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Die
vorliegende Erfindung bezieht sich auf eine Aufbewahrungsflüssigkeit
für die
in vitro-Konservierung ohne Gefrieren einer Tierzelle oder eines Tierorgans
und auf ein Konservierungsverfahren, wobei das Aufbewahrungsmittel
auf Tierzelle, innere Organe zur Transplantation, Korpuskel oder
Blutthrombozyten, als Proteinstabilisator angewendet wird und das
Aufbewahrungsmittel eine Organschädigung, die bei einer Organtransplantationsoperation
verursacht wird, verhindert, behandelt und verbessert.
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Als
normales Verfahren der Zellaufbewahrung wird ein Konservierungsverfahren
durch Gefrieren bei sehr niedriger Temperatur von –196°C angewendet;
die ursprüngliche
Zelle wird durch schnelles Auftauen der gefrorenen Zelle bei Bedarf
erhalten. Allerdings sind die Überlebensverhältnisse
von Zellen nach Tauen und Fusion niedrig, was von der Art der Zelle
und dem Fachwissen des Prüfers
abhängt, während die
von normalen und einsetzbaren Zellen, z. B. Langerhans-Inseln und Leberzellen,
ausgenommen Krebszellen, etwa 10 bis 30% betragen.
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Darüber hinaus
ist im Fall von Blut, Korpuskeln oder Blutthrombozyten der Validitätszeitraum
mit 12 bis 72 Stunden infolge der Unmöglichkeit des Konservierens
durch Gefrieren sehr kurz. Trotz der Tatsache, dass in jüngerer Zeit
die Transplantation von inneren Organen zunimmt, stellt das Konservierungsverfahren
für Transplantatorgane
für den
Forscher immer noch ein ernstes Thema dar. Diese Probleme sind stark
mit einer Zellschädigung
und Gewebeverletzung verbunden.
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Als
Resultat einer Weiterentwicklung in der Chirurgie und bei den immunsuppressiven
Mitteln nehmen die Fälle
der Transplantation eines inneren Organs in jüngerer Zeit zu.
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Bei
einer idealen Transplantation wird das innere Organ, das aus dem
Spender entfernt wurde, unverzüglich
dem Empfänger
transplantiert, allerdings erfolgen in vielen Fällen Transplantationsoperationen
nicht unverzüglich.
Es ist sehr wichtig, ein wertvolles Organ zur Transplantation zu
konservieren, da die Operation sehr dringend ist. Für ein inneres
Organ gibt es zwei Arten von Konservierungsverfahren, wobei das
Konservierungsverfahren bei niedriger Temperatur einerseits den
Metabolismus reduzieren soll, während
andererseits ein Perfusions-Konservierungsverfahren den Metabolismus aufrechterhalten
soll. Es wurden viele Arten von Aufbewahrungsmitteln zur Anwendung
in diesen Verfahren entwickelt und klinisch eingesetzt.
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Euro-Collin-Lösung wurde
in der frühen
Stufe der Transplantation verwendet; sie hat einen Validitätszeitraum
von weniger als 24 Stunden im Fall einer Leber und es wird erwartet,
dass sie den Validitätszeitraum
verlängert.
Kürzlich
wurde von der Group of University of Wisconsin (University of Wisconsin,
Wahlberg, J. A. et al., Transplantation, 43, S. 5–8, 1987)
eine UW-Lösung
entwickelt und als Aufbewahrungsmittel bei einer Pankreas-Transplantation
angewendet. Diese Lösung
ist als Aufbewahrungsmittel nicht nur bei einer Pankreas-Transplantation,
sondern auch bei Leber- und Nierentransplantation einsetzbar und
der Validitätszeitraum
der Leber wurde möglicherweise
auf 24 Stunden verlängert.
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Selbst
wenn diese Lösungen
noch nicht zufrieden stellend sind, so wird die Entwicklung und
Erfindung einer neuen Lösung
erwartet um die Lebensfähigkeit
und die Wirksamkeit von inneren Organen für lange Zeit zu konservieren.
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Allgemein
gilt für
alle Arten innerer Organe, dass eine Funktionsschädigung eines
transplantierten Organs erfolgt, die auf der Ursache beruht, dass freie
Radikale, die bei Ischämie
oder Wiederaufnahme des Blutflusses erzeugt wer den, eine prompte
Lipidperoxidation biologischer Membran verursachen. Wenn daher eine
Zellschädigung,
die auf Erzeugung von Lipidperoxidation beruht, verhindert werden kann,
ist es möglich,
ein neues wirksames Aufbewahrungsmittel zu entwickeln.
