DE60010287T2

DE60010287T2 - Resorbierbare implantatmaterialien

Info

Publication number: DE60010287T2
Application number: DE60010287T
Authority: DE
Inventors: T. Ralph FRANCIS; Hong Qing ZHAO; Amy Desmith; Nicholas B. Oray
Original assignee: Synovis Life Technologies Inc
Current assignee: Synovis Life Technologies Inc
Priority date: 1999-09-15
Filing date: 2000-09-14
Publication date: 2004-09-23
Anticipated expiration: 2020-09-15
Also published as: DE60010287D1; US20020138152A1; EP1212105B1; CA2384961C; AU772182B2; CA2384961A1; ATE265241T1; JP2012040415A; EP1212105A1; US20040107006A1; US6312474B1; JP2003509129A; WO2001019423A1; ES2220530T3; US6652594B2; JP5362937B2; AU7131400A

Description

TECHNISCHES GEBIET
Die Erfindung betrifft Materialien zur Verwendung als Implantate im Körper und insbesondere resorbierbare und umformbare Materialien für eine solche Verwendung.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Verschiedene resorbierbare (gelegentlich als absorbierbar oder "umformbar" bezeichnet) Materialien existieren gegenwärtig zur Verwendung bei prothetischen Anwendungen, z. B. als Patches, Implantate und/oder als Komponenten von prothetischen Einheiten.
Synthetische resorbierbare Materialien, zum Beispiel hergestellt aus Polyestern, Polylactid und Polyglykolid, haben Verwendung in verschiedenen Bereichen der Medizin gefunden (siehe z. B. Ashammaki, N. A., J. Biomed. Mater. Res., 33: 297–303; 1996). Versionen dieser Materialien existieren kommerziell unter den Markennamen Vicryl^® (Ethicon, Inc.) und Dexon^® (Davis & Geck, Inc.). Die allmähliche Zersetzung dieser Polymere wird erleichtert durch Hydrolyse und katalysiert durch biochemische Wirkung der Wirtsgewebe (Hanbrough, J. F., et al., J. Burn Care Rehab., 14: 485–494; 1993). Diese Materialien können als Membranen oder als gewebtes Netz im Falle der Herstellung von resorbierbarem Nahtmaterial hergestellt werden.
Obgleich synthetische resorbierbare Materialien ein relativ neues Phänomen sind, sind Collagen-Materialien seit vielen Jahren als prothetische Transplantate verwendet worden; wie im Falle lyophilisierter menschlicher Dura, was bis 1954 zurückreicht. Als eine übliche Praxis seit vielen Jahren sind solche Collagen-Materialien mit einem Agens wie etwa Glutaraldehyd vernetzt worden, um die Antigenizität eines Xenotransplantats zu verringern, während seine Widerstandsfähigkeit gegen enzymatischen Abbau erhöht wird, der durch Wirtsgewebereaktionen bewirkt wird (Gratzer, P. F., et al., J. Biomed. Mater. Res., 31: 533– 543; 1996). Polyepoxy-Verbindungen sind ebenfalls für solche Zwecke verwendet worden, sind jedoch stabiler im Hinblick auf die resultierenden alkylierten Amine im Collagen (Song, H-W., et al., J. Biomater. Sci. Polymer Edn., 8: 587–600; 1997). Obgleich vernetzte Gewebe gut als Langzeitimplantat funktionieren, sind sie nicht resorbierbar und fördern als solche nicht die Wirtsgewebeumformung oder ihrerseits den letztendlichen Ersatz eines Transplantats durch den Körper selbst.
Aesculap AG & Co. (B. Braun Surgical) bietet unter dem Markennamen Lyoplant^® Produkte in der Form eines resorbierbaren Ersatzes für Dura mater auf Basis von Rinder-Perikard an. Lyoplant^® wird hergestellt mit einem Verfahren, das mechanisches Entfernen von anhaftendem Fett- und Bindegewebe, chemische Behandlung, um Enzyme und potentielle Pathogene zu inaktivieren, Gefriertrocknung, Schneiden auf verschiedene Größen, Verpacken und abschließende Sterilisierung mit Ethylenoxid umfaßt. Das Produkt ist indiziert, um zur Abdeckung zerebraler und zerebellarer duraler Defekte, für dekompressive Duraplastik in Fällen erhöhten intrakranialen Drucks, zur Abdeckung spinaler duraler Defekte und für spinale dekompressive Duraplastik verwendet zu werden. Es ist beobachtet worden, daß dieses Material innerhalb eines Jahres nach Implantation vollständig umgeformt ist.
Tutogen Medical, Inc. liefert verarbeitete Perikard-Produkte unter dem Markennamen Tutoplast^® in der Form von lösungsmitteldehydratisiertem, gammabestrahltem, konserviertem menschlichen Perikard. Verarbeitung von Tutoplast^®-Gewebe umfaßt gründliche Reinigung, Verarbeitung, Dehydratisierung und Konservierung. Von dem Verfahren wird gesagt, daß es keine schädlichen Rückstände zurückläßt und antigenes Potential minimiert. Collagen-Bindegewebe mit multidirektionalen Fasern behält die mechanische Festigkeit und Elastizität von nativem Perikard bei, während die grundlegende formative Struktur bereitgestellt wird, um einen Ersatz durch neues endogenes Gewebe zu unterstützen. Dieses Gewebe ist indiziert zur Verwendung in einer Vielzahl chirurgischer Anwendungen, einschließlich Duraplastik (als ein Ersatz für menschliche Dura mater) und bei Bauch-, Harntrakt-, Augen- und Gefäß-Chirurgie. Der Absorptionsprozeß und die Umformung von endogenem Gewebe beginnt ein bis zwei Tage nach Implantation und setzt sich über Wochen, Monate oder Jahre fort, in Abhängigkeit von der Größe des Transplantats und der Reaktivität der Transplantatstelle. Mentor Corporation ist eine strategische Allianz mit Tutogen Medical, Inc. eingegangen, um die Tutoplast^®-Technologie zu verwenden, um resorbierbare Schlingen für Harninkontinenz herzustellen (Suspend^®).
Eine Vielzahl anderer Verwendungen von resorbierbaren Materialien sind in der Patentliteratur beschrieben. Siehe zum Beispiel U.S.-Patent Nr. 5,895,420 (Mirsch, II, et al., "Bioresorbable Heart Valve Support"), das bioprothetische Herzklappenstents betrifft, die aus resorbierbaren Materialien hergestellt sind. Solche Stents können als Ummantelungen oder Rahmen konfiguriert werden, die an die Form eines Klappentransplantats angepaßt sind. Die Stents werden letztendlich vom Patienten resorbiert, was eine funktionale "stentlose" Klappe mit verbesserten hämodynamischen Eigenschaften zurückläßt, verglichen mit Klappenimplantaten mit Stent.
Verschiedene andere resorbierbare Materialien sind zur Verwendung mit Gefäß- oder Nicht-Gefäß-Implantaten empfohlen oder vorgeschlagen worden. Goldberg et al., U.S.-Pat. Nr. 5,085,629, offenbart zum Beispiel einen biologisch abbaubaren Infusionsstent zur Verwendung bei der Behandlung von Harnleiterobstruktionen. Stack, et al., U.S.-Pat. Nr. 5,306,286, offenbart einen absorbierbaren Stent zum Anbringen innerhalb eines Blutgefäßes während Koronar-angioplastik. Duran, U.S.-Pat. Nr. 5,376,112, offenbart einen Annuloplastikring, der in das Herz implantiert werden kann, um mit der nativen Herzklappe zusammenzuarbeiten.
In einem anderen Aspekt beschreibt U.S.-Patent Nr. 5,837,278 (Geistlich, et al., "Resorbable Collagen Membrane for Use in Guided Tissue Regeneration") die Verwendung einer collagenhaltigen Membran bei geführter Geweberegeneration. Das Patent stellt eine resorbierbare Collagenmembran zur Verwendung bei geführter Geweberegeneration zur Verfügung, wobei eine Seite der Membran faserig ist, wodurch Zellwachstum darauf ermöglicht wird, und die gegenüberliegende Seite der Membran glatt ist, wodurch Zelladhäsion darauf gehemmt wird.
