DE60012932T2

DE60012932T2 - Entwässerung/rehydratisierung von markierten liposomen auf einer prüfeinrichtung

Info

Publication number: DE60012932T2
Application number: DE60012932T
Authority: DE
Inventors: Allen Richard DURST; Ti Sui SIEBERT; Daniel Martorell-Pena
Original assignee: Cornell Research Foundation Inc
Current assignee: Cornell Research Foundation Inc
Priority date: 1999-06-23
Filing date: 2000-06-23
Publication date: 2005-08-18
Anticipated expiration: 2020-06-24
Also published as: DE60012932D1; WO2000079283A1; CA2375532A1; EP1192466B1; US7419796B2; EP1192466A1; US20080230383A1; AU5635700A; US7858397B2; AU762944B2; ATE273516T1; US20030104506A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung einer Testvorrichtung, die dehydratisierte derivatisierte markerbeladene Liposomen umfasst, eine durch ein derartiges Verfahren hergestellte Testvorrichtung und Verfahren zur Verwendung der Testvorrichtung.
Hintergrund der Erfindung
Immunoassays, hauptsächlich in der Form enzymgekoppelter Immunsorptionstests (ELISAs), wurden in breitem Umfang auf dem Gebiet der klinischen diagnostischen Analyse verwendet (Gosling, Clin. Chem., 36: 1408–1427 (1990)). Diese Verfahren bieten hohe Spezifität, Empfindlichkeit und problemlose Durchführung gegenüber sonstigen Standardlaborverfahren. Jedoch umfassen einige der Nachteile des ELISA-Formats, die eine weitere Verbesserung der Methodik notwendig machen, die lange Zeitdauer, die für die Antigen-Antikörper-Reaktion, Reagenszugaben, enzymatische Umwandlung des Substrats und mehrere Waschstufen zwischen den verschiedenen Arbeitsvorgängen erforderlich ist.
Als Alternative zur Verwendung von Enzymen sind Liposomen als detektierbare Markierungen in Immunoassays wegen ihres Potentials zur unmittelbaren Signalverstärkung von Interesse. Liposomen sind kugelförmige Vesikel, in denen ein Wasservolumen durch eine aus Phospholipidmolekülen bestehende zweilagige Membran eingeschlossen ist (New, Liposomes: A Practical Approach, IRL Press, Oxford (1990)). Frühere Untersuchungen (Plant et al., Anal. Biochem., 176: 420–426 (1989); Durst et al., in: GBF Monograph Serien, Schmid, Hrsg., VCH, Weinheim, BRD, Band 14, S. 181–190 (1990) belegen die Vorteile eines liposomverkapselten Farbstoffs gegenüber enzymatisch produzierter Farbe bei der Verstärkung von Signalen bei kompetitiven Immunoassays. Der Kapillarmigrations- oder Lateralflussassay vermeidet Trennungs- und Waschstufen und lange Inkubationszeiten und er erreicht dennoch mit ELISAs vergleichbare Empfindlichkeit und Spezifität. Dennoch umfassen die Methoden (Siebert et al.; Anal. Chim. Acta, 282: 297–305 (1993); Roberts et al., Anal. Chem., 67: 482–491 (1995); Siebert et al., Anal. Chim. Acta, 311: 309–318 (1995); Reeves et al., Trends Anal. Chem., 14: 351–355 (1995); Rule et al., Clin. Chem., 42: 1206–1209 (1996)) Arbeitsvorgänge und Lösungen, die die Handhabung der Probe und von Reagentien für Fehler anfällig und für ungeübtes Personal schwieriger verwendbar machen.
Die treibende Kraft hinter der Bildung von Liposomen ist die Hydratation, so dass, wenn Wasser von Lipidmembranen entfernt wird, eine Verschiebung des Phasenübergangs erfolgt und eine Phasentrennung von Lipiden stattfinden kann, die zur Aggregation und Fusion der Liposomen führt, wodurch die Sperrfunktion der Membran verlorengeht (Lasiv, Biochim. Biophys. Acta, 692: 501–502 (1982); Mobley et al., J. Control Release, 31: 73–87 (1994); Crowe et al., Cryobiology, 19: 317–328 (1982); Lin et al., Stud. Biophys., 127: 99–104 (1988); Crowe et al., J. Bioenerg. Biomembr., 21: 77–92 (1989) ).
Die vorliegende Erfindung ist auf die Überwindung der im vorhergehenden genannten Mängel im Stand der Technik gerichtet.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung einer Testvorrichtung zum Nachweisen oder quantitativen Bestimmen eines Analyts in einer Probe. Dieses Ver fahren umfasst das Kontaktieren einer Membran mit einem Gemisch, das derivatisierte, markerbeladene Liposomen umfasst, und substantielles Dehydratisieren des Gemischs auf der Membran unter Vakuumdruck bei einer Temperatur von etwa 4 °C bis etwa 80 °C, wobei das Gemisch ferner einen oder mehrere Zucker in einer zur Förderung der Stabilität der Liposomen während der Dehydratation und Rehydratation ausreichenden Menge umfasst.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch eine Testvorrichtung und ihre Verwendung in einem Verfahren zum Nachweisen oder quantitativen Bestimmen eines Analyts in einer Probe. Die Testvorrichtung umfasst eine Membran, die eine Zone immobilisierter Liposomen umfasst, wobei die Zone immobilisierter Liposomen daran gebundene dehydratisierte, derivatisierte, markerbeladene Liposomen aufweist, die unter Vakuumdruck bei einer Temperatur von etwa 4 °C bis etwa 80 °C ausgehend von einem Gemisch, das einen oder mehrere Zucker in einer zur Förderung der Stabilität der Liposomen während der Dehydratation und Rehydratation ausreichenden Menge umfasst, dehydratisiert wurden. Die Testvorrichtung umfasst vorzugsweise eine Einfangzone mit einem daran gebundenen, für den Analyten spezifischen ersten Bindungsmaterial.
Das Verfahren zum Nachweisen oder quantitativen Bestimmen eines Analyts in einer Testprobe umfasst: Bereitstellen einer Testvorrichtung gemäß der vorliegenden Erfindung, wobei die dehydratisierten, derivatisierten, markerbeladenen Liposomen mit einem Analytanalogon derivatisiert sind; Kontaktieren der Testvorrichtung mit einer Lösung der Probe; Ermöglichen der Wanderung der Lösung durch die Zone immobilisierter Liposomen und in die Einfangzone durch Kapillarwirkung, wobei die Lösung die dehydratisierten, derivatisierten, markerbeladenen Liposomen rehydratisiert, die mit der Lösung in die Einfangzone durch Kapillarwirkung wandern; Zulassen des Auftretens einer Konkurrenz zwischen einem beliebigen in der Probe vorhandenen Analyten und den derivatisierten, markerbeladenen Liposomen um das erste Bindungsmaterial; nach dem Zulassen Nachweisen oder quantitatives Bestimmen der derivatisierten, markerbeladenen Liposomen in der Einfangzone; und Korrelieren des Vorhandenseins oder der Menge der derivatisierten, markerbeladenen Liposomen in der Einfangzone mit dem Vorhandensein oder der Menge des Analyts in der Probe.
Das Verfahren zum Nachweisen oder quantitativen Bestimmen eines Analyts in einer Probe umfasst ferner das Bereitstellen einer Testvorrichtung gemäß der vorliegenden Erfindung, wobei die dehydratisierten, derivatisierten, markerbeladenen Liposomen mit einem für den Analyten spezifischen zweiten Bindungsmaterial derivatisiert sind, und wobei das erste Bindungsmaterial mit einem Teil des Analyten eine Bindung eingeht, der von dem Teil des Analyten, für den das zweite Bindungsmaterial gewählt wurde, verschieden ist; Kontaktieren der Testvorrichtung mit einer Lösung der Probe; Ermöglichen der Wanderung der Lösung durch die Zone immobilisierter Liposomen und in die Einfangzone durch Kapillarwirkung, wobei die Lösung die dehydratisierten, derivatisierten, markerbeladenen Liposomen rehydratisiert, die mit der Lösung in die Einfangzone durch Kapillarwirkung wandern; Nachweisen oder quantitatives Bestimmen der derivatisierten, markerbeladenen Liposomen in der Einfangzone; und Korrelieren des Vorhandenseins oder der Menge der derivatisierten, markerbeladenen Liposomen in der Einfangzone mit dem Vorhandensein oder der Menge des Analyts in der Probe.
Bei dem Verfahren zur Herstellung der Testvorrichtung der vorliegenden Erfindung ermöglicht eine einfache Dehydrata tion in einem Vakuumofen eine schnellere Rehydratisierung der Liposomen, da die Liposomen partiell hydratisiert bleiben. Außerdem ist eine einfache Dehydratisierung weniger kostenaufwändig, schneller und sie ergibt stabilere Liposomen als Gefriertrocknungsverfahren.
Außerdem kann die Vorrichtung in der Praxis direkt im Gelände verwendet werden. Die Vorrichtung wird nur einmal verwendet und sie ist daher frei von verbliebenen Umgebungsverunreinigungen außer denen, die in der zu messenden Probe vorhanden sein können. Proben können innerhalb von Minuten nach dem Sammeln getestet werden, wobei die Ergebnisse unmittelbar an Ort und Stelle verfügbar sind. Außerdem sind die Vorrichtung und das Verfahren gemäß der Erfindung weniger komplex als viele der früheren Materialien und Verfahren. Beispielsweise kann ein sichtbarer Farbstoff als nachweisbarer Marker verwendet werden, was die Notwendigkeit von Nachweis- oder Messinstrumenten beseitigt, und eine getrennte Marker- oder Indikatorstufe ist bei keiner Ausführungsform der Erfindung erforderlich.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 ist eine schematische Darstellung einer Testvorrichtung der vorliegenden Erfindung.
2 ist ein Diagramm, das die Rückgewinnung von dehydratisierten Liposomen auf Nitrocellulosestreifen mit variierenden Mengen von von außen zugeführter Saccharose in der Form einer Saccharoseglasur
und als zugesetztes Streckmittel im Verdünnungsmittel
zeigt. Nitrocellulosestreifen, in die eine 4,5-μg-Antibiotinbande eingebaut war, wurden mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung als mobiler Phase verwendet. Jeder Punkt ist ein Mittelwert von mindestens drei Streifen, und eine Standardabweichung ist als Fehlerbalken angegeben.
3 ist ein Diagramm, das die Rückgewinnung von dehydratisierten Liposomen mit variierenden internen Trehalosekonzentrationen zeigt. Nitrocellulosestreifen, in die eine 4,5-μg-Antibiotinbande eingebaut war, wurden mit etwa 5,3 × 10⁸ Liposomen mit Biotin-Tag und normalem humanem Serum als mobiler Phase verwendet. Für die Kontrollen ist jeder Punkt ein Mittelwert von drei Streifen und für die dehydratisierten Liposomen ist er ein Mittelwert von vier Streifen, und eine Standardabweichung ist als Fehlerbalken angegeben. Interne Trehalosekonzentrationen: 0 mM (I), 10 mM (II), 50 mM (III) , 100 mM (IV) und 200 mM (V).
4 ist ein Diagramm, das die Rückgewinnung nach dem Dehydratations/Rehydratationsverfahren für Liposomen variierender Größen zeigt. Nitrocellulosestreifen, in die eine 4,5-μg-Antibiotinbande eingebaut war, wurden mit etwa 5,3 × 10⁸ Liposomen mit Biotin-Tag und normalem humanem Serum als mobiler Phase verwendet. Jeder Punkt ist ein Mittelwert von vier Streifen und eine Standardabweichung ist als Fehlerbalken angegeben.
5 ist ein Diagramm, das die Beziehung zwischen der Zahl der dehydratisierten Liposomen auf den Nitrocellulosestreifen und der Grauwertskala-Intensität der Antikörperzone zeigt. Nitrocellulosestreifen, in die eine 4,5-μg-Antibiotinbande eingebaut war, wurden mit normalem humanem Serum als mobiler Phase verwendet.
6 ist ein Diagramm, das die Wirkung der Konzentrationen von Gelatine und Polyvinylpyrrolidon (PVP) in Blockierungsreagens auf die Rückgewinnung dehydratisierter Liposomen auf den Nitrocellulosestreifen, ausgedrückt als Signalintensitäten der Antibiotinbande, die durch intakte Liposomen hervorgerufen wurden, zeigt. Nitrocellulosestreifen, in die eine 4,5-μg-Antibiotinbande eingebaut war, wurden mit etwa 5,3 × 10⁸ Liposomen mit Biotin-Tag und normalem humanem Serum als mobiler Phase verwendet. PVP-Konzentrationen: 0 %
, 0,05 %
, 0,2 % (♦), 0,5 %
und 1 %
.
7 ist eine Dosis-Wirkung-Kurve für Biotin. Nitrocellulosestreifen, in die eine 4,5-μg-Antibiotinbande und dehydratisierte Liposomen (etwa 5,3 × 10⁸ Liposomen mit Biotin-Tag/Streifen) an einem Punkt 6 mm unter der Antibiotinbande eingebaut waren, wurden mit Biotin in normalem humanem Serum als Testprobe verwendet. Jeder Punkt ist ein Mittelwert von mindestens drei Streifen, und eine Standardabweichung ist als Fehlerbalken angegeben.