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Diese
Probleme stehen in starker Verbindung zur Proliferation und Teilung
der Zellen. Daher scheint es eine große Möglichkeit zur Lösung der Aufgabe
zu sein, wenn Proliferation und Teilung der Zellen frei kontrolliert
werden können.
Die Schädigung
von Zellen oder Organen steht mit aktivem Sauerstoff (O– 2) in Verbindung, der erhalten wird, wenn Hypoxanthin,
das aus Adenosintriphosphat (ATP) umgewandelt wird, in Zellmitochondrien
in Xanthin übergeht.
Das äußerst ernste
Problem, das aus den Schädigungen
entsteht, ist das Auftreten von Krebs, wobei die Krebsbildung aus
zwei Stufen der Karzinogenese-Initiierung und -Begünstigung
zu bestehen scheint. In der Stufe der Karzinogenese-Initiierung wirken
verschiedene karzinogener Substanzen auf die Zell-DNA ein, eine
Mutation kann erfolgen und normale Organe werden durch unbegrenzte
Amplifikation der Zelle karzinös.
Der aktive Sauerstoff wirkt bei der Mutation mit und verursacht
eine Alterung und verschiedene Störungen durch Superperoxid,
das aus dem Sauerstoff gebildet wird.
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In
jüngerer
Zeit gibt es viele Berichte, die die Wirksamkeit von freien Radikale
auf ein lebendes Organ und den Mechanismus eines Antioxidationsmittels
betreffen. Als Beispiele für
gut bekannte Antioxidationsmittel wird Superoxiddismutase (SOD)
als Enzymtyp angeführt,
während
Vitamin E und C, Glutathion, Carotinoid, Flavonoid, Saccharid, Eisenchelat, Harnsäure und
Albumin als Nicht-Enzymtyp
genannt werden.
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EP 0 845 264 offenbart die
Verwendung von Polyphenolen, die aus Camellia sinensis extrahiert worden
sind, bei der Konservierung von Zellaggregaten um so den Tod oder
die Atrophie der Zellen im Aggregat zu verhindern oder zu verringern.
FR 2 652 132 offenbart eine Beurteilung der Antioxidans-Wirkung
verschiedener Polyphenolverbindungen einschließlich Katechinen. Unter Fluoreszenzlicht
und in Gegenwart von Lichtsensibilisatoren wird der Antioxidanseffekt
der Polyphenolverbindungen zum Einfangen von aktivem Sauerstoff,
um so Bluterythrozyten in einer wässrigen Suspension zu schützen, beurteilt.
DATABASE BIOSIS [Online] BIOSCIENCES INFORMATION SERVICE, PHILADELPHIA,
PA, US; 1994 KNIGHT JOSEPH A ET AL: "The effects of various antioxidants
on lipid peroxidation in stored whole blood" Datenbank-Zugangsnummer PREV199497399169 & ANNALS OF CLINICAL
AND LABORATORY SCIENCE, Bd. 4, Nr. 4, 1994, Seiten 294–301, ISSN;
0091-7370 schlägt
die Wirkung von Quercitin zur Aufbewahrung von Arytrozyten vor. JOURNAL
OF AGRICULTURAL AND FOOD CHEMISTRY, Bd. 46, Nr. 6, Juni 1998, Seiten
2143–2150, ISSN:
0021-8561 beschreibt in vitro- und in vivo-Studien über die
Radikaleinfangwirkung von Tee.
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Es
gibt keine Berichte bezüglich
der Proliferationskontrolle von Zellen und der Konservierung von
Gewebe und inneren Organen. Allerdings wurde kürzlich berichtet, dass Polyphenol
aus grünem
Tee Antioxidationswirkungen, Desodorierungswirkung, antibakterielle
Wirkung und Wirkung gegen Krebs zeigt; es wird billig und in großen Mengen
als Material von funktionellen Lebensmitteln hergestellt.
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Die
vorliegende Erfindung bezieht sich auf die Verwendung einer wässrigen
Aufbewahrungsflüssigkeit,
umfassend
- a) 0,1 bis 50 Gew.-% Polyphenol,
wobei das Polyphenol Katechine, ausgewählt aus Epigallokatechingallat,
Gerbsäure,
Proanto-Dianisidin, Resorcin, Hydrochinon, Pyrogallol, Phloroglucin,
Eugenol und Quercetin, als Hauptbestandteil umfasst, und
- b) eine Aufbewahrungsflüssigkeit,
ausgewählt aus
der Gruppe bestehend aus Euro-Collin-Lösung, UW-Lösung, Serum und Antibiotikum-Lösung, für die in
vitro-Konservierung ohne Gefrieren einer Tier- oder Menschenzelle,
eines Tier- oder
Menschengewebes oder -Organs zur Transplantation.