Siehe schließlich U.S.-Patent Nr. 5,413,798 (Scholl, et al.), das ein Verfahren zur Behandlung von Rinder-Perikardgewebe zur Erhöhung der Widerstandsfähigkeit gegenüber biologischem Abbau durch naßchemische Verarbeitung beschreibt. Die Verwendung des Gewebes ist beispielhaft beschrieben in der Form eines Implantats, das drei und sechs Monate nach Implantation so gut integriert war, daß es nicht länger unterscheidbar war von autochthoner Dura (revitalisiert durch Fibrocyten und durchdrungen von Blutgefäßen in den Randzonen). Die Innenseite des Implantats ist mit demselben Zelltyp wie die autologe Dura überzogen.
In noch einem anderen Bereich beschreiben bestimmte Artikel Grundlagenforschung, die auf die Untersuchung der Wirkung von Alkylierungsmitteln auf Materialien wie etwa Collagen gerichtet ist. Siehe zum Beispiel Sung, H. W., et al., J. Biomed. Mater. Res. 37: 376–383 (1997) und Tu, R. et al., J. Biomed. Mater. Res., 28: 677–684 (1994). Nach dem besten Wissen der Anmelder schlagen diese Literaturstellen jedoch nicht die Art und Weise vor, in der solche Materialien in vivo verwendet werden könnten, noch beschäftigen sie sich ihrerseits mit der Frage, ob solche Materialien vom Körper toleriert werden können, geschweige denn resorbiert und umgeformt.
Der Rechtsnachfolger im vorliegenden Fall ist anerkannt als führend bei der Entwicklung und Herstellung von Materialien auf Perikard-Basis. Siehe zum Beispiel U.S.-Patente Nrn. 5,752,965; 5,575,803; 5,549,628; 5,503,638; und 4,915,119 und Internationale Anmeldung Nr. US98/25674, deren Offenbarungen jeweils hierin durch Bezugnahme miteinbezogen sind. Allgemein werden die Perikard-Materialien vernetzt, z. B. unter Verwendung von Glutaraldehyd, und werden daher typischerweise als nicht-resorbierbar angesehen. Solche Materialien sind in einer Vielzahl von Anmeldungen verwendet worden, einschließlich als Patches, Nahtmaterial und Klammerstützelemente und Tupfer.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegenden Erfindung stellt ein nicht-vernetztes, dezellularisiertes und gereinigtes Säugergewebe (z. B. Rinder-Perikard) zur Verfügung, das insofern besondere Verwendung als ein implantierbares Material hat, als es sowohl resorbierbar als auch umformbar ist. Das Material wird hergestellt durch Alkylieren der primären Amingruppen von natürlichem Gewebe in einer ausreichenden Art und Weise, um die Antigenizität des Gewebes zu verringern, und seinerseits in einem Umfang, der ermöglicht, daß das behandelte Gewebe in vivo und ohne Vernetzung verwendet werden kann, wodurch ermöglicht wird, daß es resorbierbar ist.
Das Material kann zum Beispiel bei chirurgischer Reparatur von Weichgewebedefekten für einen bestimmten Zeitraum verwendet werden, während das Implantat selbst allmählich vom Wirt umgeformt oder absorbiert wird. In einem verwandten Aspekt stellt die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung solch eines Materials bereit sowie ein Verfahren zur Verwendung solch eines Materials für die chirurgische Reparatur. Wie hierin im Hinblick auf ein Material der vorliegenden Erfindung verwendet, wird sich das Wort "resorbieren" und Inflektionen desselben auf ein Material beziehen, das, nachdem es in vivo implantiert worden ist, vom Körper über die Zeit und ohne unangemessene schädliche Wirkungen auf oder in dem Körper selbst absorbiert wird. Das Wort "umfomen" und Inflektionen desselben, wie hierin im Hinblick auf ein Material der vorliegenden Erfindung verwendet, wird sich auf ein resorbierbares Material beziehen, das angepaßt ist, z. B. durch seine Lokalisierung und das Implantationsverfahren im Körper, um den Körper dazu anzuregen und/oder ihm zu ermöglichen, einen Teil oder die Gesamtheit der Struktur und/oder Funktion des Implantats durch neugebildetes natürliches Gewebe zu ersetzen. Obgleich nicht beabsichtigt ist, durch eine Theorie gebunden zu sein, scheint das Umformen wenigstens in einigen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung durch allmähliche Körperprozesse aufzutreten, bei denen beträchtliche Teile des Implantatmaterials allmählich resorbiert werden, während ein inhärentes Fasernetzwerk des Implantats an der Stelle zurückgehalten wird. Das Netzwerk seinerseits wird vom Körper dafür verwendet, um im wesentlichen als Gerüst für die Erzeugung von neuem Gewebe oder neuen Gewebekomponenten zu dienen.
In einer bevorzugten Ausführungsform stellt die Erfindung ein resorbierbares, implantierbares Material bereit, das ein nicht-vernetztes, dezellularisiertes, gereinigtes Säugergewebe umfaßt, in dem die meisten seiner freien Amingruppen alkyliert sind. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist das Gewebe ausgewählt aus der Gruppe, die aus Perikard, Peritoneum, Fascia lata, Dura mater, Dermis und Dünndarm-Submukosa besteht, und das Material ist alkyliert worden mit einem Alkylierungsmittel, das ausgewählt ist aus der Gruppe, die aus 1,2-Epoxy-R-Verbindungen besteht, wobei R eine Alkylgruppe mit bis zu 6 Kohlenstoffatomen ist. Solch ein Material kann in jeder geeigneten Form bereitgestellt werden, z. B. als flache oder texturierte Folien oder Streifen und kann zur Verwendung in einer Vielzahl von chirurgischen Anwendungen angepaßt werden, einschließlich derjenigen, die ausgewählt sind aus der Gruppe, die aus Duraplastik, Brust-, Bauch-, Harntrakt-, Augen-, Herz- und Gefäß-Chirurgie besteht.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG
Ein Gewebe der vorliegenden Erfindung kann aus jeder geeigneten Quelle erhalten werden, einschließlich Säugerquellen, z. B. in der Form von Collagen-Bindegewebe mit dreidimensionalen ineinander verwundenen Fasern. Solche Gewebe schließen im allgemeinen seröse und fibrinös-seröse Membranen ein. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist die Gewebequelle ausgewählt aus Rinder-Perikard, Peritoneum, Fascia lata, Dura mater, Dermis und Dünndarm-Submukosa. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist das Gewebe Rinder-Perikard und wird unter Verwendung eines Verfahrens behandelt, wie hierin beschrieben, um das behandelte Gewebe mit einer optimalen Kombination aus biologischer Kompatibilität, Dicke und anderen physikalischen und physiologischen Eigenschaften zu versehen.
Gewebe der vorliegenden Erfindung können zum Beispiel zur Verwendung in neurochirurgischen Anwendungen aus Dura mater bereitgestellt werden. Collagen-Bindegewebe mit dreidimensionalen ineinander verwundenen Fasern behält, wenn in der hierin beschriebenen Art und Weise behandelt, die multidirektionale und mechanische Festigkeit von nativer Dura mater bei, während sie die grundlegende formative Struktur bereitstellt, um Ersatz durch neues endogenes Gewebe zu unterstützen.
