DE4409436A1 - Verfahren zur Bearbeitung von Nukleinsäuren - Google Patents

Verfahren zur Bearbeitung von Nukleinsäuren

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DE4409436A1
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Wolf Dr Rer Nat Bertling
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    • BPERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01LCHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L7/00Heating or cooling apparatus; Heat insulating devices
    • B01L7/52Heating or cooling apparatus; Heat insulating devices with provision for submitting samples to a predetermined sequence of different temperatures, e.g. for treating nucleic acid samples

Description

Gegenstand der Erfindung sind Verfahren zur Bearbeitung von Nukleinsäuren mittels eines Temperaturregulationselements sowie Vorrichtungen und Geräte zur Durchführung dieser Verfahren.
In der Analytik, insbesondere in der medizinischen Diagnostik, beginnen sich immer mehr Verfahren zu etablieren, welche auf Nachweisen und Synthesen von Nukleinsäuren beruhen. Nukleinsäuren sind als z. B. sehr spezifisches Er­ kennungsmittel für Organismen zur Diagnose von Krankheiten gut geeignet. Während dieser Nachweisverfahren sind verschiedenste Bearbeitungsschritte, wie Denaturierung, Hybridisierung, Synthesen und Immobilisierung von Nukleinsäuren, sowie deren enzymatische Behandlung üblich. Ein Problem bei solchen Verfahren war lange Zeit die geringe Menge an Nukleinsäure in den Proben.
Eine Lösung für dieses Problem, mit der eine Vielzahl von Analyten für einen Nachweis zugänglich gemacht wird, brachte die Amplifikation von Nuklein­ säuren. Ein solches Verfahren ist in der EP-A-0 200 362 beschrieben, nämlich die Polymerase Chain Reaction. Dabei wird durch mehrfache Verlängerung von Primern in einer Reaktionslösung eine Vielzahl von Kopien der ur­ sprünglichen Nukleinsäure hergestellt. Diese können beispielsweise durch Hybridisierung mit einer markierten Nukleinsäuresonde gemäß EP-A-0 201184 nachgewiesen werden. Die dabei verwendeten Reaktions­ lösungen werden zur Trennung von Doppelsträngen und für die Extensions­ reaktion jeweils in Intervallen auf bestimmte Temperaturen erhitzt bzw. wieder abgekühlt. Dadurch, daß es sich um relativ große Volumina handelt, bedingen die Zeiten für die Temperaturregulierung eine relativ lange Zeit für die Durchführung des gesamten Amplifikationsverfahrens.
Eine Abhilfe versucht hier die sogenannte Kapillar-PCR zu schaffen. Dabei befindet sich die Reaktionsmischung in Glaskapillaren mit einem geringen Durchmesser. Dadurch kann die Zeit für die Durchführung einer Amplifika­ tionssequenz auf ca. 30 min gesenkt werden. Ein Problem bei der Kapillar- PCR ist die Anfälligkeit des mitzuerhitzenden Glases der Kapillare.
In jüngerer Zeit werden auch immer mehr Amplifikationsverfahren beschrie­ ben, bei denen die Amplifikationsreaktionen in einem geschlossenen System, d. h. ohne Zufuhr von Reagenzien während der Zyklen, durchgeführt werden kann.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es unter anderem, die bestehenden Nukleinsäurebearbeitungsverfahren zu verbessern und insbesondere Verfahren bereitzustellen, bei denen die Amplifikation in noch kürzerer Zeit abge­ schlossen werden kann.
Gegenstand der Erfindung ist daher ein Verfahren zur Bearbeitung und insbe­ sondere Vermehrung von Nukleinsäuren in einer Reaktionsmischung, dadurch gekennzeichnet, daß die Temperatur einer an die Reaktionsmischung an­ grenzenden Oberfläche und deren unmittelbaren Umgebung reguliert wird, jedoch der Hauptraum der Reaktionsmischung im wesentlichen isotherm ver­ bleibt.
Ebenfalls Gegenstand der Erfindung sind eine Vorrichtung zum Bearbeiten und Vermehrung von Nukleinsäuren mit einem Temperaturregulationselement sowie ein Gerät, welches diese Vorrichtung enthält.
Nukleinsäuren im Sinne der Erfindung sind jede Art von Nukleinsäuren, modifizierte oder unmodifizierte. Unmodifizierte Nukleinsäuren sind bei­ spielsweise die natürlich vorkommenden Nukleinsäuren. Modifizierte Nukleinsäuren können durch Austausch von Gruppen der natürlichen Nuklein­ säuren durch andere chemische Reste entstehen. Beispiele sind Nukleinsäure- Phosphonate, oder -Phosphothionate und an den Zuckerresten oder den Basen durch chemische Gruppen, die auch nachweisbar sein können, modifizierte Nukleinsäuren.
Die Bearbeitung von Nukleinsäuren gemäß der vorliegenden Erfindung enthält bevorzugt mindestens einen bei erhöhter Temperatur, zumindest aber von der Umgebungstemperatur abweichenden Temperatur ablaufenden Reaktions­ schritt. Solche Bearbeitungsschritte sind beispielsweise die thermische Denaturierung von teilweise oder vollständig doppelsträngigen Nukleinsäuren. Dabei werden, um Einzelstränge herzustellen, oder um Sekundärstrukturen aufzuschmelzen die Nukleinsäuren auf Temperaturen oberhalb des entsprechenden Schmelzpunktes erhitzt. Insbesondere in Amplifikations- oder Sequenzierungsverfahren wird ein weiterer Bearbeitungsschritt durchgeführt, nämlich die Verlängerung eines an eine sogenannte Templat-Nukleinsäure hybridisierten Primers mit Hilfe weiterer Mono- oder Oligonukleotide. Hierbei wird bevorzugt die Temperatur eingestellt, bei der das entsprechende ver­ wendete Enzym sein Aktivitätsoptimum aufweist, bzw. Konkurrenzreaktionen vermindert sind. Ein weiterer Bearbeitungsschritt von Nukleinsäuren ist die Hybridisierung von zueinander komplementären Nukleinsäuren in einzel­ strängigen Bereichen zu einem Nukleinsäuredoppelstrang (Hybrid). Dieser findet bei Temperaturen unterhalb des Schmelzpunktes des Hybrides statt. Um eine Hybridisierung zu erreichen, muß daher oft eine Abkühlung der Reak­ tionsmischung vorgenommen werden.