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Das
Polyphenol umfasst Katechine, ausgewählt aus Epigallokatechingallat,
Gerbsäure
oder Proanto-Dianisidin, Resorcin, Hydrochinon, Pyrogallol, Phloroglucin,
Eugenol und Quercitin, als Hauptbestandteil, wobei die Tierzelle
eine Stammzelle, eine Hautzelle, eine Mucosazelle, ein Hepatozyt, eine
Inselzelle, eine Nervenzelle, eine Knorpelzelle, eine Endothelialzelle,
eine epidermale Zelle, ein Osteozyt oder eine Muskelzelle, isoliert
aus einem menschlichen oder tierischen Organismen, oder Sperma,
Ei oder befruchtetem Ei von Haustieren oder Fischen, ist und wobei
das Organ Haut, Blutgefäß, Cornea,
Niere, Herz, Leber, Nabelschnur, Darm, Nerven, Lunge, Plazenta oder
Pankreas umfasst.
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Das
Aufbewahrungsmittel kann einen Proteinstabilisator herstellen, indem
das Polyphenol zu einem Aufbewahrungsmittel des Proteintyps gegeben wird,
kann die Rolle des Aufbewahrungsmittels spielen, indem das Polyphenol
zu Blut, Korpuskeln oder Blutthrombozyten gegeben wird und eine
Organschädigung
verhindern, behandeln und verbessern, die durch eine Organtransplantationsoperation
verursacht worden ist, indem das Polyphenol zu dem Organkonservierungsmittel
gegeben wird.
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Ein
Konservierungsverfahren für
eine Tierzelle, Tiergewebe und für
Organe, wird als Aufbewahrungsmittel für eine Organtransplantationsoperation
verwendet.
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Erfindungsgemäß ist es
möglich,
den Proliferationsmechanismus einer Tierzelle zu klären, ein neues
Aufbewahrungsmittel für
viele Arten innerer Organe und für
die Blutlagerung zu erfinden und zu entwickeln, die Validitätszeit auf
das zweifache im Vergleich zu üblichen
zu verlängern
und die Proteinstabilisierung zu verbessern.
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Konkret
ist es möglich,
normale und nützliche
Zellen über
einen langen Zeitraum ohne Gefrieren zu konservieren und die Zellproliferation
und -teilung frei zu kontrollieren, indem freie Radikale kontrolliert
werden, die in großem
Umfang mit der Zellproliferation und -teilung in Verbindung stehen.
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Die
vorliegende Erfindung stellt die Verwendung einer wässrigen
Aufbewahrungsflüssigkeit
für ein
inneres Organ oder Gewebe zur Transplantation bereit, die auf dem
Gebiet der Zell- oder Gewebeentwicklung verwendet wird und Polyphenol
als wirksame Komponente enthält.
Außerdem
wird ein Konservierungsverfahren für eine Tierzelle oder ein Tierorgan
vorgeschlagen, wobei das Aufbewahrungsmittel für eine Organtransplantationsoperation
verwendet wird.
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Das
Polyphenol der vorliegenden Erfindung umfasst Katechine als Hauptkomponente
der Polyphenole von grünem
Tee, einschließlich
Epigallokatechingallat, Gerbsäure,
Proanto-Dianisidin,
Resorcin, Hydrochinon, Pyrogallol, Phloroglucin, Eugenol und Quercitin.
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Unter
den Polyphenolen sind Katechine besonders vorteilhaft; diese umfassen
3,3,4,5,7-Flavopentanol-Epigallokatechingallat, Katecholamin, Noradrenalin,
Adrenalin und Dopamin mit der Gerüststruktur von 3,4-Dihydroxyamin
und Katechine, die aus Epigallokatechingallat bestehen, sind als
Hauptkomponente vorteilhafter.
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Das
Polyphenol als wirksame Komponente der vorliegenden Erfindung ist
reichlich in üblichen Getränken, z.
B. Tee, grüner
Tee und Wein, enthalten. Das Polyphenol von grünem Tee z. B. ist löslich und
wird in Wasser und organischen Lösungsmitteln, z.
B. Ethanol oder Ethylacetat, gereinigt und besteht aus Katechinen,
die Epigallokatechingallat (EGCg) als Hauptkomponente haben.
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Als
weiteres vorteilhaftes Polyphenol wird Gerbsäure angegeben, die als Polyhydroxyalkoholverbindung
definiert ist und durch Hydrolysieren Gallat bildet. So besteht
die sogenannte offizinelle Gerbsäure
aus einer Anordnung von acht Gallatgruppen, die eine D-Glucosegruppe
in der gleichen Ebene umgeben und in der zwei Gallatgruppen vertikal
angeordnet sind. Ein Zentrum der Verbindung kann nicht nur durch
D-Glucose besetzt sein, sondern auch durch Celluloseverbindungen
oder Didebrisidgallat, das durch Hydrolyse von Gerbsäure erhalten
wird.