Während es wünschenswert ist, antigene Eigenschaften von Material auf Basis von xenografischem und sogar allografischen Gewebebasis zu verringern oder zu minimieren, damit dieses in einen Körper implantiert werden kann, wenn eine Absorption und/oder Umformung des Materials durch den Körper gewünscht sind, kann Vernetzung nicht durchgeführt werden. Um eine solche Modifikation eines auf Collagen beruhenden Materials spezifisch durchzuführen, wird daher ein monofunktionelles Reagens verwendet. Das Reagens ist insofern "monofunktionell", als es angepaßt ist, um mit den verfügbaren Amin-Funktionalitäten von Gewebeproteinen zu reagieren und diese daher zu terminieren oder "abzudecken", würde aber nicht weiter mit benachbarten Gruppen reagieren. Ein optimales Reagens dieser Erfindung ist daher vorzugsweise eine relativ kleine und strukturell einfache Verbindung, die, bei Reaktion mit solchen Proteingruppen wie Aminen, sich an diese Gruppen binden wird, aber die biologischen Eigenschaften der Collagenmatrix nicht in anderer Weise in einem Maße verändert wird, das das Gewebe für seine beabsichtigte Verwendung ungeeignet macht.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform wird ein Gewebe der vorliegenden Erfindung mit einem Verfahren behandelt, das einschließt, daß ein größerer Prozentanteil seiner verfügbaren Amingruppen in einem Maße alkyliert wird, das ausreichend ist, um zu ermöglichen, daß das Gewebe implantiert und in vivo verwendet werden kann. Vorzugsweise wird ein Gewebe verarbeitet, indem seine Amine in einem Maße alkyliert werden, das ausreichend ist, um 80% oder mehr, vorzugsweise 90% oder mehr und am bevorzugtesten 95% oder mehr der Amingruppen, die ursprünglich vorhanden sind, umzusetzen. Die Wirksamkeit und das Ausmaß der Alkylierung kann durch eine Vielzahl von Mitteln bestimmt werden, wie hierin beschrieben, einschließlich der Verwendung eines Tests auf Ninhydrin-Basis ("Amin-Index"), um ein Vergleichsniveau von Amingruppen vor und nach der Behandlung zu bestimmen (siehe z. B. Sung H-W, et al. Art Org., 21: 50–58; 1997. Sung H-W, et al., J. Biomed. Mater. Res. 33: 177–186. 1996). Vorzugsweise wird die Wirksamkeit und das Ausmaß des Alkylierungsverfahrens weiter beurteilt durch Bestimmung nicht-umgesetzter Mengen in der Chargen-Inkubation des verwendenten Alkylierungsmittels.
Bevorzugte Alkylierungsmittel können zum Beispiel bei einem pH von zwischen etwa 9 und etwa 11 und bei einer Konzentration von zwischen etwa 2% (v/v) und etwa 5% (v/v) verwendet werden, indem das Gewebe einer Lösung, die das Mittel enthält, für wenigstens 48 Stunden ausgesetzt wird.
Bevorzugte Alkylierungsmittel schließen kleine und reaktive Amin-Alkylierungsmittel ein, wie etwa Formaldehyd und 1,2-Epoxy-Verbindungen. Die Epoxy-Mittel bieten gegenüber Formaldehyd insofern einen Vorteil, als sie dazu neigen, stabilere Addukte in ihren Reaktionen mit Aminen zu bilden (Song, H-W., et al., Biomater., 17: 2357–2365; 1996). 1,2-Epoxy-Mittel können mit einem primären Amin bei alkalischem pH reagieren, um ein extrem stabiles sekundäres 2-Hydroxyamin zu bilden. Ein Aldehyd, wie etwa Formaldehyd, reagiert dahingegen mit einem primären Amin, um ein marginal instabiles, reversibles, doppelt gebundenes Aldimin zu bilden (Girardot, J-M. und Girardot, M-N., J. Heart Valve Dis., 5: 518–525; 1996).
Von den verschiedenen monofunktionellen 1,2-Epoxy-Mittel ist Propylenoxid ("PO") besonders bevorzugt, da es Eigenschaften besitzt, die seine Einbeziehung in einen Materialprozeß einfach, aber effektiv machen. Propylenoxid (Epoxypropan) ist seit mehreren Jahren als ein Sterilisationsmittel verwendet worden, hauptsächlich in einem gasförmigen Zustand, obgleich es bei Raumtemperatur als eine Flüssigkeit existiert (Hart, A. und Brown, W., Appl. Microbiol., 28: 1069–1070; 1975). Vor vielen Jahren wurde entdeckt, daß PO Carboxyl-, Thiol-, Phenol- und Amin-Gruppen von Proteinen unter bestimmten Bedingungen direkt modifiziert (Fraenkal-Conrat, H., J. Biol. Chem., 154: 227–238; 1944). Wie mit anderen Epoxiden bewiesen worden ist, reagiert Propylenoxid überwiegend bei alkalischem pH mit Aminen. Collagen quillt bei alkalischem pH auf, was es zugänglicher dafür macht, mit einem wasserlöslichen Mittel, wie etwa Propylenoxid, alkyliert zu werden.
Ein weiteres bevorzugtes monofunktionelles Epoxy-Reagens zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung ist Methylglycidylether, der hergestellt wird von der Nagase Corp., Osaka, Japan und vertrieben wird unter dem Produktnamen Denacol^® EX-131. Dieses Produkt besitzt ein niedriges Molekulargewicht, ist wasserlöslich und hat sich als ein potenterer Alkylator von Schweine-Perikard als Formaldehyd erwiesen (Song, H-W., et al., J. Biomed. Mater. Res., 35: 147–155; 1997).
Zusätzlich zum "Amin-Index" kann ein weiterer Test verwendet werden, um Gewebemodifikation durch ein Amin-Alkylierungsmittel zu bestätigen. Die Denaturierungs-(Schrumpfungs-)-Temperatur (T_d) wird oft verwendet, um die Vernetzung von Collagen durch ein Mittel wie etwa Glutaraldehyd zu verifizieren. Es wird typischerweise beobachtet, daß bei chemischer Vernetzung die T_d signifikant ansteigt, offensichtlich aufgrund erhöhter Stabilisierung der Wasserstoffbindungen, die im Collagen vorliegen. Im Gegensatz dazu sinkt die T_d bei Alkylierung mit einem monofunktionellen Mittel wie etwa Propylenoxid signifikant. Man glaubt, daß dieses Phänomen aufgrund der Verzweigung des Collagen-Polymers durch die Wirkung des Alkylierungsmittels und die anschließende Änderung der Collagenmatrix auftritt (Tu, R., et al., J. Biomed. Mater. Res., 28: 677–684; 1994)
In einer bevorzugten Ausführungsform wird ein Gewebe der vorliegenden Erfindung auch mit einer Base wie Natriumhydroxid (NaOH) behandelt, um die schon minimale Möglichkeit der Übertragung spongiformer Rinderenzephalopathie (BSE) weiter zu verringern. Histologische Analysen von mit NaOH behandeltem Gewebe (zum Beispiel Perikard) zeigen praktisch vollständige Dezellularisierung aufgrund dieser Behandlung. Da bekannt ist, daß die zelluläre Komponente von Gewebe den Großteil der Antigenbeladung enthält (Courtman, D. W., et al., J. Biomed. Mater. Res., 28: 655–666; 1994), kann Dezellularisierungsbehandlung mit NaOH die Verwendung eines Alkylierungsmittels bei der Verringerung der Antigenizität ergänzen.
Ein Gewebe der vorliegenden Erfindung kann verwendet werden, um einen prothetischen Gegenstand mit irgendeiner geeigneten Form oder Konfiguration und allen geeigneten Abmessungen für seine beabsichtigte Verwendung herzustellen. Das Gewebe kann zum Beispiel in einer flachen Konfiguration (z. B. Folie oder bandähnlich) bereitgestellt und verpackt sein, wobei entweder eine oder beide Hauptflächen davon optimal texturiert oder modifiziert sind (z. B. durch die kovalente Bindung, Einfangen und/oder Adsorption von biologisch aktiven Faktoren, Gleitmitteln, antimikrobiellen Mitteln und dergleichen).
In einer bevorzugten Ausführungsform schließt ein Verfahren der vorliegenden Erfindung die Schritte ein:

