich ein an die zu bearbeitende Nuklein
säure gebundener verlängerter Primer. Die als Matrize benutzte Nukleinsäure
kann durch Temperaturerhöhung von dem Verlängerungsprodukt gelöst wer
den und kann im nächsten Temperaturzyklus für einen neuen, bisher noch
nicht verlängerten immobilisierten Primer als Matrize wirken. Auf diese Weise
ist es möglich, eine große Menge an an der Oberfläche immobilisierten
Primern zu verlängern und somit Kopien von Teilen der zu bearbeitenden Nu
kleinsäure herzustellen. Die extendierten oberflächenbehafteten Primer dienen
wiederum mittels komplementärer Primer zu einer Vermehrung der als Matrize
dienenden Moleküle. Die für die durchzuführenden Reaktionen erforderlichen
Reagenzien sind in der gesamten Reaktionsmischung vorrätig zu halten oder
diese nach Bedarf zuzugeben. Für eine Vermehrungsreaktion nach dem Prinzip
der Polymerasereaktion sind daher die Deoxyribonukleotide, eine DNA-
Polymerase und ein weiterer Primer und geeignete Puffer-Reagenzien in der
Reaktionsmischung zu halten. Zur Darstellung anderer Nukleinsäuretypen,
sind andere Reagenzien, z. B. Ribonukleotide oder RNA abhängige
Polymerasen vorgesehen. Dieser Schritt des Verfahrens kann besondere
Rücksicht auf die Arbeitstemperatur des bearbeitenden Enzyms nehmen.
Mit der Erfindung ist erstmals eine Kombination von isothermen Amplifika
tionen mit temperaturabhängigen Schritten (z. B. Denaturierung oder andere
Amplifikation) möglich. Die zu bearbeitenden Nukleinsäuren können jedoch
auch über physikalische Methoden an die Oberfläche gebunden werden, z. B.
mittels eines Magneten. Hierzu müssen die Nukleinsäuren jedoch an ein
magnetisierbares Teilchen gebunden werden. Die Bindung von mit Nuklein
säure beladenen magnetischen Teilchen kann dadurch reversibel gestaltet
werden, daß sich ein Magnet hinter der Oberfläche befindet oder induziert
wird. Durch Anlegen eines Wechselfeldes können die magnetischen Teilen an
die Oberfläche gebunden bzw. von ihr entfernt werden.
Spezielle Ausführungsformen, die teilweise vorteilhafte Wirkung aufweisen,
sind ebenfalls denkbar. So kann die Effizienz gesteigert werden, indem die
Diffusion der Nukleinsäuren in der Reaktionsmischung durch Konvektion
verstärkt wird. Es kann auch vorteilhaft sein, gegenüber den üblicherweise
verwendeten Reaktionsmischungen höhere Konzentrationen der Reaktions
teilnehmer einzusetzen. Außerdem kann die zu bearbeitende Nukleinsäure zu
Beginn der Reaktion durch Vorhybridisierung an der Oberfläche konzentriert
werden.
Im Falle einer Amplifikation oder Vermehrung der Nukleinsäuren kann es
sein, daß die Anzahl der zu durchlaufenden Zyklen, z. B. bei einer PCR, er
höht werden muß, damit genügend Amplifikationsprodukt erzeugt wird.
Wegen der sehr kurzen Zykluszeit nach dem erfindungsgemäßen Verfahren ist
dies jedoch nicht von Nachteil.
Für den Fall, daß die Reaktionsmischung auf einer relativ niedrigen Tempera
tur gehalten wird, bedeutet dies, daß an die Hitzestabilität der Reagenzien
weniger Ansprüche gestellt werden müssen als bei mehrmaliger Erhitzung der
gesamten Reaktionsmischung. Eine thermostabile Polymerase ist daher für
eine Vermehrungsreaktion nicht unbedingt erforderlich und dennoch muß
nicht in jedem Amplifikationszyklus neues Enzym zu der Reaktionsmischung
zupipettiert werden.
An die erfindungsgemäße Bearbeitung der Nukleinsäuren können sich belie
bige weitere Schritte anschließen. So können die Nukleinsäuren entweder im
an die Oberfläche gebundenen Zustand oder im wieder freigesetzten Zustand
untersucht oder mit weiteren Reagenzien bearbeitet werden.