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Als
weiteres mögliches
bevorzugtes Polyphenol wird Proanto-Dianisidin angegeben, das eine unbekannte
Struktur hat, aber aus Weintraubenkernen extrahiert, gereinigt und
isoliert werden kann, da diese eine Menge davon enthalten.
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Wir
können
Antioxidationsmittel unter anderen Verbindungen nennen, die ähnliche
Wirkungen wie Polyphenol haben, wobei Superoxiddismutase (SOD) als
Enzymtyp dargelegt wird, während
Vitamin E und C, Glutathion, Carotinoid, Flavonoid, Saccharin, Eisenchelat,
Harnsäure
und Albumin als solche vom Nicht-Enzymtyp genannt werden.
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Das
bevorzugte Verfahren in der vorliegenden Erfindung umfasst Zusetzen
eines Konservierungsmittels, das aus den Polyphenolen besteht, als aktives
Ingredienz zu verschiedenen Arten bekannter Kulturmedien oder Aufbewahrungsmittel
für Transplantationsorgane.
Die oben bekannten Mittel umfassen Euro-Collin-Lösung (Squifflet, J. P. et al.,
Transplant Proc., 13, 693, 1981) oder UW-Lösung.
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Die
Reinheit von erfindungsgemäßem Polyphenol,
das möglicherweise
verwendet wird, liegt bei üblichen
Produkten bei einer Reinheit von mehr als 60 Gew.-%, bevorzugter
ist ein gereinigtes Polyphenol mit einer Reinheit von mehr als 80
Gew.-% für Kulturmedien
oder Aufbewahrungsmittel, obgleich Produkte mit einer Reinheit von über 60 Gew.-%
auf dem Markt leicht erhalten werden können. Es gilt, je weiter gereinigt,
desto wirksamer ist das Mittel. Allerdings sind die wirksamen Komponenten,
die als Aufbewahrungsmittel der vorliegenden Erfindung enthalten
sind, ungeachtet der Polyphenolreinheit wirksam.
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Polyphenole
mit möglicherweise
0,1 bis 50 oder vorzugsweise 1 bis 30 Gew.-% werden den obigen bekannten
Kulturmedien oder Aufbewahrungsmitteln für Transplantationsorgane zugesetzt,
wenn das Aufbewahrungsmittel, das in der vorliegenden Erfindung
beschrieben wird, zur Konservierung der Tierzellen und -organe angewendet
wird.
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Die
Polyphenole mit möglicherweise
0,1 bis 50 oder vorzugsweise 1 bis 30 Gew.-% werden ferner der obigen
Euro-Collin-Lösung oder
UW-Lösung
zugesetzt, die bereits für
Transplantationsorgane klinisch eingesetzt wurde, wenn das in der
vorliegenden Erfindung beschriebene Aufbewahrungsmittel als Konservierungsmittel
für transplantierbare
Gewebe angewendet wird.
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Als
weiteres Beispiel werden die Polyphenole mit 0,1 bis 50 Gew.-% außerdem früher oder
später zu
einer Lösung
von Glucose oder Phosphat, die auf dem Markt ist, oder zu einer
Lösung
von Polyoxyethylen oder einem nichtionischen grenzflächenaktiven
Mittel, das als Aufbewahrungsmittel zugesetzt wird, gegeben, wenn
das in der vorliegenden Erfindung beschriebene Aufbewahrungsmittel
zur Konservierung des Bluts, von Korpuskeln oder Blutthrombozyten
angewendet wird.
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Ferner
werden die Polyphenole mit 0,1 bis 50 Gew.-% außerdem einer Aufbewahrungslösung, der vorher
ein handelsüblicher
Fettsäureester
zugesetzt wurde, zugesetzt oder mögli cherweise der Lösung anstelle
des Fettsäureesters
zugesetzt, wenn das in der vorliegenden Erfindung beschriebene Aufbewahrungsmittel
zur Proteinstabilisierung angewendet wird.
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Außerdem wird
das Polyphenol mit 0,1 bis 50 Gew.-% möglicherweise zu einer Aufbewahrungsflüssigkeit,
die bereits auf dem Markt ist, gegeben um eine Organschädigung,
die bei einer Organtransplantationsoperation verursacht wurde, als
Organaufbewahrungsmittel nach Transplantieren eines inneren Organs
zu verhindern, behandeln und zu verbessern. Ein Dosierungsverfahren
für das
Aufbewahrungsmittel umfasst übliche
Verfahren, wie z. B. intravenöse Injektion,
Mundhöhle,
Nasenhöhle,
Suppositorium oder Endermismus; und sein Volumen hat keine Begrenzung,
was vom Symptom oder dem Alter des Patienten abhängt. Die bekannten Antioxidationsmittel, wie
Superoxiddismutase (SOD), Vitamin E und C und Glutathion werden
möglicherweise
außerdem
den obigen erfindungsgemäßen Kulturmedien
oder Aufbewahrungsmitteln für
Transplantatorgane zugesetzt.