8 ist ein Diagramm, das die Stabilität von dehydratisierten Liposomen auf Nitrocellulosestreifen auf der Basis der Signalintensitäten, die über die Zeit für zwei Biotinkonzentrationen: 10 ng/l
und 100 ng/ml
erhalten wurden, zeigt. Nitrocellulosestreifen, in die eine 4,5-μg-Antibiotinbande und dehydratisierte Liposomen (etwa 5,3 × 10⁸ Liposomen mit Biotin-Tag/Streifen) an einem Punkt 6 mm unter der Antibiotinbande eingebaut waren, wurden mit Biotin in normalem humanem Serum als Testprobe verwendet. Jeder Punkt ist ein Mittelwert von mindestens zwei Streifen, und eine Standardabweichung ist als Fehlerbalken angegeben.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Wie im vorhergehenden beschrieben, betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer Testvorrichtung zum Nachweisen oder quantitativen Bestimmen eines Analyts in einer Probe. Dieses Verfahren umfasst das Kontak tieren einer Membran mit einem Gemisch, das derivatisierte, markerbeladene Liposomen umfasst, und substantielles Dehydratisieren des Gemischs auf der Membran unter Vakuumdruck bei einer Temperatur von etwa 4 °C bis etwa 80 °C, wobei das Gemisch ferner einen oder mehrere Zucker in einer zur Förderung der Stabilität der Liposomen während der Dehydratation und Rehydratation ausreichenden Menge umfasst.
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner eine Testvorrichtung zum Nachweisen oder quantitativen Bestimmen eines Analyts in einer Probe, die eine Membran umfasst, die eine Zone immobilisierter Liposomen umfasst, wobei die Zone immobilisierter Liposomen daran gebundene dehydratisierte, derivatisierte, markerbeladene Liposomen aufweist, die unter Vakuumdruck bei einer Temperatur von etwa 4 °C bis etwa 80 °C ausgehend von einem Gemisch, das einen oder mehrere Zucker in einer zur Förderung der Stabilität der Liposomen während der Dehydratation und Rehydratation ausreichenden Menge umfasst, dehydratisiert wurden. Die Testvorrichtung umfasst vorzugsweise auch eine Einfangzone mit einem daran gebundenen, für den Analyten spezifischen ersten Bindungsmaterial.
Durch die vorliegende Erfindung erfolgt ferner die Bereitstellung eines Verfahrens zum Nachweisen oder quantitativen Bestimmen eines Analyts in einer Testprobe durch Bereitstellung einer Testvorrichtung gemäß der vorliegenden Erfindung, wobei die dehydratisierten, derivatisierten, markerbeladenen Liposomen mit einem Analytanalogon derivatisiert sind; Kontaktieren der Testvorrichtung mit einer Lösung der Probe; Ermöglichen der Wanderung der Lösung durch die Zone immobilisierter Liposomen und in die Einfangzone durch Kapillarwirkung, wobei die Lösung die dehydratisierten, derivatisierten, markerbeladenen Liposomen rehydratisiert, die mit der Lösung in die Einfangzone durch Kapillarwirkung wandern; Zulassen des Auftretens einer Konkurrenz zwischen einem beliebigen in der Probe vorhandenen Analyten und den derivatisierten, markerbeladenen Liposomen um das erste Bindungsmaterial; nach dem Zulassen Nachweisen oder quantitatives Bestimmen der derivatisierten, markerbeladenen Liposomen in der Einfangzone; und Korrelieren des Vorhandenseins oder der Menge der derivatisierten, markerbeladenen Liposomen in der Einfangzone mit dem Vorhandensein oder der Menge des Analyts in der Probe.
Das Verfahren zum Nachweisen oder quantitativen Bestimmen eines Analyts in einer Probe umfasst ferner das Bereitstellen einer Testvorrichtung gemäß der vorliegenden Erfindung, wobei die dehydratisierten, derivatisierten, markerbeladenen Liposomen mit einem für den Analyten spezifischen zweiten Bindungsmaterial derivatisiert sind, und wobei das erste Bindungsmaterial mit einem Teil des Analyten eine Bindung eingeht, der von dem Teil des Analyten, für den das zweite Bindungsmaterial gewählt wurde, verschieden ist; Kontaktieren der Testvorrichtung mit einer Lösung der Probe; Ermöglichen der Wanderung der Lösung durch die Zone immobilisierter Liposomen und in die Einfangzone durch Kapillarwirkung, wobei die Lösung die dehydratisierten, derivatisierten, markerbeladenen Liposomen rehydratisiert, die mit der Lösung in die Einfangzone durch Kapillarwirkung wandern; Nachweisen oder quantitative Bestimmen der derivatisierten, markerbeladenen Liposomen in der Einfangzone; und Korrelieren des Vorhandenseins oder der Menge der derivatisierten, markerbeladenen Liposomen in der Einfangzone mit dem Vorhandensein oder der Menge des Analyts in der Probe.
"Analyt" bedeutet die zu messende oder zu erfassende Verbindung oder Zusammensetzung. Ein bevorzugter Analyt ist ein Nucleinsäuremolekül.
"Gemisch" bedeutet eine Lösung, Suspension, Dispersion oder ein anderes Gemisch.
In einer Ausführungsform umfasst das Verfahren zur Herstellung der Testvorrichtung gemäß der vorliegenden Erfindung ferner das Immobilisieren eines für den Analyten spezifischen ersten Bindungsmaterials in einer Einfangzone auf der Membran.
"Bindungsmaterial" bedeutet ein Biorezeptormolekül, beispielsweise ein Immunglobulin oder Derivat oder Fragment desselben, mit einem Bereich auf der Oberfläche oder in einer Höhlung, der spezifisch an eine spezielle räumliche und polare Organisation eines anderen Moleküls – in diesem Fall des Analyts – bindet und dadurch als zu diesem komplementär definiert wird. Alternativ ist, wenn der Zielanalyt ein Nucleinsäuremolekül ist, das erste Bindungsmaterial ein Nucleinsäuremolekül, das so gewählt wurde, dass es mit einem Teil des Zielnucleinsäuremoleküls hybridisiert.
Antikörper-Bindungsmaterialien können monoklonal oder polyklonal sein und durch einschlägig bekannte Techniken, wie Immunisierung eines Wirts und Gewinnung von Seren oder Hybridzelllinientechnologie, hergestellt werden. Das Bindungsmaterial kann auch eine beliebige natürlich vorkommende oder synthetische Verbindung sein, die spezifisch an den interessierenden Analyten bindet.
In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung sind die derivatisierten markerbeladenen Liposomen mit einem Analytanalogon derivatisiert. Diese Ausführungsform ist besonders zur Verwendung der Testvorrichtung in einem kompetitiven Bindungstest geeignet. Bestimmte interessierende Analyte können so widerspenstig sein, dass eine direkte Konjugation mit dem Liposom umständlich, schwierig oder sogar unmöglich wird. In derartigen Fällen ist es nötig, ein reaktives Analogon des interessierenden Analyts zur Herstellung der deriviatisierten Liposomen zu verwenden. Daher bedeutet "Analytanalogon" den Analyten oder ein Analogon desselben, der bzw. das mit den Liposomen reagiert oder bindet. Wenn ein Analogon verwendet wird, ist es jedoch notwendig, dass die speziellen Eigenschaften des Analyts, die zur Erkennung durch das erste Bindungsmaterial in der Konkurrenzreaktion notwendig sind, in dem mit den Liposomen konjugierten Analytanalogon vorhanden sind.
In einer weiteren Ausführungsform sind die derivatisierten markerbeladenen Liposomen mit einem zweiten Bindungsmaterial derivatisiert. Diese Ausführungsform ist besonders zur Verwendung der Testvorrichtung in einem "Sandwich"-Test geeignet. Das zweite Bindungsmaterial kann an die Liposomoberfläche konjugiert sein. Das zweite Bindungsmaterial muss an die Liposomen derart gebunden sein, dass ein Teil des zweiten Bindungsmaterials, der durch den Analyt erkannt werden kann, präsentiert wird.
Geeignete Konjugationsverfahren werden in den US-Patenten Nr. 5 789 154, 5 756 362 und 5 753 519, die hierdurch als Bezug aufgenommen sind, diskutiert. Beispielsweise kann die Liposomoberfläche mit Thiolgruppen aktiviert und an eine Maleimidgruppe auf dem zweiten Bindungsmaterial gekoppelt werden. Oder umgekehrt können Maleimid-aktivierte Liposomen und ein Thiolgruppen-aktiviertes zweites Bindungsmaterial verwendet werden.
Wenn erste und zweite Bindungsmaterialien vorhanden sind, werden sie so gewählt, dass sie spezifisch an getrennte Teile des Analyts binden. Beispielsweise ist es, wenn der Analyt eine Nucleinsäuresequenz ist, notwendig, Sonden für getrennte Teile der Zielnucleinsäuresequenz zu wählen. Techniken zur Gestaltung derartiger Sonden sind bekannt. Zur praktischen Durchführung der vorliegenden Erfindung geeignete Sonden müssen zur Zielanalytsequenz komplementär sein, d.h. mit dem Target hybridisieren können, und sie sollten für den Zielanalyt hochspezifisch sein. Die Sonden sind vorzugsweise zwischen 17 und 25 Nucleotide lang, um die erforderliche Spezifität bereitzustellen, während ungünstig lange Hybridisierungszeiten vermieden und die Möglichkeit zur Bildung von Sekundärstrukturen unter den Testbedingungen minimiert werden. Außerdem sollten die ersten und zweiten Bindungsmaterialien (Einfang- und Reportersonden) nicht miteinander hybridisieren können. Techniken zur Identifizierung von Sonden, die zur praktischen Durchführung der Erfindung geeignet sind, sind bei Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989), das hierdurch als Bezug aufgenommen ist, beschrieben. Ein Softwareprogramm, das als "Lasergene" bekannt ist, das bei DNASTAR erhältlich ist, kann optional verwendet werden.
Im allgemeinen wird zur Gestaltung eines Tests die Zielnucleinsäure aus einer Probe extrahiert und dann durch eine einer Vielzahl von bekannten Amplifikationstechniken amplifiziert. Derartige Amplifikationstechniken umfassen die Polymerasekettenreaktion, Ligasekettenreaktion und Nucleic Acid Sequence Based Amplification (NASBA). Siehe Kievits et al., "NASBA isothermal enzymatic in vitro nucleic acid amplification optimized for the diagnosis of HIV-1 infection", J. of Virological Methods, 35: 273–286 (1991), das hierdurch als Bezug aufgenommen ist. NASBA, das von Organon-Teknika vertrieben wird, ist eine bevorzugte Amplifikationstechnik für Informationen im Hinblick auf das Vorhandensein oder die Konzentration von lebenden Organismen in einer Probe.
Wie hier im vorhergehenden angegeben, umfassen die Verfahren und die Testvorrichtung der vorliegenden Erfindung einen Marken im inneren der Liposomen. Geeignete Marker umfassen fluoreszierende Farbstoffe, sichtbare Farbstoffe, Bio- und Chemilumineszenzmaterialien, Enzymsubstrate, radioaktive Materialien und elektrochemische Marker. Sichtbare Farbstoffe und radioaktive Materialien können ohne Lyse der Liposomen ermittelt werden. Eine Lyse der Liposomen in der Einfangzone kann durch Applikation eines Liposomlysemittels auf die Einfangzone erreicht werden. Geeignete Liposomlysematerialien umfassen grenzflächenaktive Mittel, wie Octylglucopyranosid, Natriumdioxycholat, Natriumdodecylsulfat, Polyoxyethylensorbitanmonolaurat, das von Sigma unter der Marke Tween-20 vertrieben wird, und ein nichtionisches grenzflächenaktives Mittel, das von Sigma unter der Marke Triton X-100 vertrieben wird, das tert-Octylphenoxypolyethoxyethanol ist. Octylglucopyranosid ist für viele Tests ein bevorzugtes Lysemittel, da es Liposomen rasch lysiert und die Signalmessung nicht zu stören scheint. Alternativ kann eine vollständige Lyse der Liposomen durchgeführt werden oder die Liposomen können mit elektrischen, optischen, thermischen oder anderen physikalischen Mitteln aufgebrochen werden.
Eine qualitative oder halbquantitative Ermittlung des Vorhandenseins oder der Menge eines interessierenden Analyts kann mit dem bloßen Auge durchgeführt werden, wenn sichtbare Farbstoffe als Marker verwendet werden. Alternativ kann, wenn eine größere Genauigkeit gewünscht wird oder wenn der verwendete Marker eine instrumentelle Analyse notwendig macht, die Intensität des Markers direkt auf der Membran unter Verwendung eines quantitativen Instruments, wie eines Reflektometers, Fluorimeters, Spektrometers und dgl., ermittelt werden.
In einer Ausführungsform der Erfindung wird ein Marker, der unter den Testbedingungen sichtbar ist, so verwendet, dass das Vorhandensein und/oder die Menge eines Analyts ohne eine weitere Behandlung und ohne die Verwendung von Instrumenten, beispielsweise durch die Verwendung von Liposomen, die einen Farbstoff als Marker enthalten, bestimmt werden kann.