Mit Hilfe des geschilderten erfindungsgemäßen Vermehrungsverfahrens läßt
sich somit auf einfache Weise ein Verfahren zum Nachweis von Nuklein
säuren in einer Probe bilden. Hierzu wird die Oberfläche, an welche die als
Primer fungierenden Oligonukleotide gebunden sind, mit der Probenflüssigkeit
in Kontakt gebracht. Danach wird die Temperatur der Oberfläche und ihrer
unmittelbaren Umgebung auf eine Temperatur gebracht, welche über dem
Schmelzpunkt der in der Probe enthaltenen doppelsträngigen Nukleinsäure
liegt. Nach Abkühlung der Oberfläche und der unmittelbaren Umgebung wird
die nachzuweisende Nukleinsäure mit dem Oligonukleotid hybridisieren.
Durch Zyklusführung wird, wie oben beschrieben, mit Hilfe der nachzu
weisenden Nukleinsäure eine Vielzahl von Kopien hergestellt, die am Ende
der Vermehrungsreaktion an die Oberfläche gebunden bleiben können. Durch
Hybridisierung mit markierten Nukleinsäuresonden und deren Detektion mit
Hilfe der Markierung kann die Menge an Nukleinsäuren an der Oberfläche
bestimmt werden. Bei Verfahren, die einen direkten Nachweis von Nuklein
säurehybriden ohne Markierung oder von verlängerten Einzelsträngen
(Primern) erlauben (z. B. nach dem Prinzip der Oberflächen-Plasmonen
resonanz), ist auch ein direkter Nachweis möglich. Verwendet man für die
Vermehrungsreaktion markierte Primer oder Mononukleotide, entfällt die
Hybridisierung mit einer nachweisbar markierten Nukleinsäuresonde. Es ist
auch ein Ansatz denkbar, bei dem im Ansatz eine höhere Temperatur gehalten
wird und die Oberfläche, die für weitere Schritte nötig tieferen Temperaturen
annimmt.
Da die erfindungsgemäße Anwendung des Verfahrens zur Vermehrung der
Nukleinsäuren praktisch an einer Oberfläche abläuft, führen wir für diese
Vermehrungsreaktion die Bezeichnung 2D-Amplifikation ein.
Ebenfalls Gegenstand der Erfindung ist eine Vorrichtung, die zum Einsatz im
oben genannten Bearbeitungsverfahren verwendet werden kann. Insbesondere
ist Gegenstand der Erfindung eine Vorrichtung zum Bearbeiten von Nuklein
säuren mittels eines Temperaturregulationselements, wobei dieses Element zur
Temperaturregulation der Oberfläche und der unmittelbar angrenzenden
Umgebung geeignet ist und wobei an diesem Mittel zur Bearbeitung der
Nukleinsäuren gebunden werden können. Diese Mittel können Oligonukleo
tide sein, und beispielsweise als Primer dienen. Diese Vorrichtung enthält be
vorzugt ein Kühlelement sowie ein Heizelement, wobei die Anordnung bevor
zugt wie im oben beschriebenen Bearbeitungsverfahren vorliegt. Diese Vor
richtung ist bevorzugt sehr klein. Sie kann beispielsweise eine Dicke von
< 5 mm und eine Fläche von < 10 mm² haben. Die darin befindlichen Ele
mente, wie das Kühlelement oder das Heizelement, sind einfache Bauteile.
Daher ist diese Vorrichtung ausgezeichnet geeignet zur einmaligen Verwen
dung (Disposable), was die für wiederverwendbare inhärente Kontaminations
gefahr reduzieren kann. Soll die Vorrichtung für eine Mehrfachbenutzung ge
eignet sein, ist es auch möglich, das Heizelement durch ein sehr dünnes Bau
teil vom Raum, welcher die Reaktionsmischung enthält, zu trennen und dieses
Bauteil von der Vorrichtung abtrennbar zu machen. Für eine weitere Bearbei
tungsstufe kann dann ein neues Bauteil eingesetzt werden.