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Die
erfindungsgemäß verwendete
Aufbewahrungsflüssigkeit
wird vorzugsweise bei einer Temperatur von 0 bis 37°C angewendet;
dies stellt eine relativ erhöhte
Temperatur dar und es besteht keine Notwendigkeit des Gefrierens,
wenn man mit üblichen
Mitteln auf dem Markt vergleicht, es hat einen relativ längeren Lagerungszeitraum
und ist bei der Transplantatoperation innerer Organe überlegen.
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Die
Zelle, wie sie in der vorliegenden Erfindung definiert ist, besteht
aus einer Tierzelle einschließlich
einer Stammzelle, Hautzelle, Mucosazelle, einem Hepatozyten, einer
Pankreaszelle, einem Neurozyten, einem Chondrozyten, einer Endothelialzelle,
einer epidermalen Zelle, einem Osteozyten oder einer Muskelzelle,
isoliert aus einem menschlichen oder tierischen Organismus oder
Sperma, Ei oder befreuchtetem Ei von Haustieren oder Fischen.
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Das
Organ, wie es in der vorliegenden Erfindung definiert ist, umfasst
Haut, Blutgefäß, Cornea, Niere,
Herz, Leber, Nabelschnur, Darm, Nerven, Lunge, Plazenta oder Pankreas
usw.
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Als
Resultat des Interesses an Polyphenol, speziell an seiner Antikrebswirkung
seit einigen Jahren, und der Untersuchung seiner Eigenschaften hat der
Erfinder der vorliegenden Erfindung festgestellt, dass Polyphenol
einzigartige Eigenschaften besitzt, nämlich dass es leicht sowohl
in Wasser als auch organischen Lösungsmitteln
löslich
ist, d. h. es hat amphipathische Eigenschaften, hat eine hydrophile
und lipophile Natur, hat Adsorptionsaktivität in Protein und eine extrem
niedrige Cytotoxizität,
hat Antioxidationswirkungen, die zehnmal höher sind als die von SOD, und
reguliert die Tierzellproliferation frei, was bisher unbekannt ist.
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Seit
den 1980ern haben bereits viele Forscher berichtet, dass Polyphenol
verschiedene Wirkungen auf physiologische Aktivitäten hat;
diese umfassen antioxidierende, antibakterielle Wirkung, Wirkung
gegen Viren und Wirkung gegen Krebs und die Wirkung einer Kontrolle
der Krebsproliferation. Allerdings gibt es keinen Bericht, der Wirkungen
auf die Tierzellproliferation betrifft.
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Kürzlich wurde
insbesondere ein Artikel mit dem Titel <<J.
Jankun, S. H. Selman und R. Swiercz, "Why drinking green tea could prevent
cancer", Nature,
387, 5. Juni, 561, 1997, Y. Cao und R. Cao "Angiogenesis inhibited by drinking tea", Nature, 398, 1. April,
381, 1999>> in "Nature" publiziert und erregte weltweit
Aufmerksamkeit.
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Polyphenol
aus grünem
Tee wird neuerdings als funktionelles Lebensmittel angesehen, da
es antioxidierende, desodorierende, antibakterielle Aktivität hat, Aktivität gegen Krebs
hat und Wirkung auf die Ernährung
hat sowie andere Wirkungen auf physiologische Aktivitäten zeigt
(Chemistry and Application of Green tea, Hrsg. T. Yamamoto et al.,
CRC Press, Boca Raton New York, 1997). Allerdings ist es unbekannt,
dass Polyphenol Konservierungswirkungen für Tierzellen, -gewebe und -organe
hat.
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Es
scheint, dass in der Vergangenheit die meisten Forscher nur Interesse
an der Antikrebsaktivität
des Polyphenols als Antioxidationsmittel hatten. Daher waren keine
Erfinder, außer
dem Erfinder der vorliegenden Erfindung, an einem Grund interessiert, warum
Säugerzellen
bei ihren Körpertemperaturen überwintern
können,
und an Verfahren, eine Proliferation der normalen Tierzellen frei
zu regulieren. Darüber
hinaus ist es für
die Erfinder natürlicherweise unmöglich, einen
Grund für
die Wiedergewinnung ihrer Zelleigenschaften zu entdecken, indem
die Zellproliferation und -teilung nach der Überwinterung in normaler Weise
wieder begonnen wird.