Alternativ können die Verfahren und die Testvorrichtung der vorliegenden Erfindung derart modifiziert werden, dass ein elektrochemischer Marker verwendet wird. Geeignete elektrochemische Marker sowie Verfahren zur Wahl derselben und Verwendung derselben sind im US-Patent Nr. 5 958 791 von Roberts et al. und der gleichzeitig anhängigen US-Patentanmeldung Nr. 09/315576, eingereicht am 20. Mai 1999, die hierdurch als Bezug aufgenommen sind, offenbart.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die Membran ein absorbierendes Material.
"Absorbierendes Material" bedeutet ein porenhaltiges Material mit einer Porengröße von 0,05 μm bis 50 μm, vorzugsweise 0,45 μm bis 5 μm, das als Reaktion auf eine Kapillarkraft von einem wässrigen Medium durchquert werden kann. Derartige Materialien können natürliche Polymermaterialien, insbesondere Cellulosematerialien, wie faserhaltige Papiere, beispielsweise Filterpapier, Chromatographiepapier und dgl.; synthetische oder modifizierte natürlich vorkommende Polymere, wie Nitrocellulose, Celluloseacetat, Poly(vinylchlorid), Polyacrylamid, vernetztes Dextran, Agarose, Polyacrylat, Nylon, aktiviertes Nylon, eine modifizierte Polysulfonbase und dgl.; Glasfaser, wie Borosilicatglasfaser und Glasfaser mit einem Polyvinylalkoholbindemittel (erhältlich von Ahlstrom); ein gewirktes Gewebe; nicht- gewirktes Gewebe; nicht-gewirkte Schleierstoffe; nicht-gewirkte Materialien; Polyestergewebe und Polyestermischgewebe (erhältlich von DuPont, Sontara Technologies); Polyester-Spinnvlies (erhältlich von Ahlstrom und DuPont); Polypropylen-Screeninggewebe (erhältlich von Sefar); Reyon; Cellulose/Reyon; ein Cellulose/Glas-Fasergemisch; Polyethersulfon (erhältlich von Pall Gelman Sciences); sein, die entweder als solche oder in Verbindung mit einem Träger wie im folgenden beschrieben verwendet werden.
Bevorzugte adsorbierende Materialien umfassen Nitrocellulose, Glasfaser, ein Gewebe, Nylon, nicht-gewirktes Material bzw. Vliesmaterial, Polyestergewebe, Reyon, ein Cellulose-Reyon-Gemisch, Cellulose/Glas-Fasergemische oder Polyethersulfon.
Es ist klar, dass der Ausdruck "Nitrocellulose" Salpetersäureester von Cellulose bezeichnet, was Nitrocellulose allein oder ein Estergemisch von Salpetersäure und anderen Säuren und insbesondere aliphatischen Carbonsäuren mit einem bis sieben Kohlenstoffatomen, wobei Essigsäure bevorzugt ist, sein kann. Derartige Materialien, die aus Cellulose, die mit Salpetersäure allein oder einem Gemisch aus Salpetersäure und einer anderen Säure, wie Essigsäure, verestert wurde, gebildet sind, werden häufig als Nitrocellulosepapier bezeichnet.
Die adsorbierenden Materialien können polyfunktional sein oder die Fähigkeit besitzen, polyfunktionalisiert zu werden, um eine Immobilisierung des zweiten Bindungsmaterials zu gestatten.
Materialien mit einer Oberfläche, die als Träger des Bindungsmaterials und beliebiger anderer Mittel, die darauf, wie hier beschrieben, immobilisiert werden sollen, ausrei chend ist, können zur Herstellung von Testvorrichtungen gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden.
Die Testvorrichtung der vorliegenden Erfindung kann ein oder mehrere absorbierende Materialien (d.h. Membranen) gemäß der Beschreibung in der gleichzeitig anhängigen US-Patentanmeldung des Aktenzeichens 09/315 576, eingereicht am 20. Mai 1999, die hierdurch als Bezug aufgenommen ist, umfassen. Ungeachtet der verwendeten Zahl der adsorbierenden Kissen oder Materialien ist es wichtig, dass mindestens der Teil des Teststreifens, der die Zone immobilisierter Liposomen und die Einfangzone und den dazwischenliegenden Teil umfasst, aus einem Liposomen nicht lysierenden Material hergestellt wird. Das Material, auf dem das erste Bindungsmaterial immobilisiert wird, muss die Fähigkeit besitzen, die Immobilisierung zu unterstützen und das Material bzw. die Materialien müssen eine Flüssigkeitswanderung (Lateralfluss) ermöglichen.
Absorbierende Materialien mit großen Oberflächen (wie Nitrocellulose) sind für einige Anwendungen insofern besonders bevorzugt, als das erste Bindungsmaterial und die derivatisierten markerbeladenen Liposomen auf derartigen Materialien in hohen Konzentrationen getragen werden können. Es ist jedoch klar, dass die Konzentration des Bindungsmaterials, die tatsächlich verwendet wird, teilweise von der Bindungsaffinität des ersten Bindungsmaterials abhängt. Daher ist der Umfang der Erfindung nicht auf eine spezielle Konzentration des ersten Bindungsmaterials auf dem absorbierenden Material beschränkt.
Die Applikation des ersten Bindungsmaterials auf die Membran kann durch bekannte Techniken, beispielsweise durch Sprühen oder Auftüpfeln von Lösungen dieser Komponente auf die Membran, durchgeführt werden.
Das erste Bindungsmaterial kann durch kovalente Bindung an die Membran gebunden werden. Beispielsweise kann das Material, das gebunden werden soll, direkt auf die Membran appliziert werden und dann durch Ultraviolettbestrahlung gebunden werden. Alternativ können Materialien auf die Membran adsorbiert werden, sofern die Bindung des ersten Bindungsmaterials an die Membran nicht diffundierend erfolgt. Dies umfasst das Kontaktieren der Membran mit einer Lösung, die das an die Membran zu bindende Material enhält, und das Trocknen der Membran. Im allgemeinen ist dieses Verfahre nur verwendbar, wenn die Membran relativ hydrophob ist oder eine hohe Oberflächenladung aufweist, und eine anschließende Behandlung mit Proteinen, Tensiden, Polysacchariden oder anderen Materialien mit der Fähigkeit zur Blockierung nichtspezifischer Bindungsstellen erforderlich ist.
Das erste Bindungsmaterial wird vorzugsweise indirekt an die Membran in der Einfangzone der Vorrichtung gebunden. Beispielsweise ist das erste Bindungsmaterial vorzugsweise mit einem Tag, beispielsweise Biotin, markiert und ein Ligand, der spezifisch an das Tag bindet, beispielsweise Streptavidin oder Anti-Biotin-Antikörper, wird mit dem mit dem Tag markierten ersten Bindungsmaterial zuvor gemischt und dann in der Einfangzone auf die Membran appliziert. Andere Mittel, die zur Immobilisierung des ersten Bindungsmaterials in der Einfangzone geeignet sind, umfassen alle Verbindungen oder Antikörper, die spezifisch ein gewähltes Tag, das als Markierung für das erste Bindungsmaterial verwendet wird, beispielsweise Avidin, Anti-Fluorescin, Anti-Digoxin und Anti-Dinitrophenyl (DNP), binden.
Vor oder nach der Applikation des ersten Bindungsmaterials auf den entsprechenden Teil auf der Membran kann die verbliebene Kapazität der Membran für nichtspezifische Bindung mit Blockierungsmitteln, die typischerweise eine Kombination von drei Verbindungen: Proteine, synthetische Polymere und grenzflächenaktive Mittel, umfassen und nicht spezifisch die in dem Test zu verwendenden Materialien binden, gesättigt oder blockiert werden und sie wird vorzugsweise gesättigt oder blockiert. Die Blockierung wird allgemein nach der Applikation des ersten Bindungsmaterials auf die Membran durchgeführt, doch kann es in Abhängigkeit von dem Applikationsverfahren, dem speziellen Blockierungsmittel und der verwendeten Membran möglich sein, die Membran vor der Applikation dieser Komponente zu blockieren. Daher kann beispielsweise die verbliebene Bindungskapazität des Substrats so blockiert werden, dass eine nichtspezifische Bindung durch Verwendung von Rinderserumalbumin gemäß der Beschreibung bei Towbin et al., Proc. Nat'1. Acad. Sci., 76: 4350 (1979), das hierdurch als Bezug aufgenommen ist, verhindert wird. Die Techniken zur Verhinderung einer nichtspezifischen Bindung sind allgemein einschlägig bekannt, und derartige Techniken sind auch zur Verhinderung einer nichtspezifischen Bindung in dem Test der vorliegenden Erfindung allgemein anwendbar. Beispiele für besonders geeignete Techniken zur Blockierung mit Polyvinylpyrrolidon und Polyvinylalkohol sind beispielsweise bei Bartles et al., Anal. Biochem., 140: 784 (1984) und in der britischen Patentbeschreibung GB 2204398 A, die hierdurch als Bezug aufgenommen sind, jeweils beschrieben. Alternativ können ein oder mehrere Blockierungsmittel in die Pufferlösung, die zum Waschen oder zum Tragen von Testkomponenten längs der Membran bzw. der Membranen verwendet werden, eingearbeitet werden.
Die Blockierungsmittel blockieren Stellen einer nichtspezifischen Bindung auf der Membran. Daher binden bevorzugte Blockierungsmittel vorzugsweise an die Membran. Die Blockierungsmittel sind aus der Gruppe ausgewählt, die aus proteinartigen Blockierungsmitteln mit der Fähigkeit zur Hemmung der Bindung von Molekülen mit einem Molekulargewicht von größer als etwa 1000 an die Membran und Polymerblockierungsmitteln mit der Fähigkeit zur Hemmung der Bindung von Molekülen mit einem Molekulargewicht von weniger als etwa 1000 an die Membran besteht. Das proteinartige Blockierungsreagens kann aus der aus Gelatine, fettarmer Trockenmilch, Rinderserumalbumin, Albumine aus anderen Quellen, Schlüssellochnapfschnecke-Hämocyanin, Casein, Gummiarabicum, Fischgelatine, Ovalbumin und Pferdeserum bestehenden Gruppe ausgewählt sein. Das Polymerblockierungsreagens kann aus der aus Polyvinylpyrrolidon, Polyvinylalkohol und Hydroxypropylmethylcellulose bestehenden Gruppe ausgewählt sein. Das Blockierungsreagens ist vorzugsweise ein Gemisch der im vorhergehenden angegebenen Blockierungsreagentien.
Vorzugsweise umfassen die Blockierungsmittel eine Kombination aus Polyvinylpyrrolidon und einem Bestandteil oder einem Gemisch von Proteinen, wie Gelatine, fettarme Trockenmilch, Rinderserumalbumin und Casein. Für Liposomen, die mit kleinen Analytanaloga derivatisiert sind, umfassen bevorzugte Konzentrationen von Blockierungsmitteln, die in beispielsweise Tris(hydroxymethyl)aminomethan-gepufferter Kochsalzlösung gelöst sind, etwa 0,01 Gew/V-% bis etwa 1 Gew/V-% Polyvinylpyrrolidon und einen Bestandteil oder ein Gemisch von: etwa 0,01 Gew/V-% bis etwa 1 Gew/V-% Gelatine, etwa 0,01 Gew/V-% bis etwa 1 Gew/V-% fettarme Trockenmilch und etwa 0,01 Gew/V-% bis etwa 0,05 Gew/V-% Rinderserumalbumin. Für Liposome, die mit größeren Analytanaloga, beispielsweise Antikörpern und Nucleotiden, derivatisiert sind, umfassen bevorzugte Konzentrationen von Blockierungsmitteln, die in beispielsweise Tris(hydroxymethyl)aminomethan-gepufferter Kochsalzlösung gelöst sind, etwa 0,001 Gew/V-% bis etwa 2 Gew/V-% Polyvinylpyrrolidon und einen Bestandteil oder ein Gemisch von: etwa 0,02 Gew/V-% bis etwa 1 Gew/V-% Gelatine, etwa 0,02 Gew/V-% bis etwa 1 Gew/V-% fettarme Trockenmilch, etwa 0,02 Gew/V-% bis etwa 1 Gew/V-% Rinderserumalbumin und etwa 0,01 Gew/V-% bis etwa 0,3 Gew/V-% Casein.
In Verbindung mit einem Blockierungsreagens oder -reagentien kann ein grenzflächenaktives Mittel auf die Membran in einer Konzentration, die zur Förderung eines homogenen Flusses der Testlösung durch die Testvorrichtung ausreichend ist, zur Erleichterung der Migration der derivatisierten markerbeladenen Liposomen ohne Lysis der Liposomen appliziert werden. Geeignete grenzflächenaktive Mittel umfassen Brij^TM (Polyoxyethylenether), Tween 20^TM (Polyoxyethylensorbitanmonolaurat), Triton X-100^TM (tert-Octylphenoxypolyethoxyethanol), Natriumdodecylsulfat, n-Octyl-D-glucopyranosid, Span 20^TM, Nonindet P-40, Chapso^TM, Turgitol^TM und Natriumdioxycholat. Die Konzentration des verwendeten bzw. der verwendeten grenzflächenaktiven Mittel in einer Blockierungslösung hängt teilweise von der Liposomzusammensetzung ab. Im allgemeinen können grenzflächenaktive Mittel in einer Konzentration von etwa 0 bis etwa 0,01 Volumenprozent der Blockierungslösung, vorzugsweise etwa 0,001 bis etwa 0,005 Volumenprozent der Blockierungslösung eingearbeitet werden. Es ist wichtig, dass die Konzentration des auf das absorbierende Material applizierten grenzflächenaktiven Mittels gesteuert wird, da eine vorzeitige Lyse der Liposomen erfolgen kann, wenn die Konzentration des grenzflächenaktiven Mittels zu hoch ist. Bevorzugte grenzflächenaktive Mittel umfassen Polyoxyethylenether, Polyoxyethylensorbitanmonolaurat, tert-Octylphenoxypolyethoxyethanol, Natriumdodecylsulfat, Octylglucopyranosid und Natriumdioxycholat.