Ein Spezialfall für die Bearbeitung von Nukleinsäuren ist die Vermehrung von Nukleinsäuren. Dabei können gemäß der vorliegenden Erfindung praktisch alle Amplifikationsverfahren, z. B. zielsequenzabhängige Amplifikationen (z. B. Polymerase Chain Reaction, Ligase Chain Reaction oder ähnliche) eingesetzt werden. Auch während dieser Vermehrungsverfahren findet mindestens einer der oben genannten temperatursensitiven Bearbeitungs­ schritte statt.
Zentrales Merkmal der vorliegenden Erfindung ist die Tatsache, daß die Ände­ rung der Temperatur nicht in der gesamten Reaktionsmischung, sondern nur in einem sehr kleinen Teil der Reaktionsmischung stattfindet. Dies hat zur Folge, daß das Aufheizen bzw. das Abkühlen dieses relativ kleinen Bereiches sehr schnell vor sich gehen kann und damit die Bearbeitung der Nukleinsäuren stark beschleunigt wird. Zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens wird daher die Reaktionsmischung mit einer temperaturregulierbaren Ober­ fläche in Kontakt gebracht. Durch Änderung der Temperatur der Oberfläche wird die unmittelbare Umgebung dieser Oberfläche erhitzt, angeglichen oder abgekühlt, je nach Bearbeitungsschritt und Temperatur der Reaktions­ mischung. Man kann hier mehrere Fälle unterscheiden.
Für den Fall, daß die Temperatur der Reaktionsmischung höher liegt als die Schmelztemperatur der zu bearbeitenden Nukleinsäuren, kann die Oberfläche gekühlt werden, um in der angrenzenden Umgebung eine Hybridisierung der Nukleinsäuren zu erreichen. Für den Fall, daß die Temperatur der Reak­ tionsmischung niedriger ist als die Schmelztemperatur und die Temperatur, die für eine Verlängerung eines Primers an der Nukleinsäure erforderlich ist, kann die Oberfläche und damit die unmittelbare Umgebung zunächst auf eine Temperatur erhitzt werden, bei der die Extension des Primers stattfinden kann. Anschließend kann die Temperatur über den Schmelzpunkt der Nukleinsäuren erhöht werden, wodurch eine Denaturierung und Einzelsträngigmachung der gebildeten doppelsträngigen Nukleinsäuren stattfinden kann. Daran kann sich eine Abkühlung auf eine Temperatur, bei der die Einzelstränge mit neuen Primern hybridisieren können, anschließen. So kann der Zyklus mehrfach durchlaufen werden.
Für den Fall, daß die Temperatur zwischen der für die Extension optimalen Temperatur und der Schmelztemperatur liegt, wird die Temperatur zunächst erhöht, um Doppelstränge zu trennen. Anschließend wird die Temperatur auf eine Temperatur gesenkt, bei der die Einzelstränge wieder mit neuen Primern hybridisieren. Daraufhin wird die für die Extension optimale Temperatur ein­ gestellt und gewünschtenfalls der Zyklus wiederholt.
Die gewünschte Temperatur kann über einen festgelegten Zeitraum aufrecht­ erhalten werden, z. B. solange, bis die gewünschten Reaktionen an der Ober­ fläche abgelaufen sind. Dazu kann die Temperatur der Oberfläche auch durch bekannte Kontrollmaßnahmen und angeschlossene Regelmaßnahmen (Nachheizen, -Kühlen) konstant gehalten werden. Die Zeiträume hängen, wie bei bekannten Verfahren üblich, von der Länge der zu bearbeitenden Nuklein­ säuren und deren Homologie sowie den speziellen Hybridisierungsbedingun­ gen ab. Der Fachmann kann jedoch durch einfache Versuche die optimalen Zeiträume ermitteln.
Bei den oben geschilderten Fällen verbleibt der Hauptraum der Reaktions­ mischung im wesentlichen isotherm, während sich die in unmittelbarer Um­ gebung der Oberfläche befindliche Reaktionsmischung den an der Oberfläche eingestellten Temperaturen anpaßt.
Zur Regulierung der Temperatur und zum Einstellen spezifischer Tempera­ turen an der Oberfläche und deren unmittelbarer Umgebung empfiehlt es sich, als Oberfläche die Oberfläche einer Vorrichtung zu wählen, die aus einem Heizelement und einem Kühlelement besteht. Das Heizelement hat bevorzugt eine relativ große Oberfläche bei vergleichsweise geringer Wärmekapazität. Als geeignet haben sich beispielsweise Metallfolien erwiesen, die auf ge­ eignete Weise erhitzt werden können, z. B. durch elektrischen Strom. Als Materialien für die Metallfolie sind gut wärmeleitende Materialien, z. B. Gold, bevorzugt.
Das Kühlelement sollte eine vergleichsweise hohe Wärmekapazität haben. Als Kühlmedium kommen feste, flüssige oder gasförmige Stoffe in Frage. Bevor­ zugt sind flüssige Kühlmedien, z. B. Wasser. Eine gute Wärmeleitfähigkeit ist von Vorteil.
Die Anordnung des Heizelements und des Kühlelements kann entsprechend der Temperatur des Reaktionsmediums verändert werden, je nach dem, ob die Vorrichtung mehr zum Erhitzen oder zum Kühlen der Oberfläche und deren unmittelbarer Umgebung benutzt werden soll. Im allgemeinen wird jedoch das Heizelement in unmittelbarer Nähe der Oberfläche lokalisiert sein. Die Oberfläche des Heizelementes kann auch schon direkt die an die Reak­ tionsmischung angrenzende Oberfläche sein. Es ist jedoch auch möglich, das Heizelement durch eine dünne, wärmeleitfähige Schicht von der Reaktions­ mischung zu trennen.