-
Als
Resultat der freien Kontrolle der Tierzellproliferation öffnet diese
Erfindung den Weg für
einen Hauptdurchbruch, der nicht nur zu Grundlagenuntersuchungen
der Zellentwicklung, sondern auch zur Langzeitkonservierung der
Zellen, Gewebe und Organe führt.
-
Die
vorliegende Erfindung trägt
zum Fortschritt in den medizinischen Grenzwissenschaften bei um
die mögliche
Substanz zu finden um die Zellproliferation von Basiseinheiten,
aus denen der Körper
besteht, z. B. Pankreas, Leber und Niere, frei zu regulieren (bzw.
zu kontrollieren), die Substanz zu üblichen Aufbewahrungsmitteln
zu geben und die Technologie zu liefern, die für die Konservierung sowohl
von Organen als auch von Blut angewendet wird.
-
Erfindungsgemäß ist es
möglich,
die hepatischen und pankreatischen Zellen sowie das befruchtete
Ei über
einen langen Zeitraum ohne Gefrieren zu konservieren, indem das
Polyphenol den obigen bekannten Kulturmedien zugesetzt wird; es
kann daher auf dem Gebiet der Zell- und Gewebe-Technologie genutzt werden, die sich
auf die Herstellung nützlicher
Substanzen, z. B. Cytokine, bezieht, welche durch Tierzellen produziert
werden. Es ist möglich, die
Transplantationsgewebe oder -organe, einschließlich Haut, Blutgefäß, Cornea,
Niere, Herz, Leber, Nabelschnur, Darm, Nerven, Lunge, Plazenta, Pankreas,
Blut, Korpuskel oder Blutthrombozyten, über einen langen Zeitraum ohne
Gefrieren zu konservieren, indem das Polyphenol den obigen bekannten
Aufbewahrungslösungen
für Transplantationsgewebe
oder -organe zugesetzt wird.
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Die
verwendete Aufbewahrungsflüssigkeit kann
Protein, z. B. ein Enzym, eine Immunität, ein Antigen, eine immunologisch
aktive Substanz oder ein physiologisch aktives Peptid in Lösung oder
in trockenem Zustand stabilisieren, kann auf Lebensmittel, klinische
und medizinische Vorrichtungen angewendet werden, indem das Polyphenol
zu dem Aufbewahrungsmittel des Proteintyps zugesetzt, eingemischt
oder zugemischt wird. Durch Zugeben des Polyphenols zu einem Organ-Aufbewahrungsmittel spielt
das neue Aufbewahrungsmittel die Rolle, dass eine Organschädigung,
die bei der Transplantationsoperation verursacht wird, verhindert,
behandelt und verbessert wird.
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Zusammenfassend
ausgedrückt,
die vorliegende Erfindung kann den Proliferationsmechanismus der
Tierzellen aufklären
und den Validitätszeitraum
auf das mindestens zweifache gegenüber üblichen Aufbewahrungsmitteln
im Fall der Konservierung von Blut und Organen nach Transplantieren
eines inneren Organs verlängern,
indem die Tierzellproliferation frei reguliert wird. Konkret ausgedrückt, es
ist möglich,
normale und nützliche
Zellen lange Zeit ohne Gefrieren zu konservieren und die Proliferation
und Teilung der Zelle frei zu regulieren, indem freie Radikale kon trolliert
werden, die in großem
Umfang mit der Proliferation und Teilung der Zelle in Verbindung
stehen. Außerdem
kann das Aufbewahrungsmittel der vorliegenden Erfindung bei relativ
höherer
Temperatur und ohne das Erfordernis des Gefrierens im Vergleich
zu normalen Mitteln, die auf dem Markt sind, angewendet werden und
ist bei der Transplantationsoperation innerer Organe überlegen.
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BEISPIEL
-
Die
vorliegende Erfindung wird durch die folgenden Beispiele und Vergleichsbeispiele
näher erläutert, wird
durch die Beispiele allerdings nicht beschränkt.
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Beispiel 1 und Vergleichsbeispiel
1
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Ratten-Fibroblasten
-
L-929-Ratten-Fibroblaten
wurden in einem Gemisch aus Eagle's MEM, das 60 ml/l Kanamycin und 10%
fötales
Rinderserum (FBS, M. A. Bioproduct, Maryland, USA) enthielt, kultiviert.