Blockierungsmittel werden in einer Pufferlösung auf die Membran appliziert. Geeignete Pufferlösungen umfassen Tris(hydroxymethyl)aminomethan/HCl (Tris/HCl), Tris/Citrat, Tris/Maleat, Tris/Glycin, Phosphatpuffer, HEPES und andere biologische Puffer in dem korrekten pH-Bereich.
Die Membran kann eine Einzelstruktur, wie eine in Streifen geschnittene Lage, sein. Die Membran kann auf einem Trägermaterial, wie im folgenden vollständiger beschrieben ist, montiert sein. Andererseits kann die Membran ihren eigenen Träger ergeben. In einer Ausführungsform der Erfindung umfasst die Testvorrichtung einen Streifen eines speziellen Materials, das an einen Träger oder eine feste Oberfläche, die beispielsweise in der Dünnschichtchromatographie gefunden wird, gebunden ist. Die Membran kann eine Lage mit darauf befindlichen Spuren sein oder eine gleichförmige Lage mit der Fähigkeit der Aufteilung in getrennte Spuren durch physikalische Entfernung des absorbierenden Materials von dem Träger zur Induktion einer Spurenbildung sein, wobei ein getrennter Test in jeder Spur durchgeführt werden kann, wie dies in US-Patent Nr. 5 958 791 von Roberts et al., das hierdurch als Bezug aufgenommen ist, angegeben ist. Die Membranen können eine Vielzahl von Formen, die rechteckig, kreisförmig, oval, dreieckig oder dgl. umfassen, aufweisen, vorausgesetzt, es besteht mindestens eine Richtung der Durchquerung eines Testgemischs durch Kapillarmigration. Andere Durchquerungsrichtungen können auftreten, beispielsweise bei einem ovalen oder kreisförmigen Teil, das in der Mitte mit dem Testgemisch kontaktiert wird. Jedoch besteht die Hauptüberlegung darin, dass eine Flussrichtung von der Zone immobilisierter Liposomen durch die Einfangzone vorhanden ist. Bei dieser Diskussion werden Streifen eines Membranträgers zur Erläuterung und nicht zur Beschränkung beschrieben.
Die derivatisierten markerbeladenen Liposomen werden auf die Testvorrichtung durch einfache Dehydratation unter Vakuumdruck eingeführt. Insbesondere wird ein Gemisch, das derivatisierte markerbeladene Liposomen und einen oder mehrere Zucker in einer zur Förderung nder Stabilität der Liposomen während der Dehydratation und Rehydratation ausreichenden Menge aufweist, auf einen passenden Teil der Membran appliziert. Die Membran wird dann in einem Vakuumofen bei Temperaturen einer Höhe, der die Membran und die Liposomen widerstehen können, typischerweise bei etwa 4 °C bis etwa 80 °C, zweckmäßigerweise etwa 4 °C bis etwa 50 °C und vorzugsweise etwa 10 °C bis etwa 50 °C, unter entsprechender Einstellung der Trocknungsdauer getrocknet.
Wie im vorhergehenden beschrieben, umfasst das Verfahren zur Herstellung der Testvorrichtung der vorliegenden Erfindung das Bereitstellen eines Gemischs, das derivatisierte markerbeladene Liposomen und einen oder mehrere Zucker in einer zur Förderung der Stabilität der Liposomen während der Dehydratation und Rehydratation ausreichenden Menge umfasst. Geeignete Zucker umfassen, ohne hierauf beschränkt zu sein, Saccharose, Trehalose, Maltose, Glucose, Lactose und Gemische derselben.
Vorzugsweise umfasst das Gemisch etwa 0,1 M bis etwa 2 M Zucker, stärker bevorzugt etwa 0,7 M bis etwa 1 M.
In einer Ausführungsform umfassen die derivatisierten markerbeladenen Liposomen auch einen oder mehrere Zucker, die in den Liposomen eingefangen sind, d.h. Zucker, der sowohl im Inneren als auch außerhalb der Vesikel vorhanden ist. Geeignete Zucker sind im vorhergehenden beschrieben. Verfahren zur Bereitstellung von Liposomen mit eingefangenen Zuckern, die auch einschlägig bekannt sind, sind beispielsweise in Beispiel II der vorliegenden Anmeldung, bei Madden et al., Biochimica et Biophysica Acta, 817: 67- 74 (1985) und Harrigan et al., Chemistry and Physics of Lipids, 52: 139–149 (1990), die hier als Bezug aufgenommen sind, beschrieben.
In einer bevorzugten Ausführungsform sind der eine oder die mehreren Zucker nur in dem Gemisch, d.h. nur außerhalb der Vesikel, vorhanden.
Wie im vorhergehenden beschrieben umfasst das Verfahren zur Herstellung einer Testvorrichtung gemäß der vorliegenden Erfindung das im wesentlichen Dehydratisieren des Gemischs, das derivatisierte markerbeladene Liposomen umfasst, auf der Membran unter Vakuumdruck. Geeignete Vakuumdrücke umfassen etwa 5 bis etwa 25 psi, vorzugsweise etwa 10 bis etwa 15 psi, wobei die Dehydratationsdauer mit dem Vakuumdruck variiert.
Die Wanderung bzw. Migration der Testprobe wird vorzugsweise durch Einführen eines Reagens mit Saugwirkung, vorzugsweise einer Pufferlösung, auf der Membran zum Tragen der Testkomponenten längs des Trägers unterstützt. Alternativ ist es, wenn das Probenvolumen ausreichend groß ist, nicht notwendig, eine getrennte Pufferlösung zu verwenden.
Der Träger für die Membran ist, wenn ein Träger gewünscht wird und notwendig ist, normalerweise hydrophob, wasserunlöslich, nicht-porenhaltig und steif und er besitzt üblicherweise die gleiche Länge und Breite wie der absorbierende Streifen, kann jedoch größer oder kleiner sein. Eine breite Vielzahl organischer und anorganischer Materialien, sowohl natürliche als auch synthetische, und Kombinationen derselben können verwendet werden, wobei nur vorausgesetzt wird, dass der Träger die Bildung des Signals von dem Marker nicht stört. Polymere zur Erläuterung umfassen Polyethylen, Polypropylen, Poly(4-methylbuten), Polystyrol, Polymethacrylat, Poly(ethylenterephthalat), Nylon, Poly(vinylchlorid), Poly(vinylbutyrat), Glas, Keramiken, Metalle und dgl.
Die Größen der Membranteile hängen von mehreren Überlegungen ab. Die folgende Diskussion konzentriert sich primär auf Membranstreifen zum Zwecke der Erläuterung und nicht der Beschränkung. Wie im vorhergehenden genannt wurde, fallen andere Formen, wie kreisförmig, oval, trigonal und dgl., in gleicher Weise in den Schutzumfang dieser Erfindung. Die Abmessungen derselben und sonstige Parameter können vom Fachmann unter Bezug auf die hier gegebene Offenbarung bestimmt werden.
Wenn der Kapillarfluss vorwiegend nach oben erfolgt, steuern die Porengröße, Länge und Dicke des Streifens die Gemischmenge, die die Einfangzone passieren kann. Wenn der Transport eines großen Volumen des Testgemischs gewünscht wird, muss die Flüssigkeitskapazität des Streifens unter der Einfangzone so ausreichend sein, dass das gewünschte Volumen untergebracht wird. Alternativ kann ein zusätzliches absorbierendes Material, absorbierendes Kissen oder ein Schwamm, die hier als Kissen mit Saugwirkung bezeichnet werden, zum Kontaktieren des Endes der Membran über die Einfangzone hinaus verwendet werden. Ein Kissen mit Saugwirkung kann auf diese Weise in Situationen verwendet werden, in denen es gewünscht wird, ein größeres Volumen des Testgemischs über die Testvorrichtung zu ziehen.
Um Reagentien zu konservieren und Proben beschränkter Größe bereitzustellen, ist die Breite des Streifens allgemein relativ schmal, üblicherweise weniger als 20 mm, vorzugsweise weniger als 10 mm. Allgemein beträgt die Breite des Streifens nicht weniger als etwa 2 mm und sie liegt üblicherweise im Bereich von etwa 2 mm bis 10 mm, vorzugsweise etwa 3 mm bis 6 mm.
Wie detailliert im folgenden beschrieben, kann die Testvorrichtung gemäß der Erfindung zur gleichzeitigen Mehrfachanalyterfassung oder -bestimmung modifiziert werden. Die Länge des Streifens hängt von der Konzentration des Analyts und praktischen Überlegungen, wie einfache Handhabung und Zahl der Messbereiche auf dem Streifen, ab, und sie beträgt etwa 4 cm bis 20 cm, üblicherweise etwa 5 cm bis 15 cm, vorzugsweise etwa 6 bis 13 cm, sie kann jedoch von jeder praktikablen Länge sein. Die Struktur des Streifens kann in weitem Umfang variiert werden und sie umfasst fein, mittelfein, mittel, mittelgrob und grob. Die Wahl der Porosität des Materials kann auf der Bindungsrate der Komponenten für einen gegebenen Test beruhen.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird eine Testvorrichtung gemäß der vorliegenden Erfindung durch Auftragen eines ersten Bindungsmaterials auf die Membran in einem passenden Bereich und anschließendes Trocknen der Membran, vorzugsweise unter Vakuumdruck, hergestellt. Anschließend wird die Membran blockiert und während eines geeigneten Zeitraums, der durch die Membran und Blockierungsmittel, die verwendet wurden, bestimmt wird, vorzugsweise unter Vakuumdruck getrocknet. Die derivatisierten markerbeladenen Liposomen werden dann auf einen passenden Bereich auf der Membran appliziert und die Membran wird erneut unter Vakuumdruck getrocknet.
1 zeigt eine Testvorrichtung gemäß der vorliegenden Erfindung, die unmittelbar nach der Einführung in die Testprobe 208, die in der Schale 210 gehalten wird, gezeichnet wurde. Wie in 1 angegeben, ist die Membran 212 auf einem Träger 214 montiert. Die in 1 gezeigte Testvorrichtung umfasst eine Zone 216 immobilisierter Liposomen, die wie im vorhergehenden beschrieben daran gebundene dehydratisierte derivatisierte markerbeladene Liposomen aufweist, und eine Einfangzone 206, die wie im vorhergehenden beschrieben ein daran gebundenes erstes Bindungsmaterial für die passenden derivatisierten markerbeladenen Liposomen aufweist.
Bei der Verwendung in einem Konkurrenzformat der vorliegenden Erfindung wird die Membran 212 in die Testprobe 208 eingeführt. Das Benetzen der Membran 212 durch Kapillarwirkung wird fortgesetzt, bis mindestens die Einfangzone 206 mit der Testprobe 208 befeuchtet ist (und vorzugsweise bis die Lösemittelfront das Ende der Membran erreicht). Die Testprobe 208 durchquert die Testvorrichtung in die und durch die Zone immobilisierter Liposomen 216, wo dehydratisierte, mit einem Analytanalog-Tag versehene, markerbeladene Liposomen rehydratisiert werden. Die Testprobe 208 durchquert weiter die Testvorrichtung in die und durch die Einfangzone 206, wo eine Konkurrenz zwischen den rehydratisierten, mit einem Analytanalog-Tag versehenen, markerbeladenen Liposomen und dem Analyt in der Testprobe um Bindungsstellen mit dem in der Einfangzone 206 gebundenen ersten Bindungsmaterial erfolgt. Wenn in der Probe weniger Analyt vorhanden ist, binden mehr Liposomen an die Einfangzone, weshalb die Intensität des Markers in der Einfangzone umgekehrt zur Konzentration des Analyts in der Testprobe variiert.
Die Testprobe kann aus einer breiten Vielzahl von Quellen, beispielsweise physiologische Flüssigkeiten, beispielsweise Speichel, Schweiß, Serum, Plasma, Urin, Tränenflüssigkeit, Cerebrospinalflüssigkeit und dgl., chemische Behandlungsströme, Nahrungsmittel, Abwasser, natürliche Wässer, Erdextrakte und dgl., stammen. Verschiedene Zusatzstoffe können zur Einstellung der Eigenschaften des Testgemischs oder einer Trägerlösung, die als Reagens mit Saugwirkung verwendet wird, in Abhängigkeit von den Eigenschaften der anderen Komponenten der Vorrichtung sowie von denjenigen der Liposomen oder des Analytanalogon-Liposom-Konjugats oder des Analyts selbst zugesetzt werden. Beispiele für Lösungszusatzstoffe, die in Test-, Kontroll- oder Trägerlösungen oder -gemische gemäß der Erfindung eingearbeitet werden können, umfassen Puffer, beispielsweise pH-Puffer und Ionenstärkepuffer, die Probe oder den Analyt solubilisierende Mittel, beispielsweise unpolare Lösemittel, und Polymere mit hohem Molekulargewicht, wie Ficoll^®, ein nichtionisches synthetisches Polymer von Saccharose, das von Pharmacia erhältlich ist, und Dextran.