Das Kühlelement kann prinzipiell an jeder Stelle positioniert sein, mit der eine Abkühlung der Oberfläche und der unmittelbaren Umgebung möglich ist. Als bevorzugt hat es sich jedoch erwiesen, das Kühlelement auf der der Reak­ tionsmischung abgelegenen Seite des Heizelements zu positionieren. Für den Fall, daß das Heizelement eine geringe Wärmekapazität hat, ist die Tatsache, daß das Heizelement ebenfalls abgekühlt werden muß, nicht von entscheiden­ dem Nachteil.
Im erfindungsgemäßen Verfahren wird mit Hilfe des Heizelements so lange geheizt, bis die Oberfläche und ihre unmittelbare Umgebung auf die ge­ wünschte Temperatur erhitzt ist. Dabei wird sich ein starker Temperatur­ gradient in der Nähe der Oberfläche ausbilden, während ein Teil, bevorzugt der restliche Teil des Reaktionsgemisches im wesentlichen isotherm bleibt. Im wesentlichen isotherm bedeutet hier eine Abweichung von weniger als 20%°C, bevorzugt weniger als 10%°C und besonders bevorzugt weniger als 2%°C. Dies gilt insbesondere, wenn kein bemerkenswerter Flüssigkeitsaus­ tausch während des Aufheizvorganges realisiert wird, aber auch, wenn ein Flüssigkeitsaustausch stattfindet. Der Aufheizvorgang kann innerhalb von Se­ kundenbruchteilen, in günstigen Fällen sogar Millisekunden, abgeschlossen sein. Dasselbe gilt für die Kühlung. Der Reaktionsraum, welcher auf die ge­ wünschte Temperatur erhitzt wird, kann sehr klein sein, bevorzugt ist er weniger als 0,2 mm, besonders bevorzugt weniger als 0,5 µm tief. Die auf die Reaktionsmischung hingerichtete Fläche des Heizelements beeinflußt die Tiefe des Temperaturgradienten und seine Aufbaugeschwindigkeit. Aus den ge­ wünschten Anwendungen des Verfahrens kann sich eine bevorzugte Größe der Oberfläche ergeben. In der Regel ist die Oberfläche < 1 cm², besonders bevorzugt zwischen 0,2 cm² und 0,2 mm². Die Oberfläche kann glatt oder auch rauh sein. Für den Fall, daß die Oberfläche gleichzeitig als Träger von Mitteln für die Bearbeitung der Nukleinsäuren genutzt wird, ist es vorteilhaft, diese Oberfläche durch Oberflächenstrukturen zu vergrößern.
Das Volumen der Reaktionsmischung ist für die Erfindung praktisch nicht von großer Bedeutung. Es kann sich hierbei um einen Tropfen mit einem Volumen von 20 µl, jedoch auch um ein beliebig großes Volumen handeln. Es ist ein Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens, daß die das Heiz- und das Kühl­ element enthaltende Vorrichtung beispielsweise auch in ein großes Gefäß mit Reaktionsmischung eingebracht werden kann, wobei die wesentlichen Reak­ tionen nur in einem sehr kleinen Grenzbereich der Oberfläche stattfinden, während der übrige Reaktionsraum praktisch keinen Einfluß auf die Reaktion ausübt. Andererseits stellen die erhältlichen Proben und Reagenzmengen ein praktisches Limit für die Größe der Reaktionsmischung dar. Die Reaktions­ volumina werden sich daher meist in einem Bereich zwischen 1 ml und 30 µl, bevorzugt zwischen 100 µl und 50 µl, bewegen, jedoch läßt sich zum Beispiel durch Aufbringen des Reaktionsansatzes auf die temperaturregulierende Ober­ fläche auch mit sehr viel kleineren Volumina arbeiten.
Zur Bearbeitung der Nukleinsäuren werden diese an die temperaturregulier­ bare Oberfläche oder deren unmittelbare Umgebung gebracht. Dies kann auf verschiedene Weise geschehen, beispielsweise mechanisch oder durch Diffu­ sion. Bevorzugt werden die Nukleinsäuren an die Oberfläche gebunden. Diese Bindung wiederum kann unterschiedlicher Art sein. Bevorzugt ist eine chemische Bindung, entweder über Adsorption oder biospezifische Wech­ selwirkungen. Im Falle einer Bindung durch Adsorption kann die Oberfläche mit einem nukleinsäurebindenden Reagenz belegt sein. Biospezifische Wech­ selwirkungen können Wechselwirkungen zwischen Nukleinsäuren und den zu bearbeitenden Nukleinsäuren sein (Hybridisierung, komplementärer Teil dieser Nukleinsäuren), jedoch auch Wechselwirkungen zwischen Antigenen oder Haptenen mit dagegen gerichteten Antikörpern und Rezeptor-Ligand-Wech­ selwirkungen. Eine bevorzugte Art der Bindung der zu bearbeitenden Nukleinsäuren an die Oberfläche geschieht über Nukleinsäuren, bevorzugt Oligonukleotide, die kovalent an die Oberfläche gebunden sind und zumindest zu einem Teil der zu bearbeitenden Nukleinsäure soweit komplementär sind, daß sie mit innen hybridisieren. Diese Oligonukleotide können auch über biospezifische Wechselwirkungen, z. B. Biotin-Streptavidin, an die Oberfläche gebunden sein. An der Oberfläche können auch Nukleinsäuren unterschied­ licher Sequenz, z. B. nach WO 90/15070, gebunden sein.
Die Bindung der zu bearbeitenden Nukleinsäuren ist gemäß der vorliegenden Erfindung reversibel. Die Nukleinsäuren können nach einer von dem durchzu­ führenden Vorgang abhängigen Zeit durch Erhitzen der Oberfläche und ihrer unmittelbaren Umgebung wieder freigesetzt werden. Zwischen dem Binden und Freisetzen der Nukleinsäure können beliebige Schritte vorgenommen werden, z. B. Durchführung chemischer Reaktionen, jedoch auch eine Trennung der gebundenen Nukleinsäuren von der ursprünglichen Reaktions­ mischung und Überführung in eine neue Reaktionsmischung.