Ebenfalls Gegenstand der Erfindung ist ein Gerät zur Bearbeitung von
Nukleinsäuren, welches ein Steuerelement für eine zeitabhängige Temperatur
regulierung sowie eine erfindungsgemäße Vorrichtung enthält. Als Steuer
element kann das Steuerelement eines sogenannten Thermocyclers gemäß
EP-A-0 236 069 verwendet werden, bevorzugt wird jedoch eine Steuerung
nach dem Prinzip von Tintenstrahldruckern, da sie eine höhere Steuerungsge
schwindigkeit aufweisen. Das Steuerelement muß in der Lage sein, das Heiz
element in vorbestimmten Intervallen so lange zu erhitzen, bis die Umgebung
der Oberfläche eine ausreichende Temperatur aufweist. Ebenso muß es in der
Lage sein, über das Kühlelement in vorbestimmten Intervallen für eine
Kühlung an der Oberfläche zu sorgen. Dazu kann beispielsweise eine Kühl
flüssigkeit durch die Vorrichtung geleitet werden. Sofern die Wärmekapazität
des Heizelementes gering, die Wärmeleistung jedoch relativ hoch ist, ist auch
eine kontinuierliche Kühlung möglich.
Die erfindungsgemäße Vorrichtung kann verschiedenste Ausführungsformen
haben. Beispielsweise kann sie für ein Eintauchen in ein Gefäß ausgelegt sein.
Sie kann jedoch auch so gestaltet sein, daß die die zu bearbeitende Nuklein
säure enthaltende Flüssigkeit auf die Oberfläche aufgetropft oder in ein durch
die Oberfläche gebildetes Gefäß eingefüllt werden kann. Dieser Reaktions
raum kann auch nach Einfüllen der Flüssigkeit verschlossen werden, so daß
Kontaminationsprobleme verringert werden können.
Eine Ausführungsform der Erfindung ist ein Verfahren zur Vermehrung von
Nukleinsäuren. Dabei handelt es sich, wie in Beispiel 2, z. B. um eine als
Polymerasekettenreaktion bezeichnete Amplifikationsreaktion mit an
schließender Detektion.
Eine weitere Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist ein Ver
fahren zur Anreicherung von Nukleinsäuren z. B. durch Hybridisation. Bei ko
valent an die Oberfläche adsorbierten Primern mit einer ausreichenden Spezifi
tät läßt sich durch Vorwahl der Hybridisierungstemperatur, bei bekannter Zu
sammensetzung (ionischer Zusammensetzung, Konzentration von Reagenzien)
der zu analysierenden Reaktionslösung eine Hybridisationstemperatur der
gestalt vorgeben, daß eine spezifische Bindung der zu analysierenden
Nukleinsäure an die zur Hybridisierung eingesetzten kovalent an die Ober
fläche gebundenen Primer stattfindet. Dieses Verfahren kann dazu eingesetzt
werden
- a) eine genaue Auswertung der tatsächlichen Hybridisationstemperatur vor zunehmen,
- b) eine genaue Konzentration der zu analysierenden Nukleinsäuren im Reaktionsgemisch vorzunehmen,
- c) auf das Vorhandensein kreuzhybridisierender Sequenzen zu testen.
Diese kurze Auflistung ist nicht abschließend.
Dieses Verfahren kann auch verwendet werden, um Nukleinsäuren von einer
Lösung in eine andere zu überführen. Dann findet im ersten Gefäß eine
Hybridisierung (niedere Temperatur) und im zweiten Gefäß eine Denaturie
rung (höhere Temperatur) statt.
Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren
zur Sequenzierung von Nukleinsäuren. Eine Möglichkeit der Anwendung der
Erfindung im Zusammenhang mit Sequenzanalysen ist die sogenannte Mini
sequenzanalyse. Dabei kann jeweils die genaue Sequenzbestimmung des an
den Primer anschließenden Nukleinsäurenukleotids vorgenommen werden,
indem in der Lösung die zur Sequenzierung bereitgestellt wird, ausschließlich
Dideoxynukleotide und keine Deoxynukleotide zur Sequenzierung zugesetzt
werden. Die vier möglichen Dideoxynukleotide ddATP, ddCTP, ddGTP und
ddTTP sind mit unterschiedlichen Fluoreszenzmarkern markiert. In jedem Fall
führt also der Einbau des jeweils nächsten Nukleotids zum Abbruch der
Sequenzreaktion und nach Aufreinigung des extendierten an der Oberfläche
befindlichen Primers kann durch Analyse der spezifischen Fluoreszenz die
Sequenz des auf dem Primer befindlichen Nukleotids bestimmt werden.