a) Erhalten von Perikard aus einer geeigneten Quelle (z. B. vom USDA zugelassen),
b) Reinigen des Gewebes und fakultativ, und bevorzugt, Behandeln des Gewebes, z. B. um es zu dezellularisieren und/oder potentielle BSE-Infektivität zu verringern/eliminieren,
c) Alkylieren des Gewebes (z. B. Hydroxypropylierung unter Verwendung von Propylenoxid), um einen größeren Prozentanteil von verfügbaren (z. B. potentiell reaktiven) Amingruppen abzudecken, und fakultativ,
d) Endverarbeitung, einschließlich einem oder mehreren der folgenden Schritte: Waschen, Trocknen, Sterilisieren und Verpacken des Gewebes.

Natürliche Gewebe, die zur Verwendung im Verfahren dieser Erfindung geeignet sind, erfüllen vorzugsweise strenge Spezifikationen während Spenderscreenings und Labortests, um das Risiko der Übertragung von infektiösen Erkrankungen zu verringern. Die Verarbeitung von Gewebe umfaßt ein striktes, qualitätskontrolliertes Verfahren, das gründliche Reinigung, Verarbeitung, Dehydratisierung und Konservierung umfaßt. Das Verfahren läßt keinerlei schädliche Rückstände zurück und minimiert antigenisches Potential. Sterilisierung wird vorzugsweise erreicht mit der Verwendung von Gamma- oder Elektronenstrahlen-Bestrahlung (typischerweise 2,5 Mrad) oder Ethylenoxid-Gas.
Ein behandeltes Gewebe der vorliegenden Erfindung ist indiziert zur Implantation mit einem Spektrum von Indikationen. Collagen-Bindegewebe dieser Art, das multidirektionale Fasern aufweist, kann ein beträchtliches Ausmaß der mechanischen Festigkeit und Elastizität von nativem Perikard beibehalten, während es die grundlegende formative Struktur in situ bereitstellt, um den Ersatz durch neues endogenes Gewebe zu unterstützen. Dieser Gewebe ist indiziert zur Verwendung in einer Vielzahl von chirurgischen Anwendungen, einschließlich Duraplastik (als ein Ersatz für menschliche Dura mater) und bei Brust-, Bauch-, Harntrakt-, Augen-, Herz- und Gefäßchirurgie.
Implantation in Bereiche mit aktiver oder latenter Infektion oder Anzeichen von Gewebenekrose sollte vermieden werden, ebenso wie in Bereiche mit beeinträchtigter Zirkulation oder bei irgendeiner Störung, die ein unannehmbares Risiko postoperativer Komplikationen schaffen würde.
Das Gewebe kann unter Verwendung konventioneller Mittel verpackt werden, so daß das Gewebe und der Verpackungsinhalt steril und nicht-pyrogen bleiben, solange die Verpackung nicht geöffnet und/oder beschädigt wird. Das Transplantat muß vor dem Ablaufdatum verwendet werden. Die Fachleute auf dem betreffenden Gebiet werden die Art und Weise erkennen, in der angemessene Lokalisierung und Fixierung des Gewebes in situ kritische Faktoren sein können bei der Vermeidung potentiell nachteiliger Wirkungen auf die Transplantatlebensdauer. Ein Gewebe dieser Erfindung kann in verschiedenen Größen (z. B. Dicke, Länge und Breite) hergestellt und verpackt werden. Die verwendeten Gewebeabmessungen sollten mit der Größe des entsprechenden Defektes übereinstimmen.
Nachdem es implantiert worden ist, beginnt der Absorptionsprozeß und die Umformung von endogenem Gewebe ein oder zwei Tage nach Implantation und setzt sich über Wochen, Monate oder Jahre fort, in Abhängigkeit von der Größe des Transplantats und der Reaktivität der Transplantatstelle. Es wird empfohlen, daß das Gewebe, falls abgepackt in einem trockenen oder dehydratisierten Zustand, vor Verwendung für etwa 2 bis etwa 30 Minuten rehydratisiert wird, in Abhängigkeit von der gewünschten Konsistenz, unter Verwendung aseptischer/steriler Technik. Der Chirurg sollte auch die Wirkung der Rehydratisierung durch visuelle Inspektion überwachen, sowohl im Verlaufe der Rehydratisierung als auch während des Abschneidens und Zuschneidens des Transplantats. Implantation sollte auf solche Weise durchgeführt werden, daß die freien Kanten des Implantats sich nicht in Bereiche hinein erstrecken, wo die Möglichkeit der Adhäsion ein Problem darstellen könnte.
Absorbierbares oder nicht-absorbierbares Nahtmaterial, Kleber, etc. kann verwendet werden, um das Gewebe an Ort und Stelle zu fixieren. Für eine kontinuierliche Naht werden absorbierbares Nahtmaterial und runde atraumatische Nadeln empfohlen, während die Nahtgröße von der chirurgischen Indikation abhängt. Der Faden sollte zwei bis drei Millimeter von der Kante des Transplantats angesetzt werden. Bessere Ergebnisse werden erzielt durch Verdopplung des Abschnittes an den Nahtstellen, die unter mittlerer bis hoher Beanspruchung stehen.
Gewebe der vorliegenden Erfindung stellen eine Vielzahl von Vorteilen bereit, einschließlich der Tatsache, daß sie unmittelbar verfügbar für die Chirurgie sind und wertvolle Operationssaalzeit einsparen können. Überdies gibt es keine sekundäre chirurgische Stelle und weniger Stress für den Patienten, was zu weniger Zeit unter Anästhesie, keinem Spenderstellenschmerz oder Morbidität und weniger Kosten führen kann. Da die Gewebe in einem weiten Bereich von Größen verfügbar gemacht werden können, kann der Chirurg die benötigte Größe auswählen, was zu minimalem Abfall führt. Wie bei allen biologischen Produkten ist es nicht möglich, eine absolute Garantie für die Freiheit von kontaminierenden infektiösen Erkrankungen zu liefern, wie etwa Hepatits, Creutzfeld-Jacob-Krankheit (CJD) oder spongiformer Rinderenzephalopathie (BSE). Verarbeitungsbehandlungen, wie die Verwendung von NaOH in den Fällen von CJD und BSE, haben gezeigt, daß sie in der Lage sind, das Risiko jeglicher Übertragung zu verringern, und sind insbesondere nützlich in Kombination mit striktem Spenderscreening und Labortests. Behandelte Gewebe der vorliegenden Erfindung können in einer sauberen, trockenen Umgebung und bei kontrollierten Temperaturen zwischen 4°C und 30°C (59° bis 96°F) gelagert werden.
TESTVERFAHREN
Collagenase-Test
Die Enzymklasse, die als Collagenase bezeichnet wird, ist seit mehreren Jahren für die Untersuchung ihrer Wirkungen auf Collagen-Biomaterialien verwendet worden. Bakterielle Collagenase, z. B. aus Clostridium histolyticum, kann als ein genaues Vorhersageinstrument für die Wahrscheinlichkeit und Geschwindigkeit der Resorption eines Materials durch einen Säugerwirt verwendet werden (Yannas, I. V., et al., J. Biomed. Mater. Res., 9: 623–628; 1975). Da eine Modifikation von Collagen durch ein Vernetzugnsmittel zu stark verringerter Empfindlichkeit gegenüber der Wirkung von Collagenase führt, ist es wichtig, daß eine solche Modifikation nicht an Gewebe durchgeführt wird, das resorbiert werden soll. Der Mechanismus, durch den Vernetzung die Aktivität von Collagenase hindert, ist nicht vollständig verstanden. Überraschenderweise haben die Anmelder herausgefunden, daß bakterielle Collagenase tatsächlich in der Lage ist, behandelte (alkylierte) Gewebe der vorliegenden Erfindung abzubauen. Somit besitzt Gewebe, das mit einem Mittel wie etwa PO alkyliert worden ist, einschlägige und funktionelle Eigenschaften und der Collagenase-Test bleibt ein nützliches Instrument zur Bestätigung der Nützlichkeit von so behandeltem Gewebe.
Der Collagenase-Test ist ein Test auf Ninhydrin-Basis für das Anzeigen von löslichen Collagen-Peptiden, die durch die Wirkung des Collagenase-Enzyms erzeugt werden, und kann wie folgt durchgeführt werden:

1. Wiege Gewebe im Bereich von 25–30 Milligramm aus.
2. Gebe 3,0 Milliliter Collagenase-Lösung [0,01 mg/ml Collagenase-Enzym (Sigma, Typ 1A) in 50 mM N-Tris[hydroxymethyl]methyl-2-aminoethansulfonsäure("TES")-Puffer mit 25 mM Calciumchlorid, pH 7,4–7,5] zu.
3. Inkubiere bei 37°C für 24 bis 96 Stunden.
4. Inkubiere zu festgelegten Zeitpunkten 100 μl Collagenase-Lösung und 1,0 ml Ninhydrin-Lösung [ein Teil 4% (w/v) Ninhydrin in Ethylenglykolmonoethylether zu einem Teil 200 mM Zitronensäure, 0,16% (w/v) Zinn(II)-chlorid, pH 5,0] bei 95–100°C für 30 Minuten.
5. Kühle die Röhrchen auf Raumtemperatur ab.
6. Gebe 250 μl der Collagenase-Probe zu 1,0 ml 50% Isopropanol zu.
7. Verwirbele und lese Extinktion bei 570 nm ab.
8. Die Extinktion bei 570 nm wird geteilt durch das Gewicht des Gewebestücks, um die OD/mg zuergeben. Die OD/mg ist der Wert für die Menge an Collagen-Peptiden, die durch die Wirkung des Collagenase-Enzyms abgebaut worden ist.

Die Ergebnisse des Collagenase-Tests werden bestimmt durch Vergleichen der Probe mit sowohl positiven (nicht-behandelten) als auch negativen (mit Glutaraldehyd vernetzten) Kontrollproben.
Amin-Index
Der Amin-Index kann definiert werden als der Prozentanteil von anfänglich verfügbaren Aminen, die durch Reaktion mit Amin-Reagenzien modifiziert (und dadurch im wesentlichen in vivo nicht-reaktiv gemacht) worden sind. Eine solche Modifikation wird das Amin unfähig machen, "Ruhemann-Purpur" zu erzeugen, wenn es zu Ninhydrin zugegeben wird, und der relevante Test kann wie folgt durchgeführt werden:

1. 200 μl DI-Wasser wurden zu 25–30 Milligramm Gewebe zugegeben.
2. Gebe einen Milliliter Ninhydrid-Lösung zu jedem Röhrchen zu.
3. Inkubiere die Röhrchen bei 95–100°C für 30–35 Minuten.
4. Kühle die Röhrchen bei Raumtemperatur ab.
5. Gebe 250 μl Probe zu einem Milliliter 50% Isopropanol-Lösung zu.
6. Verwirbele und lese Extinktion bei 570 mm ab.
7. Der Amin-Index wird berechnet.

Um den Prozentanteil an ursprünglichen Aminen, die modifiziert sind, zu berechnen, wird die folgende Formel verwendet:
Die OD/mg wird gefunden durch Dividieren OD@570 durch das Gewicht des Gewebestücks.
Test zur Quantifizierung von nicht-umgesetzten Alkylierungsmittel
Der Zweck dieses Tests ist, zu bestätigen, daß, obgleich 100% Amin-Alkylierung typischerweise nicht erreicht werden, dies nicht auf dem Mangel an ausreichend Alkylierungsmittel beruht. Im wesentlichen wird dieser Test verwendet, um zu bestätigen, daß nachweisbare Gehalte an Alkylierungsmittel in der Inkubationslösung nach erschöpfender Einwirkung auf das Gewebe verbleiben. Nach Einwirkung eines Alkylierungsmittels auf Gewebe können Proben aus der Lösung des Mittels gezogen werden, um den verbleibenden Prozentanteil zu quantifizieren. Dieser Test wird teilweise zum Zwecke der Bestimmung der Effizienz der Alkylierung durchgeführt.
Die Quantifizierung wird unter Verwendung einer Standardkurve beurteilt.