Bei dem Verfahren zum Nachweisen oder quantitativen Bestimmen eines Analyts in einer Probe gemäß der vorliegenden Erfindung wird die Membran mit Testgemisch, beispielsweise durch Eintauchen eines Kontaktbereichs des absorbierenden Materials in das Testgemisch, kontaktiert. Alternativ kann das Testgemisch mit der Membran durch Auftüpfeln des Testgemischs auf das absorbierende Material in einem Kontaktbereich, beispielsweise für Lateralflusstests, kontaktiert werden.
Die Bewegung der Testkomponenten längs der Membran bzw. Membranen beruht auf Kapillarwirkung. Diese Kapillarbewegung längs der Membran verursacht den Transport des Testgemischs zu der und durch die Einfangzone, wo die Messung des Markers von den Liposomen stattfindet.
In einer bevorzugten Ausführungsform verwenden die Testvorrichtung und die Verfahren der vorliegenden Erfindung eine Lateralfluss statt einer Aufwärtsströmung zur Wanderung der Testprobe und der rehydratisierten derivatisierten markerbeladenen Liposomen durch die Testvorrichtung.
Wenn quantitative Ergebnisse gewünscht werden, wird das Befeuchten der Membran und von etwaigen anderen absorbierenden Materialien, falls diese vorhanden sind, durch Kapillarwirkung fortgesetzt, bis ein ausreichendes Volumen von Testgemisch und/oder Pufferlösung durch die Einfangzone gelaufen ist, um sicherzustellen, dass etwaiger in dem Testgemisch vorhandener Analyt die Einfangzone erreicht hat. Wenn nur das Nachweisen gewünscht wird, muss weniger darauf geachtet werden, sicherzustellen, dass der gesamte Analyt die Einfangzone erreicht hat. Es ist möglich, Laufzeiten und Puffervolumina unter Verwendung von Vorversuchen unter Verwendung eines kolorimetrischen Nachweises, der hier und bei Rule et al., Clin. Chem., 42: 1206–1209 (1996), das hierdurch als Bezug aufgenommen ist, beschrieben ist, oder eines elektrochemischen Nachweises gemäß der Beschreibung in US-Patent Nr. 5 958 791 und der US-Patentanmeldung des Aktenzeichens 09/315 576, eingereicht am 20. Mai 1999, das hierdurch als Bezug aufgenommen ist, zu "eichen".
Größtenteils sind relativ kurze Zeiten zur Durchquerung des Streifens durch das Testgemisch erforderlich. Üblicherweise dauert der Transport des Testgemischs über den Streifen mindestens 30 Sekunden und nicht mehr als 45 Minuten bis 1 Stunde, üblicherweise etwa 1 Minute bis 10 Minuten. Gemäß dem Verfahren der Erfindung ist das Signal rasch, sogar unmittelbar nachweisbar.
Das Konjugat des zweiten Bindungsmaterials oder des Analytanalogons und der markereinkapselnden Liposomen kann durch allgemein einschlägig bekannte Verfahren hergestellt werden, wobei das in einem gegebenen Fall verwendete spezielle Verfahren von den Liposomkomponenten und dem Bindungsmaterial, die verwendet werden, abhängt. Derartige Techniken umfassen kovalente Kopplung, Derivatisierung oder Aktivierung und dgl. Die Liposomen können aus einer Komponente, die mit dem zweiten Bindungsmaterial oder Analytanalogon derivatisiert wurde, hergestellt werden, wodurch die Liposomen, wenn sie hergestellt werden, mit dem zweiten Bindungsmaterial oder Analytanalogon konjugiert werden. In einem anderen Verfahren können die Liposomen einschließlich des Markers zunächst gebildet werden und anschließend die Liposomen mit dem zweiten Bindungsmaterial oder Analytanalogon durch einschlägig bekannte Verfahren konjugiert werden.
Liposomen können aus einer breiten Vielzahl von Lipiden, die Phospholipide, Glykolipide, Steroide, relativ langkettige Alkylester; beispielsweise Alkylphosphate, Fettsäureester; beispielsweise Lecithin, Fettsäureamine und dgl., hergestellt werden. Ein Gemisch von Fettmaterialien, beispielsweise eine Kombination aus einem neutralen Steroid, einem Ladungsamphiphil und einem Phospholipid, kann verwendet werden. Beispiele zur Erläuterung von Phospholipiden umfassen Lecithin, Sphingomyelin und Dipalmitoylphosphatidylcholin und dgl. Repräsentative Steroide umfassen Cholesterin, Cholestanol, Lanosterol und dgl. Repräsentative ladungsamphiphile Verbindungen enthalten allgemein 12 bis 30 Kohlenstoffatome. Mono- oder Dialkylphosphatester oder Alkylamine; beispielsweise Dicetylphosphat, Stearylamin, Hexadecylamin, Dilaurylphosphat und dgl., sind repräsentativ.
Die Liposomtaschen werden in wässriger Lösung, die den Marker enthält, hergestellt, wodurch die Taschen den Marker in ihrem Inneren aufnehmen. Die Liposomtaschen können durch kräftiges Rühren in der Lösung und anschließendes Entfernen des nicht-eingekapselten Markers hergestellt werden. Weitere Einzelheiten in Bezug auf die Herstellung von Liposo men sind in US-Patent Nr. 4 342 826 und der PCT International Publication Nr. WO 80/01515, die beide als Bezug aufgenommen sind, angegeben.
Mit der Testvorrichtung und dem Verfahren gemäß der Erfindung kann auch eine Testprobe auf eine Mehrzahl von Analyten, wie toxische Chemikalien oder Pathogene, getestet oder auf eine oder mehrere einer Mehrzahl von Analyten, die einschlägig bekannt ist, durchmustert werden.
Zur bequemeren Handhabung kann die vorliegende Vorrichtung in einem Kit in einer abgepackten Kombination mit vorgegebenen Mengen von Reagentien zur Verwendung bei Tests auf einen Analyten oder eine Mehrzahl von Analyten bereitgestellt werden. Neben der Testvorrichtung mit dehydratisierten derivatisierten markerbeladenen Liposomen können andere Zusatzstoffe, wie Hilfsreagentien, beispielsweise Stabilisierungsmittel, Puffermittel und dgl., enthalten sein. Die relativen Mengen der verschiedenen Reagentien können in weitem Umfang zur Bereitstellung einer Konzentration der Reagentien in Lösung, die die Empfindlichkeit des Tests wesentlich optimiert, variiert werden. Die Reagentien können als Trockenpulver, üblicherweise lyophilisiert, einschließlich von Streckmitteln, die bei Auflösen eine Reagenzlösung mit den passenden Konzentrationen zur Durchführung des Tests ergeben, bereitgestellt werden. Das Kit oder die Packung kann andere Komponenten, wie Standards des Analyts oder der Analyte (Analytproben mit bekannten Konzentrationen des Analyts), umfassen.
Die vorliegende Erfindung ist für Verfahren und Produkte zur Bestimmung einer breiten Vielzahl von Analyten verwendbar. Als repräsentative Beispiele für Analytarten können genannt werden: Umgebungs- und Nahrungsmittelkontaminationsstoffe, die Pestizide und toxische Industriechemika lien umfassen; Arzneimittel, die therapeutische Arzneimittel und Drogen des Missbrauchs umfassen; Hormone, Vitamine, Proteine, die Enzyme, Rezeptoren und Antikörper aller Klassen umfassen; Prionen; Peptide; Steroide; Bakterien; Pilze; Viren; Parasiten; Komponenten oder Produkte von Bakterien, Pilzen, Viren oder Parasiten; Aptamere; Allergene aller Arten; Produkte oder Komponenten normaler oder bösartiger Zellen; und dgl. Als spezielle Beispiele können T₄; T₃; Digoxin; hCG; Insulin; Theophyllin; Luteinisierungshormone und Organismen, die verschiedene Krankheitszustände verursachen oder mit diesen in Verbindung stehen, wie Streptococcus pyrogenes (Gruppe A), Herpes Simplex I und II, Cytomegalovirus, Chlamydien und dgl., genannt werden. Die Erfindung kann auch zur Bestimmung relativer Antikörperaffinitäten und für relative Nucleinsäurehybridisierungsexperimente, einen Restriktionsenzymtest mit Nucleinsäuren und die Bindung von Proteinen oder anderem Material an Nucleinsäuren verwendet werden.
Eine gemäß der vorliegenden Erfindung hergestellte Vorrichtung kann in einer Vielzahl von Tests, wie Tests der kompetitiven Bindung und Sandwich-Tests gemäß der Beschreibung in US-Patent Nr. 5 789 154 von Durst et al., US-Patent Nr. 5 756 362 von Durst et al., US-Patent Nr. 5 753 519 von Durst et al., US-Patent 5 958 791 von Roberts et al., der gleichzeitig anhängigen US-Patentanmeldung des Aktenzeichens 09/027 324, eingereicht am 20. Februar 1998, der gleichzeitig anhängigen US-Patentanmeldung des Aktenzeichens 09/034 086, eingereicht am 3. März 1998, der gleichzeitig anhängigen US-Patentanmeldung des Aktenzeichens 09/354 471, eingereicht am 15. Juli 1999 und der gleichzeitig anhängigen US-Patentanmeldung des Aktenzeichens 09/315 576, eingereicht am 20. Mai 1999, die hierdurch als Bezug aufgenommen sind, verwendet werden.
Wie im vorhergehenden angegeben, kann der Test qualitativ (Vorhandensein oder Nichtvorhandensein einer bestimmten Analytkonzentration) oder quantitativ oder halbquantitativ sein. Die Herstellung von geeigneten Standards und/oder Standardkurven wird aufgrund der hier gegebenen Lehren als innerhalb des Kenntnisumfangs des Fachmanns liegend betrachtet.
Die Verfahren gemäß der Erfindung und die Herstellung und Verwendung der Testvorrichtung gemäß der Erfindung werden durch die folgenden Beispiele erläutert.
BEISPIELE
Beispiel 1 – Materialien
Dipalmitoylphosphatidylcholin (DPPC) und Dipalmitoylphosphatidylglycerin (DPPG) wurden von Avanti Polar Lipids, Inc. (Alabaster, AL) erhalten. Sulforhodamin B (SRB), N-((6-(Biotinoyl)amino)hexanoyl)-1,2-dihexadecanoyl-snglycero-3-phosphoethanolamin-triethylammoniumsalz (biotinyliertes DPPE) und D-(+)-Biotin wurden von Molecular Probes (Eugene, OR) gekauft. Polyvinylpyrrolidon (PVP, 10 000 Da), Cholesterin, normales humanes Serum (NHS), Gelatine, Rinderserumalbumin (BSA), Saccharose, Trehalose, Tris(hydroxymethyl)aminomethan (Tris), Tween 20 und Sephadex G-50 wurden von Sigma Chemical Co., (St. Louis, MO) gekauft. Fettarme Trockenmilch der Sorte Carnation (NFDM) wurde lokal erworben. Polycarbonatspritzenfilter der Porengröße 3 μm, 0,4 μm und 0,2 μm wudren von Osmonics Laboratory Products (Livermore, CA) gekauft, und Nitrocellulosemembranen mit Mylarträger mit einer Porengröße von 8 μm wurden von Sartorius Corp. (Göttingen, Deutschland) und Millipore Corp. (Bedford, MA) erhalten. Das Tensid n-Octyl-β-D-glucopyranosid wurde von Pfanstiehl Laboratories, Inc. (Waukegan, IL) erhalten.
Beispiel 2 – Herstellung von mit Biotin-Tag versehenen farbstoffbeladenen Liposomen
Fünf Chargen von Liposomen, als I bis V markiert, wurden zur Untersuchung der Stabilisierungswirkung von Zucker (Trehalose) im Inneren der Liposomen hergestellt. Die Chargen wurden durch ein modifiziertes Umkehrphasenverdampfungsverfahren (Siebert et al., Anal. Chim. Acta, 282: 297-305 (1993); Szoka et al., Biochim. Biophys. Acta, 601: 559-571 (1980); O'Connell et al., Clin. Chem., 31: 1424–1426 (1985, die hierdurch als Bezug aufgenommen sind) aus einem Gemisch von DPPC, Cholesterin, DPPG und biotinyliertem DPPE in einem Molverhältnis von 4,7:4,8:0,5:0,01 hergestellt. Im Lumen der Liposomen waren die gleichen Konzentrationen von Sulforhodamin B (100 μM), zunehmende Mengen von Trehalose und abnehmende Mengen von Tris/(Hydroxymethyl)aminomethan/HCl (Tris/HCl)-Puffer, pH-Wert 7,0, zum Aufrechterhalten eines Osmolalitätwerts von 827 mOsmol/kg für jede Zubereitung (siehe Tabelle 1) verkapselt.