Für den Fall einer Vermehrungsreaktion der Nukleinsäuren können die an die Oberfläche gebundenen Oligonukleotide als Primer für die Elongation oder Extension unter Verwendung der zu bearbeitenden Nukleinsäure als Matrize verwendet werden. Dadurch bildet sich ein an die zu bearbeitende Nuklein­ säure gebundener verlängerter Primer. Die als Matrize benutzte Nukleinsäure kann durch Temperaturerhöhung von dem Verlängerungsprodukt gelöst wer­ den und kann im nächsten Temperaturzyklus für einen neuen, bisher noch nicht verlängerten immobilisierten Primer als Matrize wirken. Auf diese Weise ist es möglich, eine große Menge an an der Oberfläche immobilisierten Primern zu verlängern und somit Kopien von Teilen der zu bearbeitenden Nu­ kleinsäure herzustellen. Die extendierten oberflächenbehafteten Primer dienen wiederum mittels komplementärer Primer zu einer Vermehrung der als Matrize dienenden Moleküle. Die für die durchzuführenden Reaktionen erforderlichen Reagenzien sind in der gesamten Reaktionsmischung vorrätig zu halten oder diese nach Bedarf zuzugeben. Für eine Vermehrungsreaktion nach dem Prinzip der Polymerasereaktion sind daher die Deoxyribonukleotide, eine DNA- Polymerase und ein weiterer Primer und geeignete Puffer-Reagenzien in der Reaktionsmischung zu halten. Zur Darstellung anderer Nukleinsäuretypen, sind andere Reagenzien, z. B. Ribonukleotide oder RNA abhängige Polymerasen vorgesehen. Dieser Schritt des Verfahrens kann besondere Rücksicht auf die Arbeitstemperatur des bearbeitenden Enzyms nehmen.
Mit der Erfindung ist erstmals eine Kombination von isothermen Amplifika­ tionen mit temperaturabhängigen Schritten (z. B. Denaturierung oder andere Amplifikation) möglich. Die zu bearbeitenden Nukleinsäuren können jedoch auch über physikalische Methoden an die Oberfläche gebunden werden, z. B. mittels eines Magneten. Hierzu müssen die Nukleinsäuren jedoch an ein magnetisierbares Teilchen gebunden werden. Die Bindung von mit Nuklein­ säure beladenen magnetischen Teilchen kann dadurch reversibel gestaltet werden, daß sich ein Magnet hinter der Oberfläche befindet oder induziert wird. Durch Anlegen eines Wechselfeldes können die magnetischen Teilen an die Oberfläche gebunden bzw. von ihr entfernt werden.
Spezielle Ausführungsformen, die teilweise vorteilhafte Wirkung aufweisen, sind ebenfalls denkbar. So kann die Effizienz gesteigert werden, indem die Diffusion der Nukleinsäuren in der Reaktionsmischung durch Konvektion verstärkt wird. Es kann auch vorteilhaft sein, gegenüber den üblicherweise verwendeten Reaktionsmischungen höhere Konzentrationen der Reaktions­ teilnehmer einzusetzen. Außerdem kann die zu bearbeitende Nukleinsäure zu Beginn der Reaktion durch Vorhybridisierung an der Oberfläche konzentriert werden.
Im Falle einer Amplifikation oder Vermehrung der Nukleinsäuren kann es sein, daß die Anzahl der zu durchlaufenden Zyklen, z. B. bei einer PCR, er­ höht werden muß, damit genügend Amplifikationsprodukt erzeugt wird. Wegen der sehr kurzen Zykluszeit nach dem erfindungsgemäßen Verfahren ist dies jedoch nicht von Nachteil.
Für den Fall, daß die Reaktionsmischung auf einer relativ niedrigen Tempera­ tur gehalten wird, bedeutet dies, daß an die Hitzestabilität der Reagenzien weniger Ansprüche gestellt werden müssen als bei mehrmaliger Erhitzung der gesamten Reaktionsmischung. Eine thermostabile Polymerase ist daher für eine Vermehrungsreaktion nicht unbedingt erforderlich und dennoch muß nicht in jedem Amplifikationszyklus neues Enzym zu der Reaktionsmischung zupipettiert werden.
An die erfindungsgemäße Bearbeitung der Nukleinsäuren können sich belie­ bige weitere Schritte anschließen. So können die Nukleinsäuren entweder im an die Oberfläche gebundenen Zustand oder im wieder freigesetzten Zustand untersucht oder mit weiteren Reagenzien bearbeitet werden.
Mit Hilfe des geschilderten erfindungsgemäßen Vermehrungsverfahrens läßt sich somit auf einfache Weise ein Verfahren zum Nachweis von Nuklein­ säuren in einer Probe bilden. Hierzu wird die Oberfläche, an welche die als Primer fungierenden Oligonukleotide gebunden sind, mit der Probenflüssigkeit in Kontakt gebracht. Danach wird die Temperatur der Oberfläche und ihrer unmittelbaren Umgebung auf eine Temperatur gebracht, welche über dem Schmelzpunkt der in der Probe enthaltenen doppelsträngigen Nukleinsäure liegt. Nach Abkühlung der Oberfläche und der unmittelbaren Umgebung wird die nachzuweisende Nukleinsäure mit dem Oligonukleotid hybridisieren. Durch Zyklusführung wird, wie oben beschrieben, mit Hilfe der nachzu­ weisenden Nukleinsäure eine Vielzahl von Kopien hergestellt, die am Ende der Vermehrungsreaktion an die Oberfläche gebunden bleiben können. Durch Hybridisierung mit markierten Nukleinsäuresonden und deren Detektion mit Hilfe der Markierung kann die Menge an Nukleinsäuren an der Oberfläche bestimmt werden. Bei Verfahren, die einen direkten Nachweis von Nuklein­ säurehybriden ohne Markierung oder von verlängerten Einzelsträngen (Primern) erlauben (z. B. nach dem Prinzip der Oberflächen-Plasmonen­ resonanz), ist auch ein direkter Nachweis möglich. Verwendet man für die Vermehrungsreaktion markierte Primer oder Mononukleotide, entfällt die Hybridisierung mit einer nachweisbar markierten Nukleinsäuresonde. Es ist auch ein Ansatz denkbar, bei dem im Ansatz eine höhere Temperatur gehalten wird und die Oberfläche, die für weitere Schritte nötig tieferen Temperaturen annimmt.