1. 10 mM Glycin-Lösung wird hergestellt durch Zugabe von 0,0375 Gramm Glycin zu 50 Milliliter 0,2 M Carbonat(Na⁺²)-Puffer.
2. Propylenoxid(PO)-Standards werden hergestellt (z. B. im Bereich von 0,5% PO bis 5% PO). Die Standards werden hergestellt durch Zugabe der richtigen Menge PO zum Carbonat-Puffer für insgesamt 5 Milliliter.
3. Gebe 1 Milliliter der Glycin-Lösung zu markierten Teströhrchen zu.
4. Gebe 1 Milliliter von jedem PO-Standard zu dem markierten Teströhrchen zu.
5. Verwirbele, um zu mischen und reagieren zu lassen, für 24 Stunden bei Raumtemperatur.
6. Nach 24 Stunden wurden 50 μl von jedem Standard zu einem Milliliter Ninhydrin-Lösung zugegeben.
7. Inkubiere die Röhrchen bei 95–100°C für 30 Minuten.
8. Kühle die Röhrchen bei Raumtemperatur ab.
9. Gebe 250 μl Standard zu einem Milliliter 50% Isopropanol-Lösung zu.
10. Verwirbele und lese Extinktion bei 570 nm ab.

Die Proben, die unbekannte Propylenoxid-Konzentrationen enthalten, werden unter Verwendung der obigen Methode beurteilt. Nachdem die Propylenoxid-Standardkurve aufgetragen ist, können die Proben, die unbekannte Propylen-Konzentrationen enthalten, unter Verwendung der Standardkurve geschätzt werden.
Feuchtigkeitsgehalt
Der Feuchtigkeitsgehalt wurde analysiert auf einem Mettler-Toledo HG53 Halogen Moisture Analyzer. Eine Temperatureinstellung von 200°C wurde verwendet. Die Ergebnisse werden in % Feuchtigkeitsgehalt aufgezeichnet.
Denaturierungs(Schrumpfungs)-Temperatur
Die Denaturierungstemperatur ist die Temperatur, bei der das Collagen denaturiert. Der Test wurde durchgeführt auf dem Zugtestsystem ChemDyne MC 1000. Die Denaturisierungstemperatur wurde gemessen unter Verwendung einer 30-Gramm-Vorbelastung in einem Wasserbad bei stetig ansteigender Temperatur. Die Ergebnisse sind in °C ausgedrückt.
Die Erfindung wird weiter beschrieben werden unter Bezugnahme auf die folgenden nicht-beschränkenden Beispiele. Es wird für die Fachleute deutlich sein, daß viele Veränderungen in den beschriebenen Ausführungsformen vorgenommen werden können, ohne vom Schutzumfang der vorliegenden Erfindung abzuweichen. Somit sollte der Schutzumfang der vorliegenden Erfindung nicht durch die in dieser Anmeldung beschriebenen Ausführungsformen beschränkt werden, sondern nur durch Ausführungsformen, die durch die Sprache der Ansprüche beschrieben sind, und die Äquivalente dieser Ausführungsformen.
BEISPIEL 1
Rinder-Perikardsäcke wurden von vom USDA inspizierten, gesunden Kühen, Minimumalter von 12 Monaten, geerntet. Frisches Perikard wurde erhalten und durch eine Reihe von Spülungen geschickt, gefolgt von einer abschließenden eiskalten Wasserspülung. Das Gewebe wurde von Fremdgewebe gereinigt und frisch verwendet oder bei –20°C gelagert. Folgende allgemeine Verfahren wurden verwendet, um behandeltes Gewebe gemäß der vorliegenden Erfindung herzustellen. Alle Testverfahren werden durchgeführt bei 20–25°C.
NaOH & Neutralisation

1. Wiege 40–45 Gramm Rinderperikard ab.
2. Gebe das Perikard für 60–65 Minuten in einen Liter 1,0 M NaOH (40 Gramm NaOH in einem Liter DI-Wasser). Nehme eine Probe zur pH-Messung am Ende des Einweichens.
3. Dekantiere NaOH; drücke das Gewebe vorsichtig aus und gebe es für 15–20 Minuten in zwei Liter DI-Wasser.
4. Dekantiere DI-Wasser und gebe das Gewebe) für 60–65 Minuten in zwei Liter Zitrat-Puffer (28 Gramm Natriumzitrat und 2,0 Gramm Zitronensäure in zwei Litern DI-Wasser. Nehme eine Probe zur pH-Messung am Ende des Einweichens.
5. Dekantiere Zitrat-Puffer, drücke das Gewebe vorsichtig aus und gebe das Gewebe für 30– 35 Minuten in weitere zwei Liter DI-Wasser.

Alkylierung des Gewebes

1. Stelle 5% Propylenoxid-Lösung her (50 Milliliter Propylenoxid in 950 Milliliter 0,2 M Carbonat-Puffer, pH 10,5–10,6).
2. Gebe das mit NaOH behandelte Gewebe in Propylenoxid-Lösung.
3. Vermische auf einem Plattfomrüttler für 72–96 Stunden.
4. Entferne das Gewebe aus der Lösung und gebe es für 24 Stunden in 1,5 Liter DI-Wasser.

Nach Hydroxypropylierung des Gewebes werden die Tests zum Amin-Index und zur Quantifizierung von nicht-umgesetzten Alkylierungsmittel durchgeführt, um ausreichende Alkylierung und PO zu verifizieren. Das Gewebe wurde auf Drahtgittergestelle überführt und in einem Vakuumtrockner Virtis Genesis bei 115 mtorr getrocknet.
ERGEBNISSE
TABELLE 1
Collagenase-Aktivität
Die Tabelle unten liefert die Ergebnisse eines Collagenase-Tests, wenn resorbierbares Gewebe, hergestellt in der hierin beschriebenen Art und Weise, für 24–96 Stunden in 0,01 mg/ml Collagenase inkubiert wurde.
TABELLE 1
OD/mg ist der relative Wert für die Collagen-Menge, die durch die Wirkung des Collagenase-Enzyms abgebaut worden ist. Man kann sehen, daß jedes der Gewebe, einschließlich des alkylierten Gewebes dieser Erfindung, empfindlich ist gegenüber Collagenase-Verdauung, was auf die Wahrscheinlichkeit hindeutet, daß sie resorbiert werden würden.
TABELLE 2 – pH-Abhängigkeit
Die folgende Tabelle liefert die Amin-Index-Ergebnisse von mit NaOH/PO behandeltem Gewebe, wenn inkubiert in einer 5% PO-Lösung bei zwei unterschiedlichen pHs.
Man kann sehen, daß, unter den involvierten experimentellen Umständen, das Ausmaß der Alkylierung bei höherem pH erhöht werden konnte.
TABELLE 3 – Zeitabhängigkeit
Die folgende Tabelle liefert die Amin-Index-Ergebnisse von mit NaOH/PO behandeltem Gewebe, wenn inkubiert in einer 5% PO-Lösung für einen Zeitraum bei einem pH von 10,5.
Man kann, daß es einen geringfügigen Anstieg der Alkylierung gibt, sogar im Zeitraum von 72 bis 96 Stunden Inkubation.
TABELLE 4 – Test, um nicht-umgesetztes Alkylierungsmittel zu quantifizieren
Die Tabelle unten ist ein Beispiel einer Standardkurve aus dem Test auf nicht-umgesetztes Alkylierungsmittel.
Wenn die Daten oben aufgetragen werden, liefern sie eine Standardkurve, und in einer typischen Herstellung kann abgeschätzt werden, daß unter den experimentellen Bedingungen dieses Beispiels zwischen 0,4 und 0,5% Propylenoxid nicht-umgesetzt in der Alkylierungs-Lösung zurückbleiben.
TABELLE 5 – Feuchtigkeitsgehalt
Die Tabelle unten zeigt, wie der Feuchtigkeitsgehalt dazu neigt anzusteigen, wenn das Gewebe durch den Alkylierungsprozeß geht (zwischen 72–96 Stunden).