Tabelle 1 Eigenschaften von mit einem Biotin-Tag versehenen Liposomen Liposomzubereitung
Kurz gesagt, umfasste das Verfahren das Auflösen der Lipide in einem Lösemittelgemisch, das Chloroform:Isopropylether:Methanol (6:6:1, V/V) enthielt. Die Temperatur wurde während des gesamten Verfahrens bei 45 °C gehalten. Das Verkapselungsmittel wurde zugegeben und das Gemisch wurde 5 min unter einem geringen Stickstoffstrom ultraschallbehandelt. Die organische Phase wurde unter Vakuum auf einem Rotationsverdampfer entfernt. Ein weiteres Aliquot der Verkapselungsmittellösung wurde zugegeben, und die Liposomzubereitung wurde weitere 30 min ultraschallbehandelt. Die Liposomen wurden dann nacheinander dreimal durch 3-, 0,4- und 0,2-μm-Polycarbonatspritzenfilter in Tandemanordnung extrudiert. Zur Entfernung des nicht-eingekapselten Farbstoffs wurde die Zubereitung auf einer Sephadex G-50-150-Säule (Sigma Chemical Co., (St. Louis, MO)), die mit dem passenden Puffer, der eine ähnliche Osmolalität wie die Verkapselungsmittellösung aufweist, equilibriert war, gelfiltriert und gegen 1 Liter des gleichen Puffers dialysiert.
Drei weitere Chargen von Liposomen, markiert als VI bis VIII, wurden zur Untersuchung der Wirkung der Liposomengröße auf die Stabilität hergestellt. Diese Chargen wurden durch das gleichen Umkehrphasenverdampungsverfahren unter Verwendung eines Verkapselungsmittels, das 175 mM Sulforhodamin B in 0,02 M Tris/HCl-Puffer, pH-Wert 7,5 enthielt, (Osmolalität des Verkapselungsmittels gleich 204 mOsmol/kg) hergestellt. Die Unterschiede bei dem Verfahren für die drei Chargen bestanden in der Länge der Ultraschallbehandlungszeit, der jede Charge unterzogen wurde, und der Porengröße der verwendeten Filter, die zu Unterschieden hinsichtlich der Liposomengrößen führte. Längere Ultraschallbehandlungszeiten ergaben kleinere Liposomen.
Alle Liposomen wurden in Puffern, die isoosmolar zu oder bis zu 100 mOsmol/kg über ihrem jeweiligen Verkapselungsmittel waren, bei 4 °C im Dunklen aufbewahrt, bis sie benötigt wurden.
Beispiel 3 – Charakterisierung der Liposomen
Der mittlere Durchmesser der Liposomen wurde durch einen lichtstreuenden Teilchengrößenanalysator auf Laserbasis (PCS Sizing System von Malvern Instruments Ltd, Malvern, UK) ermittelt. Fluoreszenzintensitätsmessungen wurden auf einem McPherson Modell SF 750-Spektrofluorometer (Acton, MA), das bei der Anregungs- und Emissionswellenlänge von 543 bzw. 596 nm betrieben wurde, durchgeführt.
Beispiel 4 – Herstellung von mit Antibiotin beschichteten Teststreifen
Antibiotin-Antikörper wurden auf Nitrocellulosemembranlagen (45 × 160 mm) in einer 2,5 mm breiten Bande 15 mm vom unteren Ende der Lage unter Verwendung eines mikroprozessorgesteuerten Linomat IV TLC Sample Applicator (Camag Scientific, Inc., Wrightsville Beach, NC) immobilisiert. Die antikörperbeschichteten Membranen wurden in einem Vakuumofen (15 psi) bei Raumtemperatur 1 h getrocknet und dann in verschiedene Blockierungsmittel, die in Tris-gepufferter Kochsalzlösung (TBS; 0,02 M Tris/HCl, 0,15 M NaCl, 0,01 NaN₃, pH-Wert 7,0) gelöst waren, 1 h getaucht. Die blockierten Membranen wurden bei Raumtemperatur in einem Vakuumofen während unterschiedlicher Zeiträume getrocknet und in Streifen (5 × 45 mm) geschnitten. Jeder Teststreifen enthielt 4,5 μg Antibiotin in der Einfangzone. Die Streifen wurden bei 4 °C in vakuumversiegelten Kunststoffbeuteln aufbewahrt, bis sie zur Verwendung bereit waren.
Glasierte Streifen wurden durch Applizieren von Saccharoselösungen unterschiedlicher Konzentrationen unter Verwendung des Linomat IV Sample Applicator auf eine Fläche 6 mm unter der Antibiotinbande auf Nitrocellulosemembranlagen, die zuvor mit Antibiotin-Antikörpern beschichtet und mit 0,2 PVP und 0,01 % Gelatine in TBS blockiert wurden, hergestellt. Die glasierten Membranen wurden 1 h luftgetrocknet, bevor sie zu Streifen von 5 × 45 mm geschnitten und in vakuumversiegelten Kunststoffbeuteln aufbewahrt wurden, bis sie zur Verwendung bereit waren.
Beispiel 5 – Dehydratation von Liposomen auf mit Antibiotin beschichteten Streifen
Liposomlösungen wurden unter Verwendung von Verdünnungsmitteln, die unterschiedliche Streckmittel in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS; 0,01 M KH₂PO₄/K₂HPO₄, 0,15 M NaCl und 0,01 % NaN₃, pH-Wert 7,0) enthielten, hergestellt. Ein Mikroliter der verdünnten Liposomlösung wurde an einem Punkt 6 mm unter der Antibiotinbande appliziert und sofort mit Aluminiumfolie bedeckt, um eine Lyse von mit Sulforhodamin B (SRB) beladenen Liposomen durch Licht zu verhindern (es wurde beobachtet, dass SRB-Verkapselungsliposomen gegenüber Licht etwas empfindlich waren). Die Streifen wurden in einem Vakuumofen (15 psi) bei Raumtemperatur 2 h getrocknet.
Streifen ohne Liposomen wurden ebenfalls in dem Vakuumofen gleichzeitig mit den Teststreifen zur Verwendung als Kontrollen getrocknet. Der Zweck bestand darin, den gleichen Hydratationsgrad in sowohl den Teststreifen als auch den Kontrollen zu erhalten.
Für die Experimente, bei denen die Wirkungen einer Zuckerglasur unter den dehydratisierten Liposomen untersucht wurde, wurde 1 μl der Liposomlösung oben auf die Zuckerglasur appliziert und ebenfalls in dem Vakuumofen bei Raumtemperatur 2 h getrocknet.
Beispiel 6 – Rückgewinnungstestprotokoll
Der Rückgewinnungstest wurde durch Einführen der Teststreifen in ein Teströhrchen oder eine Haltevorrichtung, der bzw. die PBS (pH-Wert 7,4) oder NHS als Träger oder mobile Phase enthielt, durchgeführt. Wenn die Lösungsfront das obere Ende des Streifens erreichte, wurde der Streifen entfernt und luftgetrocknet. Die Antibiotin-Einfangzone sammelte die Liposomen mit Biotin-Tag, die nach dem Dehydratations/Rehydratationsprozess intakt blieben. Die Kontrolle bestand aus der Applikation von 1 μl der gleichen Liposomlösung auf die Kontrollstreifen an einem Punkt 6 mm unter der Antibiotinbande und dem unmittelbaren Einführen derselben – ohne Trocknen – in die die mobile Phase enthaltenden Teströhrchen.
Beispiel 7 – Biotintestprotokoll
Der Test wurde durch Einführen der Teststreifen, die die dehydratisierten SRB-beladenen Liposomen mit Biotin-Tag in einer Zone unter der Antibiotinbande enthielten, in Teströhrchen, die die flüssige Probe oder die Eichproben von Biotin in PBS, TBS oder NHS hielten, durchgeführt. Wenn die Lösungsfront das obere Ende des Streifens erreichte, wurde der Streifen entfernt und luftgetrocknet.
Beispiel 8 – Nachweis und quantitative Bestimmung
Die Farbintensität der Antibiotin-Einfangzone wurde optisch ermittelt. Für eine genauere quantitative Bestimmung der Rotfärbung der Bande wurden ein Hewlett-Packard ScanJet IIc Desktop Scanner (Palo Alto, CA) und Scan Analysis Densitometry Software (Biosoft, Ferguson MO), die auf einem Macintosh Performer 636CD installiert war, verwendet. Dieser Ansatz ermöglichte die Umwandlung der Rotfärbung in eine Grauwertskalaablesung, die quantitativ bestimmt werden konnte (Siebert et al., Anal. Chim. Acta, 282: 297–305 (1993), das hierdurch als Bezug aufgenommen ist). Die Ergebnisse sind in willkürlichen Einheiten der Grauwertskalaintensität oder als Prozentsatz der Rückgewinnung der dehydratisierten/rehydratisierten Liposomen im Vergleich zu der Kontrolle, d.h. unter Zuordnung eines Werts von 100 % für die Kontrolle, dargestellt.
Beispiel 9 – Liposomeigenschaften
Die Fluoreszenz von Sulforhodamin B ist selbstlöschend, wenn es mit hoher Konzentration eingekapselt wird, weshalb die Unversehrtheit der Liposomen durch Ermitteln der Fluoreszenz einer Liposomlösung vor und nach einer Lysis der Liposomen bestimmt werden kann. Die Gesamtlyse der Liposomen wurde durch die Zugabe einer Lösung von n-Octyl-β-D-glucopyranosid zu einer Endkonzentration von 30 mM erhalten. Die Stabilität über die Zeit kann durch Ermitteln des Prozentgehaltes des freien Farbstoffs in der Zubereitung untersucht werden. Die Ermittlung von in den Liposomen eingekapseltem Farbstoff und die Bestimmung der Liposomengröße durch das Laserstreuungsverfahren ermöglichte die Berechnung der Liposomeigenschaften (siehe Tabelle 1). Alle Berechnungen wurden wie bereits beschrieben durchgeführt (Siebert et al., Anal. Chim. Acta, 282: 297–305 (1993), das hierdurch als Bezug aufgenommen ist), wobei berücksichtigt wurde, dass das DPPE-Biotin 0,1 Mol-% der Gesamtlipide beträgt, und unter der Annahme, dass der verkapselte Farbstoff die gleiche Konzentration wie die verwendete ursprüngliche Farbstofflösung aufwies, dass die Doppel schichtdicke 4 nm beträgt und dass die durchschnittliche Oberflächenkopfgruppenfläche von DPPC-Molekülen und Cholesterinmolekülen in einer Mischdoppelschicht 0,71 bzw. 0,19 nm² beträgt (Israelachvili et al., Biochim. Biophys. Acta, 389: 13–19 (1975), das hierdurch als Bezug aufgenommen ist).
Beispiel 10 – Gewinnung von dehydratisierten/rehydratisierten Liposomen auf Nitrocellulosestreifen
Grundlegend waren zwei Hauptpunkte bei dem Dehydratations/Rehydratationsprozess von Liposomen auf Nitrocellulosestreifen wichtig. Der erste war die Bestimmung der passenden Blockierungsmittel und Trocknungsbedingungen für die Membranen und der zweite war die Untersuchung der Komponenten der Liposomzubereitung, die das (innere) Einkapselungsmittel, das (externe) Streckmittel in dem Verdünnungsmittel umfassten, und der Eigenschaften der Liposomen.
Anfangstests umfassten die Verwendung variierender Konzentrationen unterschiedlicher Blockierungsmittel, die in Tris-gepufferter Kochsalzlösung hergestellt wurden. Polyvinylpyrrolidon (PVP), Gelatine, Rinderserumalbumin (BSA) und fettarme Trockenmilch (NFDM) wurden mit 0,02, 0,1 und 0,5 % und Tween 20 mit 0,002 und 0,02 % getestet. Die Liposomcharge VII (keine interne Trehalose) wurde mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) (keine Streckmittel) verdünnt und 1 μl wurde auf den blockierten Nitrocellulosestreifen unter der Antibiotinbande wie im vorhergehenden beschrieben dehydratisiert. Von den getesteten Blockierungsmitteln ergab PVP den besten Schutz der Liposomen nach dem Dehydratations/Rehydratationszyklus, was durch das höchste Signal, das in der Antibiotin-Einfangzone erhalten wurde, angezeigt wurde. Die Blockierungsmittel sind in der Reihenfolge abnehmender Wirksamkeit hinsichtlich der Kon servierung der dehydratisierten Liposomen mit ihren individuellen optimalen Konzentrationen und dem jeweiligen Prozentsatz der Rückgewinnung der erhaltenen Liposomen aufgelistet: 0,5 % PVP (14,9 % Rückgewinnung) > 0,1 % Gelatine (8,7 % Rückgewinnung) > 0,02 % BSA (3,7 % Rückgewinnung) > 0,1 % NFDM (2,5 % Rückgewinnung). Die Verwendung nicht-blockierter Membranen (mit Tris-gepufferter Kochsalzlösung behandelt) und von mit Tween 20 blockierten Membranen führte zur vollständigen Lyse der Liposomen, wenn die getrockneten Liposomen durch die mobile Phase rehydratisiert wurden.
Trocknen der blockierten Membran über Nacht (14 h) im Vakuumofen (15 psi) bei Raumtemperatur führte zu sehr trockenen Membranen. Während der Migration der mobilen Phase wurde beobachtet, dass die Migration der Flüssigkeit durch die Einfangzone eine sehr lange Zeit (ca. 15 min) dauerte. Außerdem wanderte die mobile Phase vorzugsweise längs der Streifenränder, was die Chancen von Liposomen zur Bindung in der Einfangzone verringerte. Durch Verringern der Trocknungszeit der blockierten Membranen auf 8 Stunden wanderte die Trägerlösung rascher und gleichförmiger durch die Einfangzone und das Signal auf der Antibiotinbande war verbessert.