Da die erfindungsgemäße Anwendung des Verfahrens zur Vermehrung der Nukleinsäuren praktisch an einer Oberfläche abläuft, führen wir für diese Vermehrungsreaktion die Bezeichnung 2D-Amplifikation ein.
Ebenfalls Gegenstand der Erfindung ist eine Vorrichtung, die zum Einsatz im oben genannten Bearbeitungsverfahren verwendet werden kann. Insbesondere ist Gegenstand der Erfindung eine Vorrichtung zum Bearbeiten von Nuklein­ säuren mittels eines Temperaturregulationselements, wobei dieses Element zur Temperaturregulation der Oberfläche und der unmittelbar angrenzenden Umgebung geeignet ist und wobei an diesem Mittel zur Bearbeitung der Nukleinsäuren gebunden werden können. Diese Mittel können Oligonukleo­ tide sein, und beispielsweise als Primer dienen. Diese Vorrichtung enthält be­ vorzugt ein Kühlelement sowie ein Heizelement, wobei die Anordnung bevor­ zugt wie im oben beschriebenen Bearbeitungsverfahren vorliegt. Diese Vor­ richtung ist bevorzugt sehr klein. Sie kann beispielsweise eine Dicke von < 5 mm und eine Fläche von < 10 mm² haben. Die darin befindlichen Ele­ mente, wie das Kühlelement oder das Heizelement, sind einfache Bauteile. Daher ist diese Vorrichtung ausgezeichnet geeignet zur einmaligen Verwen­ dung (Disposable), was die für wiederverwendbare inhärente Kontaminations­ gefahr reduzieren kann. Soll die Vorrichtung für eine Mehrfachbenutzung ge­ eignet sein, ist es auch möglich, das Heizelement durch ein sehr dünnes Bau­ teil vom Raum, welcher die Reaktionsmischung enthält, zu trennen und dieses Bauteil von der Vorrichtung abtrennbar zu machen. Für eine weitere Bearbei­ tungsstufe kann dann ein neues Bauteil eingesetzt werden.
Ebenfalls Gegenstand der Erfindung ist ein Gerät zur Bearbeitung von Nukleinsäuren, welches ein Steuerelement für eine zeitabhängige Temperatur­ regulierung sowie eine erfindungsgemäße Vorrichtung enthält. Als Steuer­ element kann das Steuerelement eines sogenannten Thermocyclers gemäß EP-A-0 236 069 verwendet werden, bevorzugt wird jedoch eine Steuerung nach dem Prinzip von Tintenstrahldruckern, da sie eine höhere Steuerungsge­ schwindigkeit aufweisen. Das Steuerelement muß in der Lage sein, das Heiz­ element in vorbestimmten Intervallen so lange zu erhitzen, bis die Umgebung der Oberfläche eine ausreichende Temperatur aufweist. Ebenso muß es in der Lage sein, über das Kühlelement in vorbestimmten Intervallen für eine Kühlung an der Oberfläche zu sorgen. Dazu kann beispielsweise eine Kühl­ flüssigkeit durch die Vorrichtung geleitet werden. Sofern die Wärmekapazität des Heizelementes gering, die Wärmeleistung jedoch relativ hoch ist, ist auch eine kontinuierliche Kühlung möglich.
Die erfindungsgemäße Vorrichtung kann verschiedenste Ausführungsformen haben. Beispielsweise kann sie für ein Eintauchen in ein Gefäß ausgelegt sein. Sie kann jedoch auch so gestaltet sein, daß die die zu bearbeitende Nuklein­ säure enthaltende Flüssigkeit auf die Oberfläche aufgetropft oder in ein durch die Oberfläche gebildetes Gefäß eingefüllt werden kann. Dieser Reaktions­ raum kann auch nach Einfüllen der Flüssigkeit verschlossen werden, so daß Kontaminationsprobleme verringert werden können.
Eine Ausführungsform der Erfindung ist ein Verfahren zur Vermehrung von Nukleinsäuren. Dabei handelt es sich, wie in Beispiel 2, z. B. um eine als Polymerasekettenreaktion bezeichnete Amplifikationsreaktion mit an­ schließender Detektion.
Eine weitere Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist ein Ver­ fahren zur Anreicherung von Nukleinsäuren z. B. durch Hybridisation. Bei ko­ valent an die Oberfläche adsorbierten Primern mit einer ausreichenden Spezifi­ tät läßt sich durch Vorwahl der Hybridisierungstemperatur, bei bekannter Zu­ sammensetzung (ionischer Zusammensetzung, Konzentration von Reagenzien) der zu analysierenden Reaktionslösung eine Hybridisationstemperatur der­ gestalt vorgeben, daß eine spezifische Bindung der zu analysierenden Nukleinsäure an die zur Hybridisierung eingesetzten kovalent an die Ober­ fläche gebundenen Primer stattfindet. Dieses Verfahren kann dazu eingesetzt werden
  • a) eine genaue Auswertung der tatsächlichen Hybridisationstemperatur vor­ zunehmen,
  • b) eine genaue Konzentration der zu analysierenden Nukleinsäuren im Reaktionsgemisch vorzunehmen,
  • c) auf das Vorhandensein kreuzhybridisierender Sequenzen zu testen.
Diese kurze Auflistung ist nicht abschließend.
Dieses Verfahren kann auch verwendet werden, um Nukleinsäuren von einer Lösung in eine andere zu überführen. Dann findet im ersten Gefäß eine Hybridisierung (niedere Temperatur) und im zweiten Gefäß eine Denaturie­ rung (höhere Temperatur) statt.
Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Sequenzierung von Nukleinsäuren. Eine Möglichkeit der Anwendung der Erfindung im Zusammenhang mit Sequenzanalysen ist die sogenannte Mini­ sequenzanalyse. Dabei kann jeweils die genaue Sequenzbestimmung des an den Primer anschließenden Nukleinsäurenukleotids vorgenommen werden, indem in der Lösung die zur Sequenzierung bereitgestellt wird, ausschließlich Dideoxynukleotide und keine Deoxynukleotide zur Sequenzierung zugesetzt werden. Die vier möglichen Dideoxynukleotide ddATP, ddCTP, ddGTP und ddTTP sind mit unterschiedlichen Fluoreszenzmarkern markiert. In jedem Fall führt also der Einbau des jeweils nächsten Nukleotids zum Abbruch der Sequenzreaktion und nach Aufreinigung des extendierten an der Oberfläche befindlichen Primers kann durch Analyse der spezifischen Fluoreszenz die Sequenz des auf dem Primer befindlichen Nukleotids bestimmt werden.
Ein Spezialfall der Möglichkeiten der Anwendung der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Sequenzierung von Nukleinsäuren, die zuvor in einer PCR-Reaktion amplifiziert worden sind. Nach der Amplifikation liegt das vermehrte Produkt über den Primer kovalent gebunden in doppelsträngiger Form an der reaktiven Oberfläche vor. Durch kurzes Durchlaufen einer Höhentemperaturphase wird durch Denaturierung dieses Amplifikat einzel­ strängig vorliegen, läßt sich durch Überführen in eine Waschlösung reinigen und ist danach wiederum durch Überführen diesmal in eine Sequenzierreaktion einsetzbar für eine darauffolgende Sequenzierung. Diese Sequenzierung ver­ läuft besonders effizient, da nun nur einzelsträngiges Matrizenmaterial vor­ handen ist, an das ein Sequenzierpaar besonders effizient binden wird. Durch die Sequenzierreaktion liegt anschließend wieder ein doppelsträngiges Mole­ kül vor, dessen markierte (sequenzierte) Hälfte nun zur Analyse durch Gelchromatographie zur Verfügung steht. Bei Einsatz verschiedener markierter (mit unterschiedlichen Fluoreszenzmarkern markierten Dideoxynukleotiden) lassen sich alle vier für eine Sequenzanalyse notwendigen Reaktionen auf einmal durchführen, bei der konventionellen Methode muß diese Analyse viermal wiederholt werden.
Die vorliegende Erfindung wird anhand der beiliegenden Figuren näher er­ läutert:
Fig. 1 zeigt das Aufbauschema einer erfindungsgemäßen Vorrichtung (1), welche in ein mit Reaktionsgemisch (2) gefülltes Reaktionsgefäß (3) eintaucht. Die Vorrichtung enthält ein Kühlelement (4) und ein mittels Strom heizbares Heizelement (5). An die Oberfläche des Heizelements sind Oligonukleotide (6) kovalent gebunden. Sowohl das Kühl- wie das Heizelement sind über Anschlüsse (7) an Steuereinheiten regulierbar.
In Fig. 2 ist ein beispielhafter Temperaturverlauf für eine Vermehrungsreak­ tion nach der Art der PCR gezeigt. In einer ersten Phase (A) werden die Nukleinsäuren bei einer Temperatur von etwas unterhalb 100°C denaturiert. In einer Phase (B) findet bei etwa 50°C die Hybridisierung der zu vermehren­ den Nukleinsäuren mit den immobilisierten Oligonukleotiden an der Festphase statt. In einer dritten Phase (C) findet bei ca. 70°C die Extension der Primer unter Verwendung der Nukleinsäure als Templat statt.
In Fig. 3 sind die in unmittelbarer Nähe der Oberfläche ablaufenden Reaktio­ nen (Phasen A bis C) gezeigt. Für Phase (A) sind drei Isothermen in ihrem schematischen Verlauf, für Phase (B) und (C) jeweils nur eine Isotherme an­ gezeigt. In Phase (A) werden Nukleinsäuren denaturiert und diffundieren über eine gewisse Zeit einzelsträngig, in Phase (B) hybridisieren Vorlagen und Primer und in Phase (C) werden Primer entlang der Matrizen extendiert.
Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung näher erläutern.
Beispiel 1 Herstellung einer erfindungsgemäßen Vorrichtung
Eine beispielhafte Vorrichtung gemäß dieser Erfindung besteht aus drei Strukturuntereinheiten. Bei diesen drei Struktureinheiten handelt es sich um
  • 1. die in das flüssige Reaktionsmilieu eindringende heizbare und tempera­ turregulierbare Oberfläche,
  • 2. um die zur Heizung und Kühlung notwendigen Bauteile, die an
  • 3. die elektronische Steuerung angeschlossen sind.
Die in diesem Beispiel beschriebene Elementoberfläche, besteht aus einer dünnen Goldfolie mit einer Dicke von weniger als einem halben Millimeter, die mit einer polymeren Dextranschicht durch Aufpolymerisieren fest verbun­ den ist. Durch Kopplung mittels chemischer Mediatoren läßt sich an diese Dextranschicht wiederum die für den jeweiligen Bearbeitungsschritt notwen­ dige Oligonukleotide anbringen. Diese Oligonukleotide sind dann über ihr 5′- Phosphatende kovalent an die Oberfläche gekoppelt und besitzen somit ein reaktives, für Enzyme zugängliches 3′-Ende.
Diese Goldfolie, die durch ein unterstützendes Plastiknetz strukturell stabili­ siert werden kann, und die eine reaktive Oberfläche von etwa 5 × 5 mm be­ sitzt, dient auch zugleich als Heizelement, da sie an eine elektrische Strom­ quelle angeschlossen ist, die bei Stromfluß zu einer spontanen Erhitzung dieser Goldfolie führt. Distral zum Reaktionsansatz, hinter der Goldfolie, befindet sich das Kühlelement. In diesem Fall besteht das Kühlelement aus einem in Plastik ausgesparten Kanal mit einer an die Goldfolie grenzenden 7 mm breiten Fläche. Der Kanal ist 2 mm tief und erstreckt sich über die ganze Länge des hier als Meßfühler bezeichneten Teil des Gerätes, der in diesem Fall die Heiz- und Kühlelemente sowie die reaktive Oberfläche umfaßt. Dieser Kanal erstreckt sich von einem Ende des Meßfühlers bis zum anderen Ende des Meßfühlers, an dem die reaktive Oberfläche angebracht ist, und zurück in­ dem er einen die beiden Kanäle trennenden Steg umfaßt. In diesem, als Kühl­ schleife zu bezeichnendem Bauteil, wird eine geeignete Kühlflüssigkeit, z. B. Wasser, umgewälzt. Die gesamte Einheit ist in Hartplastik eingegossen und recyclebar, d. h. sowohl die Goldfolie als auch das Plastik sind wiederverwert­ bar.