Ein Spezialfall der Möglichkeiten der Anwendung der vorliegenden Erfindung
ist ein Verfahren zur Sequenzierung von Nukleinsäuren, die zuvor in einer
PCR-Reaktion amplifiziert worden sind. Nach der Amplifikation liegt das
vermehrte Produkt über den Primer kovalent gebunden in doppelsträngiger
Form an der reaktiven Oberfläche vor. Durch kurzes Durchlaufen einer
Höhentemperaturphase wird durch Denaturierung dieses Amplifikat einzel
strängig vorliegen, läßt sich durch Überführen in eine Waschlösung reinigen
und ist danach wiederum durch Überführen diesmal in eine Sequenzierreaktion
einsetzbar für eine darauffolgende Sequenzierung. Diese Sequenzierung ver
läuft besonders effizient, da nun nur einzelsträngiges Matrizenmaterial vor
handen ist, an das ein Sequenzierpaar besonders effizient binden wird. Durch
die Sequenzierreaktion liegt anschließend wieder ein doppelsträngiges Mole
kül vor, dessen markierte (sequenzierte) Hälfte nun zur Analyse durch
Gelchromatographie zur Verfügung steht. Bei Einsatz verschiedener markierter
(mit unterschiedlichen Fluoreszenzmarkern markierten Dideoxynukleotiden)
lassen sich alle vier für eine Sequenzanalyse notwendigen Reaktionen auf
einmal durchführen, bei der konventionellen Methode muß diese Analyse
viermal wiederholt werden.
Die vorliegende Erfindung wird anhand der beiliegenden Figuren näher er
läutert:
Fig. 1 zeigt das Aufbauschema einer erfindungsgemäßen Vorrichtung (1),
welche in ein mit Reaktionsgemisch (2) gefülltes Reaktionsgefäß (3) eintaucht.
Die Vorrichtung enthält ein Kühlelement (4) und ein mittels Strom heizbares
Heizelement (5). An die Oberfläche des Heizelements sind Oligonukleotide (6)
kovalent gebunden. Sowohl das Kühl- wie das Heizelement sind über
Anschlüsse (7) an Steuereinheiten regulierbar.
In Fig. 2 ist ein beispielhafter Temperaturverlauf für eine Vermehrungsreak
tion nach der Art der PCR gezeigt. In einer ersten Phase (A) werden die
Nukleinsäuren bei einer Temperatur von etwas unterhalb 100°C denaturiert.
In einer Phase (B) findet bei etwa 50°C die Hybridisierung der zu vermehren
den Nukleinsäuren mit den immobilisierten Oligonukleotiden an der Festphase
statt. In einer dritten Phase (C) findet bei ca. 70°C die Extension der Primer
unter Verwendung der Nukleinsäure als Templat statt.
In Fig. 3 sind die in unmittelbarer Nähe der Oberfläche ablaufenden Reaktio
nen (Phasen A bis C) gezeigt. Für Phase (A) sind drei Isothermen in ihrem
schematischen Verlauf, für Phase (B) und (C) jeweils nur eine Isotherme an
gezeigt. In Phase (A) werden Nukleinsäuren denaturiert und diffundieren über
eine gewisse Zeit einzelsträngig, in Phase (B) hybridisieren Vorlagen und
Primer und in Phase (C) werden Primer entlang der Matrizen extendiert.
Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung näher erläutern.
Eine beispielhafte Vorrichtung gemäß dieser Erfindung besteht aus drei
Strukturuntereinheiten. Bei diesen drei Struktureinheiten handelt es sich um
- 1. die in das flüssige Reaktionsmilieu eindringende heizbare und tempera turregulierbare Oberfläche,
- 2. um die zur Heizung und Kühlung notwendigen Bauteile, die an
- 3. die elektronische Steuerung angeschlossen sind.
Die in diesem Beispiel beschriebene Elementoberfläche, besteht aus einer
dünnen Goldfolie mit einer Dicke von weniger als einem halben Millimeter,
die mit einer polymeren Dextranschicht durch Aufpolymerisieren fest verbun
den ist. Durch Kopplung mittels chemischer Mediatoren läßt sich an diese
Dextranschicht wiederum die für den jeweiligen Bearbeitungsschritt notwen
dige Oligonukleotide anbringen. Diese Oligonukleotide sind dann über ihr 5′-
Phosphatende kovalent an die Oberfläche gekoppelt und besitzen somit ein
reaktives, für Enzyme zugängliches 3′-Ende.