Beispiel 11 – Wirkung einer Saccharoseglasur auf die Rückgewinnung der Liposomen
Die Liposomcharge I (keine interne Trehalose) wurde zur Untersuchung der Wirkung einer Saccharoseglasur bzw. eines Saccharosespiegels auf die Rückgewinnung von Liposomen verwendet. Die getestete Saccharosekonzentration lag im Bereich von 0 bis 4,4 μmol/Streifen. Die Ergebnisse zeigten, dass die Saccharoseglasur, die vor der Applikation der Liposomzubereitung zur Dehydratation auf den Streifen plat ziert wurde, eine dramatische Verbesserung der Rückgewinnung der dehydratisierten/rehydratisierten Liposomen ergab. Die Glasur verringerte die zuvor am Punkt der Applikation der Liposomen nach dem Passieren der mobilen Phase beobachtete Aggregation stark und sie erhöhte die Intensität an der Antibiotinbande beträchtlich, was eine höhere Rückgewinnung intakter Liposomen anzeigte. Als optimale Menge der Saccharoseglasur wurden ca. 1,5 μmol/Streifen beobachtet (siehe 2), und dies führte zu 70 % Rückgewinnung. Bei Saccharoseglasuren von größer als ca. 2,2 μmol/Streifen verschwand die Aggregation am Punkt der Applikation der Liposomen vollständig, doch verringerte sich die Signalintensität an der Antibiotinbande.
Beispiel 12 – Komponenten der Liposomzubereitung
1. Zucker außerhalb der Liposome. Aufgrund der Beobachtung, dass die Zuckerglasur die Konservierung der dehydratisierten/rehydratisierten Liposomen stark verbesserte, wurde die Wirkung von als Streckmittel in dem Verdünnungsmittel für die Liposomzubereitung vor deren Applikation auf die Streifen zugesetztem Zucker bewertet und mit den Ergebnissen der Zuckerglasur verglichen. Konzentrationen von Saccharose und Trehalose im Bereich von 0,07 bis 0,6 M wurden in PBS, pH-Wert 7,4, hergestellt und als Verdünnungsmittel für die Liposomcharge I (keine interne Trehalose) verwendet. Ohne externen Zucker trat eine Aggregation am Punkt der Applikation der Liposomen nach der Migration der mobilen Phase über die dehydratisierten Liposomen auf, und die Antibiotinzone band nur sehr wenige Liposomen, d.h. viele der Liposomen erfuhren bei der Rehydratation eine Lyse. Wenn die Konzentration der Zucker erhöht wurde, verringerte sich die Aggregation am Punkt der Applikation, bis die Aggregation vollständig verschwand, und gleichzeitig nahm die Rückgewinnung der dehydratisierten Liposomen zu.
Es wurde beobachtet, dass Saccharose eine leicht bessere Konservierungswirkung als Trehalose aufwies. Ein zusätzlicher Vorteil der Wahl von Saccharose gegenüber Trehalose sind die niedrigeren Kosten. Eine Untersuchung mit höheren Konzentrationen von Saccharose wurde durchgeführt, und es wurde beobachtet, dass die optimale Konzentration von externer Saccharose, die zur Stabilisierung der dehydratisierten Liposomen benötigt wurde, im Bereich von 0,7 bis 1,0 M oder 0,7 bis 1,0 μmol/μl/Streifen lag (siehe 2). Mit Saccharosekonzentrationen von höher als 1,0 M nahm die Rückgewinnung der dehydratisierten Liposomen ab. Außerdem wurde die Durchflussrate der mobilen Phase mit dem hohen Saccharosegehalt nach dem Kontaktieren der dehydratisierten Liposomen sehr langsam. Die Gleichförmigkeit der Einfangzone war ebenfalls vermindert. Die langsamere Durchflussrate kann durch die Zunahme der Viskosität der mobilen Phase aufgrund der Saccharose erklärt werden.
Die in 2 angegebenen Ergebnisse zeigten, dass in dem Verdünnungsmittel für die Liposomen im Vergleich zu der Saccharoseglasur (1,5 μmol/Streifen) weniger Saccharose benötigt wurde (0,7 bis 1,0 μmol/μl/Streifen), um einen Schutz der dehydratisierten Liposomen zu erreichen. Außerdem wurde mit Saccharose in dem Verdünnungsmittel ein höherer Rückgewinnungsgrad erhalten. In Anbetracht dieser Ergebnisse und der Einfachheit der Zugabe von Saccharose zu dem Verdünnungsmittel gegenüber einer Applikation der Zuckerglasur wurde das letztere Verfahren für die anschließende Arbeit gewählt.
2. Zucker im Inneren der Liposomen. Gemäß der Literatur (Crowe et al., Arch. Biochem. Biophy., 242: 240–247 (1985); Madden et al., Biochim. Biophys. Acta, 817: 67–74 (1985); Harrigan et al., Chem. Phys. Lipids, 52: 139–149 (1990); Crowe et al., in: Liposome Technology, Gregoriandis, Hrsg., CRC Press, Boca Raton, FL, Band 1, S. 229–270 (1993), die hierdurch als Bezug aufgenommen sind) muss Trehalose sowohl im Inneren als auch außerhalb der Vesikel vorhanden sein, um die Liposomen während Lyophilisierungs- und Dehydratationsprozessen zu stabilisieren. Zum Zwecke des Ermittelns der optimalen internen Konzentration von Trehalose wurden fünf Liposomchargen hergestellt, die die folgenden Konzentrationen von Trehalose: 0, 10, 50, 100 und 200 mM enthielten (siehe Tabelle 1). Die verschiedenen Liposomchargen wurden mit PBS, das 0,42 M Saccharose enthielt, vor der Applikation auf die Nitrocellulosestreifen zur Dehydratation verdünnt. Die in 3 angegebenen Ergebnisse zeigten, dass in Gegenwart von Saccharose außerhalb der Liposomen in den Liposomen eingekapselte Trehalose die Stabilität der Liposomen, die dem Dehydratations/Rehydratationsverfahren auf Nitrocellulosemembranen unterzogen wurden, nicht verbesserte. Interne Trehalosekonzentrationen von höher als 100 mM können sogar eine Destabilisierungswirkung auf die Liposomen haben. Diese Ergebnisse der Liposomstabilität, die auf Nitrocellulosemembranen erhalten wurden, stehen im Gegensatz zu der positiven Wirkung von sowohl interner als auch externer Trehalose, die für lyophilisierte Liposomen berichtet wurde (Crowe et al., Arch. Biochem. Biophys., 242: 240–247 (1985); Madden et al., Biochim. Biophys. Acta, 817: 67–74 (1985); Crowe et al., in: Liposome Technology, Gregoriandis, Hrsg., CRC Press, Boca Raton, FL, Band 1, S. 229–270 (1993), die hierdurch als Bezug aufgenommen sind) und dehydratisierte Liposomen (Harrigan et al., Chem. Phys. Lipids, 52: 139–149 (1990), das hierdurch als Bezug aufgenommen ist). Eine mögliche Erklärung können Unterschiede in der Lipidzusammensetzung der in dieser Untersuchung verwendeten Liposomen gegenüber den berichteten sein. Eine andere könnten die unterschiedlichen physikalischen Eigenschaften dieser Liposomen, wenn diese auf Membranen dehydratisiert sind, im Vergleich zu denjenigen im gefrorenen oder dehy dratisierten Zustand sein.
Beispiel 13 – Wirkung der Liposomgröße auf die Stabilität
Drei Zubereitungen von Liposomen, die einen Durchmesser von 242, 300 und 384 nm aufwiesen (Chargen VI, VII und VIII in Tabelle 1), wurden untersucht. Obwohl mehrere Berichte (Harrigan et al., Chem. Phys. Lipids, 52: 139–149 (1990); Crowe et al., in: Liposome Technology, Gregoriandis, Hrsg., CRC Press, Boca Raton, FL, Band 1, S. 229–270 (1993); Crowe et al., Biochim. Biophys. Acta, 939: 327–334 (1988), die hierdurch als Bezug aufgenommen sind) zeigten, dass Vesikel mit einem Durchmesser von größer als 200 nm weniger stabil als kleinere waren, wurde die Stabilität der größeren Liposomen wegen der früheren Beobachtung, dass größere Signalintensitäten mit größeren Liposomen erhalten werden konnten, untersucht. während die Ergebnisse in 4 zeigen, dass eine leichte Zunahme der Rückgewinnung für die kleineren Liposomen besteht, können Liposomen mit Durchmessern im Bereich von 242 bis 384 nm nach einem Dehydratations/Rehydratationsverfahren erfolgreich rückgewonnen werden, was sie in einem einstufigen Streifentest verwendbar macht.
Beispiel 14 – Wirkung der Zahl von Liposomen
Die Ergebnisse von 5 zeigen eine positive lineare Korrelation zwischen der Grauskalaintensität der Bindungszone und der Zahl der auf dem Nitrocellulosestreifen dehydratisierten Liposomen. Jedoch blieb der Prozentsatz der bei der Rehydratation zurückgewonnenen Liposomen konstant. Das heißt, Liposomen in einem zur Bildung eines unterscheidbaren Signals benötigten Bereich (2,5 × 10⁸ bis 2 × 10⁹ Liposomen/Streifen) ergaben den gleichen Rückgewinnungsprozentsatz (75 %) nach dem Dehydratations/Rehydratationsverfahren. Obwohl ein höheres Signal erhalten wurde, wenn die Zahl der dehydratisierten Liposomen zunahm, wurden größere Mengen des Analyts zum Konkurrieren mit den Analyt-Tags auf den Liposomen benötigt. Daher muss, um die Nachweisgrenze niedrig zu halten, eine Liposommenge gewählt werden, die ein ausreichend starkes Signal für den Nullstandard ergibt und dennoch ein Signal einer möglichst niedrigen Analytkonzentration, das von dem Nullstandard unterscheidbar ist, ergeben kann. Die Zahl der Liposomen, die die beste Ansprechkurve ergab, lag zwischen 7 × 10⁸ und 9 × 10⁸ Liposomen pro Streifen, der 4,5 μg Antibiotin in der Bindungszone enthielt.
Beispiel 15 – Wirkung der Osmolalität im Inneren der Liposomen
Vergleiche zwischen den Liposomchargen I bis V (alle mit der gleichen internen Osmolalität von 827 mOsmol/kg) und den Chargen VI bis VIII (alle mit einer internen Osmolalität von 204 mOsmol/kg) in 3 und 4 zeigten ähnliche Rückgewinnungsraten nach dem Dehydratations/Rehydratationsverfahren. Diese Beobachtung ermöglicht die Anwendung dieses Ansatzes auf einen breiten Bereich von Liposomen, die unterschiedliche Marker einkapseln, da jede wasserlösliche Verbindung, die als Marker eingekapselt werden soll, einen eigenen Osmolalitätswert besitzt. Dies ist auch von potentieller Bedeutung für die Entwicklung eines Mehrfachanalyttests.
Beispiel 16 – Optimierung von Komponenten zur maximalen Rückgewinnung dehydratisierter Liposomen
Die Beobachtung, dass externer Zucker zur Konservierung der dehydratisierten Liposomen notwendig war, erforderte eine Neubestimmung der optimalen Konzentrationen der Blockierungsmittel, die zur maximalen Rückgewinnung der dehydra tisierten, an Saccharose angereicherten Liposomen benötigt wurden. Experimente unter Verwendung von PVP und Gelatine als solchen oder in unterschiedlichen Anteilen gemischt wurden unter Verwendung der Liposomcharge I (keine interne Trehalose), die mit 0,44 M Saccharose im Verdünnungsmittel angereichert war (0,44 M wurde verwendet, bevor 0,7 bis 1,0 M als optimaler Bereich festgestellt wurden), durchgeführt. 6 zeigt die Wirkungen von Kombinationen von PVP und Gelatine auf die Rückgewinnung der dehydratisierten Liposomen. Gelatine selbst kann eine große Zahl von Liposomen konservieren, doch ist die Gleichförmigkeit über die Einfangzone schlecht. Die Ergebnisse zeigen, dass die mit 0,2 PVP und 0,01 % Gelatine blockierten Membranen die höchste Rückgewinnungsrate der dehydratisierten/rehydratisierten Liposomen ergaben. Spätere Experimente zeigten keinen signifikanten Unterschied zwischen 0,1 und 0,2 % PVP, wenn es mit 0,01 % Gelatine verwendet wurde. Es wurde beobachtet, dass PVP zur Bereitstellung der besten Rückflussrate und der Homogenität über die Antibiotinbande wesentlich war.
Auf der Basis der im vorhergehenden gemachten Beobachtungen wurden für beste Ergebnisse Liposomen mit Durchmessern von kleiner als 384 nm und ohne interne Zuckerarten in Verdünnungsmittel, das zwischen 0,7 und 1 M Saccharose enthielt, zubereitet, bevor sie auf eine Fläche unter der Antikörperbande auf den mit 0,1 oder 0,2 % PVP und 0,01 % Gelatine in TBS blockierten Nitrocellulosestreifen appliziert wurden.
Beispiel 17 – Testergebnisse
Die Tabelle 2 zeigt die Reproduzierbarkeit des Tests mit Streifen, die dehydratisierte Liposomen enthielten, zusammen mit Kontrollstreifen (frisch applizierte Liposomen) unter Verwendung von PBS oder normalem humanem Serum (NHS) als Träger.