Die Steuerung sowohl der Erhitzung der reaktiven Oberfläche, als auch der Umwälzgeschwindigkeit und Vorkühltemperatur der Kühlflüssigkeit wird über einen elektronischen dritten Bauteil, der außerhalb des Meßfühlers angebracht ist, vorgenommen. Dies dritte Einheit umfaßt auch das Vorratsbehältnis sowie die Verbindungsanschlüsse für die Kühlflüssigkeit. In dieser dritten Einheit befindet sich weiterhin eine Mikropumpe die für die Umwälzung der Kühl­ flüssigkeit zuständig ist. Durch Anflanschen der Kühlflüssigkeitsschläuche an die Meßeinheit sowie durch das Anschließen der Stromzufuhr an die reaktive Oberfläche wird der Meßfühler einsatzbereit. Über eine Eingabeeinheit, die an der Oberfläche der Steuereinheit angebracht ist, die über einen digitalen Dis­ play verfügt, sind sowohl die einzelnen Temperaturbereiche, als auch die Dauer ihrer Einwirkung auf diese Oberfläche vorwählbar.
Beispiel 2 Durchführung einer Vermehrungsreaktion mit Hilfe der erfindungsgemäßen Vorrichtung
Bei dem hier als Beispiel einer erfindungsgemäßen Anwendung der Vorrich­ tung handelt es sich um eine als Polymerasekettenreaktion bezeichnete Ampli­ fikationsreaktion von einer vorgegebenen Nukleinsäuresequenz. Für diese Nukleinsäuresequenz sind zwei Primer mit einer Länge von jeweils 16 Basen, die im Abstand von 4 Nukleotiden zueinander codieren, ausgewählt worden. Der eine Primer ist in seiner Sequenz identisch, der andere komplementär zur analysierenden Sequenz. Der hier als identisch bezeichnete Primer ist dabei kovalent über sein 5′-Phosphatende an die reaktive Oberfläche gekoppelt. Der andere, komplementäre Primer sowie alle weiteren Reagenzien, die üblicher­ weise in einer sogenannten PCR-Reaktion zum Einsatz kommen, sind dem Reaktionsansatz zugegeben. Durch Eingabe der entsprechenden Reaktions­ temperaturen die in unmittelbarer Nähe der reaktiven Oberfläche herrschen sollen, und durch Eintauchen der reaktiven Oberfläche bzw. des Meßfühlers (siehe Beispiel 1) in den Reaktionsansatz, wird die Reaktion gestartet. Die Temperaturänderungen in der reaktiven Oberfläche sind so programmiert, daß die Durchführung von 50 Erwärmungs- und Abkühlungszyklen in ca. 1 Min. durchgeführt werden kann. Durch anschließendes Eintauchen des Meßfühlers in eine Lösung mit destilliertem Wasser und kurzfristiges Erhitzen, wird die Oberfläche von allen nicht kovalent gebundenen Reaktionspartner gereinigt. Die so gereinigte Oberfläche, die nun nur noch Primermoleküle und exten­ dierte Primenmoleküle enthält, wird zur Analyse, zusammen mit dem Meß­ fühler, in ein Gerät eingeführt, das nach dem Prinzip der Plasmonenresonanz, eine direkte Bestimmung der Menge des extendierten Produkts zuläßt.

Claims (39)

1. Verfahren zur Bearbeitung von Nukleinsauren in einer Reaktions­ mischung, dadurch gekennzeichnet, daß die Temperatur der an die Reak­ tionsmischung angrenzenden Oberfläche und deren unmittelbare Um­ gebung reguliert wird, jedoch ein Teil der Reaktionsmischung im wesentlichen isotherm verbleibt.
2. Verfahren gemäß Anspruch 1, bei dem mindestens ein Arbeitsschritt eine Temperatur, die von dem Reaktionsansatz abweicht, aufweist.
3. Verfahren gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß ein tempera­ turverändernder Arbeitsschritt der thermischen Denaturierung dient.
4. Verfahren gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß ein tempera­ turverändernder Schritt der Hybridisation von Nukleinsäuren dient.
5. Verfahren gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß ein tempera­ turverändernder Schritt der Extension des Matrizenmoleküls dient.
6. Verfahren gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß verschiedene Arbeitsschritte der zielsequenz-abhängigen Amplifikation eines Matrizenmoleküls dienen.
7. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß Reaktanten an eine Oberfläche gebunden vorliegen und so für eine Detektion der Be­ arbeitungs- und Vermehrungsergebnisse geeignet sind.
8. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß Mittel zur Bearbeitung von Nukleinsäuren an eine Oberfläche gebunden sein können.
9. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 und/oder 8, dadurch gekenn­ zeichnet, daß diese Mittel Oligonukleotide sind.
10. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 und/oder 7 und/oder 8, dadurch gekennzeichnet, daß sich weitere Mittel zur Bearbeitung von Nuklein­ säuren in einer Reaktionsmischung befinden.
11. Verfahren gemäß Anspruch 1 und/oder 6, dadurch gekennzeichnet, daß eine Detektion spezifischer Sequenzen nach Hybridisierung mit markier­ ten Nukleinsäuren oder markierbaren Nukleinsäuren möglich ist.
12. Verfahren gemäß Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß zur Vermeh­ rung (Amplifikation) nicht-temperaturresistente DNA-Polymerasen ein­ setzbar sind.