Diese Goldfolie, die durch ein unterstützendes Plastiknetz strukturell stabili
siert werden kann, und die eine reaktive Oberfläche von etwa 5 × 5 mm be
sitzt, dient auch zugleich als Heizelement, da sie an eine elektrische Strom
quelle angeschlossen ist, die bei Stromfluß zu einer spontanen Erhitzung dieser
Goldfolie führt. Distral zum Reaktionsansatz, hinter der Goldfolie, befindet
sich das Kühlelement. In diesem Fall besteht das Kühlelement aus einem in
Plastik ausgesparten Kanal mit einer an die Goldfolie grenzenden 7 mm
breiten Fläche. Der Kanal ist 2 mm tief und erstreckt sich über die ganze
Länge des hier als Meßfühler bezeichneten Teil des Gerätes, der in diesem Fall
die Heiz- und Kühlelemente sowie die reaktive Oberfläche umfaßt. Dieser
Kanal erstreckt sich von einem Ende des Meßfühlers bis zum anderen Ende
des Meßfühlers, an dem die reaktive Oberfläche angebracht ist, und zurück in
dem er einen die beiden Kanäle trennenden Steg umfaßt. In diesem, als Kühl
schleife zu bezeichnendem Bauteil, wird eine geeignete Kühlflüssigkeit, z. B.
Wasser, umgewälzt. Die gesamte Einheit ist in Hartplastik eingegossen und
recyclebar, d. h. sowohl die Goldfolie als auch das Plastik sind wiederverwert
bar.
Die Steuerung sowohl der Erhitzung der reaktiven Oberfläche, als auch der
Umwälzgeschwindigkeit und Vorkühltemperatur der Kühlflüssigkeit wird über
einen elektronischen dritten Bauteil, der außerhalb des Meßfühlers angebracht
ist, vorgenommen. Dies dritte Einheit umfaßt auch das Vorratsbehältnis sowie
die Verbindungsanschlüsse für die Kühlflüssigkeit. In dieser dritten Einheit
befindet sich weiterhin eine Mikropumpe die für die Umwälzung der Kühl
flüssigkeit zuständig ist. Durch Anflanschen der Kühlflüssigkeitsschläuche an
die Meßeinheit sowie durch das Anschließen der Stromzufuhr an die reaktive
Oberfläche wird der Meßfühler einsatzbereit. Über eine Eingabeeinheit, die an
der Oberfläche der Steuereinheit angebracht ist, die über einen digitalen Dis
play verfügt, sind sowohl die einzelnen Temperaturbereiche, als auch die
Dauer ihrer Einwirkung auf diese Oberfläche vorwählbar.
Bei dem hier als Beispiel einer erfindungsgemäßen Anwendung der Vorrich
tung handelt es sich um eine als Polymerasekettenreaktion bezeichnete Ampli
fikationsreaktion von einer vorgegebenen Nukleinsäuresequenz. Für diese
Nukleinsäuresequenz sind zwei Primer mit einer Länge von jeweils 16 Basen,
die im Abstand von 4 Nukleotiden zueinander codieren, ausgewählt worden.
Der eine Primer ist in seiner Sequenz identisch, der andere komplementär zur
analysierenden Sequenz. Der hier als identisch bezeichnete Primer ist dabei
kovalent über sein 5′-Phosphatende an die reaktive Oberfläche gekoppelt. Der
andere, komplementäre Primer sowie alle weiteren Reagenzien, die üblicher
weise in einer sogenannten PCR-Reaktion zum Einsatz kommen, sind dem
Reaktionsansatz zugegeben. Durch Eingabe der entsprechenden Reaktions
temperaturen die in unmittelbarer Nähe der reaktiven Oberfläche herrschen
sollen, und durch Eintauchen der reaktiven Oberfläche bzw. des Meßfühlers
(siehe Beispiel 1) in den Reaktionsansatz, wird die Reaktion gestartet. Die
Temperaturänderungen in der reaktiven Oberfläche sind so programmiert, daß
die Durchführung von 50 Erwärmungs- und Abkühlungszyklen in ca. 1 Min.
durchgeführt werden kann. Durch anschließendes Eintauchen des Meßfühlers
in eine Lösung mit destilliertem Wasser und kurzfristiges Erhitzen, wird die
Oberfläche von allen nicht kovalent gebundenen Reaktionspartner gereinigt.