Tabelle 2 Testergebnisse
Der Prozentzsatz der Rückgewinnung für Streifen mit dehydratisierten Liposomen ist der Mittelwert der Intensitäten der Antibiotinbande aller Teststreifen im Vergleich zur Intensität der Antibiotinbande der Kontrollen. Unter Verwendung von NHS als Träger war die Rückgewinnung signifikant höher als mit PBS. Aus diesen Ergebnissen wurde ein Bereich von 70 bis 80 % Rückgewinnung mit einem akzeptablen Variationskoeffizienten (CV) von ≤ 8 % ermittelt. Die Analysezeit, die aus der Zeit vom Kontakt des die dehydratisierten Liposomen enthaltenden Teststreifens mit der Probenlösung bis zu dem Zeitpunkt, an dem die Lösung das Ende des Streifens erreichte, betrug weniger als 6 min. Weitere Zeit wurde für die kolorimetrische quantitative Bestimmung mit dem Scanner, der im Labor verwendeten Technik, benötigt. Als einfacherer und benutzerfreundlicherer Ansatz könnte ein Messgerät zur Ermittlung der Farbintensität bei einer spezifischen Wellenlänge auf der Basis von Reflektrometrie verwendet werden. Am einfachsten würde eine visuelle Abschätzung der Farbintensität unter Verwendung von geeigneten Eichmitteln oder eines Farbintensitätsdiagramms die Notwendigkeit jeglicher Instrumente umgehen.
Beispiel 18 – Biotin-Streifen-Immunoassay
Der Test beruhte auf dem Prinzip eines kompetitiven Immunoassays. Wenn die flüssige Probe den Teststreifen hinaufwanderte, rehydratisierte sie die getrockneten, mit einem Biotin-Tag versehenen SRB-beladenen Liposomen und sie wanderte zur Zone des immobilisierten Antikörpers weiter, wo eine Konkurrenz zwischen den mit Biotin konjugierten Liposomen und dem Analyt in der Probe um die Bindungsstellen am Antikörper erfolgte. Wenn weniger Biotin in der Probe vorhanden ist, binden mehr Liposomen an die Anbiotinzone, weshalb die Intensität der Farbe in der Antikörper-Einfangzone invers zur Konzentration des Biotins in der Probe variiert. Eine Dosis-Wirkung-Kurve für Biotin in normalem humanem Serum ist in 7 gezeigt. Diese Dosis-Wirkung-Kurve zeigt die Sigmaform kompetitiver Immunoassays. Aus dieser Kurve wurde die Nachweisgrenze als 6 ng/ml (24,6 nM) Biotin mit mehr als 95 % Konfidenz bestimmt. Obwohl diese Konzentration größer als der klinisch relevante Spiegel in Blut/Serum ist, wird angenommen, dass weitere Verbesserungen die Nachweisgrenze auf die erforderliche Höhe senken.
Um zu bestimmen, ob unterschiedliche Mengen von Bindungsprotein (Antikörper) auf dem Streifen die Nachweisgrenze und den Arbeitsbereich des Assay beeinflussen, wurden Streifen mit 1, 2,5 und 4,5 μg Antibiotin beschichtet. Die Streifen mit nur 1 μg Antibiotin wiesen nicht genügend Antikörper auf, um Liposomen unter Bildung einer visuell erkennbaren Bande zu binden. Die unter Verwendung von Streifen, die 2,5 und 4,5 μg Antibiotin enthalten, erhaltenen Ansprechkurven zeigten die gleiche Nachweisgrenze, doch wurde eine leichte Verbesserung des Arbeitsbereichs mit der höheren Antibiotinkonzentration auf dem Streifen beobachtet.
Beispiel 19 – Stabilität von dehydratisierte Liposomen enthaltenden Teststreifen über die Zeit
Die Streifen mit dehydratisierten Liposomen wurden in einem vakuumverschlossenen Kunststoffbeutel bei 4 °C und vor Licht geschützt aufbewahrt. Eine Eichkurve unter Verwendung von Streifen, die ein Jahr bei 4 °C und vor Licht geschützt aufbewahrt worden waren, zeigten ein identisches Ansprechen gegenüber der Kurve, die erhalten wurde, als die Streifen frisch hergestellt wurden. Die Ergebnisse, die mit zwei Biotinstandards, 10 und 100 μg/ml Biotin erhalten wurde, die über einen Zeitraum von 1,2 Jahren unter Verwendung der gelagerten Teststreifen getestet wurden, sind in 8 angegeben. Die unbedeutende Änderung der Ansprechdaten, die für die Standards erhalten wurden, zeigte, dass die dehydratisierten Liposomen auf den NC-Streifen mindestens ein Jahr stabil waren. Für die Biotinstandards von 10 und 100 μg/l betragen die erhaltenen prozentualen CV-Werte 5,50 (n = 8) bzw. 5,14 (n = 7).
Auf diese Weise wurde die Durchführbarkeit der Entwicklung eines schnellen einstufigen Streifen-Immunoassays unter Verwendung dehydratisierter Liposomen belegt. Diese Technik ergibt ein einfaches und bequemes Format für Versorgungs- und Feld-Testvorrichtungen. Die Dehydratation von farbstoffbeladenen Liposomen in Gegenwart einer hohen Konzentration von externem Zucker auf einer Nitrocellullosemembran, die mit PVP und Gelatine blockiert war, ergab 70-80 % Rückgewinnung der Liposomen bei Rehydratation durch die Probenlösung. Die optimale externe Saccharosekonzentration wurde als 0,7–1,0 M bestimmmt. Eine relativ große Variabilität der Liposomgröße, internen Osmolalität, Einkapselungskonzentration und Liposomzahl beeinflusste die Rückgewinnung der Liposomen nicht, was das Herstellungsverfahren für den Test stark vereinfachte. Die hier offenbarten Blockierungsbedingungen sind das für Biotin als Analyt erreichte Optimum, doch können Modifikationen für andere Analyte, insbesondere Proteine, notwendig sein.

Claims

Verfahren zur Herstellung einer Testvorrichtung zum Nachweisen oder quantitativen Bestimmen eines Analyts in einer Probe, das umfasst: Kontaktieren einer Membran mit einem Gemisch, das derivatisierte, markerbeladene Liposome umfasst, und substantielles Dehydratisieren des Gemischs auf der Membran unter Vakuumdruck bei einer Temperatur von etwa 4 °C bis etwa 80 °C, wobei das Gemisch ferner einen oder mehrere Zucker in einer zur Förderung der Stabilität der Liposomen während der Dehydratation und Rehydratation ausreichenden Menge umfasst.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die derivatisierten, markerbeladenen Liposome mit einem Analytanalogon derivatisiert sind.
Verfahren nach Anspruch 1, das ferner das Immobilisieren eines für den Analyten spezifischen ersten Bindungsmaterials in einer Einfangzone auf der Membran umfasst.
Verfahren nach Anspruch 1, das ferner das Blockieren der Membran mit einem oder mehreren Blockierungsmitteln umfasst.
Verfahren nach Anspruch 4, wobei das Blockierungsmittel aus der aus Polyvinylpyrrolidon, Gelatine, fettfreier Trockenmilch, Rinderserumalbumin, Kasein, Gummiarabicum und Gemischen derselben bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Dehydratisieren bei einer Temperatur von etwa 4 °C bis etwa 50 °C durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Vakuumdruck von etwa 5 bis etwa 25 psi beträgt.
Testvorrichtung zum Nachweisen oder quantitativen Bestimmen eines Analyts in einer Probe, die umfasst: eine Membran, die eine Zone immobilisierter Liposomen umfasst, wobei die Zone immobilisierter Liposomen daran gebundene dehydratisierte, derivatisierte, markerbeladene Liposomen aufweist, die unter Vakuumdruck bei einer Temperatur von etwa 4 °C bis etwa 80 °C ausgehend von einem Gemisch, das einen oder mehrere Zucker in einer zur Förderung der Stabilität der Liposomen während der Dehydratation und Rehydratation ausreichenden Menge umfasst, dehydratisiert wurden.
Testvorrichtung nach Anspruch 8, die ferner umfasst: eine Einfangzone mit einem daran gebundenen, für den Analyten spezifischen ersten Bindungsmaterial.
Verfahren zum Nachweisen oder quantitativen Bestimmen eines Analyts in einer Probe, das umfasst: Bereitstellen einer Testvorrichtung, die umfasst: eine Membran, die umfasst: eine Zone immobilisierter Liposomen, wobei die Zone immobilisierter Liposomen daran gebundene dehydratisierte, derivatisierte, markerbeladene Liposomen aufweist, die unter Vakuumdruck bei einer Temperatur von etwa 4 °C bis etwa 80 °C ausgehend von einem Gemisch, das einen oder mehrere Zucker in einer zur Förderung der Stabi lität der Liposomen während der Dehydratation und Rehydratation ausreichenden Menge umfasst, dehydratisiert wurden, und eine Einfangzone mit einem daran gebundenen, für den Analyten spezifischen ersten Bindungsmaterial, wobei die dehydratisierten, derivatisierten, markerbeladenen Liposome mit einem Analytanalogon derivatisiert sind; Kontaktieren der Testvorrichtung mit einer Lösung der Probe; Ermöglichen der Wanderung der Lösung durch die Zone immobilisierter Liposomen und in die Einfangzone durch Kapillarwirkung, wobei die Lösung die dehydratisierten, derivatisierten, markerbeladenen Liposome rehydratisiert, die mit der Lösung in die Einfangzone durch Kapillarwirkung wandern; Zulassen des Auftretens einer Konkurrenz zwischen einem beliebigen in der Probe vorhandenen Analyten und den derivatisierten, markerbeladenen Liposomen um das erste Bindungsmaterial; nach dem Zulassen Nachweisen oder quantitatives Bestimmen der derivatisierten, markerbeladenen Liposomen in der Einfangzone; und Korrelieren des Vorhandenseins oder der Menge der derivatisierten, markerbeladenen Liposomen in der Einfangzone mit dem Vorhandensein oder der Menge des Analyts in der Probe.
Verfahren zum Nachweisen oder quantitativen Bestimmen eines Analyts in einer Probe, das umfasst: Bereitstellen einer Testvorrichtung, die umfasst: eine Membran, die umfasst: eine Zone immobilisierter Liposomen, wobei die Zone immobilisierter Liposomen daran gebundene dehydratisierte, derivatisierte, markerbeladene Liposomen aufweist, die unter Vakuumdruck bei einer Temperatur von etwa 4 °C bis etwa 80 °C ausgehend von einem Gemisch, das einen oder mehrere Zucker in einer zur Förderung der Stabilität der Liposomen während der Dehydratation und Rehydratation ausreichenden Menge umfasst, dehydratisiert wurden, und eine Einfangzone mit einem daran gebundenen, für den Analyten spezifischen ersten Bindungsmaterial, wobei die dehydratisierten, derivatisierten, markerbeladenen Liposome mit einem für den Analyten spezifischen zweiten Bindungsmaterial derivatisiert sind, und wobei das erste Bindungsmaterial mit einem Teil des Analyten eine Bindung eingeht, der von dem Teil des Analyten, für den das zweite Bindungsmaterial gewählt wurde, verschieden ist; Kontaktieren der Testvorrichtung mit einer Lösung der Probe; Ermöglichen der Wanderung der Lösung durch die Zone immobilisierter Liposomen und in die Einfangzone durch Kapillarwirkung, wobei die Lösung die dehydratisierten, derivatisierten, markerbeladenen Liposome rehydratisiert, die mit der Lösung in die Einfangzone durch Kapillarwirkung wandern; Nachweisen oder quantitatives Bestimmen der derivatisierten, markerbeladenen Liposomen in der Einfangzone; und Korrelieren des Vorhandenseins oder der Menge der derivatisierten, markerbeladenen Liposomen in der Einfangzone mit dem Vorhandensein oder der Menge des Analyts in der Probe.
Verfahren nach Anspruch 1, 10 oder 11 oder Testvorrichtung nach Anspruch 8, wobei der Marker ein Fluo reszenzfarbstoff, ein sichtbarer Farbstoff, ein Biolumineszenzmaterial, ein Chemilumineszenzmaterial, ein Enzymsubstrat, ein radioaktives Material oder ein elektrochemischer Marker ist.
Verfahren nach Anspruch 1, 10 oder 11 oder Testvorrichtung nach Anspruch 8, wobei die Membran ein absorbierendes Material ist.
Verfahren oder Testvorrichtung nach Anspruch 13, wobei das absorbierende Material Nitrocellulose, Glasfaser, ein Gewebe, Nylon, Vliesmaterial, Polyestergewebe, Reyon, ein Cellulose-Reyon-Gemisch, ein Cellulose/Glas-Fasergemisch oder Polyethersulfon ist.
Verfahren nach Anspruch 1, 10 oder 11 oder Testvorrichtung nach Anspruch 8, wobei der eine oder die mehreren Zucker aus der aus Saccharose, Trehalose, Maltose, Glucose, Lactose und Gemischen derselben bestehenden Gruppe ausgewählt sind.
Verfahren nach Anspruch 1, 10 oder 11 oder Testvorrichtung nach Anspruch 8, wobei der eine oder die mehreren Zucker nur im Gemisch vorhanden sind.