13. Verfahren gemäß Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß zur Vermeh­ rung (Amplifikation) temperaturresistente DNA-Polymerasen eingesetzt werden können.
14. Verfahren gemäß Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß zur Vermeh­ rung (Amplifikation) RNA-abhängige RNA-Polymerase verwendet wer­ den kann.
15. Verfahren gemäß Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß zur Vermeh­ rung (Amplifikation) RNA-abhängige DNA-Polymerase verwendet wer­ den kann.
16. Verfahren gemäß Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß zur Vermeh­ rung (Bearbeitung) DNA-Ligase verwendet werden kann.
17. Verfahren gemäß einem oder mehrerer der Ansprüche 1, 6, 8, 9, 10, da­ durch gekennzeichnet, daß Mittel zur Bearbeitung von Nukleinsäuren an eine Oberfläche gebracht werden.
18. Verfahren gemäß einem oder mehrerer der Ansprüche 1, 8, 9, 10, 16, 17, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens eine der bei der Bearbeitung beteiligten, bei erhöhter Temperatur ablaufenden Reaktionen an einer Oberfläche abläuft.
19. Verfahren gemäß Anspruch 1 und/oder 6, dadurch gekennzeichnet, daß für die Meßlösung eine weitestgehende Volumenunabhängigkeit besteht, d. h. sowohl in sehr kleinen als auch sehr großen Volumina dieses Ver­ fahren zur Bearbeitung und Vermehrung von Nukleinsäuren durchgeführt werden kann.
20. Verfahren gemäß Anspruch 1 durch Konvektion oder Bewegung ge­ steigert wird.
21. Vorrichtung zur Bearbeitung von Nukleinsäuren mit Hilfe eines Tempe­ raturregulationselements, dadurch gekennzeichnet, daß die Vorrichtung zur Regulation der Temperatur der Oberfläche und der unmittelbar an­ grenzenden Umgebung geeignet ist und daß daran Mittel zur Bearbeitung der Nukleinsäuren gebunden werden können.
22. Vorrichtung gemäß Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, daß eine Eignung zur Verwendung für Verfahren gemäß den Ansprüchen 1 bis 20 verwendbar ist.
23. Vorrichtung zur Bearbeitung von Nukleinsäuren gemäß Anspruch 21 und/oder 22, dadurch gekennzeichnet, daß die in das Reaktionsmilieu ragende Oberfläche gekühlt und/oder geheizt werden kann.
24. Vorrichtung gemäß Anspruch 21 und/oder 22, dadurch gekennzeichnet, daß die temperaturregulierende Oberfläche durch chemische oder physi­ kalische Behandlung zur Aufnahme von Reaktanden entsprechend dem Anspruch 1 vorbereitet wurde.
25. Vorrichtung gemaß Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, daß die Temperatur der Oberfläche durch eine Steuereinheit reguliert wird.
26. Vorrichtung gemaß der Ansprüche 21, 22 und/oder 24, dadurch gekenn­ zeichnet, daß eine zeitlich koordinierte Regulation der Temperaturände­ rungen vorgenommen werden kann.
27. Vorrichtung gemaß der Ansprüche 21, 22, 24, dadurch gekennzeichnet, daß ein Heizelement eine geringe und ein Kühlelement eine hohe Wärmekapazität aufweisen.
28. Vorrichtung gemäß Anspruch 21, 22, dadurch gekennzeichnet, daß eine Oberfläche zu einer direkten Ausweitung der Bearbeitungs- und Vermeh­ rungsergebnisse geeignet ist.
29. Vorrichtung gemäß Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, daß die temperaturregulierte Oberfläche aus einer Folie aus wärmeleitfähigem Material besteht, bevorzugterweise Metall, bevorzugterweise Gold.
30. Vorrichtung gemäß Anspruch 21, 22, 24, dadurch gekennzeichnet, daß die Kühlung der temperaturregulierten Oberfläche auf der dem Reak­ tionsansatz distalen Seite vorgenommen wird.
31. Vorrichtung gemäß Anspruch 21, 22, 24, dadurch gekennzeichnet, daß das Heizelement identisch ist mit der reaktiven Oberfläche, wobei diese Oberfläche speziell behandelt sein kann.
32. Vorrichtung gemäß Anspruch 21, 22, 24 sowie 30 und 31, dadurch ge­ kennzeichnet, daß Nukleinsäuren an der Oberfläche des Heizelements fixiert sein können.
33. Vorrichtung gemäß Anspruch 32, dadurch gekennzeichnet, daß die Fixie­ rung über Mittlungsstrukturen zum Heizelement erfolgt.
34. Vorrichtung gemäß Anspruch 33, dadurch gekennzeichnet, daß diese Fixierung über Mittlungsstrukturen sowohl über chemische als auch bio­ spezifische Bindung erfolgen kann.
35. Vorrichtung gemäß Anspruch 21, 22, dadurch gekennzeichnet, daß Nukleinsäuren nur vorübergehend in unmittelbarer Nähe der Oberfläche assoziieren bzw. dort verweilen.
36. Vorrichtung gemäß Anspruch 35, dadurch gekennzeichnet, daß diese Assoziation von Nukleinsäuren an die reaktive Oberfläche durch die Bindung dieser Nukleinsäuren an Magnetobeads bzw. die Adsorption dieser Nukleinsäuren an Magnetobeads gewährleistet wird.
37. Vorrichtung gemäß Anspruch 35, 36, dadurch gekennzeichnet, daß ein induzierbares Magnetfeld zur Attrahierung besagter Magnetobeads dient.
38. Verfahren gemäß Anspruch 21, 22, dadurch gekennzeichnet, daß die Vorrichtung, die Heiz- und Kühlelemente enthält, nur einmal verwendbar ist, um Kontaminationen vorzubeugen.
39. Vorrichtung gemäß Anspruch 21, 22, dadurch gekennzeichnet, daß die gesamte Vorrichtung mehrfach verwendbar ist, und nur die Oberfläche bzw. deren Halterung für einzelne Arbeitsgänge ausgetauscht werden muß.
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