Ein neues Gemisch (Beispiel 1), das das obige Gemisch mit 5 mg/ml
zugesetztem Polyphenol war, wurde bezüglich der Zellproliferation
bei den Testbedingungen einer Zelldichte von 1,76 × 105 Zellen/ml im Vergleich zu dem Gemisch des
Serummediums (Vergleichsbeispiel 1) beurteilt. Die Fibroblastenkultur
im Gemisch aus Serummedium wurde unter schneller Proliferation am
zweiten Tag gestartet und stieg bis 2,5 × 106 Zellen
am fünften
Tag, während
in dem neuen Gemisch selbst am siebten Tag keine Proliferation beobachtet
wurde. Allerdings begann die Fibroblastenkultur im neuen Gemisch
erneut zu proliferieren, als das Medium durch das Gemisch des Serummediums (Vergleichsbeispiel
1) ausgetauscht wurde und nahm bis 4,5 × 106 Zellen
am siebten Tag zu. Es wurde beobachtet, dass die Fibroblasten über einen
Zeitraum von drei Monaten schlafen konnten.
-
Beispiel 2 und Vergleichsbeispiel
2
-
Schweinehepatozyten
-
Schweinehepatozyten
wurde aus einem Schwein mit einem Körpergewicht von etwa 20 kg entnommen
und in Kulturblut mit 2,1 × 105 Zellen, beschichtet mit Typ 1-Collagen,
kultiviert und in Dulbecco's
modifiziertem Eagle-Medium (Vergleichsbeispiel 2; DMEM), bestehend
aus 100 mg/l Rinderserum, 50.000 Einheiten/l Penicillin, 100 mg/l
Streptomycin, 0,5 mg/ml EGF und 0,25 mg/l Insulin, kultiviert, wobei alle
drei Tage das Eagle's-Medium
durch frisches ersetzt wurde. Das Proliferationsverhalten der Hepatozyten
wurde bei Original-Eagle's-Medium
mit verbessertem Medium (Beispiel 2), bei dem 5 mg/ml Polyphenol
zu dem Eagle's-Medium
gegeben worden war, verglichen.
-
Schweinehepatozyten
machten in Eagle's-Medium
ab Beginn bis zum vierten Tag eine allmähliche Proliferation durch
und vermehrten sich rasch bis 5,4 × 106 Zellen
am siebten Tag, während bei
den Hepatozyten, die im verbesserten Gemisch kultiviert wurden,
selbst am siebten Tag keine Proliferation beobachtet wurde. Allerdings
begannen die Schweinehepatozyten, die im verbesserten Gemisch kultiviert
worden waren, erneut mit der Proliferation, als das Medium in Eagle's-Medium geändert wurde, wie
es bei den L-929-Ratten-Fibroblasten
der Fall war. Die Eigenschaften von Hepatozyten (Beispiel 2), die
durch Zugabe des Polyphenols eine Woche schliefen und aufwachten,
lag auf ähnlichem
Niveau wie bei ursprünglichen
Hepatozyten, was durch D-Glucose und Lidocain-Clearen untersucht
wurde, um so die Eigenschaften von Hepatozyten zu untersuchen.
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Beispiel 3 und Vergleichsbeispiel
3
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Ratten-Pankreas-Langerhans-Inseln
-
Etwa
2000 Stück
Langerhans-Inseln wurden aus dem Pankreas einer Wistar-Ratte (Gewicht
380 g) isoliert und etwa 200 Stück
wurden als Teil dieser kultiviert.
-
RPMI-Medium
1640 (LIFE TECHNOLOGIES; Chargen Nr. 1019650) wurde als Kulturmedium
angewendet; es bestand aus Gibco BRL mit L-Glutamin und ohne Glucose
und war außerdem
mit 10%iger Glucose, 100 mg/dl, hergestellt in fötalem Rinderserum (Chargen
Nr. 29110643, CASERA INTERNATIONAL INC. CANADA) und Antibiotikum-Antimykotikum
(Chargen Nr. 1013807, LIFE TECHNOLOGIES) versetzt.
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In
Beispiel 3 wurde das Polyphenol dem Medium 1640 unter Erhalt einer
Konzentration von 2% zugesetzt, während das Polyphenol in Vergleichsbeispiel
3 nicht zugesetzt wurde. Die Inseln wurde eine Woche bei 37°C sowohl
in mit Polyphenol versetztem Medium als auch in Medium ohne Polyphenol
kultiviert. In dem Medium ohne Polyphenol (Vergleichsbeispiel 3)
waren die Inseln am zweiten Tag bzw. vierten Tag zu 50% bzw. 100
zerstört.
Dagegen waren die Stücke
in Medium mit Polyphenol (Beispiel 3) am siebten Tag zu 100% nicht
zerstört,
sondern überwinterten.