Gewebe Feuchtigkeitsgehalt (%)

unbehandelt 78,35

NaOH 87,33

NaOH/PO 89,28
TABELLE 6 – Denaturierungstemperatur
Die Tabelle unten gibt die Art und Weise wieder, in der die Denaturierungs(Schrumpfungs)-Temperatur dazu neigt abzunehmen, wenn das Gewebe durch den Alkylierungsprozeß geht.

Gewebe Denaturierungstemperatur

unbehandelt 65,1°C

NaOH 62,4°C

NaOH/PO 49,2°C
BEISPIEL 2
In-Vivo-Biokompatibilitäts- und -Biostabilitäts-Studie von mit PO abgedecktem Rinder-Perikard
In dieser Studie wurde mit Propylenoxid (PO) abgedecktes, nicht-vernetztes Rinder-Perikard mit mit Glutaraldehyd (GA) vernetztem Rinder-Perikard in einem subkutanen Tiermodell im Hinblick auf Entzündung, Veränderungen der physikalischen Eigenschaften und Umformung von Implantatmatrix mit dem Wirtsgewebe verglichen.
Herstellung von mit PO behandeltem Gewebe
Patches (ungefähr 4 cm × 6 cm) aus frischem Rinder-Perikard wurden zunächst in 1 N NaOH für eine Stunde behandelt, gefolgt von 2- bis 3-maligem Untertauchen in 4 l 50 mM Zitrat-Puffer für 1 Stunde. Das mit NaOH behandelte Gewebe wurde anschließend in große Teströhrchen gegeben, die 100 ml 0,2 M NaHCO₃-Puffer bei pH 10,5 und 2% Propylenoxid enthielten. Die Röhrchen wurden für 48 Stunden bei Raumtemperatur auf einem automatischen Rüttler vorsichtig gerüttelt. Das Gewebe wurde mit Salzlösung bis zu einem pH-Niveau von 6,5 bis 7,5 gründlich gewaschen und anschließend in 70% Ethanol aufbewahrt.
Herstellung von mit GA vernetztem Gewebe
Patches aus mit Glutaraldehyd (GA) vernetztem Rinder-Perikard sind kommerziell erhältlich unter dem Markennamen "Peri-Guard", einschließlich Supple Peri-Guard^® und wurden erhalten von Bio-Vascular, Inc., St. Paul, MN.
Sterilisation
Die feuchten Gewebepatches wurden zu einer Probengröße von 1 cm × 2 cm zugeschnitten. Die Proben wurden flach auf eine Kunststoffhülle (jeweils vier) gelegt und durch Falten der Plastikhülle drumherum eingeschlossen. Die umhüllten Proben wurden in Pouches aus Kunststoff/Aluminiumfolie gegeben, die anschließend mit Argon-Gas gespült und hitzeversiegelt wurden. Die Pouches wurden zur Sterilisation durch Elektronenstrahl-Bestrahlung bei 25 ± 2.5 KGy weitergeleitet.
Implantation
Die Tiere waren 3 Monate alte, männliche Fisher-344-Ratten. Jedes Tier erhielt zwei Implantate aus unterschiedlichem Material. Bei den chirurgischen Eingriffen wurden die Tiere mit Pentobarbital (5 mg/100 g) anästhesiert und die oberen Rücken wurden rasiert und mit Butadien-Lösung gewaschen. Ein Einschnitt von 2 cm wurde über der Mittellinie auf dem Rücken des Tieres angebracht. Die subkutanen Gewebeflächen wurden lateral seziert, um auf der linken und der rechten Seite des Rückens eine Tasche zu bilden. In jede Tasche wurde eine Probe eingeführt und flach ausgebreitet. Die Wunden wurden mit chirurgischen Nähten verschlossen und mit Butadien gewaschen. Die Tiere wurden nach Erholung von der Anästhesie in ihre Käfige zurückgebracht.
Explantation
4 und 12 Wochen nach der Implantation wurden die Tiere durch Kohlendioxid-Inhalation geopfert. Die Proben wurden zusammen mit dem umgebenden anhängenden Gewebe wiedergewonnen. Die wiedergewonnenen Proben wurden in 3 Stücke geschnitten. Ein Stück wurde in Salzlösung mit 0,3% Natriumazid aufbewahrt und für einen Fadenretentionstest verwendet, das zweite in Bouin-Fixativen fixiert und zur Einbettung, Schnittherstellung und Hematoxylin- und Eosin("H & E")-Anfärbung weitergeleitet und das dritte Stück eingefroren aufbewahrt und für enzymatische Verdauungstests verwendet.
Fadenretentionsmessung
Ein Fadenretentionstest, der die Kraft bestimmt, die notwendig ist, um eine Fadenschlaufe aus der Prothese zu ziehen, wurde auf dem Zugtestsystem ChemDyne MC 1000 (Columbia Labs, Inc.) durchgeführt. Ein 5-0-Prolen-Faden wurde durch das Gewebe gelegt mit einer 2 mm Okklusion unter der Kante des Gewebes. Die Fadenschlaufe wurde mit einer Geschwindigkeit von 100 mm/min mit einer Probennahmerate von 20 Hz gezogen.
Enzymatische Verdauungstests
Die Gewebeproben wurden in 1,0 ml einer 40 U/ml Collagenase (Worthington, Biochem Corp.) bzw. 1,0 ml 0,05% Trypsin/EDTA-Lösung eingetaucht. Die Proben wurden für 12 Stunden bei 37°C inkubiert und visuell auf Gewebeintegrität bewertet.
Ergebnisse
Fadenretention
Während mit GA vernetztes Rinder-Perikard seine Fadenretentionseigenschaften während des gesamten Implantationszeitraums (bis zu 12 Wochen nach E-Strahl-Sterilisation) im wesentlichen beibehielt, gab es beträchtliche Veränderungen in dem mit PO abgedeckten Gewebe im Anschluß an E-Strahl-Sterilisation sowie Implantation (Tabelle 7). Es scheint, daß E-Strahl-Bestrahlung die Fadenretention von mit PO abgedecktem Gewebe um etwa 60% verringerte. Die Fadenretention wurde weiter verringert während des Implantationszeitraums.
Es ist jedoch interessant, daß die Fadenretention von mit PO abgedecktem Gewebe mit der Zeit anzusteigen schien, nachdem sie das niedrigste Niveau 4 Wochen nach Implantation erreicht hatte.
TABELLE 7 Fadenretentionskraft (g) von Gewebeproben vor und nach E-Strahl-Sterilisation und Implantation in Ratten
Enzymatische Verdauung
GA-Vernetzung machte Rinder-Perikard beständig gegenüber Collagenase und/oder Trypsin vor und nach Implantation (bis zu 12 Wochen). Das mit PO abgedeckte Rinder-Perikard wurde jedoch vor der Implantation leicht durch Collagenase sowie Trypsin verdaut. Da Rinder-Perikard hauptsächlich aus Collagen besteht, das in seinem natürlichen Zustand (d. h. nicht-vernetzt) durch Collagenase, aber nicht durch Trypsin verdaut werden kann, ist es interessant, daß das Gewebe nach PO-Abdeckung gegen Trypsin empfindlich wird. Im Anschluß an die Implantation waren die mit PO abgedeckten Proben nach 4 Wochen vollständig verdaubar durch Trypsin, aber teilweise nach 12 Wochen. Es ist möglich, daß sich neues Collagen in den Proben in späteren Stadien der Implantation bildete.
Histologische Bewertung
Die Objektträger für die Histologie (H & E-Anfärbung) wurden unter einem optischen Mikroskop bewertet und in eine Skala von 1 bis 4 eingeordnet (Tabelle 7). 4 Wochen nach Implantation induzierten die mit GA vernetzten Proben ein leichtes bis mittleres Niveau einer entzündlichen Reaktion, die gekennzeichnet war durch beträchtliche Mengen an polymorphonukleären Leukocyten (PMNs), Makrophagen und Fremdkörper-Riesenzellen sowie Lymphocyten, die hauptsächlich in den Außenflächen des Implantats zu finden waren. Im Vergleich wurde sehr milde oder keine Reaktion für die mit PO abgedeckten Proben gefunden, die sauber aussahen mit sehr wenigen vorhandenen Entzündungszellen. Fasereinkapselung war evident um die Implantate aus mit GA vernetztem Gewebe, aber fast nicht nachweisbar in mit PO abgedeckten Proben. Collagenfaserstruktur der mit GA vernetzten Gewebematrix war unverändert, während die Gewebematrix von mit PO abgedeckten Implantaten delaminert und locker erschien.
12 Wochen nach Implantation gab es, obgleich die Entzündungsreaktion auf das mit GA vernetzte Gewebe ähnlich zu derjenigen nach 4 Wochen war, mit geringer Veränderung der physischen Integrität, merkbare Veränderungen in den mit PO behandelten Proben. Es gab mehr zelluläre Infiltrate (insbesondere Fibroblasten) um das mit PO behandelte Gewebe herum sowie darin. Die mit PO abgedeckte Gewebematrix wurde gleichförmig und anisotrop ohne wellenförmige Faserstruktur, wie beobachtet in regulärem Rinder-Perikard. In einigen Bereichen unter einer dünnen Faserkapsel ähnelte die Gewebematrix den Charakteristika von sich entwickelndem Granulationsgewebe mit Fibroblasten, Neocollagen und Makrophagen.
TABELLE 7 Mikroskopische Bewertung (Skala von 1 bis 4) von Explantaten nach 4 und 12 Wochen
Als Schlußfolgerung induzierte das mit PO abgedeckte, nicht-vernetzte Rinder-Perikard, verglichen mit dem mit GA vernetztem Rinder-Perikard, weniger Entzündung, wie angezeigt durch weniger Enzündungszellen (wie etwa PMNs und Makrophagen), die 4 und 12 Wochen nach Implantation vorhanden waren. Während das mit GA vernetzte Gewebe den Großteil seiner physischen und strukturellen Integrität während des gesamten Implantationszeitraumes beibehielt, schien das mit PO abgedeckte Gewebe signifikante Veränderungen während der Implantation zu durchlaufen. Im Anschluß an die Implantation wurde das mit PO abgedeckte Gewebe innerhalb der ersten paar Wochen teilweise abgebaut, was zu Verringerungen der Fadenretention führte. Es ist jedoch interessant, daß das Material, statt vollständig im Körper absorbiert zu werden, über die Zeit mit neuem Wirtsgewebe umgeformt zu werden schien und mit zunehmender Fadenretention stärker wurde. Neue Collagenbildung trat wahrscheinlich in dem Umformungsprozeß auf, wie angezeigt durch Fibroblasten-Proliferation und erhöhte Beständigkeit der Explantate gegenüber Trypsin-Verdauung nach 12 Wochen. Die histologische Untersuchung zeigte, daß in späteren Stadien (z. B. 12 Wochen) der Implantation die Matrix des mit PO abgedeckten Rinder-Perikards dem Granulationsgewebe zu ähneln begann, das der spezialisierte Gewebetyp ist, der indikativ ist für einen normalen Heilungsprozeß.