Die so gereinigte Oberfläche, die nun nur noch Primermoleküle und exten
dierte Primenmoleküle enthält, wird zur Analyse, zusammen mit dem Meß
fühler, in ein Gerät eingeführt, das nach dem Prinzip der Plasmonenresonanz,
eine direkte Bestimmung der Menge des extendierten Produkts zuläßt.
Claims (39)
1. Verfahren zur Bearbeitung von Nukleinsauren in einer Reaktions
mischung, dadurch gekennzeichnet, daß die Temperatur der an die Reak
tionsmischung angrenzenden Oberfläche und deren unmittelbare Um
gebung reguliert wird, jedoch ein Teil der Reaktionsmischung im
wesentlichen isotherm verbleibt.
2. Verfahren gemäß Anspruch 1, bei dem mindestens ein Arbeitsschritt eine
Temperatur, die von dem Reaktionsansatz abweicht, aufweist.
3. Verfahren gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß ein tempera
turverändernder Arbeitsschritt der thermischen Denaturierung dient.
4. Verfahren gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß ein tempera
turverändernder Schritt der Hybridisation von Nukleinsäuren dient.
5. Verfahren gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß ein tempera
turverändernder Schritt der Extension des Matrizenmoleküls dient.
6. Verfahren gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß verschiedene
Arbeitsschritte der zielsequenz-abhängigen Amplifikation eines
Matrizenmoleküls dienen.
7. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß Reaktanten
an eine Oberfläche gebunden vorliegen und so für eine Detektion der Be
arbeitungs- und Vermehrungsergebnisse geeignet sind.
8. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß Mittel zur
Bearbeitung von Nukleinsäuren an eine Oberfläche gebunden sein
können.
9. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 und/oder 8, dadurch gekenn
zeichnet, daß diese Mittel Oligonukleotide sind.
10. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 und/oder 7 und/oder 8, dadurch
gekennzeichnet, daß sich weitere Mittel zur Bearbeitung von Nuklein
säuren in einer Reaktionsmischung befinden.
11. Verfahren gemäß Anspruch 1 und/oder 6, dadurch gekennzeichnet, daß
eine Detektion spezifischer Sequenzen nach Hybridisierung mit markier
ten Nukleinsäuren oder markierbaren Nukleinsäuren möglich ist.
12. Verfahren gemäß Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß zur Vermeh
rung (Amplifikation) nicht-temperaturresistente DNA-Polymerasen ein
setzbar sind.
13. Verfahren gemäß Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß zur Vermeh
rung (Amplifikation) temperaturresistente DNA-Polymerasen eingesetzt
werden können.
14. Verfahren gemäß Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß zur Vermeh
rung (Amplifikation) RNA-abhängige RNA-Polymerase verwendet wer
den kann.
15. Verfahren gemäß Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß zur Vermeh
rung (Amplifikation) RNA-abhängige DNA-Polymerase verwendet wer
den kann.
16. Verfahren gemäß Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß zur Vermeh
rung (Bearbeitung) DNA-Ligase verwendet werden kann.
17. Verfahren gemäß einem oder mehrerer der Ansprüche 1, 6, 8, 9, 10, da
durch gekennzeichnet, daß Mittel zur Bearbeitung von Nukleinsäuren an
eine Oberfläche gebracht werden.
18. Verfahren gemäß einem oder mehrerer der Ansprüche 1, 8, 9, 10, 16, 17,
dadurch gekennzeichnet, daß mindestens eine der bei der Bearbeitung
beteiligten, bei erhöhter Temperatur ablaufenden Reaktionen an einer
Oberfläche abläuft.
19. Verfahren gemäß Anspruch 1 und/oder 6, dadurch gekennzeichnet, daß
für die Meßlösung eine weitestgehende Volumenunabhängigkeit besteht,
d. h. sowohl in sehr kleinen als auch sehr großen Volumina dieses Ver
fahren zur Bearbeitung und Vermehrung von Nukleinsäuren durchgeführt
werden kann.
20. Verfahren gemäß Anspruch 1 durch Konvektion oder Bewegung ge
steigert wird.