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Nachdem
etwa 2000 Stück
Inseln durch Zugabe des Polyphenols zum Medium 1640 für eine Woche überwintern
gelassen worden waren, wurde das Polyphenol aus dem Medium 1640
entfernt um die Eigenschaften der Inseln nach der Überwinterung zu
beurteilen. Als Resultat der Untersuchung der Insulinproduktion
durch Anwenden eines einstufigen Enzymverfahrens mit einem Immunitäts- und
Insulinproduktionstestgerät
(GLAZYME; Wako) wird festgestellt, dass die Eigenschaften der oben
genannten Inseln von Ratten-Pankreas eine normale Funktion, ähnlich wie
die Inseln unmittelbar nach der Gewinnung zeigten.
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Beispiel 4 und Vergleichsbeispiel
4
-
Konservierung von Rattenniere
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Eine
Niere wurde aus einer Wistar-Ratte (Gewicht 380 g) unter Anästhesie
entnommen und die Konservierungseffekte wurden verglichen. In Vergleichsbeispiel
4 wurde die Niere 48 Stunden nach Herausnehmen und Waschen in UW-Lösung in
gefrorenem Zustand aufbewahrt. In Beispiel 4 dagegen wurde die Niere
für 48
Stunden in der UW-Lösung nach
Herausnehmen und Waschen in einer neuen Lösung konserviert, die durch
weiteren Zusatz von 10 mg/ml Polyphenol zu der UW-Lösung zusammengesetzt war; danach
wurde die isolierte Niere kontinuierlich 90 Minuten in einem Perfusionsgerät perfundiert
und beide Proben wurden bezüglich
ihres Perfusionsvolumens, des Harnvolumens und der Creatin-Clearance
verglichen. Es wurde festgestellt, dass die Nierenschädigung in
der neuen Lösung
der vorliegenden Erfindung im Vergleich zu der Niere, die nur in
UW-Lösung
war, außerordentlich
verringert war.
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Beispiel 5 und Vergleichsbeispiel
5
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Enzymstabilisator
-
Es
wurde eine neue β-D-Galactosidase-Lösung hergestellt,
indem 10 mg/ml Polyphenol zu einer normalen gegeben wurden (Beispiel
5); es wurde vier Wochen bei 30°C
inkubiert und die Extinktion bei 420 nm wurde gemessen. Die Extinktion
zeigte mehr als 90% in der neuen Lösung an, während etwa 10% in einer üblichen
Lösung
ohne Polyphenol (Vergleichsbeispiel 5) angezeigt wurden.
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Beispiel 6 und Vergleichsbeispiel
6
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Konservierung von Blut
und Korpuskeln
-
2
ml humane Blutlösung
wurden mit 500 μl einer
neuen Lösung
versetzt, die vorher hergestellt wurde, indem 10 mg/ml Polyphenol
zu einer Salzlösung
gegeben wurden (Beispiel 6). Nach 48 Stunden wurde die Granulazahl
durch Verwendung eines automatischen Zählgeräts gezählt. Die Zahl des humanen Bluts
war fast unverändert
und zeigte fast denselben Level wie unmittelbar nach Sammlung in
der neuen Lösung,
während
die Zahl in normaler Salzlösung
um etwa 30% reduziert war (Vergleichsbeispiel 6).
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Beispiel 7 und Vergleichsbeispiel
7
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Konservierung von Blutthrombozyten
-
Thrombozoyten-reiches
Plasma (PRP) wurde durch einen Zentrifugenseparator aus humanem Blut
erhalten. 100 ml PRP wurden mit 10 ml einer neuen Lösung versetzt,
die vorher hergestellt worden war, indem Polyphenol mit 10 mg/ml
zu einer Kochsalzlösung
(Beispiel 7) gegeben worden war, dann wurde 3 Tage bei 22°C inkubiert.
Die Kohäsionseigenschaften
der Thrombozyten und ihre Form waren nach 3 Tagen in normaler Kochsalzlösung (Vergleichsbeispiel
7) reduziert und gequollen. Die obige Reduktion und Verschlechterung
wurden in der neuen Lösung
jedoch nicht beobachtet, sondern es wurde fast derselbe Level ihrer
Kohäsionseigenschaften und
ihrer Gestalt wie zu Beginn beobachtet.
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Beispiel 8
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Intravenöse Injektion
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Die
Polyphenol-Lösung
wurde Rattenblut zugesetzt um eine Organschädigung, die bei einer Organtransplantationsopera tion
verursacht wird, zu verhindern, zu behandeln und zu verbessern.
2 ml einer physiologischen Salzlösung,
die mit 10 ml/ml Polyphenol versetzt worden war, wurde immer wieder
in die Schwanzvene einer männlichen
Ratte vom Wistar-Typ
(350 g Gewicht) einmal täglich
eine Woche lang injiziert. Die Ratte war normal lebendig, nicht
nur eine Woche, sondern 3 Monate.