Claims

Resorbierbares, umformbares Implantatmaterial, das ein steriles, nicht-vernetztes, dezellularisiertes und gereinigtes Säugergewebe umfaßt, in dem ein größerer Prozentanteil seiner verfügbaren Amingruppen alkyliert ist.
Material nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Gewebe ausgewählt ist aus der Gruppe, die aus serösen und fibrinös-serösen Membranen besteht.
Material nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Gewebe ausgewählt ist aus der Gruppe, die aus Perikard, Peritoneum, Fascia lata, Dura mater, Dermis und Dünndarm-Submukosa besteht.
Material nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß das Gewebe Rinder-Perikard umfaßt.
Material nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Material mit einem Alkylierungsmittel alkyliert worden ist, das ausgewählt ist aus der Gruppe, die aus 1,2-Epoxy-R-Verbindungen besteht, worin R eine Alkylgruppe mit bis zu 6 Kohlenstoffatomen ist.
Material nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß das Alkylierungsmittel Propylenoxid ist.
Material nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Alkylierungsmittel Methylglycidylether ist.
Material nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Material in der Form flacher oder texturierter Folien oder Streifen bereitgestellt ist.
Material nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Material angepaßt ist zur Verwendung in einer chirurgischen Anwendung, die ausgewählt ist aus der Gruppe, die aus Duraplastik, Brust-, Bauch-, Harntrakt-, Augen-, Herz- und Gefäß-Chirurgie besteht.
Verfahren zur Herstellung eines resorbierbaren, umformbaren Implantatmaterials nach Anspruch 1, wobei das Verfahren den Schritt umfaßt, daß ein biologisches Gewebe mit einem Alkylierungsmittel unter Bedingungen behandelt wird, die geeignet sind, um einen größeren Prozentanteil verfügbarer Amingruppen im Gewebe zu alkylieren, und das behandelte Gewebe zur Verwendung in vivo sterilisiert wird.
Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß das gereinigte Gewebe vor dem Alkylierungsschritt mit einer Base behandelt wird.
Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß das Alkylierungsmittel bei einem pH von zwischen etwa 9 und etwa 11 verwendet wird.
Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß die Konzentration des Alkylierungsmittels zwischen etwa 2% (v/v) und etwa 5% (v/v) liegt.
Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß das Gewebe dem Alkylierungsmittel für wenigstens 48 Stunden ausgesetzt wird.