21. Vorrichtung zur Bearbeitung von Nukleinsäuren mit Hilfe eines Tempe
raturregulationselements, dadurch gekennzeichnet, daß die Vorrichtung
zur Regulation der Temperatur der Oberfläche und der unmittelbar an
grenzenden Umgebung geeignet ist und daß daran Mittel zur Bearbeitung
der Nukleinsäuren gebunden werden können.
22. Vorrichtung gemäß Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, daß eine
Eignung zur Verwendung für Verfahren gemäß den Ansprüchen 1 bis 20
verwendbar ist.
23. Vorrichtung zur Bearbeitung von Nukleinsäuren gemäß Anspruch 21
und/oder 22, dadurch gekennzeichnet, daß die in das Reaktionsmilieu
ragende Oberfläche gekühlt und/oder geheizt werden kann.
24. Vorrichtung gemäß Anspruch 21 und/oder 22, dadurch gekennzeichnet,
daß die temperaturregulierende Oberfläche durch chemische oder physi
kalische Behandlung zur Aufnahme von Reaktanden entsprechend dem
Anspruch 1 vorbereitet wurde.
25. Vorrichtung gemaß Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, daß die
Temperatur der Oberfläche durch eine Steuereinheit reguliert wird.
26. Vorrichtung gemaß der Ansprüche 21, 22 und/oder 24, dadurch gekenn
zeichnet, daß eine zeitlich koordinierte Regulation der Temperaturände
rungen vorgenommen werden kann.
27. Vorrichtung gemaß der Ansprüche 21, 22, 24, dadurch gekennzeichnet,
daß ein Heizelement eine geringe und ein Kühlelement eine hohe
Wärmekapazität aufweisen.
28. Vorrichtung gemäß Anspruch 21, 22, dadurch gekennzeichnet, daß eine
Oberfläche zu einer direkten Ausweitung der Bearbeitungs- und Vermeh
rungsergebnisse geeignet ist.
29. Vorrichtung gemäß Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, daß die
temperaturregulierte Oberfläche aus einer Folie aus wärmeleitfähigem
Material besteht, bevorzugterweise Metall, bevorzugterweise Gold.
30. Vorrichtung gemäß Anspruch 21, 22, 24, dadurch gekennzeichnet, daß
die Kühlung der temperaturregulierten Oberfläche auf der dem Reak
tionsansatz distalen Seite vorgenommen wird.
31. Vorrichtung gemäß Anspruch 21, 22, 24, dadurch gekennzeichnet, daß
das Heizelement identisch ist mit der reaktiven Oberfläche, wobei diese
Oberfläche speziell behandelt sein kann.
32. Vorrichtung gemäß Anspruch 21, 22, 24 sowie 30 und 31, dadurch ge
kennzeichnet, daß Nukleinsäuren an der Oberfläche des Heizelements
fixiert sein können.
33. Vorrichtung gemäß Anspruch 32, dadurch gekennzeichnet, daß die Fixie
rung über Mittlungsstrukturen zum Heizelement erfolgt.
34. Vorrichtung gemäß Anspruch 33, dadurch gekennzeichnet, daß diese
Fixierung über Mittlungsstrukturen sowohl über chemische als auch bio
spezifische Bindung erfolgen kann.
35. Vorrichtung gemäß Anspruch 21, 22, dadurch gekennzeichnet, daß
Nukleinsäuren nur vorübergehend in unmittelbarer Nähe der Oberfläche
assoziieren bzw. dort verweilen.
36. Vorrichtung gemäß Anspruch 35, dadurch gekennzeichnet, daß diese
Assoziation von Nukleinsäuren an die reaktive Oberfläche durch die
Bindung dieser Nukleinsäuren an Magnetobeads bzw. die Adsorption
dieser Nukleinsäuren an Magnetobeads gewährleistet wird.
37. Vorrichtung gemäß Anspruch 35, 36, dadurch gekennzeichnet, daß ein
induzierbares Magnetfeld zur Attrahierung besagter Magnetobeads dient.
38. Verfahren gemäß Anspruch 21, 22, dadurch gekennzeichnet, daß die
Vorrichtung, die Heiz- und Kühlelemente enthält, nur einmal verwendbar
ist, um Kontaminationen vorzubeugen.
39. Vorrichtung gemäß Anspruch 21, 22, dadurch gekennzeichnet, daß die
gesamte Vorrichtung mehrfach verwendbar ist, und nur die Oberfläche
bzw. deren Halterung für einzelne Arbeitsgänge ausgetauscht werden
muß.
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